CN103768604A - 治疗性肿瘤疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞，和将所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。特别地，本发明涉及一种治疗性癌症疫苗。更特别地，本发明涉及经至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理的树突状细胞(DC)。

Description

治疗性肿瘤疫苗

技术领域

本发明涉及一种治疗癌症的方法，其包括用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞，和将治疗有效量的所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。特别地，本发明涉及一种治疗性癌症疫苗。更特别地，本发明涉及经至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理的树突状细胞(DC)。

背景技术

肿瘤疫苗是近年研究的热点之一，其原理是通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。

DC在激活固有免疫与适应性免疫反应中起关键作用(Banchereau etal.，1998，Nature 392：245-252)。DC能够提呈肿瘤抗原给初始肿瘤特异性细胞毒T细胞。DC也是重要的细胞因子来源，如白介素-12(Interleukin-12IL-12)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor alpha TNFα)与α干扰素(Interferon alphaI FNα)，这些细胞因子在抗肿瘤免疫反应中起作用(Banchereau et al.，1998，Nature 392：245-252)。因此，近几年来，科学家正在努力开发激活DC活性以用于治疗肿瘤的药物。为了诱导适当的免疫反应，DC必须摄取抗原、被TLR信号激活、迁移到次级淋巴器官并激活T细胞。

DC是免疫系统的中枢组分，桥联固有免疫与适应性免疫反应。在接收到成熟信号刺激后如炎性细胞因子、T细胞刺激或识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)，DC上调细胞表面主要组织相容性抗原I and II(major histocompatibility complex II，MHCII)与共刺激分子的表达(Kawai T & Akira S.Nature Immunology，11，373-384，2010)。在成熟过程中，DC的作用从抗原摄取转变成抗原提呈，并迁移到次级淋巴器官，刺激T淋巴细胞。利用DC特性用于临床的工作已经被大量开展如DC的间接体内疗法已经成为标准操作(Gilboa E.JClin Invest.117(5)：1195-1203，2007)。尤其是由于DC能够激活初始T细胞，因此DC在恶性肿瘤治疗方面的应用是大有希望的(Figdor CG.et al.Nature Medicine 10，475-480，2004)。

DC辅助免疫疗法已经显示出对增强肿瘤患者的免疫反应是一种安全的方式。可是，到目前为止已经取得的免疫反应还没有达到治疗潜力，而且DC辅助疗法目前还没有成为临床的标准治疗(Gilboa E.J Clin Invest.117(5)：1195-1203，2007；Steinman RM，Annual Review of Immunology，30：1-22，2012)。一项新近的meta研究发现，使用成熟的DC治疗338个黑色素瘤患者中，大约30％的病人有完全反应(CR)，部分反应(CR)或病情稳定(SD)(Melanoma Research，21，165-174，2011)。在免疫学参数中，尤其是抗原特异性T淋巴细胞的诱导被发现对于阳性结果(CR，PR和SD)的产生是有意义的。

DC用于临床治疗的最关键的方面是DC对T淋巴细胞的刺激能力。Toll样受体(TLR)已经被认为是一种激活DC的重要受体。TLR识别微生物病原体的特异的分子模式。在人类中，已经鉴定到至少十种不同的TLR分子。通过微生物分子触发的TLR信号强烈地激活DC上调共刺激分子(CD80和CD86)(Hertz et al.，2001，J.Immunol.166：2444-2450)，并产生促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IL-12)(Thoma-Uszynski et al.，2001，J.Immunol.154：3804-3810)。现在，众多研究已经鉴定了多种的结构不同的细菌产物可作为TLR的配体和激动剂，包括细菌脂多糖(TLR-4)、鞭毛蛋白(TLR-5)、脂磷壁酸(TLR-2)与Poly I:C(TLR-3)。更特别的是，TLR-9已经显示是具有免疫刺激作用的细菌CpG DNA的配体(Hemmi et al.，2000，Nature 408：740745；Wagner，2001，Immunity 14：499-502)。

Toll样受体(TLR)是一种模式识别受体家族(pattern recognitionreceptors，PRR)，是主要的识别微生物病原体诱导固有免疫反应的传感器。TLR识别微生物的不同结构，被称为“PAMP”(pathogen associatedmolecular patterns)。配体结合到TLR引起细胞内信号通路级联，诱导产生炎症与免疫因子。PRR也包括细胞内蛋白，如NOD样受体、RIG-1样解旋酶(RLH)以及细胞外受体如清道夫受体和C型凝集素受体。TLR典型地被微生物信号或者内源性配体(如热休克蛋白、纤连蛋白与纤维蛋白原)或化学合成的药物激活。在人类，已经鉴定到十种TLR。这些受体包括一种保守的跨膜分子家族，在胞外区富含亮氨酸重复序列，含有一个跨膜结构域与一个细胞内TIR(Toll/IL-1R)结构域。表达于细胞表面的TLR(TLR1，-2，-4，-5，-6)侦测局部微环境中的病原体。TLR4通过胞外段识别细菌细胞壁成分脂多糖(LPS)，除了单磷酰脂A(monophosphoryllipid A，MPLA)外。脂蛋白与脂磷壁酸被TLR2分别联合TLR1与TLR6识别。TLR5识别细菌鞭毛蛋白。相反，某些TLR(TLR-3，-7/8，-9)位于内质网(ER)并被快速募集到内体-溶酶体区室，在区室内的TLR能够侦测微生物核酸(分别是dsRNA，ssRNA与含有未甲基化的CpG模序的ss DNA)(Napolitani G.et al.Nature Immunology 6，769，2005.)。配体结合到TLR诱导细胞衔接蛋白募集，在细胞质形成信号转导复合物。这导致信号通路包括NF-KB与MAPK p38和JNK的激活，调节参与炎症(细胞因子)与免疫(MHC分子、黏附分子)的基因的表达。由于不同的TLR信号通过不同的衔接蛋白的联合，因此募集不同的转录因子与诱导不同的基因表达。内体受体TLR7，-8，-9在配体结合后被激活，并与衔接蛋白MyD88(myeloid diff erentiation primary response gene)相互作用，接着与几种信号复合物联合，最后导致IRF7，NF-KB和MAPK的激活。IRF7的表达促进I型干扰素(IFN)的高表达。LPS与TLR4结合后，募集几种衔接蛋白(TIRAP，MyD88，TRAM和TRIF)到TIR胞内结构域。这些衔接蛋白随后参与MyD88和TRIF依赖的信号通路。

由于目前的肿瘤疫苗无法激活足够的免疫反应来抗击肿瘤，因此有必要开发新的肿瘤疫苗来治疗肿瘤。

发明内容

本发明人首次出人意料地发现，通过用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原的组合处理DC细胞，能够特别有效地激活DC细胞从而增强抗肿瘤免疫应答，由此可用于治疗癌症。

因此，在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原。

在另一个方面，本发明提供了一种用于刺激免疫系统的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将治疗有效量的所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

在又一个方面，本发明提供了一种用于改善对象中针对癌症的免疫应答的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将治疗有效量的所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将治疗有效量的所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

在又一个方面，本发明提供了用于处理树突状细胞的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞。

在又一个方面，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在又一个方面，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于刺激免疫系统的药物中的用途。

在又一个方面，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于改善对象中针对癌症的免疫应答的药物中的用途。

另外，本发明还提供了一种药物、药物组合或药盒(kit)，其包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原。本发明还提供了一种经处理的树突状细胞，其经过至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原的处理。本发明还提供了一种治疗性癌症疫苗，其包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原或者经过至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理的树突状细胞。

本发明至少部分地基于发现联合施用两种或更多种独特的TLR激动剂有很强的免疫刺激活性。另外，本发明还发现在联合施用两种TLR激动剂的情况下，用针对来源于肿瘤干细胞、肿瘤细胞与增殖性肿瘤相关内皮细胞的抗原处理树突状细胞，然后将树突状细胞施用给患者能够从三方面抑制了肿瘤干细胞与肿瘤细胞的生长及血管生成。

因此，在一个特定的实施方案中，本发明提供了通过激活DC治疗肿瘤的药物，该药物含有至少两种TLR激动剂与至少三种分别来源于肿瘤干细胞、肿瘤细胞与增殖性肿瘤相关内皮细胞的抗原。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供了通过给予有效剂量的药物来激活DC治疗肿瘤的方法，该药物含有至少两种TLR激动剂与至少三种分别来源于肿瘤干细胞、肿瘤细胞与增殖性肿瘤相关内皮细胞的抗原。

在又一个特定的实施方案中，本发明提供了通过给予足够量的用药物预处理的DC并通过激活DC来治疗肿瘤的方法，该药物含有至少两种TLR激动剂与至少三种分别来源于肿瘤干细胞、肿瘤细胞与增殖性肿瘤相关内皮细胞的抗原。

附图说明

图1是激活DC抗原提呈的药物与方法的示意图，其中激活DC以诱导广泛的抗肿瘤细胞、肿瘤干细胞与肿瘤相关血管内皮细胞的免疫反应，其中AACSc表示抗血管发生肿瘤干细胞及肿瘤细胞(Anti AngiogenesisCancer Stem Cell and Cancer Cell)。

图2显示了通过ELISA方法定量人DC产生的促炎细胞因子IL-12p70，其中DC经以下药物预处理：OK-432、IC、CpG、AACSc、OK-432+IC以及对照PBS缓冲液，其中IC表示Poly I:C，CpG表示非甲基化CpG寡核苷酸，AACSc表示包含两种TLR激动剂(Poly I:C和OK-432)和三种癌症相关抗原(hTERT、MUC1和VEGFR2)的抗血管发生，肿瘤干细胞及肿瘤细胞疫苗。

图3是一系列ELISPOT试验的检测图，其显示经AACSc疫苗预处理的DC相比于仅用肿瘤相关抗原(TAA)(其包含三种癌症相关抗原(hTERT、MUC1和VEGFR2))或肿瘤裂解物预处理的DC更强地活化抗TAA(tumor-associated antigen)特异性人T淋巴细胞。图3A显示在针对抗hTERT细胞应答的活化中，相比于肿瘤裂解物(MDA-MB-231裂解物)+TLR激动剂(Poly I:C和OK-432)，AACSc预处理的DC表现出更强的活性。AACSc表示包含两种TLR激动剂Poly I:C和OK-432以及三种癌症相关抗原hTERT、MUC1和VEGFR2的疫苗；图3B显示AACSc在活化抗MUC1T细胞应答中活性更强，缩写如图3A中所述；图3C显示AACSc在活化抗VEGFR T细胞应答中活性更强，缩写如图3A中所述。

图4是标准的51Cr释放试验的结果图，显示用AACSc疫苗或其他药物预处理的自体DC在体外激活HLA-A2+T淋巴细胞的溶瘤活性.所述激活HLA-A2+T淋巴细胞对HLA-A2+、hTERT+及MUC1+人类肿瘤细胞(MDA-MD-231细胞)的溶瘤活性，其中TAA表示hTERT、MUC1和VEGFR2的混合物，肿瘤裂解物表示MDA-MB-231裂解物，TLR激动剂表示Poly I:C和OK-432，AACSc表示包含两种TLR激动剂Poly I:C和OK-432以及三种癌症相关抗原hTERT、MUC1和VEGFR2的疫苗。

图5是标准的51Cr释放试验的结果图，显示用AACSc疫苗或其他药物预处理的自体DC在体外激活HLA-A2+T淋巴细胞杀伤增殖内皮细胞(HUVEC)活性.所述激活HLA-A2+T淋巴细胞对增殖性HLA-A2+及VEGFR2+人类血管内皮细胞(原代HLA-A2+人脐静脉内皮细胞(HUVEC))的杀伤活性，其中TAA表示hTERT、MUC1和VEGFR2的混合物，肿瘤裂解物表示MDA-MB-231裂解物，TLR激动剂表示PolyI:C和OK-432，AACSc表示包含两种TLR激动剂Poly I:C和OK-432以及三种癌症相关抗原hTERT、MUC1和VEGFR2的疫苗。

具体实施方式

在一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂。在另一些实施方案中，所述药物组合物包含至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原。优选地，所述药物组合物包含至少两种TLR激动剂和至少三种癌症相关抗原。

在另一个方面，本发明提供了一种用于刺激免疫系统的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将治疗有效量的所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。本发明还提供了一种用于刺激免疫系统的方法，其包括：将治疗有效量的至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原施用给有此需要的对象，从而在原位处理树突状细胞。在一些实施方案中，所述方法用至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂处理树突状细胞。在另一些实施方案中，所述方法用至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原处理树突状细胞。优选地，所述方法用至少两种TLR激动剂和至少三种癌症相关抗原处理树突状细胞。

在又一个方面，本发明提供了一种用于改善对象中针对癌症的免疫应答的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将治疗有效量的所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。本发明还提供了一种用于改善对象中针对癌症的免疫应答的方法，其包括：将治疗有效量的至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原施用给有此需要的对象，从而在原位处理树突状细胞。在一些实施方案中，所述方法用至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂处理树突状细胞。在另一些实施方案中，所述方法用至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原处理树突状细胞。优选地，所述方法用至少两种TLR激动剂和至少三种癌症相关抗原处理树突状细胞。

在又一个方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将治疗有效量的所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。本发明还提供了一种用于治疗癌症的方法，其包括：将治疗有效量的至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原施用给有此需要的对象，从而在原位处理树突状细胞。在一些实施方案中，所述方法用至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂处理树突状细胞。在另一些实施方案中，所述方法用至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原处理树突状细胞。优选地，所述方法用至少两种TLR激动剂和至少三种癌症相关抗原处理树突状细胞。

在又一个方面，本发明提供了用于处理树突状细胞的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞。在一些实施方案中，所述方法用至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂处理树突状细胞。在另一些实施方案中，所述方法用至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原处理树突状细胞。优选地，所述方法用至少两种TLR激动剂和至少三种癌症相关抗原处理树突状细胞。在某些实施方案中，所述处理在原位进行。

在又一个方面，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，所述TLR激动剂为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂。在另一些实施方案中，所述癌症相关抗原为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原。

在又一个方面，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于刺激免疫系统的药物中的用途。在一些实施方案中，所述TLR激动剂为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂。在另一些实施方案中，所述癌症相关抗原为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原。

在又一个方面，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于改善对象中针对癌症的免疫应答的药物中的用途。在一些实施方案中，所述TLR激动剂为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂。在另一些实施方案中，所述癌症相关抗原为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原。

在又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其用于治疗癌症、刺激免疫系统或者改善对象中针对癌症的免疫应答，所述药物组合物包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原。在一些实施方案中，所述TLR激动剂为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂。在另一些实施方案中，所述癌症相关抗原为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原。

另外，本发明还提供了一种药物、药物组合或药盒(kit)，其包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原或者经至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理的树突状细胞。本发明还提供了一种经处理的树突状细胞，其经过至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原的处理。本发明还提供了一种治疗性癌症疫苗，其包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原或者经过至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理的树突状细胞。

在又一个方面中，本发明提供了用于处理树突状细胞的方法，其包括：用至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞。

在另一个方面中，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中所述治疗通过以下方式实现：用所述至少一种TLR激动剂和所述至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

在又一个方面中，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于刺激免疫系统的药物中的用途，其中所述刺激通过以下方式实现：用所述至少一种TLR激动剂和所述至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

在又一个方面中，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于改善对象中针对癌症的免疫应答的药物中的用途，其中所述改善通过以下方式实现：用所述至少一种TLR激动剂和所述至少一种癌症相关抗原处理树突状细胞；和将所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

在又一个方面中，本发明提供了至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原在制备用于处理树突状细胞的药物中的用途。

在一个方面中，本发明还特别地提供了一种癌症疫苗(特别地为治疗性癌症疫苗)，其包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原，或者包含经至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原处理的树突状细胞。

在另一个方面中，本发明还提供了药物组合、药物、树突状细胞、药盒或者癌症疫苗，其用于治疗癌症、刺激免疫系统和/或改善针对癌症的免疫应答。

在又一个方面中，本发明还提供了如上所述的药物组合、药物、树突状细胞、药盒或者癌症疫苗在制备用于治疗癌症、刺激免疫系统和/或改善针对癌症的免疫应答之药物中的用途。

在本发明的一些实施方案中，所述至少一种TLR激动剂为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂，优选至少两种TLR激动剂，更优选两种TLR激动剂。特别地，所述TLR激动剂包括：TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂(例如Poly I:C)、TLR4激动剂(例如单磷酰脂A)、TLR5激动剂(例如鞭毛蛋白)、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂(例如非甲基化CpG寡核苷酸)、非特定TLR激动剂(例如OK-432)或其任意组合。优选地，本发明中的所述至少一种TLR激动剂为TLR3激动剂和非特定TLR激动剂，更优选为Poly I:C和OK-432。

在本发明的另一些实施方案中，所述至少一种癌症相关抗原为至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原，优选至少三种癌症相关抗原，更优选三种癌症相关抗原。特别地，所述至少一种癌症相关抗原包括至少一种来源于肿瘤细胞的癌症相关抗原、至少一种来源于增生的肿瘤相关内皮细胞的癌症相关抗原或其任意组合。更特别地，所述至少一种来源于肿瘤细胞的癌症相关抗原包括至少一种来源于肿瘤干细胞的癌症相关抗原。优选地，所述至少一种癌症相关抗原包括至少两种来源于肿瘤干细胞的癌症相关抗原和至少一种来源于增生的肿瘤相关内皮细胞的癌症相关抗原。

在本发明的又一些实施方案中，所述来源于肿瘤细胞的抗原包括：端粒酶逆转录酶、黑素细胞分化抗原A(melanocyte differentiation antigenMelan-A)、酪氨酸酶、黑色素瘤抗原-1(melanoma-associated antigen-1MAGE-1)、黑色素瘤抗原-2、黑色素瘤抗原-3、黑色素瘤抗原-4、黑色素瘤抗原-12、黑色素瘤相关抗原1(Melanoma-associated antigen recognizedby T cells)、粘蛋白1(MUC1)、粘蛋白2、粘蛋白3、粘蛋白4、粘蛋白18、癌胚抗原(Cancer Embryo Antigen CEA)、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen PSA)、前列腺特异性膜抗原(prostate-specificmembrane antigen PSM)、α-胎球蛋白、gp100抗原、NY-ESO-1抗原或其任意抗原性片段。

在本发明的又一些实施方案中，所述来源于肿瘤干细胞的抗原包括：端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)例如hTERT、粘蛋白1(mucin 1，MUC1)或其任意抗原性片段。

在本发明的又一些实施方案中，所述来源于增生的肿瘤相关内皮细胞的抗原包括：血管内皮生长因子受体1(Vascular Endothelial Growthfactor receptor-1VEGFR1)、血管内皮生长因子受体2、肿瘤内皮标记物8(Tumor Endothelial Marker 8TEM8)、成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast Growth factor receptor-1)、内皮素、Tie2受体、血管动蛋白、生存素及血小板源生长因子受体β(platelet-derived growth factorreceptor beta PDGFRbeta)或其任意抗原性片段。

在本发明一些特别优选的实施方案中，所述癌症相关抗原包括hTERT、MUC1和VEGFR2或其任意抗原性片段。

在本发明的一些实施方案中，所述癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、子宫内膜癌、胃癌、小肠癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺肿瘤、卵巢癌、睾丸癌、头颈癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、眼癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤以及转移癌。

在本发明的一些实施方案中，所述树突状细胞为异体或自体树突状细胞，优选自体树突状细胞。

在本发明的一些实施方案中，根据本发明的疫苗、药物、药物组合或组合物还包含根据施用方式所选的适合的药物赋形剂、稀释剂或载体，其可以通过任何适合的方式施用于需要处理的细胞和/或需要治疗的患者/受试者。精确的剂量将取决于多个因素。

本领域中相关技术人员可使用适当的溶剂或制剂配制根据本发明的疫苗、药物、药物组合或组合物，例如：等张赋形剂如氯化钠注射液、林格氏注射液，乳酸林格氏注射液。根据要求，可以加入防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉剂或口服液等形式。片剂可以包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。

以上所提到的技术和方案的例子以及其它一些根据本发明所使用的技术和方案可以在Remington′s Pharmaceutical Sciences，16th edition，Oslo，A.(ed)，1980.中找到。

定义

除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。

尽管本发明的广义范围所示的数字范围和参数近似值，但是具体实施例中所示的数值尽可能准确的进行记载。然而，任何数值本来就必然含有一定的误差，其是由它们各自的测量中存在的标准偏差所致。另外，本文公开的所有范围应理解为涵盖其中包含的任何和所有子范围。例如记载的“1至10”的范围应认为包含最小值1和最大值10之间(包含端点)的任何和所有子范围；也就是说，所有以最小值1或更大起始的子范围，例如1至6.1，以及以最大值10或更小终止的子范围，例如5.5至10。另外，任何称为“并入本文”的参考文献应理解为以其整体并入。

另外应注意，如本说明书中所使用的，单数形式包括其所指对象的复数形式，除非清楚且明确的限于一个所指对象。术语“或”可与术语“和/或”互换使用，除非上下文另有清楚指明。

本文使用的术语“TLR激动剂”是指能够激活toll样受体(“TLR”)的任何分子，其包括但不限于多种TLR配体。特别地，TLR激动剂包括但不限于TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂(例如Poly I:C)、TLR4激动剂(例如单磷酰脂A)、TLR5激动剂(例如鞭毛蛋白)、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂(例如非甲基化CpG寡核苷酸)、非特定TLR激动剂(例如OK-432)或其任意组合。在本发明的一个优选实施方案中，TLR激动剂是指TLR 3激动剂Poly I:C和/或TLR4激动剂OK-432。另外，本文使用的术语“非特定TLR激动剂”是指激活多于一种特定toll样受体的TLR激动剂，即激活选自TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9中一种或更多种的激动剂，例如激活TLR1和TLR2的TLR激动剂、激活TLR1和TLR3的TLR激动剂、激活TLR2和TLR3的TLR激动剂、激活TLR3和TLR4的TLR激动剂等、或者激活TLR1、TLR2和TLR3的TLR激动剂。

本文使用的术语“OK-432”是指一种用于治疗癌症的链球菌制剂，其具有免疫活性作用，又称为OK432或Picibanil。

本文使用的术语“Poly I:C”是指聚肌胞苷酸，又称为聚肌苷酸-聚胞苷酸。其为一种双链RNA类似物，已知Poly I:C与TLR3相互作用。

本文使用的术语“癌症相关抗原”和“肿瘤相关抗原”可互换地使用，其是指与癌症或肿瘤有关的抗原，特别地指肿瘤抗原，即由肿瘤产生的抗原性物质，例如肿瘤细胞、肿瘤干细胞、增生的肿瘤相关内皮细胞所产生的抗原性物质。所述癌症相关抗原在宿主中引发了免疫应答。在本发明的一些实施方案中，所述癌症相关抗原为天然或重组的多肽或其抗原性片段。

本文使用的术语“抗原性片段”是指天然或合成多肽的片段，其保留了所述天然或合成多肽的抗原特性，即能够引发针对所述天然或合成多肽的免疫应答。

本文使用的术语“药物组合物”、“组合药物”和“药物组合”可互换地使用，其表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用赋形剂或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如TLR激动剂和/或癌症相关抗原)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。

本文使用的术语“肿瘤细胞”是指以不受控的方式生长和分裂的细胞，也经常被称为“癌细胞”。

本文使用的术语“肿瘤干细胞”是指具有正常干细胞特征的肿瘤细胞，其具有产生在肿瘤组织中存在的所有细胞类型的能力。该术语的定义还可参见http://en.wikipedia.org/wiki/Cancer stem cell。

本文使用的术语“增生的肿瘤相关内皮细胞”是指在肿瘤发生过程中出现异常增生的内皮细胞。所述增生的肿瘤相关内皮细胞包括血管内皮细胞。

本文使用的术语“来源于肿瘤干细胞的癌症相关抗原”是指与肿瘤干细胞有关的癌症相关抗原，特别地为由肿瘤干细胞产生或者由肿瘤干细胞所表达的抗原性物质。

本文使用的术语“来源于肿瘤细胞的癌症相关抗原”是指与肿瘤细胞有关的癌症相关抗原，特别地为由肿瘤细胞产生或者由肿瘤细胞所表达的抗原性物质。

本文使用的术语“来源于增生的肿瘤相关内皮细胞的癌症相关抗原”是指与增生的肿瘤相关内皮细胞有关的癌症相关抗原，特别地为由增生的肿瘤相关内皮细胞产生或者由其所表达的抗原性物质。

本文使用的术语“hTERT”指人端粒酶逆转录酶或其抗原性片段。特别地，所述hTERT包含O14746的121位至1132位氨基酸所示的序列(例如SEQ ID NO：1的121位至1132位氨基酸所示的序列)，如下所示：

121    130        140        150        160        170        180

SYLPNTVTDA LRGSGAWGLL LRRVGDDVLV HLLARCALFV LVAPSCAYQV CGPPLYQLGA

       190        200        210        220        230        240

ATQARPPPHA SGPRRRLGCE RAWNHSVREA GVPLGLPAPG ARRRGGSASR SLPLPKRPRR

       250        260        270        280        290        300

GAAPEPERTP VGQGSWAHPG RTRGPSDRGF CVVSPARPAE EATSLEGALS GTRHSHPSVG

       310        320        330        340        350       360

RQHHAGPPST SRPPRPWDTP CPPVYAETKH FLYSSGDKEQ LRPSFLLSSL RPSLTGARRL

       370        380        390        400        410        420

VETIFLGSRP WMPGTPRRLP RLPQRYWQMR PLFLELLGNH AQCPYGVLLK THCPLRAAVT

       430        440        450        460        470        480

PAAGVCAREK PQGSVAAPEE EDTDPRRLVQ LLRQHSSPWQ VYGFVRACLR RLVPPGLWGS

       490        500        510        520        530        540

RHNERRFLRN TKKFISLGKH AKLSLQELTW KMSVRDCAWL RRSPGVGCVP AAEHRLREEI

       550        560        570        580        590        600

LAKFLHWLMS VYVVELLRSF FYVTETTFQK NRLFFYRKSV WSKLQSIGIR QHLKRVQLRE

       610        620        630        640        650        660

LSEAEVRQHR EARPALLTSR LRFIPKPDGL RPIVNMDYVV GARTFRREKR AERLTSRVKA

       670        680        690        700        710        720

LFSVLNYERA RRPGLLGASV LGLDDIHRAW RTFVLRVRAQ DPPPELYFVK VDVTGAYDTI

       730        740        750        760        770        780

PQDRLTEVIA SIIKPQNTYC VRRYAVVQKA AHGHVRKAFK SHVSTLTDLQ PYMRQFVAHL

       790        800        810        820        830        840

QETSPLRDAV VIEQSSSLNE ASSGLFDVFL RFMCHHAVRI RGKSYVQCQG IPQGSILSTL

       850        860        870        880        890        900

LCSLCYGDME NKLFAGIRRD GLLLRLVDDF LLVTPHLTHA KTFLRTLVRG VPEYGCVVNL

       910        920        930        940        950        960

RKTVVNFPVE DEALGGTAFV QMPAHGLFPW CGLLLDTRTL EVQSDYSSYA RTSIRASLTF

       970        980        990       1000       1010       1020

NRGFKAGRNM RRKLFGVLRL KCHSLFLDLQ VNSLQTVCTN IYKILLLQAY RFHACVLQLP

      1030       1040       1050       1060       1070       1080

FHQQVWKNPT FFLRVISDTA SLCYSILKAK NAGMSLGAKG AAGPLPSEAV QWLCHQAFLL

      1090       1100       1110       1120       1130

KLTRHRVTYV PLLGSLRTAQ TQLSRKLPGT TLTALEAAAN PALPSDFKTI LD

或者通过替换、添加或缺失一个或更多个氨基酸获得的功能性变体，或者与本文所示的多肽序列(例如SEQ ID NO：1的121位至1132位氨基酸所示的序列)具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的变体。

优选地，本发明的hTERT包含任意本领域已知的接头、信号肽、标记、标签等，以便于合成和/或分离而不影响其抗原性。

本文使用的术语“MUC1”指粘蛋白1或其抗原性片段。特别地，所述MUC1包含1位至360位氨基酸所示的序列(例如SEQ ID NO：2的1位至360位氨基酸所示的序列)，如下所示：

       10         20         30         40         50         60

MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGSGHASST PGGEKETSAT QRSSVPSSTE KNAVSMTSSV

        70         80         90        100        110        120

LSSHSPGSGS STTQGQDVTL APATEPASGS AATWGQDVTS VPVTRPALGS TTPPAHDVTS

       130        140        150        160        170        180

APDNKPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

       190       200         210        220        230        240

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

       250        260        270        280        290        300

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

       310        320        330        340        350        360

APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS APDTRPAPGS TAPPAHGVTS

或者通过替换、添加或缺失一个或更多个氨基酸获得的功能性变体，或者与本文所示的多肽序列(例如SEQ ID NO：2的1位至360位氨基酸所示的序列)具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的变体。

优选地，本发明的MUC1包含任意本领域已知的接头、信号肽、标记、标签等，以便于合成和/或分离而不影响其抗原性

本文使用的术语“VEGFR2”指血管内皮生长因子受体2或其抗原性片段。特别地，所述VEGFR2包含421位至1356位氨基酸所示的序列(例如SEQ ID NO：3的421位至1356位氨基酸所示的序列)，如下所示：

       430        440        450        460        470        480

PQIGEKSLIS PVDSYQYGTT QTLTCTVYAI PPPHHIHWYW QLEEECANEP SQAVSVTNPY

       490        500        510        520        530        540

PCEEWRSVED FQGGNKIEVN KNQFALIEGK NKTVSTLVIQ AANVSALYKC EAVNKVGRGE

       550        560        570        580        590        600

RVISFHVTRG PEITLQPDMQ PTEQESVSLW CTADRSTFEN LTWYKLGPQP LPIHVGELPT

       610        620        630        640        650        660

PVCKNLDTLW KLNATMFSNS TNDILIMELK NASLQDQGDY VCLAQDRKTK KRHCVVRQLT

       670        680        690        700        710        720

VLERVAPTIT GNLENQTTSI GESIEVSCTA SGNPPPQIMW FKDNETLVED SGIVLKDGNR

       730        740        750        760        770        780

NLTIRRVRKE DEGLYTCQAC SVLGCAKVEA FFIIEGAQEK TNLEIIILVG TAVIAMFFWL

       790        800        810        820        830        840

LLVIILRTVK RANGGELKTG YLSIVMDPDE LPLDEHCERL PYDASKWEFP RDRLKLGKPL

       850        860        870        880        890        900

GRGAFGQVIE ADAFGIDKTA TCRTVAVKML KEGATHSEHR ALMSELKILI HIGHHLNVVN

       910        920        930        940        950        960

LLGACTKPGG PLMVIVEFCK FGNLSTYLRS KRNEFVPYKT KGARFRQGKD YVGAIPVDLK

       970        980        990       1000       1010       1020

RRLDSITSSQ SSASSGFVEE KSLSDVEEEE APEDLYKDFL TLEHLICYSF QVAKGMEFLA

      1030       1040       1050       1060       1070       1080

SRKCIHRDLA ARNILLSEKN VVKICDFGLA RDIYKDPDYV RKGDARLPLK WMAPETIFDR

      1090       1100       1110       1120       1130       1140

VYTIQSDVWS FGVLLWEIFS LGASPYPGVK IDEEFCRRLK EGTRMRAPDY TTPEMYQTML

      1150       1160       1170       1180       1190       1200

DCWHGEPSQR PTFSELVEHL GNLLQANAQQ DGKDYIVLPI SETLSMEEDS GLSLPTSPVS

      1210       1220       1230       1240       1250       1260

CMEEEEVCDP KFHYDNTAGI SQYLQNSKRK SRPVSVKTFE DIPLEEPEVK VIPDDNQTDS

      1270       1280       1290       1300       1310       1320

GMVLASEELK TLEDRTKLSP SFGGMVPSKS RESVASEGSN QTSGYQSGYH SDDTDTTVYS

      1330       1340       1350

SEEAELLKLI EIGVQTGSTA QILQPDSGTT LSSPPV

或者通过替换、添加或缺失一个或更多个氨基酸获得的功能性变体，或者与本文所示的多肽序列(例如SEQ ID NO：3的421位至1356位氨基酸所示的序列)具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％序列同一性的变体。

优选地，本发明的VEGFR2包含任意本领域已知的接头、信号肽、标记、标签等，以便于合成和/或分离而不影响其抗原性

本文使用的术语“AACSc疫苗”或“AACSc”表示抗血管发生肿瘤肝细胞及肿瘤细胞疫苗，优选地由两种TLR激动剂(例如Poly I:C和OK-432)和三种癌症相关抗原(例如hTERT、MUC1和VEGFR2多肽或其抗原性片段)组成，更优选地其中三种癌症相关抗原为hTERT、MUC1和VEGFR2抗原性片段，其序列分别如SEQ ID NO：1的121位至1132位、SEQ ID NO：2的1位至360位和SEQ ID NO：3的421位至1356位所示。

本文使用的术语“癌症”是指由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病，其包括例如实体瘤、血源性肿瘤(例如白血病)和肿瘤转移，特别地指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统肿瘤、消化系统肿瘤、泌尿生殖系统肿瘤、前列腺肿瘤、内分泌系统肿瘤和黑色素瘤。在本文中，术语“转移瘤(Metastatic)”是指肿瘤播散到远离区域淋巴结的部位。本发明的药物可用于治疗原发的和/或转移的肿瘤。可治疗的肿瘤类型包括而不限于黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、子宫内膜癌、胃癌、小肠癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺肿瘤、卵巢癌、睾丸癌、肝癌、头颈部肿瘤、结直肠肿瘤、食管癌、胃癌、眼部肿瘤、膀胱癌、胶质母细胞瘤与转移癌。特别地，所述癌症包括癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病和淋巴样恶性肿瘤。癌症的特定实例包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺部腺癌、肺部鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌症、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌肾癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌症、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛管癌、阴茎癌和头颈癌。

本文使用的术语“树突状细胞”是指一种存在于哺乳动物的一种白细胞，其由Steinman于1973年所发现的。它存在于血液和暴露于环境中的组织中，如皮肤和鼻子、肺、胃和小肠的上皮组织。它们的作用是调节对当前环境刺激的先天和后天免疫反应，为目前已知功能最强的抗原提呈细胞(又称抗原呈递细胞)。

本文所使用的术语“对象”是指哺乳动物，如人类，但也可以是其它动物，如家养动物(如狗、猫等)，家畜(如牛、羊、猪、马等)或实验动物(如猴子、大鼠、小鼠、兔子、豚鼠等)。

本文使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其它医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。

本发明人出人意料地发现几种TLR激动剂(例如OK432和poly I:C)的共施用能够更加有效地激活DC。进一步地，本发明人更加出人意料地发现至少一种TLR激动剂和至少一种肿瘤相关抗原共同处理树突状细胞，能够特别有效地激活树突状细胞，从而用于治疗癌症。

青霉素灭活的、低毒的化脓性链球菌株OK432首先被Okamoto及其同事描述。OK432是作为一种批准的药物(商品名Picibanil)，已经被证明有很小的副作用，并被有效地用于治疗一些肿瘤(Ryoma Y et al.Anticancer Research 2004 24，3295-3302，2004；Kakimi K et al.International Journal of Cancer，129，2836-2846，2011)。OK432在肿瘤病人中的作用没有得到足够的解释，但是体外联合培养OK432与DC诱导了炎性细胞因子的产生和类似Th1型反应(Ryoma Y et al.AnticancerResearch 2004 24，3295-3302，2004；Kakimi K et al.International Journalof Cancer，129，2836-2846，2011)。双链RNA(dsRNA)或其合成模拟物poly I:C被TLR3识别，TLR3定位于内体。与其它的TLR不同，TLR3结合诱导的信号转导通过MyD88非依赖途径，并与TRIF衔接蛋白结合，信号通过IRF3诱导IFNβ产生。

干细胞是一类较小的细胞群，通常是静止的细胞，具有较长的寿命、高度的集落形成、自我复制潜力、可塑性与药物抗性。具有这些特性的细胞已经在人类的多种正常的以及肿瘤组织中得到鉴定。化疗、放疗与抑制生长的药物很好地消除了活跃生长的肿瘤细胞。肿瘤复发目前认为是由于非分裂性肿瘤干细胞/祖细胞对这些治疗产生抵抗。不同的治疗方法需要考虑到消除肿瘤干细胞群。免疫疗法正是这样的方法。除了具有特异性与无毒性，免疫疗法靶向的肿瘤细胞，不管处于何种增殖状态，只要它们表达特异的肿瘤抗原。可是，目前的肿瘤疫苗主要靶向与肿瘤细胞相关的抗原。

人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptasehTERT)既是来源于肿瘤干细胞的癌症相关抗原，也是来源于肿瘤细胞的癌症相关抗原。端粒酶通过保护端粒DNA来保持染色体的完整性，端粒DNA将在快速分裂的细胞进行连续的细胞分裂时缺失，如肿瘤细胞。端粒酶活性与hTERT表达在大多数正常的人类细胞中缺乏，而在超过85％的人类肿瘤中发现端粒酶活性，包括迄今描述的多数的肿瘤干细胞。hTERT表达在肿瘤生成中起关键的功能作用，并且体外抑制表达端粒酶活性的肿瘤细胞的hTERT导致了细胞生长抑制，并没有发现逃逸突变子。hTERT具有免疫原性，能够激活T细胞(Roland Schroers R et al.ClinCancer Res，20039；4743；Filaci G，et al.Blood 2006；107：1505-12；Domchek SM et al.Cancer Res，2007 67；10546)。对自然生成的来源于TERT的CTL表位p540(hTERT：540-548，ILAKFLHWL)肽(HungerRE et al.Cancer Immunology，Immunotherapy.60，1553-1564，2011)有特异性的CD8+T细胞已经在肿瘤病人血液中多次观察到，这类病人在接受标准的治疗后处于缓解期。但是，这类T细胞是否代表肿瘤免疫监视的活性组分，是否可用于治疗开发，这些还不清楚。体外研究显示，所述p540肽可以高亲和力地与HLA-A2结合，并产生特异性CTL，裂解广泛的hTERT⁺肿瘤细胞系与原代肿瘤细胞。在健康个体或患有转移瘤的病人，其外周血液中p540肽特异性的CD8+T细胞前体很少。相反，超过80％的患有慢性粒细胞白血病的HLA-A2+病人在伊马替尼(imatinib)、IFN-α或干细胞移植治疗后的持续静息期，其外周血中所述p540肽特异性CTL占新鲜分离CD8+T细胞的比例为0.1％到13.2％。在患有急性髓细胞性白血病或慢性粒细胞白血病的病人使用同种异体干细胞移植或伊马替尼治疗后的静息期，发现超过80％的病人外周血有所述p540肽四聚体反应性CD8+T细胞。同样，超过90％的患有前列腺癌的HLA-A2+病人在前列腺切除术治疗后的静息期，体外发现所述p540肽特异的CD8+T细胞识别相应HLA的或自体肿瘤，并特异性分泌IFN-γ(Filaci G，et al. Blood 2006；107：1505-12；Domchek SM et al.Cancer Res，2007 67；10546)。

此外，上皮细胞粘蛋白1(MUC1)是众所周知的肿瘤抗原之一，MUC1是一种跨膜糖蛋白，与正常的上皮细胞比，MUC1显著表达于肿瘤细胞。MUC1在正常上皮细胞或者不表达或仅表达于少量正常上皮，但却异常地或重新高表达于多数腺癌细胞。MUC1的肿瘤相关改变的特点是低糖基化，增加的唾液酸化和改变的碳水化合物核型表达。这些差异是由于它的免疫原性所致，而它被免疫系统识别为肿瘤特异性抗原。因此，它已经被多种免疫疗法作为靶标。最近的研究显示MUC1表达于肿瘤干细胞/祖细胞。我们发现，这些细胞在体内导致MUC1⁺肿瘤，这些肿瘤保持一小群具有肿瘤干/祖细胞特性的MUC1⁺细胞。肿瘤干细胞/祖细胞的MUC1是低糖基化与高度的唾液酸化；肿瘤特异性特征表达于成熟的肿瘤细胞并被肿瘤特异性T细胞与抗体识别。这提示，肿瘤干细胞/祖细胞如同成熟的肿瘤细胞，将是MUC1指导的免疫疗法的靶标(Cancer Res2008；68(7)：2419-26)。

血管生成在原发性实体瘤的生长与转移过程中起主要作用。抗肿瘤血管生成已经被证明是一种有效的抗肿瘤治疗措施。血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(VEGFR)是血管形成的首要的调控子。VEGF通过特异结合到三种不同的细胞膜受体发挥功能，分别是VEGFR1(Flt-1)、VEGFR2(Flk/KDR)和VEGFR3(Flt-4)；其中，VEGFR2有较强的酪氨酸激酶活性，并参与转导主要的血管生成信号。因此，VEGFR2被认为是病理性血管生成的直接的信号转导子，尤其是在肿瘤生成中。而且，VEGFR2与VEGF/Flk自分泌信号回路的过表达已经在多种肿瘤中证明。自分泌回路使肿瘤细胞能够促进自身恶性生物学行为。因此，VEGFR2本身与相关的信号通路被认为是抑制血管生成的关键靶标。VEGFR2含有一个能够结合VEGF配体的胞外结构域，一个跨膜结构域与一段胞内区。越来越多的证据表明，抗小鼠VEGFR2(mFlk-1)胞外区的抗体能够通过阻碍VEGF刺激的内皮细胞在实体瘤与白血病中的增殖来抑制肿瘤生长。在这些研究中，是通过抗体而不是CTL靶向胞外区来对抗肿瘤血管生成。此外，其它的研究提示，对mFlk-1的特异的细胞免疫反应可以通过编码自体VEGFR2胞外区的一段小肽的微基因疫苗来诱导。

优选地，本发明药物的组合施用指的是同时或连续施用。更优选地，所述TLR激动剂与癌症相关抗原能在相同位点或不同位点，在相同时间或彼此间隔不超过48小时的时间内递送或施用。在此，同时或联合施用意为是TLR激动剂和/或癌症相关抗原被(a)同时或(b)在一个疗程的不同时间施用给对象。在后一种情况下，两种药物在足够接近地时间施用以取得预期效果。

本发明的TLR激动剂和/或癌症相关抗原可以是天然蛋白质或重组蛋白质或其抗原性片段，其中所述重组蛋白质可具有与天然产物相同的氨基酸序列或者是衍生自天然产物的氨基酸序列。优选地，所述衍生自天然产物的氨基酸序列具有一些修饰，如改变了药代动力学特性和/或增加了新的生物学特性，但却保留了原有的激活DC的特性或抗肿瘤特性。

在本发明中，所述TLR激动剂和/或癌症相关抗原，或者经TLR激动剂与癌症相关抗原处理的DC可以通过任何合适地方式施用给对象，例如胃肠外施用，如注射，包括静脉注射、瘤内注射、皮内注射、肌肉注射、皮下注射或局部注射。

在本发明的一个优选实验方案中，TLR激动剂与三种抗原联合投予，三种抗原来源于肿瘤干细胞、肿瘤细胞与增殖性内皮细胞。

可用于本发明中的肿瘤细胞相关抗原包括，但不限于端粒酶、Melan-A，tyrosinase，MAGE-1，MAGE-2，MAGE-3，MAGE-4，MAGE-12，MART-1，MUC1，MUC2，MUC3，MUC4，MUC18，CEA，PSA，PSM，α-fetoprotein，gp100，和NY-ESO-1。

可用于本发明中的肿瘤干细胞相关抗原包括，但不限于hTERT和MUC1。

可用于本发明中的增殖性内皮细胞抗原包括，但不限于VEGFR1，VEGFR2，TEM8，FGFR1，Endoglin，Tie2，Angiomotin，survivin和PDGFRbeta。

可用于本发明中的TLR激动剂包括，但不限于TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR5激动剂、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂或非特定TLR激动剂。

上述列举并未详尽陈述，而仅仅是提到可能用在这项发明中的典型抗原。

另外，在本发明的方法中，可使用不同的抗原联合，以在不同的种族、性别、地理分布于疾病不同阶段显示出最佳的功能。在本发明的一个实验方案中，可施用至少两种或更多种不同的抗原与肿瘤来源的DC抑制因子激动剂和TLR激动剂的联合。

在本发明的一些实施方案中，所述TLR激动剂可以是彼此相关联的，或者以多种方式彼此相连。在本发明的另一些实施方案中，所述癌症相关抗原可以是彼此相关联的，或者以多种方式彼此相连的(例如通过接头肽等)。在又一些实施方案中，所述TLR激动剂和所述癌症相关抗原可以彼此相关联的，或者以多种方式彼此相连。。比如，TLR激动剂和/或所述癌症相关抗原可以在空间上彼此接近地进行使用，或作为单一添加物(例如在单一溶液中)来使用。所述相连可以通过许多方式完成，包括缀合、衣壳化、通过附加到同一固体支持物或吸附在同一表面。

对于TLR激动剂与癌症相关抗原的缀合连接可以使用许多方法。连接可能通过共价相互作用和/或非共价相互作用完成，包括高亲和力和/或低亲和力相互作用。TLR激动剂与抗原可通过非共价相互作用连接，包括但不限于离子键按、疏水作用、氢键与范德华力。在胞嘧啶的C-5碱基结合一个具有潜在反应功能的″linker arm″如一个氨基或羧基，对于连接TLR激动剂与癌症相关抗原提供了接头。可以方便地施加另外的用于激活或刺激DC成熟的靶向分子。所述另外的靶向分子对于肿瘤细胞表达的抗原可以是特异性的，其已有描述，比如对于叶酸受体、Her2/neu受体、表皮生长因子受体和CA125肿瘤抗原(Glennie et al.，2000，Immunol.Today 21：403-410)。几种其它的肿瘤抗原可被用作靶标，并且被恶性肿瘤细胞优先表达、唯一表达、过表达或者以突变形式表达。可选择的是，靶向配体对于肿瘤成分而不是恶性肿瘤细胞优先表达的抗原可以是特异性的，尤其是肿瘤血管。alpha v整合素家族、VEGF受体和蛋白聚糖NG2是这种肿瘤血管相关抗原的实例。

实施例

本发明能够通过下面的非限定性实施例得到阐释。

实施例1：联合使用两种TLR激动剂激活DC的协同效应

在本实施例中，测定了联合使用两种TLR激动剂poly I:C和OK432对于人PBMC来源的DC产生促炎细胞因子的作用。来源于人外周血单核细胞(PBMC)的DC的产生按照Schroers等的描述(Schorers et al.，Clinical Can Res，9：4743-4755，2003)。简短地，PBMC通过Ficoll(GIBCO-BRL，Grand Island，N.Y.)密度梯度离心从来源于健康人的肝素(Sigma，St.Louis，MO)抗凝血中分离。培养基中的细胞以5×10⁶/ml的细胞密度被接种于150-mm细胞培养板(U形底96孔板，Costar)。37℃孵育3h后，没有粘附的细胞被移出并以1×10⁶/ml细胞密度冷冻作进一步使用。粘附的血单核细胞在CellGro DC培养基(Freiburg im Breisgau，Germany)内培养，并补充人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF，1,000U/mL，R&D Systems，Minneapolis，Minn.)和白介素4(rhIL-4，1,000U/ml，R&D Systems，Minneapolis，Minn.)。rhGM-CSF和rhIL-4每隔3天补充一次。在第5天，收集PBMC来源的DC，以1×10⁶/ml的细胞密度重新种于12孔细胞培养板做进一步使用。

细胞因子主要参与免疫细胞激活、增殖与分化的调节。最近的研究提示，DC产生的细胞因子是作为触发和激活T、B淋巴细胞的第三信号。我们比较了Poly I:C或临床批准的OK432的对DC成熟的刺激能力。把二者单独或联合检测了OK432与Poly I:C对DC的协同作用和可能在临床的应用。我们发现，人DC当用Poly I:C(Amersham)以20μg/ml的浓度和OK432(Picibanil，Chugai Pharmaceutical Co.Ltd，Tokyo，Japan)以0.1KE(1Klinische Einheit(KE)约等于0.1mg)的浓度刺激48h后，与Poly I:C或OK432单独刺激的DC作比较，增强了促炎细胞因子如IL-12的产生(参见图2)。此外，与Poly I:C或OK432单独刺激的DC相比，用两种TLR激动剂Poly I:C和OK-432与三种癌症相关抗原hTERT(其序列如SEQ ID NO：1的121位至1132位所示)、MUC1(其序列如SEQ ID NO：2的1位至360位所示)和VEGFR2(其序列如SEQ ID NO：3的421位至1356位所示)所组成的AACSc疫苗处理的人DC增强了促炎细胞因子如IL-12的产生(参见图2)。因此，联合使用Poly I:C和OK432对DC激活有协同作用，可用于临床。

实施例2：用AACSc疫苗处理人DC

在本实施例中，本发明人证明通过用AACSc疫苗(即两种TLR激动剂和三种癌症相关抗原)处理人DC可增强激活抗原特异性T细胞的能力。其中，所述两种TLR激动剂是Poly I:C和OK432，所述三种癌症相关抗原是重组hTERT蛋白、人MUC1肽段和人VEGFR2蛋白(其各自序列如实施例1中所述)。

通过体外T细胞致敏试验检测激活人DC并触发抗原特异性CTL的免疫刺激潜力。使用自体T细胞进行体外致敏试验。在12孔细胞培养板(Costar)上，两种TLR激动剂和三种癌症相关抗原在1ml无血清的RPMI1640培养基(Life Technologies，Inc)内将1x10⁶人PBMC来源的DC预处理12h，然后加入1ml含有20％的胎牛血清的DC培养基(CellGenix，Germany)孵育48h。收集转染的DC并用RPMI1640培养基洗涤，随后与自体T细胞以DC：效应细胞为1∶20的比率置于37℃5％CO2的孵箱内、在DC培养基内共培养7天，DC培养基不含有rhIL-4和rhGM-CSF。每隔3天，培养基以50U/mL的浓度补充重组人IL-2(R&DSystems，Minneapolis，Minn.)。T细胞每周用新鲜制备的模拟(PBS)或药物(即两种TLR激动剂或者AACSc(两种TLR激动剂和三种癌症相关抗原))预处理的DC重新刺激。在共培养14天后，收集T细胞以进行不同的检测。共培养物中的抗原特异性激活的T细胞的数量通过ELISPOT试验测定。ELISPOT试验主要按照以前的描述进行(Schroerset al.，Methods Mol Biol，246：451-459，2004；Schorers et al.，Clinical CanRes，9：4743-4755，2003)，稍微进行了修改。简短地讲，MultiScreen-HA培养板(Millipore，Bedford，Mass.)在包被缓冲液(碳酸盐-硼酸盐缓冲液(pH 9.6))中用10μg/mL的抗人IFNgamma.mAb 1-D1K(Mabtech，Stockholm，Sweden)在4℃进行过夜包被。培养板用RPMI 1640和10％人血清在37℃封闭至少2h。刺激的T细胞以每孔2×10⁵种植于培养板，并与已接受辐照的自体DC在存在40μg/mL的hTERT、VEGFR2和MUC1时共培养。培养板在37℃、湿润的5％CO2孵箱内孵育16h，细胞通过用PBS-0.05％Tween 20(Sigma，St.Louis，Mo.)进行六次洗涤移除。生物素化的抗人IFNgamma抗体7-B6-1(Mabtech，Stockholm，Sweden)在PBS-0.5％的人血清内以1μg/ml的浓度添加，培养板在37℃孵育2h。链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶(Mabtech，Stockholm，Sweden)被添加并孵育1h。细胞因子产生细胞在用5-溴-4-氯-3吲哚磷酸(BCIP)与氮蓝四唑(NBT)(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，Md.)反应4分钟后检测。结果被ZellNet公司(New York，N.Y.)以双盲方式使用KSELISPOT 4.3软件在自动ELISPOT系统(Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，N.Y.)评估。图3是ELISPOT试验的检测图，证明经AACSc疫苗预处理的DC增强了TAA(tumor-associated antigen)-特异性人类T淋巴细胞的活化。AACSc疫苗由以下组成：两种TLR激动剂Poly I:C和OK-432与三种癌症相关抗原hTERT、MUC1和VEGFR2(具体序列如实施例1所述)。因此，这些结果提示，用该疫苗预处理DC对于触发抗原特异性CTL反应有强大的免疫刺激潜力。

实施例3：使用经AACSc疫苗预处理的DC激活的T细胞增强了它的肿瘤毒性

在本实施例中，本发明人证明通过用AACSc疫苗(即两种TLR激动剂和三种癌症相关抗原)处理人DC可激活抗原特异性CTL，其中CTL具有溶解肿瘤细胞活性。在与用实施例2中AACSc疫苗(即所述两种TLR激动剂和三种癌症相关抗原)预处理的自体DC共培养后，激活的HLA-A2+T细胞的溶解肿瘤细胞活性通过标准的51Cr释放试验检测。通过流式细胞术显示，人乳腺癌细胞(MDA-MD-231)是HLA-A2+，而pRT-PCR试验也显示了hTERT与MUC1的表达。CTL标准的51Cr释放试验按照以前的Schroers等描述执行(Cancer Res，62：2600-2605.，2002)。DC致敏的T细胞用20μg/mL MUC1和20μg/mL生存素脉冲触发的DC重刺激2h，不进行Ad转染。靶细胞(MCF7，A498，SK-OV3和MDA-MB-231)(ATCC，USA)用[₅₁Cr]-铬酸钠在RPMI 1640培养基中标记1h。靶细胞被转移到圆底96孔培养板(Millipore Corp.，Bedford，MA)中。将多种数量的DC致敏的T细胞加入到终体积为每孔200μL的培养板的孔中，并在37℃孵育4h。在试验结束时，收集上清液(50μL/孔)，并用计数仪计数。裂解细胞的百分比通过如下计算：100x(试验释放-自发释放/最大释放-自发释放)。自发释放与最大释放在分别存在培养基或1％SDS的情况下测定。在这个实施例中，来源于HLA-A2+捐赠者的T细胞在体外用AACSc疫苗(即两种TLR激动剂和三种癌症相关抗原)预处理的DC致敏两周后，被用AACSc疫苗(即两种TLR激动剂和三种癌症相关抗原)预处理的自体DC重刺激，然后和51Cr标记的人肿瘤细胞共孵育。图4是51Cr释放试验的结果图，显示用AACSc疫苗或其他药物预处理的自体DC在体外对HLA-A2+T淋巴细胞敏化两周后，所述HLA-A2+T淋巴细胞对HLA-A2+、hTERT+及MUC1+的人肿瘤细胞MDA-MD-231的溶瘤活性。结果发现，与由TAA(hTERT、MUC1与VEGFR2混合物)、MDA-MB-231肿瘤裂解物、肿瘤裂解物与Poly I:C及OK432的混合物或模拟(PBS)预处理的DC触发的T细胞相比，由AACSc疫苗预处理的DC触发的HLA-A2+T细胞对HLA-A2+和生存素/MUC1+的人肿瘤细胞MDA-MB-231有更强的溶解细胞活性。这些结果证明，本发明的经AACSc疫苗处理的DC对触发抗原特异性抗肿瘤CTL反应有强大的免疫刺激效力，能够杀灭人肿瘤细胞。

实施例4：使用经AACSc疫苗处理的DC所激活的人T细胞增强了抗人血管内皮细胞的细胞毒性

在本实施例中，本发明人证明通过用AACSc疫苗(两种TLR激动剂和三种癌症相关抗原)处理人DC可激活抗原特异性CTL，其中CTL具有溶解VEGFR2+细胞的活性。通过51Cr释放试验测定与AACSc疫苗预处理的DC共培养后激活的HLA-A2+T细胞溶解血管内皮细胞的活性，其中AACSc疫苗如实施例2中所述。原代HLA-A2+人脐静脉内皮细胞(HUVEC)使用标准的实验方法分离(BD Bioscience)。它们的内皮细胞起源通过流式细胞术测定，被证明是CD31抗原、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)和内皮细胞系细胞标记阳性。通过pRT-PCR测定，增殖的HUVEC细胞表达VEGFR2。图5是51Cr释放试验的结果图，显示用AACSc疫苗或其他药物预处理的自体DC在体外对HLA-A2+T淋巴细胞敏化两周后，所述HLA-A2+T淋巴细胞对HLA-A2+与VEGFR2+人类血管内皮细胞的溶瘤活性。结果发现，与经TAA(hTERT、MUC1与VEGFR2混合物)、MDA-MB-231肿瘤裂解物、肿瘤裂解物与Poly I:C及OK432的混合物或模拟(PBS)转染预处理的DC触发的T细胞相比，由所述AACSc疫苗预处理的DC触发的HLA-A2+T细胞对HLA-A2+人脐静脉内皮细胞有更强的溶解细胞活性。本发明的经AACSc疫苗处理的DC对触发抗原特异性抗肿瘤CTL反应有强大的免疫刺激效力，能够杀灭增殖的人血管内皮细胞。

在本申请中，多个出版物在括号中被引用。由此，这些出版物的公开以整体通过引用并入本申请，以更完整的描述与本发明相关的技术的状态。

尽管通过公开的实施方案描述了本发明，本领域技术人员应当容易理解，具体的实施例和上文详述的研究只是对本发明的举例说明。应当理解在不脱离本发明精神的情况下，可作出各种修改。因此，本发明只受所附权利要求的限制。

Claims (20)

1.一种药物组合物，其包含至少一种TLR激动剂和至少一种癌症相关抗原。

2.根据权利要求1的药物组合物，其包含至少两种、至少三种、至少四种或至少五种TLR激动剂，例如包含两种TLR激动剂。

3.根据前述任一项权利要求的药物组合物，其中所述至少一种TLR激动剂选自：TLR1激动剂、TLR2激动剂、TLR3激动剂(例如Poly I:C)、TLR4激动剂(例如单磷酰脂A)、TLR5激动剂(例如鞭毛蛋白)、TLR6激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂、TLR9激动剂(例如非甲基化CpG寡核苷酸)、非特定TLR激动剂(例如OK-432)和其任意组合。

4.根据前述任一项权利要求的药物组合物，其中所述至少一种TLR激动剂至少包括TLR3激动剂和非特定TLR激动剂，优选至少包括PolyI:C和OK-432。

5.根据前述任一项权利要求的药物组合物，其中所述药物组合物包含至少两种、至少三种、至少四种或至少五种癌症相关抗原，优选至少三种癌症相关抗原。

6.根据前述任一项权利要求的药物组合物，其中所述至少一种癌症相关抗原包括至少一种来源于肿瘤细胞的癌症相关抗原和至少一种来源于增生的肿瘤相关内皮细胞的癌症相关抗原，更优选地所述至少一种来源于肿瘤细胞的癌症相关抗原包括至少一种来源于肿瘤干细胞的癌症相关抗原。

7.根据权利要求6的药物组合物，其中所述来源于肿瘤细胞的抗原选自：端粒酶逆转录酶、黑素细胞分化抗原A、酪氨酸酶、黑色素瘤抗原-1、黑色素瘤抗原-2、黑色素瘤抗原-3、黑色素瘤抗原-4、黑色素瘤抗原-12、黑色素瘤相关抗原1、粘蛋白1(MUC1)、粘蛋白2、粘蛋白3、粘蛋白4、粘蛋白18、癌胚抗原、前列腺特异性抗原、前列腺特异性膜抗原、α-胎球蛋白、gp100抗原、NY-ESO-1抗原及其任意抗原性片段。

8.根据权利要求6的药物组合物，其中所述来源于肿瘤干细胞的抗原选自：端粒酶逆转录酶、粘蛋白1及其任意抗原性片段。

9.根据权利要求6的药物组合物，其中所述来源于增生的肿瘤相关内皮细胞的抗原选自：血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、肿瘤内皮标记物8、成纤维细胞生长因子受体1、内皮素、Tie2受体、血管动蛋白、生存素、血小板源生长因子受体β及其任意抗原性片段。

10.根据前述任一项权利要求的药物组合物，其中所述癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、子宫内膜癌、胃癌、小肠癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺肿瘤、卵巢癌、睾丸癌、头颈癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、眼癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤以及转移癌。

11.根据前述任一项权利要求的药物组合物，其中所述至少一种癌症相关抗原包括至少两种来源于肿瘤干细胞的癌症相关抗原和至少一种来源于增生的肿瘤相关内皮细胞的抗原，例如包括端粒酶逆转录酶或其任意抗原性片段、粘蛋白1或其任意抗原性片段和血管内皮生长因子受体2或其任意抗原性片段。

12.经权利要求1-10中任一项所述药物组合物处理的树突状细胞。

13.药盒，其包含根据权利要求1-11任一项的药物组合物和/或经根据权利要求1-11任一项的药物组合物处理的树突状细胞。

14.治疗性癌症疫苗，其包含根据权利要求1-11任一项的药物组合物和/或经过根据权利要求1-11任一项的药物组合物处理的树突状细胞。

15.一种获得树突状细胞的方法，其包括：用权利要求1-11中任一项所述药物组合物处理树突状细胞。

16.一种用于治疗癌症的方法，其包括：

将治疗有效量的根据权利要求1-11任一项的药物组合物和/或根据权利要求12所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

17.一种用于刺激免疫系统的方法，其包括：

将治疗有效量的根据权利要求1-11任一项的药物组合物和/或根据权利要求12所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

18.一种用于改善对象中针对癌症的免疫应答的方法，其包括：

将治疗有效量的根据权利要求1-11任一项的药物组合物和/或根据权利要求12所述经处理的树突状细胞施用给有此需要的对象。

19.根据权利要求16或18的方法，其中所述癌症选自：黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肺癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、子宫内膜癌、胃癌、小肠癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺肿瘤、卵巢癌、睾丸癌、头颈癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、眼癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤以及转移癌。

20.根据权利要求12-19任一项的方法，其中所述树突状细胞为异体或自体树突状细胞，优选自体树突状细胞。

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