JPWO2016152767A1 - 免疫賦活活性を有するCpGスペーサーオリゴヌクレオチド含有複合体及びその用途 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサーを介して結合している、オリゴデオキシヌクレオチド。
[2]ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、10ヌクレオチド以上の長さであり、1または複数個の非メチル化CpGモチーフを含む、[1]に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[3]ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列TCGAまたはTCGTを含む、[1]又は[2]に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[4]ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなる、[1]〜[3]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[5]オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合で置換されている、[1]〜[4]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[6]オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、[5]に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[7]ポリデオキシアデニル酸の長さが、20〜60ヌクレオチド長である、[1]〜[6]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
[8]スペーサーが、式(A)
[9]スペーサーが、式(A1)
[10]スペーサーが、式
[11][1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−1, 3−グルカンを含有する複合体。
[12]β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである[11]に記載の複合体。
[13]β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン又はスクレログルカンである[12]に記載の複合体。
[14]下記(i)に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び(ii)に記載のβ−1, 3−グルカンからなる[11]に記載の複合体。
(i)配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサーを介して20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されているオリゴデオキシヌクレオチド
(ii)レンチナン又はシゾフィラン
[15]配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
[16]配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜50ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
[17]配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜45ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
[18]配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に40ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
[19]三重螺旋構造状のものである、[11]〜[18]のいずれかに記載の複合体。
[20]B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性を有する、[11]〜[19]のいずれかに記載の複合体。
[21][1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[11]〜[20]のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
[22]ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、[21]に記載の医薬組成物。
[23]ウイルス感染症の予防又は治療のための、[22]に記載の医薬組成物。
[24]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である[23]に記載の医薬組成物。
[25][11]〜[20]のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び/又はII型インターフェロン産生誘導剤。
[26][1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[11]〜[20]のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
[27]ワクチンアジュバントである、[26]の免疫賦活剤。
[28][1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[11]〜[20]のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
[29]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である[28]に記載の予防又は治療剤。
[30]医薬組成物の製造のための、[1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[11]〜[20]のいずれかに記載の複合体の使用。
[31]医薬組成物が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための医薬組成物である、[30]に記載の使用。
[32]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、[31]に記載の使用。
[33][1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[11]〜[20]のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における疾患の治療もしくは予防のための方法。
[34]疾患が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症である、[33]に記載の方法。
[35]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、[34]に記載の方法。
[36]温血動物がヒトである、[33]〜[35]のいずれかに記載の方法。
[37][1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[11]〜[20]のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における防御免疫反応を誘導する方法。
[38]ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の治療又は予防において使用するための、[1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[11]〜[20]のいずれかに記載の複合体。
[39]ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、[38]に記載のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体。
[40](a)[1]〜[10]のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは[11]〜[20]のいずれかに記載の複合体、及び
(b) 抗原
を含む、医薬組成物。
[41]該抗原に対する免疫反応を誘導するための、[40]に記載の組成物。
[42]抗原が病原体由来の抗原である、[41]に記載の組成物。
[43]病原体の感染症の予防又は治療用である、[42]に記載の組成物。
[44]病原体がウイルスである、[43]に記載の組成物。
[45]ウイルスがRSウイルス又はインフルエンザウイルスである、[44]に記載の組成物。
本発明は、K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸(dA)を含む、オリゴデオキシヌクレオチド(以下、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドと称する。)を提供するものである。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドにはリン酸ジエステル結合が修飾(例えば、一部又は全てのリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合により置換)されているものを含む。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチドは薬学的に許容可能な塩を含む。
なお、本明細書においてオリゴデオキシヌクレオチドとODNは同義である。また、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)」と、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)残基」とは末尾の用語「残基」の有無に関わらず同義であり、交換可能に用いられる。更に、ポリデオキシアデニル酸とポリデオキシアデノシン酸(残基)は同義である。用語「残基」は、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するが、本明細書中、「ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)」が、独立した分子を意味するか、より大きな分子量の化合物の部分構造を意味するかは、当業者であれば、文脈から容易に理解可能である。「ポリデオキシアデニル酸」等、本発明のオリゴデオキシヌクレオチドに含まれる他の部分構造に関する用語についても、同様である。
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−1,3−グルカンを含有する複合体(以下、本発明の複合体と称する。)を提供するものである。
本発明は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を含む、医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は上記本発明の複合体を常套手段に従って製剤化することにより得ることができる。本発明の医薬組成物は、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体と薬理学的に許容され得る担体を含む。また、本医薬組成物は抗原を更に含んでいても良い。このような医薬組成物は、経口又は非経口投与に適する剤形として提供される。
本発明のオリゴデオキシヌクレオチド及び複合体は、優れた免疫賦活活性を有するので、本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体及び医薬組成物は、免疫賦活剤として用いることができる。本発明のオリゴデオキシヌクレオチド、複合体又は医薬組成物を哺乳動物(ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等)に投与することにより、該哺乳動物における免疫反応を惹起することができる。特に、本発明の複合体は、D型CpG ODNの活性特性を有し、末梢血単核球を刺激して、I型インターフェロン(Pan-IFN-α、IFN-α2等)及びII型インターフェロン(IFN-γ)の両方を大量に産生させるので、I型インターフェロン産生誘導剤、II型インターフェロン産生誘導剤、I型及びII型インターフェロン産生誘導剤として有用である。I型及びII型インターフェロンの両方の産生を誘導することから、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、I型及びII型インターフェロンのいずれか一方又は両方が有効な疾患の予防又は治療に有用である。I型インターフェロンが有効な疾患としては、ウイルス感染症(例えば、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、RSウイルス、インフルエンザウイルス等)、癌等を挙げることが出来る。II型インターフェロンが有効な疾患としては、アレルギー疾患、細胞内寄生性の原虫(リーシュマニア等)や細菌(リステリア、結核菌等)等の感染症等を挙げることが出来る。RSウイルスやインフルエンザウイルスを含む急性ウイルス感染症に対しては、I型インターフェロン及びII型インターフェロン共に、ウイルス排除に関する免疫応答を高めるので、本発明の複合体及びこれを含有する医薬組成物は、急性ウイルス感染症に対する有効性が期待できる。
[実施例1−3及び参考例1]
実施例のK3-spacer及び参考例K3-dA40の合成
実施例のK3-spacer及び参考例K3-dA40は、表2に示し、以下のような方法で合成した。
K3-dA40とSPGとの複合体(K3-SPG複合体)の調製
[その1]
7.22 mgのK3-dA40を水(3.7mL)に溶解した。SPG(三井製糖)15 mgを0.25 N NaOH (1 mL)に溶解した。1 mLの330 mM NaH2PO4をDNA溶液に加え、次にSPG溶液をDNA/NaH2PO4溶液に加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した。モル比(MSPG/MDNA)は、0.27に固定した。複合体の形成は、マイクロチップ電気泳動装置(SHIMADZU:MultiNA)によって確認した。
SPG(三井製糖)を15mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-dA40は100μMとなるように、注射用水に溶解した。SPG 8.12mgとK3-dA40 4.17mgを混合し、続いて、SPGと同体積(541.4μl)の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-dA40の高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。K3-dA40の保持時間が30.35minであったのに対し、K3-SPG複合体の保持時間は21.99minであった。また、そのピークシフトは100%であったことから、K3-SPG複合体の形成が確認された(System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer: 100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃)。
K3-spacerとLNTとの複合体(K3-spacer-LNT複合体)の調製
レンチナン(LNT:味の素株式会社、ロット番号:2D8X1)を50mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-spacerは100μMとなるように、注射用水に溶解した。LNT水溶液とK3-spacer水溶液を表4に示す比率で混合し、続いて、添加したLNTと同体積の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した(以後、K3-spacer-LNTと表記する)。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-spacerの高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。
分析条件A
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GF7M-HQ (Shodex) 2本連結、Flow rate:0.8mL/min、Buffer:10mM EDTA PBS, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件B
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件C
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:20% Acetonitrile, 80mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
K3-spacerとSPGとの複合体(K3-spacer-SPG複合体)の調製
シゾフィラン(SPG:三井製糖株式会社)を15mg/mLとなるように、0.25N NaOHに溶解し、室温で一晩放置した。K3-spacerは100μMとなるように、注射用水に溶解した。SPG水溶液とK3-spacer水溶液を表6に示す比率で混合し、続いて、添加したSPGと同体積の330 mM NaH2PO4を加え、4℃にて一晩静置することにより複合体化を完了した(以後、K3-spacer-SPGと表記する)。複合体の形成は、サイズ排除クロマトグラフィーを用い、K3-spacerの高分子量側へのシフトを、260nmにおける吸収をモニタリングすることによって確認した。
分析条件B
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:100mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
分析条件C
System:Agilent 1100series、Column:Asahipak GS-520 HQ (Shodex)−GS-320 HQ (Shodex)、Flow rate:0.5mL/min、Buffer:20% Acetonitrile, 80mM Phosphate Buffer, pH7.4、Temperature:40℃
(1)方法
動物
C57BL/6Jマウスは、日本クレアから購入した。全ての動物実験は、医薬基盤研究所及び大阪大学動物施設の機関ガイドラインに従って実施した。
凍結ヒトPBMCs(Lonza社、Cat# CC-2702、Lot# 0000396517)を融解し、コンプリートRPMI(10% FCS、ペニシリン、及びストレプトマイシンが添加されたRPMI 1640)で1 x 107 個/mlの細胞密度に調製した。U底96 well細胞培養プレートに100 μL/wellで播種し、各ワクチンアジュバントで24時間刺激した。刺激後、培養上清中のpan-IFN-α (Mabtech)およびIL-6 (R&D)をサイトカインELISAによって定量した。図1におけるK3-spacer-LNTに付される#1または#2は、それぞれmG/dAモル比が2.5または3.0の条件で作製されたアジュバント複合体を指す。
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント10 μg(核酸アジュバントでは核酸用量で10 μg)の混合製剤を2週間隔で2回接種した。最終免疫から1週後に末梢血の回収と血清の調製を行い、評価試料とした。血清中のRSV Fワクチン抗原に結合するtotal IgGおよびIgGサブクラスは、ELISA法を用いて測定した。
7週齢のC57BL/6マウスの尾根部に、一匹あたりRSV F抗原0.5 μgと各種アジュバント10 μgを2週間隔で2回免疫した。最終免疫から1週後に脾臓を回収し、脾臓細胞を調製した。96 well培養プレートに播種した脾臓細胞を、RSV F抗原のMHC class I拘束性エピトープペプチド、MHC class II拘束性エピトープペプチド、ワクチン抗原タンパク質それぞれで刺激し、24時間もしくは48時間、培養した。RSV F抗原特異的サイトカイン産生能は、培養上清を試料とし、サイトカインELISA法を用いて評価した。本検討では、Th1型サイトカインであるIFN-g、活性化T細胞から産生されるIL-2、Th2型サイトカインであるIL-5およびIL-13の4種のサイトカインについて評価した。
ヒトPBMCsを用いたK3-spacer-LNT及びK3-SPG複合体の炎症応答誘導能
K3-spacer単独(K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40)、およびK3-spacer-LNT複合体(K3-(S18)-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)2-dA40-LNT#1/#2、K3-(S18)3-dA40-LNT#1/#2)について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図1に示す。K3-spacer単独刺激においては、pan-IFN-a産生は検出限界レベルであるのに対し、K3-spacer-LNT複合体は高いpan-IFN-a誘導能を有していることが示唆された。また、K3-spacer-LNT複合体によるpan-IFN-a誘導能は、K3-SPG複合体に比べて高い結果であった。更に、K3-spacer-LNT複合体によるpan-IFN-a誘導能は、spacerの長さに依存しないことが示唆された。一方、IL-6誘導活性においては、K3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPG複合体は同等であることが認められた。
K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40のK3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体(K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)3-dA40-LNT)、およびK3-SPGの抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図2に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群(F)に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer単独(F+K3-(S18)-dA40、F+K3-(S18)2-dA40、F+K3-(S18)3-dA40)、K3-spacer-LNT複合体(F+K3-(S18)2-dA40-LNTおよびF+K3-(S18)3-dA40-LNT)およびK3-SPG複合体(F+K3-dA40-SPG)とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム(F+Alum)を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群(F)に比べて高いことが認められ、K3-spacer-LNT複合体においてもリン酸アラムと同等のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、K3-spacer単独、K3-spacer-LNT複合体、K3-SPG複合体を接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い増強活性が示された。以上の結果から、(S18)、(S18)2、(S18)3スペーサーを含むK3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体と同様のTh1型アジュバント活性を示す一方、リン酸アラムと同様のTh2型の免疫増強活性も有することが示唆された。
K3-spacer単独(K3-(S18)-dA40、K3-(S18)2-dA40、K3-(S18)3-dA40)、K3-spacer-LNT複合体(K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S18)3-dA40-LNT)、およびK3-SPG複合体のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図3に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、K3-spacer単独に比べて、K3-spacer-LNT複合体(F+K3-(S18)-dA40-LNT、 F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT)において高く、K3-LNT複合体とK3-SPG複合体(F+K3-dA40-SPG)の活性は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント接種群(F+Alum)では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-13産生増強効果は、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められ、Th1型アジュバントであるK3-SPG接種群では低い結果となった。興味深いことに、K3-spacer-LNT複合体(F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S18)3-dA40-LNT)において、同じTh1型アジュバントであるK3-SPG複合体接種群(F+K3-dA40-SPG)に比べて高いIL-13産生増強効果を示し、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群と同等であった。このことから、K3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体が有する高いTh1応答増強効果に加え、Th2応答増強能も有することが示唆された。
K3-spacer-LNT複合体(K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT)およびK3-SPG複合体について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図4に示す。K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体に比べて、高いpan-IFN-a誘導能を有することが示唆された。一方、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体においては、pan-IFN-a誘導能は検出限界以下であった。IL-6産生量においては、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTを除くK3-spacer-LNT複合体において、K3-SPG複合体と同等の誘導活性が認められた。
K3-spacer-LNT複合体(K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT)およびK3-SPG複合体の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図5に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群(F)に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer-LNT複合体(F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT)およびK3-SPG複合体(F+K3-SPG)とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム(F+Alum)を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群(F)に比べて高いことが認められ、K3-spacer-LNT複合体においてもリン酸アラムと同等以上のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPGを接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い結果が示された。以上の結果から、K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNTおよびK3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等の抗体増強活性を有している可能性が示唆された。
K3-LNT複合体(K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNT)およびK3-SPG複合体のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図6に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群(F)に比べて、K3-spacer-LNT複合体(F+K3-(S18)2-dA30-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)3-dA40-LNT、F+K3-(C12)2-dA40-LNT、F+K3-(C12)3-dA40-LNT)およびK3-SPG複合体(F+K3-dA40-SPG)で高い結果となった。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント投与群(F+Alum)では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-13産生増強効果は、抗原単独投与群に比べて、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められ、Th1型アジュバントであるK3-SPG接種群では低い結果となった。K3-spacer-LNT複合体においては、同じTh1型アジュバントであるK3-SPG接種群(F+K3-dA40-SPG)に比べて高いIL-13産生増強効果を示し、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群と同等であった。このことから、K3-(S18)2-dA30-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S12)3-dA40-LNT、K3-(C12)2-dA40-LNT、K3-(C12)3-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等のTh1およびTh2サイトカイン産生増強活性を有することが示唆された。
K3-spacer-LNT複合体(K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT)およびK3-SPG複合体について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図7に示す。全てのK3-spacer-LNT複合体において、K3-SPG複合体に比べて、高いpan-IFN-a誘導能を有することが示唆された。一方、IL-6産生量は、K3-spacer-LNT複合体およびK3-SPG複合体で、同等の誘導活性が認められた。
K3-spacer-LNT複合体(K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT)の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図8に示す。RSV F抗原特異的なtotal IgG誘導は、RSV F抗原単独接種群(F)に比べて、アジュバント添加によって増強されており、K3-spacer-LNT複合体(F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT)とリン酸アラム(F+Alum)のアジュバント効果は同等である可能性が示唆された。Th2型アジュバントであるリン酸アラム(F+Alum)を接種したマウス群では、IgG1サブクラス誘導能がRSV F抗原単独接種群(F)に比べて高いことが認められ、最もspacer長が長いK3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT複合体投与群(F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT)においてもリン酸アラムと同等のIgG1誘導能が認められた。一方、IgG2cサブクラス抗体において、全K3-spacer-LNT複合体を接種した免疫群では、リン酸アラムに比べて高い結果が示された。以上の結果から、K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNTのK3-spacer-LNT複合体は、同等のTh1増強活性を有しており、中でもK3-(S18)2-dA35-LNTおよびK3-(S18)2-dA40-LNTは高いTh2増強活性も有していることが示唆された。
K3-spacer-LNT複合体(K3-(S18)-dA35-LNT、K3-(S18)-dA40-LNT、K3-(S18)2-dA35-LNT、K3-(S18)2-dA40-LNT、K3-(S12)-dA35-LNT、K3-(S12)-dA40-LNT、K3-(S12)2-dA35-LNT、K3-(S12)2-dA40-LNT、K3-(S9)-dA35-LNT、K3-(S9)-dA40-LNT、K3-(S9)2-dA35-LNT、K3-(S9)2-dA40-LNT)のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図9に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群(F)に比べて、K3-spacer-LNT複合体(F+K3-(S18)-dA35-LNT、F+K3-(S18)-dA40-LNT、F+K3-(S18)2-dA35-LNT、F+K3-(S18)2-dA40-LNT、F+K3-(S12)-dA35-LNT、F+K3-(S12)-dA40-LNT、F+K3-(S12)2-dA35-LNT、F+K3-(S12)2-dA40-LNT、F+K3-(S9)-dA35-LNT、F+K3-(S9)-dA40-LNT、F+K3-(S9)2-dA35-LNT、F+K3-(S9)2-dA40-LNT)で高い結果となった。Th2型アジュバントであるリン酸アラムアジュバント投与群(F+Alum)では、IFN-g産生はいずれの刺激においても検出限界以下であった。一方、IL-5およびIL-13産生増強効果は、抗原単独投与群(F)に比べて、Th2型アジュバントであるリン酸アラム接種群で高く認められた。K3-spacer-LNT複合体においては、K3-(S18)2-dA40-LNT投与群(F+K3-(S18)2-dA40-LNT)で高いIL-5およびIL-13産生増強効果を示した。以上の結果から、K3-spacer-LNT複合体は、K3-SPG複合体と同等の自然免疫活性化能とTh1増強活性を有しており、その中でも、K3-(S18)2-dA40-LNT においては、高いTh2増強活性も有することが示唆された。
試験例1と同様にして、次の評価を行った。
ヒトPBMCsを用いたK3-spacer-SPG複合体の炎症応答誘導能の検討
K3-spacer-SPG複合体(K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG)について、ヒトPBMCにおける炎症応答誘導能を検討した。結果を図11に示す。K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG複合体において、pan-IFN-a、IL-6誘導能を有することが示唆された。一方、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG複合体において、pan-IFN-a、IL-6の誘導活性は検出限界レベルであった。
K3-spacer-SPG複合体(K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG)の抗体産生増強活性を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス血清中抗体価を計測することによって評価した。結果を図12に示す。RSV F抗原特異的な抗体誘導は、RSV F抗原単独接種群(F)に比べて、K3-spacer-SPG複合体投与群(F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG)で増強されていることが明らかとなった。
K3-spacer-SPG複合体(K3-(S9)-dA40-SPG、K3-(S9)2-dA40-SPG、K3-(S12)-dA40-SPG、K3-(S12)2-dA40-SPG、K3-(S18)-dA40-SPG、K3-(S18)2-dA40-SPG、K3-(C12)2-dA40-SPG、K3-(C12)3-dA40-SPG)のRSV F抗原特異的サイトカイン産生誘導能を、RSV Fサブユニットワクチンを免疫したマウス脾臓細胞から抗原刺激に応じて産生されるサイトカインを計測することによって評価した。結果を図13に示す。RSV F抗原特異的なIFN-g産生誘導とIL-2産生誘導の増強効果は、抗原単独投与群(F)に比べて、K3-spacer-SPG複合体(F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG)で高い結果となった。一方、IL-5は抗原単独投与群(F)に比べて同等以下の誘導レベルであったが、IL-13産生増強効果は、抗原単独投与群(F)に比べ、K3-spacer-SPG複合体(F+K3-(S9)-dA40-SPG、F+K3-(S9)2-dA40-SPG、F+K3-(S12)-dA40-SPG、F+K3-(S12)2-dA40-SPG、F+K3-(S18)-dA40-SPG、F+K3-(S18)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)2-dA40-SPG、F+K3-(C12)3-dA40-SPG)において高い結果となった(図13)。
Claims (45)
- ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチド及びポリデオキシアデニル酸を含む、オリゴデオキシヌクレオチドであって、ポリデオキシアデニル酸が、ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサーを介して結合している、オリゴデオキシヌクレオチド。
- ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、10ヌクレオチド以上の長さであり、1または複数個の非メチル化CpGモチーフを含む、請求項1に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列TCGAまたはTCGTを含む、請求項1又は2に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- ヒト化K型CpGオリゴデオキシヌクレオチドが、配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなる、請求項1〜3のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の一部又は全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項1〜4のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- オリゴデオキシヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されている、請求項5に記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- ポリデオキシアデニル酸の長さが、20〜60ヌクレオチド長である、請求項1〜6のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
- スペーサーが、式(A)
- スペーサーが、式(A1)
- スペーサーが、式
- 請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド及びβ−1, 3−グルカンを含有する複合体。
- β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン、スクレログルカン、カードラン、パーキマン、グリホラン、又はラミナランである、請求項11に記載の複合体。
- β−1, 3−グルカンがレンチナン、シゾフィラン又はスクレログルカンである請求項12に記載の複合体。
- 下記(i)に記載のオリゴデオキシヌクレオチド、及び(ii)に記載のβ−1, 3−グルカンからなる、請求項11に記載の複合体。
(i)配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側にスペーサーを介して20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が結合し、かつリン酸ジエステル結合の全てがホスホロチオエート結合により置換されているオリゴデオキシヌクレオチド
(ii)レンチナン又はシゾフィラン - 配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に20〜60ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
- 配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜50ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
- 配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に30〜45ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
- 配列番号1で表されるヌクレオチド配列からなるオリゴデオキシヌクレオチドの3’側に40ヌクレオチド長のポリデオキシアデニル酸が式
- 三重螺旋構造状のものである、請求項11〜18のいずれかに記載の複合体。
- B細胞を活性化してIL-6を産生させる活性、及び樹状細胞を活性化してIFN-αを産生させる活性を有する、請求項11〜19のいずれかに記載の複合体。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項11〜20のいずれかに記載の複合体を含む、医薬組成物。
- ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための、請求項21に記載の医薬組成物。
- ウイルス感染症の予防又は治療のための、請求項22に記載の医薬組成物。
- ウイルス感染症がRSウイルス、又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項23に記載の医薬組成物。
- 請求項11〜20のいずれかに記載の複合体を含む、I型及び/又はII型インターフェロン産生誘導剤。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項11〜20のいずれかに記載の複合体を含む、免疫賦活剤。
- ワクチンアジュバントである、請求項26に記載の免疫賦活剤。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項11〜20のいずれかに記載の複合体を含む、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療剤。
- ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である請求項28に記載の予防又は治療剤。
- 医薬組成物の製造のための、請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項11〜20のいずれかに記載の複合体の使用。
- 医薬組成物が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の予防又は治療のための医薬組成物である、請求項30に記載の使用。
- ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項31に記載の使用。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項11〜20のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における疾患の治療もしくは予防のための方法。
- 疾患が、ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症である、請求項33に記載の方法。
- ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項34に記載の方法。
- 温血動物がヒトである、請求項33〜35のいずれかに記載の方法。
- 請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項11〜20のいずれかに記載の複合体の薬理的有効量を温血動物に投与することを含む、当該温血動物における防御免疫反応を誘導する方法。
- ウイルス感染症、癌、アレルギー疾患、細胞内寄生性原虫又は細菌感染症の治療又は予防において使用するための、請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項11〜20のいずれかに記載の複合体。
- ウイルス感染症がRSウイルス又はインフルエンザウイルス感染症である、請求項38に記載のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体。
- (a)請求項1〜10のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド、或いは請求項11〜20のいずれかに記載の複合体、及び
(b) 抗原
を含む、医薬組成物。 - 該抗原に対する免疫反応を誘導するための、請求項40に記載の組成物。
- 抗原が病原体由来の抗原である、請求項41に記載の組成物。
- 病原体の感染症の予防又は治療用である、請求項42に記載の組成物。
- 病原体がウイルスである、請求項43に記載の組成物。
- ウイルスがRSウイルス又はインフルエンザウイルスである、請求項44に記載の組成物。
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