TWI701047B - 具有免疫賦活活性之核酸多醣複合體作為抗腫瘤藥之應用 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種以單劑之形式使用之抗癌劑。詳細而言，本發明提供一種包含複合體之抗癌劑，該複合體包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖。較佳為以如下情況為特徵：抗癌劑係於無癌抗原之情況下進行投予。

Description

具有免疫賦活活性之核酸多醣複合體作為抗腫瘤藥之應用

本發明係關於一種新穎之癌症治療。

CpG寡聚核苷酸(CpG ODN，CpG Oligonucleotide)係含有免疫賦活性之CpG模體之較短(約20個鹼基對)之單鏈之合成DNA(Deoxyribonucleic Acid，去氧核糖核酸)片段，且係類Toll受體9(TLR9，Toll-like receptor 9)之強力之促效劑，並且係作為將樹狀細胞(DCs，Dendritic Cells)及B細胞活化，產生I型干擾素(IFNs，Interferon type I)及炎症性細胞激素(非專利文獻1、2)，包括細胞毒殺性T淋巴球(CTL，Cytotoxic T Lymphocyte)反應在內之Th1型之體液性及細胞性免疫反應之佐劑而發揮作用(非專利文獻3、4)。因此，CpG ODN開始被視為針對感染症、癌、哮喘及花粉症具有可能性之免疫治療劑(非專利文獻2、5)。

存在骨架序列及免疫賦活特性分別不同之至少4個類型之CpG ODN(非專利文獻6)。D型(亦稱為A型)CpG ODN典型而言包含磷酸二酯(PO，Phosphodiester)骨架、硫代磷酸酯(PS，Phosphorothioate)聚G尾(Poly G tail)及1個迴文結構之CpG模體，將類漿細胞DCs(pDCs，Plasmacytoid dendritic cells)活化而產生大量IFN-α，但無法誘導pDC成熟化及B細胞活化(非專利文獻7、8)。其他3個類型之ODN包含PS骨架。K型(亦稱為B型)CpG ODN典型而言含有非迴文結構之複數個CpG模體，強力地將B細胞活化而產生IL-6，將pDCs活化而使之成熟化， 但幾乎不產生IFN-α(非專利文獻8、9)。近年來，業界開發出之C型及P型之CpG ODN分別含有1個及2個迴文結構CpG序列，兩者均可如K型般使B細胞活化，且如D型般使pDCs活化，但與P型CpG ODN相比，C型CpG ODN更弱地誘導IFN-α產生(非專利文獻10-12)。於專利文獻1中，記載有大量優異之K型CpG ODN。

揭示有D型及P型CpG ODN分別形成如下高次結構：形成稱為G-tetrads(G-四聯體)之平行四鏈結構之胡格斯丁鹼基對(Hoogsteen base pair)、及順式迴文結構部位與反式迴文結構部位間之華特生-克里克(Watson-Crick)鹼基對，該等對於因pDCs所引起之強力之IFN-α產生而言為必須(非專利文獻12~14)。此種高次結構似乎為向早期內體(early endosome)中之定位或經由TLR9之訊息傳遞所必須，但該等受到產物之多樣性及沈澱之影響，結果妨礙其臨床應用(非專利文獻15)。因此，通常僅K型及C型CpG ODN可用作人類用之免疫治療劑及疫苗佐劑(非專利文獻16及17)。關於K型CpG ODN，於人類臨床試驗中係提高以感染症及癌為標靶之疫苗之免疫原性(immunogenicity)(非專利文獻6、16)，但為了實現最佳之佐劑效果，需要抗原與K型CpG ODN間之化學性及物理性之連結。該等結果顯示，4個類型(K、D、P、及C)之CpG ODN存在優點及缺點，而期待開發出在不進行聚集之情況下將B細胞及pDCs兩者活化之「一體化(all in one)」之CpG ODN。

作為來自裂褶菌(Schizophyllum commune)之可溶性β-1,3-葡聚糖之裂褶菌多糖(SPG(Schizophyllan))係作為針對宮頸癌患者之放射線療法之賦活藥而於最近30年於日本被許可之醫藥(非專利文獻18)。同樣地，作為來自香菇之可溶性β-1,3-葡聚糖之香菇多糖(LNT，Lentinan)係於1985年被認可之醫藥，藉由與氟嘧啶系藥劑併用而對無法手術及胃癌復發患者使用(非專利文獻19、20)。揭示有β-1,3-葡聚糖會與聚 去氧腺苷酸(dA)形成三股螺旋結構之複合體(非專利文獻21)。

專利文獻2~4中揭示有，包含裂褶菌多糖之β-1,3-葡聚糖與核酸(基因)之水溶性複合體作為基因載體之用途。該等文獻中記載有藉由形成該複合體，可提高基因之反義作用及對核酸分解酵素(核酸酶)之耐性作用。

專利文獻5中揭示有，藉由將具有β-1,3-鍵之多糖類用作載體(轉染劑)，可提高包含CpG序列且將磷酸二酯鍵取代為硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵之免疫刺激性寡聚核苷酸之作用。

專利文獻6中記載有一種免疫刺激性複合體，其特徵在於：包含免疫刺激性寡聚核苷酸、及具有長鏈之β-1,6-葡糖苷鍵側鏈之β-1,3-葡聚糖。

本發明者等人先前揭示有：與SPG進行複合體化而成之連結有於5'末端具有磷酸二酯鍵之聚(dA)的小鼠及人類化之CpG ODN會增強細胞激素產生，而作為流行性感冒疫苗佐劑或Th2細胞相關疾病之預防或治療劑發揮作用(非專利文獻22、23、專利文獻7)。若於K型及D型之各自CpG之5'末端附加聚(dA)，與SPG形成複合體，則分別維持K型及D型之特性，並且其活性得以增強。然而，難以實現更有效、成本效益(cost effectiveness)較高、且面向臨床前期及臨床開發之CpG-SPG複合體之高產率。近年來，揭示有若使CpG ODN與具有硫代磷酸酯鍵之聚(dA)進行連結，則複合體之形成上升至將近100%(非專利文獻24)。然而，尚未進行用於對最佳之人類化CpG序列進行鑑定，使用以獲得4個類型之CpG ODN之「一體化」活性的因子進行最佳化之周密試驗。

專利文獻8中揭示有，抗原/CpG寡聚核苷酸/β-1,3-葡聚糖系之三元複合體之製造方法。

作為類Toll受體9(TLR9)之配位子的合成核酸CpG寡聚去氧核苷 酸(CpG ODN)具有較強之自然免疫活化能力，而作為疫苗佐劑備受期待。又，由於在以單劑形式投予時具有抗腫瘤活性，故而CpG ODN亦作為針對癌之免疫治療劑而備受期待。然而，先前之CpG ODN雖然具有抗腫瘤活性，但僅可藉由向腫瘤直接投予才會發揮效果，認為難以應用於臨床。實際上，認為難以於臨床現場向初始階段之腫瘤直接投予藥劑。又，於深部亦需要外科處理，其障礙較高。

最近，本發明者等人進行有利用多糖之β-葡聚糖包裹CpG ODN之新穎TLR9之配位子(K3-SPG)之開發(PCT申請(PCT/JP2014/074835)))。K3-SPG不會形成凝聚塊，與先前型之CpG ODN相比，強力地將自然免疫活化，同時藉由使用小鼠之實驗而顯示出較強之佐劑效果。進而明確K3-SPG不僅對小鼠，亦對食蟹獼猴誘導較強之後天性免疫(acquired immunity)，成功克服了以往所擔憂之小鼠與靈長類體內之反應性之差異。

如此，該CpG ODN作為佐劑之用途雖然備受期待，但尚不明確是否可單獨用作醫藥。

就癌治療而言，自1991年鑑定出細胞毒殺性T細胞所識別之癌相關抗原並進行報告以來(非專利文獻25：van der Bruggen et al.Science(New York,N.Y.)254,1643-1647(1991))，非常多之癌相關抗原以分子水平得以鑑定，而實現以該等作為標靶之癌免疫療法之臨床應用(非專利文獻26：Jager,E.,et al.The Journal of experimental medicine 187,265-270(1998)；非專利文獻27：Jager,D.et al.Journal of clinical pathology 54,669-674(2001).；非專利文獻28：Imai,K.,et al.British journal of cancer 104,300-307(2011)；非專利文獻29：Kang,X.,et al.The Journal of Immunology 155,1343-1348(1995))。尤其是令人關注之癌免疫療法，係於2010年4月針對攝護腺癌患者，首次受到美國食品及藥物管理局(FDA，Food and Drug Administration)之認 可，使用自體末梢血液之抗原呈現細胞之癌疫苗Provenge(非專利文獻30：Cancer vaccine approval could open floodgates.Nature medicine 16,615-615(2010)；非專利文獻31：Higano,C.S.,et al.Cancer 115,3670-3679(2009))。其後，關於針對作為T淋巴細胞之活化之抑制性分子的細胞毒殺性T淋巴球抗原4(CTLA-4，Cytotoxic T Lymphocyte Antigen 4)之抑制性抗體伊匹單抗(ipilimumab)，2011年5月於美國針對惡性黑色素瘤患者被認可(非專利文獻32：Phan,G.Q.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100,8372-8377(2003)；非專利文獻33：Camacho,L.H.,et al.Journal of clinical oncology：official journal of the American Society of Clinical Oncology 27,1075-1081(2009)；非專利文獻34：Hodi,F.S.,et al.New England Journal of Medicine 363,711-723(2010))。進而，作為免疫反應抑制因子之PD-1(Programed Cell Death-1，計畫性細胞死亡1)受體抑制劑之nivolumab處於臨床試驗階段(非專利文獻35：AZIJLI,K.,et al.Anticancer Research 34,1493-1505(2014)；非專利文獻36：Okazaki,T.,et al.Nature immunology 14,1212-1218(2013)；非專利文獻37：Ishida,Y.,et al.The EMBO journal 11,3887-3895(1992)；非專利文獻38：Topalian,S.L.,et al.The New England journal of medicine 366,2443-2454(2012))。

對於樹狀細胞有效地引導出抗癌效應之環境之形成，需要顯示出於炎症部之抗癌作用的自然免疫之模式分子(pattern molecule)(非專利文獻39：Chiba,S.,et al.Nature immunology 13,832-842(2012))。上述分子群及與其相關之過程雖未經特定，但樹狀細胞會將CD4、CD8、及NK等淋巴球活化(非專利文獻40：Engelhardt,J.J.,et al.Cancer cell 21,402-417(2012))。腫瘤浸潤巨噬細胞(主要相關巨噬細胞(TAM，Tumor Associated Macrophages))係作為炎症反應之元兇而 為人所知(非專利文獻41：Huang,Y.,et al.Cancer cell 19,1-2(2011))。另一方面，作為抗癌免疫之主導者(playmaker)而發揮功能之樹狀細胞亦為與巨噬細胞相同之骨髄細胞(非專利文獻42：Huang,Y.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109,17561-17566(2012))。雖然將該等轉變為抗癌指向性之方法尚未找到，但認為腫瘤已因複雜之因素而逃避免疫。TAM及樹狀細胞之兩者係由炎症及模式識別應答支配(非專利文獻43：Garaude,J.,et al.Science translational medicine 4,120ra116(2012)；非專利文獻44：Martinez-Pomares,L.et al.Trends in immunology 33,66-70(2012))。免疫學之效應細胞與癌細胞接觸係癌細胞之攻擊所必須(非專利文獻40：Engelhardt,J.J.,et al.Cancer cell 21,402-417(2012)；非專利文獻45：Palucka,K.et al.Nature reviews.Cancer 12,265-277(2012))。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]US 8,030,285 B2

[專利文獻2]WO 01/034207 A1

[專利文獻3]WO 02/072152 A1

[專利文獻4]日本專利特開2004-107272號公報

[專利文獻5]WO 2004/100965 A1

[專利文獻6]日本專利特開2007-70307號公報

[專利文獻7]日本專利特開2008-100919號公報

[專利文獻8]日本專利特開2010-174107號公報

[非專利文獻]

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[非專利文獻8]Verthelyi, D., et al., Journal of immunology 166, 2372-2377 (2001).

[非專利文獻9]Hartmann, G. & Krieg, A. M. Journal of immunology 164, 944-953 (2000).

[非專利文獻10]Hartmann, G., et al. European journal of immunology 33, 1633-1641 (2003).

[非專利文獻11]Marshall, J. D., et al. Journal of leukocyte biology 73, 781-792 (2003).

[非專利文獻12]Samulowitz, U., et al. Oligonucleotides 20, 93-101 (2010).

[非專利文獻13]Kerkmann, M., et al. The Journal of Biological Chemistry 280, 8086-8093 (2005).

[非專利文獻14]Klein, D. C., et al., Ultramicroscopy 110, 689-693 (2010).

[非專利文獻15]Puig, M., et al. Nucleic acids research 34, 6488- 6495 (2006).

[非專利文獻16]Bode, C., et al., Expert review of vaccines 10, 499-511 (2011).

[非專利文獻17]McHutchison, J. G., et al. Hepatology 46, 1341-1349 (2007).

[非專利文獻18]Okamura, K., et al. Cancer 58, 865-872 (1986).

[非專利文獻19]Oba, K. et al., J. Individual patient based meta-analysis of lentinan for unresectable/recurrent gastric cancer. Anticancer Res., 2009, 29, 2739-2746.

[非專利文獻20]Nakano, H. et al., Hepato-Gastroenterol., 1999, 46, 2662-2668.

[非專利文獻21]Sakurai, K., et al., Biomacromolecules 2, 641-650 (2001).

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[非專利文獻23]Koyama, S., et al. Science translational medicine 2, 25ra24 (2010).

[非專利文獻24]Minari, J., et al. Bioconjugate chemistry 22, 9-15 (2011).

[非專利文獻25]van der Bruggen et al. Science (New York, N. Y.) 254, 1643-1647 (1991)

[非專利文獻26]Jager, E., et al. The Journal of experimental medicine 187, 265-270 (1998)

[非專利文獻27]Jager, D. et al. Journal of clinical pathology 54, 669-674 (2001).

[非專利文獻28]Imai, K., et al. British journal of cancer 104, 300- 307 (2011)

[非專利文獻29]Kang, X., et al. The Journal of Immunology 155, 1343-1348 (1995)

[非專利文獻30]Cancer vaccine approval could open floodgates. Nature medicine 16, 615-615 (2010)

[非專利文獻31]Higano, C. S., et al. Cancer 115, 3670-3679 (2009)

[非專利文獻32]Phan, G. Q., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 8372-8377 (2003)

[非專利文獻33]Camacho, L. H., et al. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 27, 1075-1081 (2009)

[非專利文獻34]Hodi, F. S., et al. New England Journal of Medicine 363, 711-723 (2010)

[非專利文獻35]AZIJLI, K., et al. Anticancer Research 34, 1493-1505 (2014)

[非專利文獻36]Okazaki, T., et al. Nature immunology 14, 1212-1218 (2013)

[非專利文獻37]Ishida, Y., et al. The EMBO journal 11, 3887-3895 (1992)

[非專利文獻38]Topalian, S. L., et al. The New England journal of medicine 366, 2443-2454 (2012)

[非專利文獻39]Chiba, S., et al. Nature immunology 13, 832-842 (2012)

[非專利文獻40]Engelhardt, J. J., et al. Cancer cell 21, 402-417 (2012)

[非專利文獻41]Huang, Y., et al. Cancer cell 19, 1-2 (2011)

[非專利文獻42]Huang, Y., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 17561-17566 (2012)

[非專利文獻43]Garaude, J., et al. Science translational medicine 4, 120ra116 (2012)

[非專利文獻44]Martinez-Pomares, L. et al. Trends in immunology 33, 66-70 (2012)

[非專利文獻45]Palucka, K. et al. Nature reviews. Cancer 12, 265-277 (2012)

本發明者等人進行努力研究，結果使用先前作為佐劑而開發出之CpG-β葡聚糖複合體(例如K3-SPG(使用作為人類型K型CpG ODN之K3與β-葡聚糖之複合體作為單劑形式之抗腫瘤藥，結果於利用先前型之CpG ODN(K3)時無效果之靜脈內投予時，K3-SPG確認到荷癌狀態之小鼠體內之腫瘤之退化(圖2(A~B))，從而完成本發明。本發明者等人進而證實，於作為更接近臨床之模型之腹膜接種模型中亦顯示出強力之抗腫瘤活性(圖2g、m(圖2B))。本發明者等人無需為了該效果而投予抗原，於以單劑形式進行投予時確認到效果。

進而，本發明者等人使用基因缺損小鼠而顯示出：對於K3-SPG之抗腫瘤效果而言，重要的是後天性免疫應答，及以藉由自然免疫應答所誘導之I型干擾素(IFN)與IL-12(圖6a、b、c(圖6A))為必須。又，本發明者等人藉由靜脈投予K3-SPG，而確認到CD45陰性之腫瘤細胞集聚於脾臟中，從而明確該細胞之多數發生細胞死亡(細胞壞死(necrosis)或細胞凋亡(apoptosis))。若利用該CD45陰性細胞對小鼠進行免疫，則由於強力地發揮出抗腫瘤效果，故而明確集聚於脾臟之CD45陰性細胞之細胞死亡顯示出重要作用(圖6g、h、i、j(圖6B))。 又，本發明者等人亦確認藉由投予K3-SPG，經活化之CD8T細胞會集聚於腫瘤，而明確該等細胞對於抗腫瘤效果而言為必須。

因此，業界期待於全身性投予時發揮出抗腫瘤效果之CpG ODN之開發對迄今為止難以治療之癌腫瘤亦強力地發揮作用。進而，關於CpG ODN，由於在無抗原之條件下發揮出抗腫瘤效果，故而亦可期待作為單劑之應用。

迄今為止，顯示出CpG ODN係作為單劑治療(Pratesi,G.,et al.Cancer research 65,6388-6393(2005)；Manegold,C.,et al.Annals of oncology：official journal of the European Society for Medical Oncology/ESMO 23,72-77(2012)；Kim,Y.H.,et al.Blood 119,355-363(2012)；Hirsh,V.,et al.Journal of clinical oncology：official journal of the American Society of Clinical Oncology 29,2667-2674(2011)；Weber,J.S.,et al.Cancer 115,3944-3954(2009))或癌疫苗佐劑(Reed,S.G.,Nature medicine 19,1597-1608(2013)；Perret,R.,et al.Cancer research 73,6597-6608(2013)；Mbow,M.L.,et al.Current opinion in immunology 22,411-416(2010)；Duthie,M.S.,et al.Immunological reviews 239,178-196(2011))而有前景之藥物。但是，關於作為迄今為止之利用CpG-ODN之抗癌劑之治療，僅於注射至腫瘤內之情形時才可抑制腫瘤之生長(Schettini,J.,et al.Cancer immunology,immunotherapy：CII 61,2055-2065(2012)；Lin,A.Y.,et al.PLoS One 8,e63550(2013)；Ishii,K.J.,et al.Clinical cancer research：an official journal of the American Association for Cancer Research 9,6516-6522(2003)；Lou,Y.,et al.Journal of immunotherapy(Hagerstown,Md.：1997)34,279-288(2011)；Auf,G.,Clinical cancer research：an official journal of the American Association for Cancer Research 7,3540-3543(2001)；Nierkens,S.,et al.PLoS One 4,e8368(2009)；Heckelsmiller, K.,et al.Journal of immunology 169,3892-3899(2002))。本發明者等人開發出在此稱為K3-SPG之奈米粒子狀之TLR9促效劑，其包含裂褶菌多糖(SPG；β葡聚糖)及B/K型CpG(K3)複合體，顯示出K3-SPG係作為強於K3本身之疫苗佐劑(伴有強力之IFN-α之誘發)而發揮功能。於本實施例中，本發明者等人進而調查針對癌之K3-SPG之單劑免疫療法之潛能(不使用進一步之腫瘤肽及抗原)，結果得知可獲得如上所述之效果，從而完成本發明。因此，本發明代表性地提供如下者。

(抗癌劑單劑)

(1)一種包含複合體之抗癌劑，該複合體包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖。

(2)如上述項目(1)中所記載之抗癌劑，其特徵在於：上述抗癌劑係於無癌抗原之情況下進行投予。

(3)如上述項目(1)或(2)中所記載之抗癌劑，其特徵在於：上述抗癌劑係以傳遞至網狀內皮系統及/或淋巴結之方式進行投予。

(4)如上述項目(3)中所記載之抗癌劑，其中上述網狀內皮系統及/或淋巴結包含腫瘤及巨噬細胞。

(5)如上述項目(3)或(4)中所記載之抗癌劑，其中上述網狀內皮系統包含脾臟及/或肝臟。

(6)如上述項目(1)至(5)中任一項所記載之抗癌劑，其特徵在於：上述抗癌劑係於無癌抗原之情況下進行投予。

(7)如上述項目(2)至(6)中任一項所記載之抗癌劑，其中上述投予包括全身性投予。

(8)如上述項目(7)中所記載之抗癌劑，其中上述全身性投予係選自靜脈內投予、腹腔內投予、經口投予、皮下投予、肌內投予、及腫 瘤內投予之中。

(9)如上述項目1至8中任一項所記載之抗癌劑，其中上述寡聚去氧核苷酸係選自由K3(序列編號1)、K3-dA₄₀(序列編號2)、dA₄₀-K3(序列編號3)、K3-dA20(序列編號4)、K3-dA25(序列編號5)、K3-dA30(序列編號6)及K3-dA35(序列編號12→7)所組成之群中。

(10)如上述項目1至9中任一項所記載之抗癌劑，其中上述β-1,3-葡聚糖係選自由裂褶菌多糖(SPG)、香菇多糖、硬葡聚糖(Scleroglucan)、卡德蘭多糖(Curdlan)、茯苓多糖(Pachyman)、灰樹花多糖(Grifolan)及昆布糖(Laminaran)所組成之群中。

(11)如上述項目1至10中任一項所記載之抗癌劑，其中上述複合體為K3-SPG。

(網狀內皮系統(包含脾臟及/或肝臟)及/或淋巴結集聚劑)

(12)一種用於使癌之死細胞集聚於脾臟之組合物，其包含含有如下成分之複合體：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖。

(13)如上述項目(12)中所記載之組合物，其中上述寡聚去氧核苷酸係選自由K3(序列編號1)、K3-dA₄₀(序列編號2)、dA₄₀-K3(序列編號3)、K3-dA20(序列編號4)、K3-dA25(序列編號5)、K3-dA30(序列編號6)及K3-dA35(序列編號7)所組成之群中。

(14)如上述項目(12)或(13)中所記載之組合物，其中上述β-1,3-葡聚糖係選自由裂褶菌多糖(SPG)、香菇多糖、硬葡聚糖、卡德蘭多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖及昆布糖所組成之群中。

(15)如上述項目(12)至(14)中任一項所記載之組合物，其中上述複合體為K3-SPG。

(16)如上述項目12至15中任一項所記載之組合物，其中上述網狀內皮系統及/或淋巴結包含腫瘤及巨噬細胞。

(17)如上述項目(12)至(16)中任一項所記載之組合物，其中上述網狀內皮系統包含脾臟及/或肝臟。

(18)如上述項目(12)至(17)中任一項所記載之組合物，其中上述投予包括全身性投予。

(19)如上述項目(18)中所記載之組合物，其中上述全身性投予係選自靜脈內投予、腹腔內投予、經口投予、皮下投予、肌內投予、及腫瘤內投予之中。

<用於介白素12(IL12)及/或干擾素(IFN)γ之表現或表現促進之組合物>

(20)一種用於介白素12(IL12)及/或干擾素(IFN)γ之表現或表現促進之組合物，其包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖。

(21)如上述項目(20)中所記載之組合物，其中上述寡聚去氧核苷酸為K3(序列編號1)、K3-dA₄₀(序列編號2)、dA₄₀-K3(序列編號3)、K3-dA20(序列編號4)、K3-dA25(序列編號5)、K3-dA30(序列編號6)及K3-dA35(序列編號7)。

(22)如上述項目(20)或(21)中所記載之組合物，其中上述β-1,3-葡聚糖係選自由裂褶菌多糖(SPG)、香菇多糖、硬葡聚糖、卡德蘭多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖及昆布糖所組成之群中。

(23)如上述項目(20)至(22)中任一項所記載之組合物，其中上述複合體為K3-SPG。

於本發明中，關於上述一個或複數個特徵，意在除明示之組合 以外，亦可進一步加以組合而提供。本發明之進一步之實施形態及優點係藉由視需要閱讀以下之詳細說明進行理解而被從業者所認知。

關於本發明之K3-SPG作為抗腫瘤藥之應用，於藉由先前之CpG ODN未能克服之全身性投予時可發揮出強力之抗腫瘤效果。因此，就臨床之觀點而言亦認為非常有用。又，由於即便對於人類細胞亦確認到充分之效果(自然免疫應答)，故而應用於人類之可能性亦較高。根據本發明者等人之研究結果顯示，與迄今為止臨床試驗中所使用之CpG ODN相比，除具有非常強之自然免疫活化能力以外，亦具有較強之抗腫瘤效果，故而K3-SPG可作為有用之免疫治療藥而備受期待。進而，可無需投予抗原，藉由誘導腫瘤細胞之細胞死亡而發揮出效果，故而認為可應用於各種癌。根據該等結果，K3-SPG具有作為無需抗原之自然免疫活化型抗腫瘤藥之可能性。

圖1係表示SPG與CpG ODN之複合體化之方法。

圖2A~圖2B表示不含抗原之奈米粒子狀之CpG(K3-SPG)之全身性注射可應用於包括胰臟癌腹膜接種模型在內之多種已確立之腫瘤模型。圖2A表示a~i。於第0天對C57BL/6小鼠s.c.(subcutaneous，皮下注射)接種EG7細胞，並於第7、9及11天將PBS(a~c)、K3(30μg)(d~f)、或K3-SPG(10μg)(g~i)投予至皮內(i.d.，intradermal)(腫瘤周圍區域)(a、d、g)、腫瘤內(i.t.，intratumoral)(b、e、h)、或靜脈內(i.v.，Intravenous)(c、f、i)。測定腫瘤尺寸23天(n=4)。各曲線表示各小鼠。箭頭表示治療之時期。

圖2A~圖2B係表示不含抗原之奈米粒子狀之CpG(K3-SPG)之全身性注射可應用於包括胰臟癌腹膜接種模型在內之多種已確立之腫瘤模型。圖2B表示j~n。(j~l)於第0天對C57BL/6小鼠接種B16細胞、 B16F10細胞或MC38細胞。於第10、12及14天利用K3-SPG對B16接種群進行i.v.或i.t.處理。於第7、9及11天利用K3-SPG對B16F10接種群進行i.v.或i.t.處理。於第14、16及18天利用K3-SPG對MC38接種群進行i.v.或i.t.處理。誤差線(error bar)表示平均+SEM(Standard error of the mean，標準誤差均值)(n=4)。* p<0.05(t檢定)。(m)於第0天對C57BL/6小鼠腹腔內注射Pan02細胞，並於第11、13及15天利用K3或K3-SPG或PBS(對照)進行i.v.處理。腫瘤之重量(g)表示第21天。* p<0.05(t檢定)。(n)於第0天對C57BL/6小鼠腹腔內注射Pan02，並利用K3或K3-SPG或PBS進行3次i.v.處理。表示存活率(%)(n=8)。* p<0.05(對數等級檢定)。

圖3係將因K3-SPG之全身性投予所產生之結果與其他對照、K3進行比較而獲得者。顯示出K3-SPG之全身性投予可成為無需抗原之癌免疫治療劑。於將作為腫瘤細胞株之EG7移植至小鼠後，將K3、K3-SPG靜脈內投予3次(第7、9、11天)。移植腫瘤細胞後自第7天起測定腫瘤尺寸。

圖4表示K3-SPG以腫瘤微環境內之吞噬細胞(Phagocyte)作為標靶。(a~c)於第0天對C57BL/6小鼠s.c.接種EG7，於第12天i.v.投予PBS(對照)、ALEXA 647-K3(30μg)、或ALEXA 647-K3-SPG(10μg)。投予1小時後，利用活體內螢光成像系統(IVIS，in vivo imaging system)對小鼠進行分析，並將藉由相對螢光測得之影像轉換為表面放射亮度之物理單位(光子/sec/cm²/sr)。白箭頭表示腫瘤接種區域(a)。(b、c)利用抗CD3e抗體(紅，EG7染色)及Hoechst 33258(藍，核染色)對來自圖6a(圖6A)之腫瘤之冷凍切片進行染色，其後利用螢光顯微鏡進行分析(比例尺，100μm)。白箭頭表示螢光陽性區域。(d~g)於第0天對C57BL/6小鼠s.c.接種EG7，並於第12天將Alexa 647-K3、Alexa 647-K3-SPG、或FITC-SPG與葡聚糖-PE一併i.v.投予。(d~f)注 射1小時後，利用螢光顯微鏡對腫瘤之冷凍切片進行分析(比例尺，100μm)。(g)對綠、紅或融合之細胞進行計數(自3個腫瘤分別選取10個視野)。誤差線表示平均+SD(Standard deviation，標準誤差)。星號表示與注射K3之融合細胞數之有意義差。(h)於第0天對C57BL/6小鼠(n=3或4)s.c.接種EG7，並於第5天i.v.投予氯屈膦酸鹽脂質體或對照脂質體。於第7、9及11天對小鼠注射PBS(對照)或K3-SPG。誤差線表示平均+SEM。箭頭表示治療之時期。* p<0.05(t檢定)。

圖5表示腫瘤中之F4/80陽性細胞因氯屈膦酸鹽脂質體而耗竭(exhaustion)。於第0天對C57BL/6小鼠接種EG7，於第5天i.v.投予氯屈膦酸鹽脂質體(a)或對照脂質體(b)，然後於第7天利用Alexa 647-K3-SPG進行i.v.處理。處理1小時後，利用抗F4/80抗體(紅)及Hoechst 33258(藍)對腫瘤之冷凍切片進行染色，其後利用螢光顯微鏡進行分析(比例尺，100μm)。

圖6A~圖6B表示IL-12及IFN之兩者對於腫瘤縮小及該等免疫原性細胞死亡之潛在作用較重要。圖6A表示a~f。(a~c)於第0天對Il12p40異質基因剔除小鼠(a)、Ifnar2異質基因剔除小鼠(b)、及Il12p40-Ifnar2基因雙剔除(double knockout)小鼠(c)s.c.接種EG7細胞，並於第7、9及11天利用K3-SPG對該等小鼠進行i.v.處理。誤差線表示平均+SEM(n=4)。箭頭表示治療之時期。* p<0.05(t檢定)。(d、f)於第0天對Rag2異質及基因剔除以及Il12p40-Ifnar2基因雙剔除小鼠接種EG7細胞，並利用K3-SPG進行3次(第7、9及11天，黑色箭頭)、6次(第7、9、11、14、16、18天，灰色箭頭)、或0次(對照)i.v.處理。(e)放大圖表示第4天至第21天。

圖6A~圖6B表示IL-12及IFN之兩者對腫瘤縮小及該等免疫原性細胞死亡之潛在作用較重要。圖6B表示g~k。(g)於第0天對C57BL/6小鼠及Il12p40-Ifnar2基因雙剔除小鼠s.c.接種EG7細胞，並於第7、9 及11天利用K3-SPG對小鼠進行i.v.處理，其後於第12天處死。將脾細胞回收，利用抗CD45抗體進行染色，其後利用流式細胞儀(flow cytometer)對該細胞進行分析。(h)散佈圖表示CD45陰性細胞亞群。誤差線表示平均+SEM。* p<0.05(t檢定)。(i)為了進行死細胞之染色，利用Hoechst 33342及PI(propidium iodide，碘化丙啶)對CD45陰性亞群進行染色，其後利用流式細胞儀進行分析。柱狀圖表示凋亡細胞、壞死細胞、及CD45陰性活細胞之亞群。誤差線表示平均+SD(n=3)。* p<0.05(t檢定)。(j)利用PBS或CD45陰性細胞將C57BL/6小鼠免疫化。免疫化7天後，於第0天對小鼠s.c.接種EG7細胞，並於其後之25天測定腫瘤尺寸(n=3)。誤差線表示平均+SEM。* p<0.05(t檢定)。(k)藉由柱狀圖及散佈論文圖分別表示第25天之腫瘤體積及OVA(Ovalbumin，卵白蛋白))_257~264特異性四聚物+CD8T細胞之數量。* p<0.05(t檢定)。

圖7表示於腫瘤微環境中檢測出IFN-β。(a)對IFN-βGFP(Green Fluorescent Protein，綠色螢光蛋白)小鼠於第0天接種EG7，於第7、9及11天利用K3-SPG進行i.d.或i.v.處理。接種12天後，將腫瘤回收，並利用抗CD11b抗體、抗CD169抗體、抗F4/80抗體、抗MARCO抗體(紅)及Hoechst 33258(藍)對冷凍切片進行染色，其後利用螢光顯微鏡進行分析(比例尺，100μm)。(b)對IFN-β陽性細胞進行計數(自3個腫瘤分別選取10個視野)。誤差線表示平均+SD。* p<0.05(t檢定)。

圖8表示於腫瘤微環境中檢測出IL12-p40。(a)對C57BL/6小鼠於第0天接種EG7，於第7、9及11天利用K3-SPG進行i.d.或i.v.處理。接種12天後，將腫瘤回收，並利用抗IL12-p40抗體(紅)及Hoechst 33258(藍)對冷凍切片進行染色，其後利用螢光顯微鏡進行分析(比例尺，100μm)。(b)對IL12-p40陽性細胞進行計數(自3個腫瘤分別選取10個視野)。誤差線表示平均+SD。* p<0.05(t檢定)。

圖9表示CD45陰性細胞係源自腫瘤細胞，而非源自宿主細胞。於第0天對GFP小鼠s.c.接種EG7細胞，於第7、9及11天利用K3-SPG對該小鼠進行i.v.處理，其後於第12天處死。將脾細胞回收，並利用抗CD45抗體進行染色，其後利用流式細胞儀對細胞進行分析。

圖10A~圖10B表示K3-SPG誘發性腫瘤縮小需要如下兩者：包括Il12、1型IFN、Batf3、CD8⁺DC、及浸潤於腫瘤之強力之細胞毒殺性T細胞的自然免疫應答及適應免疫應答。圖10A表示a~c。於第0天對C57BL/6基因剔除小鼠(a)、以及Batf3異質及Batf3基因剔除小鼠(b)接種EG7細胞，並於第7、9及11天利用K3-SPG進行i.v.處理(黑色箭頭)。(a)於第6天及第13天投予CD8耗竭抗體(200μg/小鼠)。誤差線表示平均+SEM(n=4)。* p<0.05(t檢定)。箭頭表示治療之時期。(c)於第0天對C57BL/6小鼠接種EG7，並於第7、9及11天藉由i.d.或i.v.對K3-SPG進行處理。接種12天後，將腫瘤回收，並利用抗CD8β抗體(紅)及Hoechst 33258(藍)對冷凍切片進行染色，其後利用螢光顯微鏡進行分析(比例尺，100μm)。對CD8β陽性細胞進行計數(自3個腫瘤分別選取10個視野)。誤差線表示平均+SD。* p<0.05(t檢定)。

圖10A~圖10B表示K3-SPG誘發性腫瘤縮小需要如下兩者：包括Il12、1型IFN、Batf3、CD8⁺DC、及浸潤於腫瘤之強力之細胞毒殺性T細胞的自然免疫應答及適應免疫應答。圖10B表示d~e。(d)於第0天對C57BL/6(WT(wild-type，野生型))小鼠及Il12p40-Ifnar2基因雙剔除(DKO，Double knockout)小鼠接種EG7細胞，並於第7、9及11天利用K3-SPG進行i.v.處理。於第14天利用Xenolight DiR(註冊商標)對源自注射過K3-SPG或PBS之任一者之帶有腫瘤之小鼠的CD8α⁺T細胞進行染色並移植(i.v.)，其後，於第15天利用IVIS對小鼠進行分析。(I、II)受移植小鼠：利用K3-SPG進行i.v.處理之帶有EG7之WT小鼠。小鼠被移植經K3-SPG處理之CD8α⁺T細胞(I)、或被移植未經處理之CD8α⁺T細 胞(II)。(e)(I、II)受移植小鼠：未經處理之帶有EG7之WT小鼠(I)及利用K3-SPG進行i.v.處理之DKO小鼠。小鼠被移植經K3-SPG處理之CD8α+T細胞(I、II)。

圖11表示實驗系統之模式論文圖。於第0天對WT小鼠及Il12p40-Ifnar2 DKO小鼠接種EG7細胞，並於第7、9及11天利用K3-SPG或PBS進行i.v.處理。於第14天自該等小鼠之脾臟中純化CD8α⁺T細胞，利用Xenolight DiR(註冊商標)進行標記，然後移植至經K3-SPG處理(第7、9及11天)之另一帶有EG7之小鼠(接種14天後)，其後於第15天藉由IVIS對利用Xenolight DiR(註冊商標)進行標記之CD8T細胞之分佈進行分析。

圖12表示K3-SPG處理之戰略。K3-SPG係經由血流將腫瘤微環境作為標靶。並且，K3-SPG係以吞噬細胞作為標靶，將該等細胞活化。於腫瘤微環境中，IFN及IL-12係藉由K3-SPG處理而誘發。然後，經由淋巴流及血流而釋出抗原。該抗原之呈現誘發強力之腫瘤特異性CTL。

以下，一面揭示最佳形態，一面對本發明進行說明。於本說明書之全文中，單數形式之表述只要未特別說明，則應理解為亦包括其複數形式之概念。因此，單數形式之冠詞(例如於英語之情形時，為「a」、「an」、「the」等)只要未特別說明，則應理解為亦包括其複數形式之概念。又，本說明書中所使用之用語只要未特別說明，則應理解為基於該領域中通常使用之含義而使用。因此，此外只要未加以定義，則本說明書中所使用之所有專門用語及科學技術用語具有與本發明之所屬領域之從業者通常理解者相同之含義。於發生矛盾之情形時，以本說明書(包括定義)為準。

以下，適當說明本說明書中特別使用之用語之定義及/或基本技 術內容。

本發明提供一種包含K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸(dA)之寡聚去氧核苷酸(以下，稱為本發明之寡聚去氧核苷酸)。於本發明之寡聚去氧核苷酸中包含磷酸二酯鍵經修飾(例如一部分或全部磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代)者。本發明之寡聚去氧核苷酸包含藥學上可容許之鹽。

於本說明書中，所謂「CpG寡聚核苷酸(殘基)」或「CpG寡聚去氧核苷酸(殘基)」、「CpG ODN(殘基)」或僅「CpG(殘基)」係指包含可用於交換使用且至少1個未經甲基化之CG二核苷酸序列之多核苷酸、較佳為寡聚核苷酸，無論有無末尾之用語「殘基」，含義均相同。包含至少1個CpG模體之寡聚核苷酸可包含複數個CpG模體。於本說明書中使用之情形時，所謂用語「CpG模體」係指包含胞嘧啶核苷酸及其後之鳥苷核苷酸的寡聚核苷酸之未經甲基化之二核苷酸部分。亦可使用5-甲基胞嘧啶代替胞嘧啶。進而，聚去氧腺苷酸與聚去氧腺苷酸(殘基)含義相同。用語「殘基」係指更大分子量之化合物之部分結構，於本說明書中，「CpG寡聚去氧核苷酸(CpG ODN)」意指獨立之分子、或意指更大分子量之化合物之部分結構，只要為從業者，則可由上下文容易地理解。關於「聚去氧腺苷酸」等與本發明之寡聚去氧核苷酸中所含之其他部分結構相關之用語亦相同。

CpG寡聚核苷酸(CpG ODN)係含有免疫賦活性之CpG模體的較短(約20個鹼基對)之單鏈之合成DNA片段，且係類Toll受體9(TLR9)之強力之促效劑，係作為將樹狀細胞(DCs)及B細胞活化，產生I型干擾素(IFNs)及炎症性細胞激素(Hemmi，H.,et al.Nature 408,740-745(2000)；Krieg,A.M.Nature reviews.Drug discovery 5,471-484(2006).)，包括細胞毒殺性T淋巴球(CTL)反應在內之Th1型之體液性及細胞性免疫反應之佐劑而發揮作用(Brazolot Millan,C.L., Weeratna,R.,Krieg,A.M.,Siegrist,C.A.& Davis,H.L.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95,15553-15558(1998).；Chu,R.S.,Targoni,O.S.,Krieg,A.M.,Lehmann,P.V.& Harding,C.V.The Journal of experimental medicine 186,1623-1631(1997))。因此，CpG ODN被視為對感染症、癌、哮喘及花粉症具有可能性之免疫治療劑(Krieg,A.M.Nature reviews.Drug discovery 5,471-484(2006)；Klinman,D.M.Nature reviews.Immunology 4,249-258(2004))。

CpG寡聚去氧核苷酸(CpG ODN)係含有免疫賦活性之非甲基化CpG模體之單鏈DNA，為TLR9之促效劑。CpG ODN存在骨架序列及免疫賦活特性分別不同之K型(亦稱為B型)、D型(亦稱為A型)、C型及P型之4個類型(Advanced drug delivery reviews 61,195-204(2009))。本發明之寡聚去氧核苷酸包含該等中之K型CpG ODN。

K型CpG ODN係典型而言含有非迴文結構之複數個非甲基化CpG模體，將B細胞活化而產生IL-6，但具有幾乎不誘導類漿細胞樹狀細胞(pDCs)之IFN-α產生之結構及功能特性之CpG ODN。所謂非甲基化CpG模體係包含至少1個胞嘧啶(C)-鳥嘌呤(G)序列之較短之核苷酸序列，係指該胞嘧啶-鳥嘌呤序列中之胞嘧啶之5位未經甲基化者。再者，於以下之說明中，所謂CpG，只要未特別說明，則係指非甲基化CpG。因此，本發明之寡聚去氧核苷酸藉由包含K型CpG ODN，而具有對K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將B細胞(較佳為人類B細胞)活化而產生IL-6之活性)。於該技術領域中，已知有大量人類化K型CpG ODN(Journal of immunology 166,2372-2377(2001)；Journal of immunology 164,944-953(2000)；US 8,030,285 B2)。

本發明之寡聚去氧核苷酸中所含之K型CpG ODN較佳為經人類化。所謂「人類化」係指具有針對人類TLR9之促效劑活性。因此， 包含人類化K型CpG ODN之本發明之寡聚去氧核苷酸對人類具有對K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將人類B細胞活化而產生IL-6之活性)。於本發明中可適宜地使用之K型CpG ODN為10個核苷酸以上之長度，且包含式：[化1]5'N ₁ N ₂ N ₃ T-CpG-WN ₄ N ₅ N ₆ 3'

(式中，中央之CpG模體未經甲基化，W為A或T，N₁、N₂、N₃、N₄、N₅及N₆亦可為任何核苷酸)所表示之核苷酸序列。

於一實施形態中，本發明之K型CpG ODN係具有10個核苷酸以上之長度且包含上述式之核苷酸序列。其中，上述式中，中央之4個鹼基之CpG模體(TCpGW)只要包含在10個核苷酸中即可，並非必須於上述式中位於N₃及N₄之間。又，上述式中，N₁、N₂、N₃、N₄、N₅及N₆可為任何核苷酸，N₁及N₂、N₂及N₃、N₃及N₄、N₄及N₅、以及N₅及N₆之至少任一個(較佳為一個)組合亦可為2個鹼基之CpG模體。於上述4個鹼基之CpG模體未位於N₃及N₄間之情形時，上述式中，中央之4個鹼基(第4~7個鹼基)中之連續之任兩個鹼基為CpG模體，其他2個鹼基亦可為任何核苷酸。

本發明中可更適宜地使用之K型CpG ODN包含含有1個或複數個CpG模體(motif)之非迴文結構。可更適宜地使用之K型CpG ODN包含含有1個或複數個CpG模體之非迴文結構。

人類化K型CpG ODN通常係以包含TCGA或TCGT之4個鹼基之CpG模體作為特徵。又，多數情況下，於1個人類化K型CpG ODN中包含2或3個該4個鹼基之CpG模體。因此，於較佳實施形態中，本發 明之寡聚去氧核苷酸中所含之K型CpG ODN包含至少1個、更佳為2以上、進而較佳為2或3個包含TCGA或TCGT之4個鹼基之CpG模體。於該K型CpG ODN具有2或3個之4個鹼基之CpG模體之情形時，該等4個鹼基之CpG模體可相同亦可不同。其中，只要具有針對人類TLR9之促效劑活性，則無特別限定。

本發明之寡聚去氧核苷酸中所含之K型CpG ODN更佳為包含序列編號1所表示之核苷酸序列。

關於K型CpG ODN之長度，只要本發明之寡聚去氧核苷酸具有免疫賦活活性(例如將B細胞(較佳為人類B細胞)活化而產生IL-6之活性)，則無特別限定，較佳為100個核苷酸長度以下(例如10~75個核苷酸長度)。K型CpG ODN之長度更佳為50個核苷酸長度以下(例如10~40核苷酸長度)。K型CpG ODN之長度進而較佳為30個核苷酸長度以下(例如10~25核苷酸長度)。K型CpG ODN之長度最佳為12~25核苷酸長度。

關於聚去氧腺苷酸(dA)之長度，只要為對於與β-1,3-葡聚糖(較佳為香菇多糖、或裂褶菌多糖)鏈一併形成三股螺旋結構而言充分之長度，則無特別限定，就形成穩定之三股螺旋結構之觀點而言，通常為20個核苷酸長度以上，較佳為40個核苷酸長度以上，更佳為60個核苷酸長度以上。由於聚dA越長越會與β-1,3-葡聚糖形成穩定之三股螺旋結構，故而理論上並無上限，但若過長，則於合成寡聚去氧核苷酸時會於長度方面產生不均，故而通常為100個核苷酸長度以下，較佳為80個以下。另一方面，除了形成上述穩定之三股螺旋結構以外，就增大與每單位量之β-1,3-葡聚糖鍵結之本發明之寡聚去氧核苷酸量且避免合成寡聚去氧核苷酸時之長度不均、複合化效率之觀點而言，聚dA之長度較佳為20~60個核苷酸長度(具體而言為20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59或60個核苷酸長度)，更佳為30~50個核苷酸長度(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50個核苷酸長度)18，最佳為30~45個核苷酸長度(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45個核苷酸長度)。尤其為30個核苷酸長度以上之情形時，顯示出良好之複合化效率。本發明之寡聚去氧核苷酸藉由包含聚dA，而具有與2條裂褶菌多糖鏈一併形成三股螺旋結構之活性。再者，亦存在將聚去氧腺苷酸表述為「聚(dA)」或「poly(dA)」之情形。

於1分子之本發明之寡聚去氧核苷酸中，亦可含有複數個K型CpG ODN及/或聚dA，較佳為含有K型CpG ODN及聚dA各1個，最佳為包含K型CpG ODN及聚dA各1個。

作為例示性之CpG之序列，可列舉K3 CpG(序列編號1：5'-atcgactctcgagcgttctc-3')等，但並不限定於此。

本發明之寡聚去氧核苷酸之特徵在於：聚dA係配置於K型CpG ODN之3'側。認為藉由該配置，本發明之複合體(詳細情況如下所述)之抗癌作用亦有可能增強，但並不限定於該等，亦可作為抗癌劑而與任一者結合。

K型CpG ODN與聚dA可藉由直接共價鍵進行連結，亦可經由間隙子序列進行連結。所謂間隙子序列係指插入至2個接近之構成要素間之包含1個以上核苷酸之核苷酸序列。關於間隙子序列之長度，只要本發明之複合體具有免疫賦活活性(較佳為將B細胞活化而產生IL-6之活性、及將樹狀細胞活化而產生IFN-α之活性)，則無特別限定，通常為1~10個核苷酸長度，較佳為1~5個核苷酸長度，更佳為1~3個核苷酸長度。最佳為K型CpG ODN與聚dA藉由直接共價鍵進行連結。

本發明之寡聚去氧核苷酸除具有K型CpG ODN、聚dA及任意之 間隙子序列以外，亦可於其5'末端及/或3'末端具有附加核苷酸序列。關於該附加核苷酸序列之長度，只要本發明之複合體具有免疫賦活活性(較佳為將B細胞活化而產生IL-6之活性、及將樹狀細胞活化而產生IFN-α之活性)，則無特別限定，通常為1~10個核苷酸長度，較佳為1~5個核苷酸長度，更佳為1~3個核苷酸長度。

於較佳態樣中，本發明之寡聚去氧核苷酸不含此種5'末端及/或3'末端之附加核苷酸序列。即，本發明之寡聚去氧核苷酸較佳為包含K型CpG ODN、聚dA及任意之間隙子序列，進而較佳為包含K型CpG ODN及聚dA。

於最佳態樣中，本發明之寡聚去氧核苷酸包含K型CpG ODN(具體而言，例如包含序列編號1所表示之核苷酸序列之寡聚去氧核苷酸)及聚dA，K型CpG ODN位於該寡聚去氧核苷酸之5'末端，聚dA位於3'末端。具體而言，係於包含序列編號1所表示之核苷酸序列之寡聚去氧核苷酸之3'末端鍵結有20~60個核苷酸長度(更佳為30~50個核苷酸長度(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50個核苷酸長度)，最佳為30~45個核苷酸長度(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45個核苷酸長度))之聚dA之寡聚去氧核苷酸，例如係包含序列編號2、或9~12所表示之核苷酸序列的寡聚去氧核苷酸。

本發明之寡聚去氧核苷酸之總長度通常為30~200個核苷酸長度，較佳為35~100個核苷酸長度，更佳為40~80個核苷酸長度(具體而言，40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79或80個核苷酸長度)，更佳為50~70個核苷酸長度(具體而言，50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70個核苷酸長度)，最佳為50~65個核苷酸長度(具體而 言，50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65個核苷酸長度)。本發明之寡聚去氧核苷酸亦能以對活體內(in vivo)之分解(例如因外或內核酸酶所引起之分解)呈現抗性之方式適當地進行修飾。較佳為該改型包含硫代磷酸酯修飾或二硫代磷酸酯修飾。即，本發明之寡聚去氧核苷酸中之磷酸二酯鍵之一部分或全部被取代為硫代磷酸酯鍵或二硫代磷酸酯鍵。

較佳為本發明之寡聚去氧核苷酸包含磷酸二酯鍵之修飾，更佳為磷酸二酯鍵之修飾為硫代磷酸酯鍵(即，如WO 95/26204中所記載般，非交聯氧原子中之1個被取代為硫原子)。即，本發明之寡聚去氧核苷酸中之磷酸二酯鍵之一部分或全部被取代為硫代磷酸酯鍵。

關於本發明之寡聚去氧核苷酸，較佳為於K型CpG ODN中包含利用硫代磷酸酯鍵、或二硫代磷酸酯鍵之修飾，更佳為該K型CpG ODN之磷酸二酯鍵之全部被取代為硫代磷酸酯鍵。又，關於本發明之寡聚去氧核苷酸，較佳為於聚dA中包含硫代磷酸酯鍵、或二硫代磷酸酯鍵，更佳為該聚dA之磷酸二酯鍵之全部被取代為硫代磷酸酯鍵。進而較佳為本發明之包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸之寡聚去氧核苷酸的磷酸二酯鍵之全部被取代為硫代磷酸酯鍵。最佳為本發明之寡聚去氧核苷酸係於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸(例如序列編號1)之3'末端鍵結有20~60個核苷酸長度(更佳為30~50個核苷酸長度(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50個核苷酸長度)，最佳為30~45個核苷酸長度(30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45個核苷酸長度))之聚dA者，且該寡聚去氧核苷酸中所含之所有磷酸二酯鍵被取代為硫代磷酸酯鍵。其原因在於，藉由硫代磷酸酯鍵，對於本發明之寡聚去氧核苷酸，不僅期待針對分解之抗性，亦期待免疫賦活活性(例如使pDC活化而產生IFN-α之活性)之增強、及CpG-β-1,3-葡聚糖複合體之 高產率、以及抗癌活性之增強。再者，本說明書中之硫代磷酸酯鍵與硫代磷酸酯骨架含義相同，磷酸二酯鍵與磷酸骨架含義相同。於本發明之寡聚去氧核苷酸中，包括上述寡聚去氧核苷酸之所有藥學上可容許之鹽類、酯、或此種酯之鹽類。

作為本發明之寡聚去氧核苷酸之藥學上可容許之鹽類，可適宜地列舉：鈉鹽、鉀鹽、鋰鹽之類的鹼金屬鹽，鈣鹽、鎂鹽之類的鹼土金屬鹽，鋁鹽、鐵鹽、鋅鹽、銅鹽、鎳鹽、鈷鹽等金屬鹽；銨鹽之類的無機鹽、第三辛基胺鹽、二苄基胺鹽、嗎啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘胺酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、胍鹽、二乙基胺鹽、三乙基胺鹽、二環己基胺鹽、N,N'-二苄基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-苄基-苯乙基胺鹽、哌

鹽、四甲基銨鹽、三(羥基甲基)胺基甲烷鹽之類的有機鹽等胺鹽；氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽之類的氫鹵酸鹽，硝酸鹽、過氯酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等無機酸鹽；甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽、乙磺酸鹽之類的低級烷磺酸鹽，苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽之類的芳基磺酸鹽，乙酸鹽、蘋果酸鹽、反丁烯二酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、順丁烯二酸鹽等有機酸鹽；及甘胺酸鹽、離胺酸鹽、精胺酸鹽、鳥胺酸鹽、麩胺酸鹽、天冬胺酸鹽之類的胺基酸鹽。

本發明之寡聚去氧核苷酸可為單鏈、雙鏈、三鏈之任一形態，較佳為單鏈。

本發明之寡聚去氧核苷酸較佳為進行單離。所謂「單離」係指進行去除目標成分以外之因子的操作，而脫離天然存在狀態。「所單離之寡聚去氧核苷酸」之純度(目標寡聚去氧核苷酸重量於評價對象物之總重量中所占之百分率)通常為70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，進而較佳為99%以上。

本發明之寡聚去氧核苷酸由於具有優異之免疫賦活活性(例如將 B細胞(較佳為人類B細胞)活化而產生IL-6之活性)，故而作為免疫賦活劑等有用。進而，本發明之寡聚去氧核苷酸由於具有與2條β-1,3-葡聚糖(較佳為裂褶菌多糖、香菇多糖或硬葡聚糖)一併形成三股螺旋結構之性質，故而對本發明之複合體之製備有用。

本發明提供一種含有上述本發明之寡聚去氧核苷酸及β-1,3-葡聚糖之複合體(以下，稱為本發明之複合體)。

上述本發明之寡聚去氧核苷酸由於包含K型CpG ODN，故而其單獨發揮出對K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將B細胞(較佳為人類B細胞)活化而產生IL-6之活性)，缺乏對D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將類漿細胞樹狀細胞活化而產生IFN-α之活性)。然而，令人驚訝的是，藉由與β-1,3-葡聚糖(較佳為香菇多糖、裂褶菌多糖)形成複合體，無需D型CpG ODN之序列，而獲得對D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將類漿細胞樹狀細胞活化而產生IFN-α之活性)。即，本發明之複合體具有對K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將B細胞(較佳為人類B細胞)活化而產生IL-6之活性)、及對D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將類漿細胞樹狀細胞(較佳為人類類漿細胞樹狀細胞)活化而產生IFN-α之活性)之兩者。作為本發明中所使用之β-1,3-葡聚糖，可列舉：裂褶菌多糖、硬葡聚糖、卡德蘭多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖、香菇多糖、昆布糖等。β-1,3-葡聚糖較佳為如裂褶菌多糖、香菇多糖或硬葡聚糖般含有大量1,6-葡萄糖苷支鏈(側鏈率33~40%)之β-1,3-葡聚糖，更佳為裂褶菌多糖。

香菇多糖(LNT)係源自香菇之公知之β-1,3-1,6-葡聚糖，分子式為(C₆H₁₀O₅)_n，分子量約為30~70萬。幾乎不溶於水、甲醇、乙醇(95)、或丙酮，但會溶解於作為極性有機溶劑之DMSO(dimethylsulfoxide，二甲基亞碸)或氫氧化鈉水溶液。

香菇多糖具有活化巨噬細胞、殺手T細胞、自然殺手(Natural Killer)細胞及抗體依賴性巨噬細胞介導之細胞毒殺作用(ADMC，Antibody dependent monocyte cytotoxicity)活性之增強作用(Hamuro,J.,et al.：Immunology,39,551-559,1980、Hamuro,J.,et al.：Int.J.Immunopharmacol.,2,171,1980、Herlyn,D.,et al.：Gann,76,37-42,1985)。於動物實驗中，對同系腫瘤及自體腫瘤，藉由與化學治療劑之併用投予，確認到腫瘤增生抑制作用以及延長壽命效果。又，藉由香菇多糖之單獨投予，亦確認到腫瘤增生抑制作用以及延長壽命效果。於臨床試驗中，針對無法手術或胃癌復發患者，藉由與替加氟經口投予之併用，確認到存活時間之延長(醫藥品評估表「香菇多糖靜脈注射用1mg「Ajinomoto」」)，而於日本得到認可。因香菇多糖之單獨投予所產生之效果目前尚未確認。

裂褶菌多糖(SPG)係源自裂褶菌之公知之可溶性β-葡聚糖。SPG包含β-(1→3)-D-葡聚糖之主鏈、及每3個葡萄糖為1個之β-(1→6)-D-葡糖基側鏈(Tabata,K.,Ito,W.,Kojima,T.,Kawabata,S.and Misaki A.,「Carbohydr.Res.」,1981,89,1,p.121-135)。SPG作為針對婦科癌之免疫增強法之肌內注射製劑臨床藥，有20年以上之使用實績(清水，陳，荷見，增淵，「Biotherapy」,1990,4,p.1390長谷川，「Oncology and Chemotherapy(腫瘤學及化療)」，1992,8,p.225)，且確認到於活體內之安全性(Theresa,M.McIntire and David,A.Brant,「J.Am.Chem.Soc.」,1998,120,p.6909)。

於本說明書中，所謂「複合體」係指藉由複數個分子經由靜電鍵、凡得瓦鍵、氫鍵、疏水性交互作用等非共價鍵或共價鍵進行聚集而獲得之產物。

本發明之複合體較佳為三股螺旋結構狀。於較佳態樣中，於形成該三股螺旋結構之3條鏈中，2條為β-1,3-葡聚糖鏈，1條為上述本發明之寡聚去氧核苷酸中之聚去氧腺苷酸之鏈。再者，該複合體亦可包 含一部分未形成三股螺旋結構之部分。

關於本發明之複合體中之寡聚去氧核苷酸與β-1,3-葡聚糖之組成比，可根據寡聚去氧核苷酸中之聚去氧腺苷酸之鏈長、及β-1,3-葡聚糖之長度等而變化。例如，於β-1,3-葡聚糖鏈與聚去氧腺苷酸之鏈之長度相等之情形時，2條β-1,3-葡聚糖鏈與1條本發明之寡聚去氧核苷酸可進行聚集而形成三股螺旋結構。通常，相對於β-1,3-葡聚糖鏈，聚去氧腺苷酸之鏈長較短，因此複數個本發明之寡聚去氧核苷酸可針對2條β-1,3-葡聚糖鏈，經由聚去氧腺苷酸進行聚集，而形成三股螺旋結構(參照圖1)。

本發明之複合體係含有人類化K型CpG ODN及β-1,3-葡聚糖(例如香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖、卡德蘭多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖、昆布糖)之複合體，較佳為包含人類化K型CpG ODN及β-1,3-葡聚糖(例如香菇多糖、裂褶菌多糖、硬葡聚糖)之複合體。更佳為包含於含有序列編號1所表示之核苷酸序列之寡聚去氧核苷酸之3'側鍵結有20~60個核苷酸長度(具體而言，20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59或60個核苷酸長度)之聚去氧腺苷酸且磷酸二酯鍵之全部被取代為硫代磷酸酯鍵的寡聚去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚糖(例如香菇多糖、裂褶菌多糖)之複合體(例如K3-dA20~60-LNT、K3-dA20~60-SPG)，進而較佳為包含於含有序列編號1所表示之核苷酸序列之寡聚去氧核苷酸之3'側鍵結有30~50個核苷酸長度(具體而言，30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50個核苷酸長度)之聚去氧腺苷酸且磷酸二酯鍵之全部被取代為硫代磷酸酯鍵的寡聚去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚糖(例如香菇多糖、裂褶菌多糖)之複合體(例如K3-dA30~50-LNT、K3-dA30~50-SPG)，最佳為包含於含有序列編號1所表示之核苷酸序 列之寡聚去氧核苷酸之3'側鍵結有30~45個核苷酸長度(具體而言，30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45個核苷酸長度)之聚去氧腺苷酸且磷酸二酯鍵之全部被取代為硫代磷酸酯鍵之寡聚去氧核苷酸、及β-1,3-葡聚糖(例如香菇多糖、裂褶菌多糖)之複合體(K3-dA30~45-LNT、K3-dA30~45-SPG)。

關於本發明之複合體之製備方法，可與非專利文獻21~24、或日本專利特開2008-100919號公報中所記載之條件相同地進行。即，使原本為天然且以三股螺旋結構之形式存在之β-1,3-葡聚糖溶解於非質子性有機極性溶劑(二甲基亞碸(DMSO)、乙腈、丙酮等)或鹼性水溶液(氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨、氫氧化鈣等)中而解開為單鏈。將以上述方式獲得之單鏈之β-1,3-葡聚糖的溶液與本發明之寡聚去氧核苷酸之溶液(水溶液、中性附近之pH值之緩衝水溶液、或酸性之緩衝水溶液，較佳為水溶液或中性附近之pH值之緩衝水溶液)加以混合，視需要再次將pH值調整至中性附近後，保持適當時間，例如於5℃下保持一夜。其結果為，2條β-1,3-葡聚糖鏈與該寡聚去氧核苷酸中之聚dA鏈形成三股螺旋結構，藉此形成本發明之複合體。藉由對所產生之複合體利用尺寸排除層析法進行純化、超濾、透析等，可去除未形成複合體之寡聚去氧核苷酸。又，藉由對所產生之複合體利用陰離子交換層析法進行純化，可去除未形成複合體之β-1,3-葡聚糖。藉由上述方法，可對複合體進行適當純化。

本發明之複合體之形成例如可藉由測定利用CD(Circular Dichroism，圓偏振光二色性)光譜之構象變化、利用尺寸排除層析法之UV(Ultra Violet，紫外線)吸收位移、凝膠電泳、微晶片電泳、毛細管電泳而進行確認，但並不限定於此。

關於本發明之寡聚去氧核苷酸與β-1,3-葡聚糖之混合比，可考慮聚dA鏈之長度等而適當設定，通常莫耳比(SPG/ODN)為0.02~2.0， 較佳為0.1~0.5。於進一步之態樣中，莫耳比(β-1,3-葡聚糖(LNT等)/ODN)例如為0.005~1.0，較佳為0.020~0.25。

以CpG-ODN與LNT複合體為例對本發明之複合體之製備方法進行說明。使LNT溶解於0.05~2N、較佳為0.1~1.5N之鹼性水溶液(例如0.25N氫氧化鈉水溶液)中，於1℃~40℃下放置10小時~4天(例如於室溫下放置一晚)，而製備單鏈之LNT水溶液(例如50mg/ml之LNT水溶液)。以莫耳比(LNT/ODN)0.005~1.0將上述LNT水溶液與另外製備之CpG水溶液(例如100μM之CpG水溶液)加以混合，繼而向上述LNT水溶液中添加酸性之緩衝水溶液(例如NaH₂PO₄)而加以中和，於1~40℃下維持6小時~4天(例如於4℃下維持一晚)，藉此結束複合化。再者，為了上述複合化，亦可最後添加LNT水溶液並加以混合。複合體之形成例如可藉由如下方法確認，即，使用尺寸排除層析法，針對CpG ODN向高分子量側之位移，監測240~280nm(例如260nm)下之吸收。

於一態樣中，本發明之複合體呈現出桿狀粒子之形態。粒徑係與藉由使用作材料之β-1,3-葡聚糖(例如裂褶菌多糖)為天然且呈現三股螺旋結構而形成之粒子之直徑同等，通常平均粒徑為10~100nm，較佳為20~50nm。關於該粒徑，可將複合體溶解於水中，使用馬爾文儀器Zeta分級器(Malvern Instruments Zeta Sizer)於80℃之條件下藉由動態光散射法進行計測。

本發明之複合體較佳為加以單離。「所單離之複合體」之純度(目標複合體重量於評價對象物之總重量中所占之百分率)通常為70%以上，較佳為80%以上，更佳為90%以上，進而較佳為99%以上。

進而，本發明之複合體除具有抗癌活性以外，亦具有優異之免疫賦活活性，尤其是具有對K型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將B細胞(較佳為人類B細胞)活化而產生IL-6之活性)、及對D型CpG ODN特有之免疫賦活活性(例如將類漿細胞樹狀細胞(較佳為人類類漿細胞樹狀細胞)活化而產生IFN-α之活性)之兩者，故而作為免疫賦活劑等亦可賦予效果，因此有利。例如，關於包含K型CpG ODN(例如序列編號2、11、12與SPG之複合體及包含K型CpG ODN(例如序列編號2)與SPG之複合體(K3-SPG)，作為發揮出炎症應答誘導能力(pan-IFN-a、IL-6等)、病毒接種個體中之血清中抗原特異性IgG抗體效價(Total IgG、IgG2c等)之增強作用、病毒接種個體中之抗原特異性細胞激素產生能力(IFN-γ、IL2等)、針對病毒之感染防禦效果者亦有利。

(醫藥組合物)

本發明提供一種包含上述本發明之寡聚去氧核苷酸或上述本發明之複合體之醫藥組合物。本發明之醫藥組合物可藉由依據慣用方法將上述本發明之寡聚去氧核苷酸或上述本發明之複合體製劑化而獲得。本發明之醫藥組合物包含本發明之寡聚去氧核苷酸或複合體與藥理學上可容許之載體。又，本醫藥組合物亦可進而包含抗原。此種醫藥組合物係製成適於經口或非經口投予之劑型而提供。

作為用於非經口投予之組合物，例如可使用注射劑、栓劑等，注射劑亦可包含靜脈注射劑、皮下注射劑、皮內注射劑、肌肉注射劑、點滴注射劑等劑型。此種注射劑可根據公知之方法而製備。作為注射劑之製備方法，例如可藉由使上述本發明之寡聚去氧核苷酸或複合體溶解或懸浮於通常注射劑中所使用之無菌水性溶劑中而製備。作為注射用之水性溶劑，例如可使用蒸餾水；生理鹽水；磷酸緩衝液、碳酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、乙酸緩衝液等緩衝液等。此種水性溶劑之pH值可列舉5~10，較佳為6~8。所製備之注射液較佳為填充至適當之安瓿(ampoule)中。

又，亦可藉由對本發明之寡聚去氧核苷酸或複合體之懸浮液實 施真空乾燥、冷凍乾燥等處理，而製備本發明之寡聚去氧核苷酸或複合體之粉末製劑。可藉由將本發明之寡聚去氧核苷酸或複合體於粉末狀態下保存，且於使用時將該粉末於注射用之水性溶劑中分散並供於使用。

關於醫藥組合物中之本發明之寡聚去氧核苷酸或複合體之含量，通常為醫藥組合物整體之約0.1~100重量%，較佳為約1~99重量%，進而較佳為約10~90重量%左右。

本發明之醫藥組合物可單獨含有本發明之寡聚去氧核苷酸或複合體作為有效成分，亦可與其他有效成分組合而含有本發明之寡聚去氧核苷酸或複合體。

(醫藥用途)

發現本發明之寡聚去氧核苷酸及複合體單獨具有抗癌作用。可認為此種效果與作為佐劑而開發之本發明之特性相比，為無法預料之效果。因此，提供如下之抗癌劑，其無需迄今為止之作為佐劑之使用方法、即與癌抗原一併投予，並且不限定於特定癌種類，作為通用之抗癌劑而對身體適度地發揮作用。又，當然亦具有免疫賦活活性，因此亦期待針對其他疾病之免疫賦活活性，且亦期待對體力較弱之癌患者具有協同效應。

由於本發明除具有抗癌作用以外，亦具有優異之免疫賦活活性，故而本發明之寡聚去氧核苷酸、複合體及醫藥組合物可用作免疫賦活劑。藉由向哺乳動物(人類等靈長類、小鼠等嚙齒類等)投予本發明之寡聚去氧核苷酸、複合體或醫藥組合物，可引起該哺乳動物之免疫反應。尤其是本發明之複合體具有D型CpG ODN之活性特性，刺激末梢血液單核球，而產生大量I型干擾素(Pan-IFN-α、IFN-α2等)及II型干擾素(IFN-γ)之兩者，故而作為I型干擾素產生誘導劑、II型干擾素產生誘導劑、I型及II型干擾素產生誘導劑有用。由於誘導產生I型及 II型干擾素之兩者，故而本發明之複合體及含有其之醫藥組合物對於I型及II型干擾素之任一者或兩者有效之疾病之預防或治療有用。

作為醫藥用途之實現方法，例如可藉由向癌之患者或有可能罹患癌之人類投予(a)本發明之寡聚去氧核苷酸、或包含本發明之複合體之組合物，使接受該投予之對象之細胞毒殺性T淋巴球(CTL)抗原特異性地活化，而直接(作為單劑效果)對癌進行預防、治療。

於本說明書中，所謂「被實驗體(者)」係指成為本發明之診斷或檢測、或治療等之對象之對象(例如人類等生物或自生物提取之細胞、血液、血清等)。

於本說明書中，「藥劑」、「劑」或「因子」(任一者於英語中均相當於agent)廣義上可交換使用，只要可達成所欲實現之目的，則亦可為任何物質或其他要素(例如光、輻射能、熱、電等能量)。作為此種物質，例如可列舉：蛋白質、多肽、寡肽、肽、多核苷酸、寡聚核苷酸、核苷酸、核酸(例如包括cDNA(Complementary Deoxyribonucleic Acid，互補去氧核糖核酸)、基因組DNA之類的DNA、mRNA(Messenger Ribonucleic Acid，信使核糖核酸)之類的RNA(Ribonucleic Acid，核糖核酸))、多糖、寡糖、脂質、有機低分子(例如激素、配位子、訊息傳遞物質、有機低分子、藉由組合化學(combinatorial chemistry)而合成之分子、可用作醫藥品之低分子(例如低分子配位子等)等)、該等之複合分子，但並不限定於該等。作為對多核苷酸具有特異性之因子，代表性而言可列舉：對該多核苷酸之序列具有一定之序列同源性(例如70%以上之序列一致性(sequence identity))且具有互補性之多核苷酸、結合於啟動子區域之轉錄因子之類的多肽等，但並不限定於該等。作為對多肽具有特異性之因子，代表性而言可列舉對該多肽特異性地進行指向之抗體或其衍生物或其類似物(例如單鏈抗體)、該多肽為受體或配位子之情形時之特異性之配 位子或受體，於該多肽為酵素之情形時，可列舉其受質等，但並不限定於該等。

於本說明書中，所謂「治療」係指針對某疾病或障礙(例如癌、過敏)，於成為此種狀態之情形時，防止此種疾病或障礙之惡化，較佳為維持現狀，更佳為使之減輕，進而較佳為使之消退，包括可發揮出患者之疾病、或者疾病所伴有之1個以上症狀之症狀改善效果或預防效果的情況。存在將事前進行診斷而進行適當之治療稱為「伴隨治療(companion treatment)」，將用於其之診斷藥稱為「伴隨診斷藥」之情形。

於本說明書中，所謂「治療藥(劑)」廣義上係指可對目標狀態(例如癌、過敏等疾病等)進行治療之所有藥劑。於本發明之一實施形態中，「治療藥」亦可為包含有效成分、及藥理學上容許之1種或者其以上之載體之醫藥組合物。醫藥組合物例如可將有效成分與上述載體混合，藉由製劑學之技術領域中已知之任意方法而製造。又，治療藥只要為用於治療者，則使用形態並無限定，可為有效成分單獨，亦可為有效成分與任意成分之混合物。又，上述載體之形狀並無特別限定，例如亦可為固體或液體(例如緩衝液)。再者，癌、過敏等之治療藥包括用於預防癌、過敏等之藥物(預防藥)、或癌、過敏等之抑制劑。

於本說明書中，所謂「預防」係指針對某疾病或障礙(例如過敏)，在成為此種狀態前阻止成為此種狀態。可使用本發明之藥劑進行診斷，視需要使用本發明之藥劑例如進行過敏等之預防，或採取用於預防之對策。

於本說明書中，所謂「預防藥(劑)」廣義上係指可對目標狀態(例如過敏等疾病等)進行預防之所有藥劑。

於本說明書中，所謂「套組」通常係指提供應分成2個以上之子 部分而提供之部分(例如檢驗藥、診斷藥、治療藥、抗體、標記、說明書等)之單元。為了穩定性等，不應進行混合而提供，於以提供如較佳為於即將使用前進行混合而使用之組合物為目標時，該套組之形態較佳。較佳為，此種套組具備記載如何使用所提供之部分(例如檢驗藥、診斷藥、治療藥)、或應如何處理試劑之指示書或說明書，此情況較有利。於本說明書中，於套組係以試劑套組之形式使用之情形時，套組中通常包含記載有檢驗藥、診斷藥、治療藥、抗體等之用法等之指示書等。

於本說明書中，「指示書」係記載有對醫師或其他使用者說明使用本發明之方法者。該指示書記載有本發明之檢測方法、診斷藥之用法、或指示投予醫藥等之內容。又，於指示書中，亦可記載有指示經口投予、向食道之投予(例如利用注射等)作為投予部位之內容。該指示書係根據實施本發明之國家之監督政府機構(例如，於日本為厚生勞動省，於美國為食品及藥物管理局(FDA)等)所規定之格式而製作，明確記載有由其監督政府機構所認可之要點。指示書係所謂隨附文件(package insert(藥品說明書))，通常係以紙媒體提供，但並不限定於此，例如亦能以電子媒體(例如網際網路中所提供之首頁、電子郵件)之類的形態提供。

(較佳實施形態之態樣)

以下，對本發明之較佳實施形態進行說明。以下所提供之實施形態係為了更佳地理解本發明而提供者，可理解本發明之範圍不應限定於以下之記載。因此，明確從業者可參考本說明書中之記載，而於本發明之範圍內進行適當改變。又，可理解本發明之以下之實施形態可單獨使用或可將該等組合而使用。

<單劑形態>

於一態樣中，本發明提供一種包含複合體之抗癌劑，該複合體 包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖。於本發明中，發現本發明之複合體本身係作為抗癌劑而發揮作用。先前，本發明者等人僅發現該複合體可用作佐劑並提出申請，未預測可直接以單劑之形式用作抗癌劑。因此，就於無癌抗原之情況下使用之觀點而言，可認為帶來無法預料之效果。

於一實施形態中，本發明之抗癌劑之特徵在於：於無癌抗原之情況下進行投予。

於另一實施態樣中，本發明之抗癌劑之特徵在於：其係以傳遞至網狀內皮系統及/或淋巴結之方式進行投予。較佳為上述網狀內皮系統及/或淋巴結包含腫瘤及巨噬細胞。例示性地上述網狀內皮系統包含脾臟及/或肝臟。因此，本發明之抗癌劑之特徵在於：其係以傳遞至包含腫瘤及巨噬細胞之網狀內皮系統臟器(脾臟、肝臟等)及/或淋巴結之方式進行投予。不希望被理論所束縛，揭示本發明之複合體被傳遞至腫瘤及巨噬細胞，並於此處將癌之死細胞募集(recruit)至網狀內皮系統臟器(脾臟、肝臟等)內。藉此，認為可進一步驅逐身體內之癌細胞。因此，本發明並非使用特定癌抗原作為佐劑而針對特定之癌，就可殺傷存在於身體內之任意癌細胞而可提供前所未有之抗癌劑之觀點而言，可認為帶來顯著之效果。

因此，於更佳實施形態中，本發明之上述抗癌劑之特徵在於：其係於無癌抗原之情況下，以傳遞至腫瘤及巨噬細胞之方式進行投予。

此種傳遞方法可使用任意方法，例如上述投予可列舉全身性投予，但並不限定於此。較佳為全身性投予，作為全身性投予，可列舉：靜脈內投予、腹腔內投予、經口投予、皮下投予、肌內投予等。 於一實施形態中，本發明中所使用之寡聚去氧核苷酸可列舉：K3(序列編號1)、K3-dA₄₀(序列編號2)、dA₄₀-K3(序列編號3)、K3-dA20(序列編號4)、K3-dA25(序列編號5)、K3-dA30(序列編號6)及K3-dA35(序列編號7)等，但並不限定於該等。

於一實施形態中，本發明中所使用之β-1,3-葡聚糖亦可為裂褶菌多糖(SPG)、香菇多糖、硬葡聚糖、卡德蘭多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖、昆布糖等。

於較佳實施形態中，本發明之複合體為K3-SPG或其類似物。此處，所謂類似物，可列舉於CpG側結構與K3類似者、於β葡聚糖側結構與SPG類似者等，但並不限定於該等。

再者，由於抗癌作用係利用各種機制，故而用於使癌之死細胞集聚於脾臟等用途並不容易想到。尤其是於投予全身性時，不會想到用於集聚於腫瘤，使死亡之腫瘤細胞集聚於脾臟等組織之用途。又，介白素12(IL12)及/或干擾素(IFN)α之表現或表現促進效果亦利用與抗癌作用不同之機制，介白素12(IL12)及/或干擾素(IFN)α之表現或表現促進於抗癌以外亦可發揮，故而並非容易相互想到者。因此，可認為本發明之CpG-β葡聚糖複合體之各用途(抗癌用途(以單劑之形式)、使癌之死細胞集聚於脾臟之用途、用於介白素12(IL12)及/或干擾素(IFN)α之表現或表現促進之用途)處於不認為可容易相互想到之關係。

<網狀內皮系統(包括脾臟及/或肝臟)及/或淋巴結集聚劑>

於另一態樣中，本發明提供一種包含複合體，且用於使癌之死細胞集聚於網狀內皮系統(包含脾臟及/或肝臟)及/或淋巴結之組合物，且該複合體包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖。不希望被理論 所束縛，發現本發明之複合體可使癌之死細胞集聚於網狀內皮系統(包含脾臟及/或肝臟)及/或淋巴結。如實施例中所例證，證實利用K3-SPG之類的本發明之複合體所進行之處理係以依賴於IL12p40及IFN-I之兩者之態樣而誘發腫瘤細胞死亡。先前未預測到複合體具有此種作用，於該意義上可認為實現無法預料之作用效果。即，CpG係經腫瘤微環境中之吞噬細胞進行標靶化者。若癌之死細胞集聚於網狀內皮系統(包含脾臟及/或肝臟)及/或淋巴結，則其後，所釋出之腫瘤死細胞誘發針對複數個腫瘤抗原之抗腫瘤CTL，位於身體內之癌細胞亦可如被霰彈槍攻擊般被殺傷而根治。不希望被理論所束縛，產生腫瘤微環境中之IL12及IFN-I細胞激素之兩者雖然不認為係K3-SPG單劑治療所必須，但較重要。

於一實施形態中，本發明中所使用之寡聚去氧核苷酸係選自由K3(序列編號1)、K3-dA₄₀(序列編號2)、dA₄₀-K3(序列編號3)、K3-dA20(序列編號4)、K3-dA25(序列編號5)、K3-dA30(序列編號6)及K3-dA35(序列編號7)所組成之群中。

於另一實施態樣中，本發明中所使用之β-1,3-葡聚糖係選自由裂褶菌多糖(SPG)、硬葡聚糖、卡德蘭多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖及昆布糖所組成之群中。

於較佳實施形態中，本發明之複合體為K3-SPG。

於一實施形態中，成為本發明之組合物之對象的網狀內皮系統及/或淋巴結包含腫瘤及巨噬細胞。例示性地上述網狀內皮系統包含脾臟及/或肝臟。因此，本發明之組合物之特徵在於：其係以傳遞至包含腫瘤及巨噬細胞之網狀內皮系統臟器(脾臟、肝臟等)及/或淋巴結之方式進行投予。不希望被理論所束縛，揭示本發明之複合體被傳遞至腫瘤及巨噬細胞，並在此將癌之死細胞募集至網狀內皮系統臟器(脾臟、肝臟等)。藉此，認為可進一步驅逐身體內之癌細胞。因此， 本發明並非使用特定癌抗原作為佐劑而針對特定之癌，就可殺傷存在於身體內之任意癌細胞而可提供前所未有之抗癌劑之觀點而言，可認為帶來顯著之效果。

因此，於更佳實施形態中，本發明之上述抗癌劑之特徵在於：其係於無癌抗原之情況下，以傳遞至腫瘤及巨噬細胞之方式進行投予。

此種傳遞方法可使用任意方法，例如上述投予可列舉全身性投予，但並不限定於此。較佳為全身性投予，作為全身性投予，可列舉：靜脈內投予、腹腔內投予、經口投予、皮下投予、肌內投予等。

<IL12及/或IFN表現促進劑>

進而，於另一態樣中，本發明提供一種用於介白素12(IL12)及/或干擾素(IFN)γ之表現或表現促進之組合物，其包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖。產生腫瘤微環境中之IL12及IFN-I細胞激素之兩者係K3-SPG單劑治療中之重要作用效果，此種效果除作為抗癌劑之作用以外，於其他用途中亦較重要。作為此種處理之對象，可列舉癌、此外之病毒等慢性感染症疾病、病毒感染預防等，但並不限定於該等。

於一實施形態中，本發明中所使用之寡聚去氧核苷酸係選自由K3(序列編號1)、K3-dA₄₀(序列編號2)、dA₄₀-K3(序列編號3)、K3-dA20(序列編號4)、K3-dA25(序列編號5)、K3-dA30(序列編號6)及K3-dA35(序列編號7)所組成之群中。

於另一實施態樣中，本發明中所使用之β-1,3-葡聚糖係選自由裂褶菌多糖(SPG)、硬葡聚糖、卡德蘭多糖、茯苓多糖、灰樹花多糖及昆布糖所組成之群中。

於較佳實施形態中，本發明之複合體為K3-SPG。

(醫藥品、劑型等)

本發明係以上述各種形態之醫藥(治療藥或預防藥)之形式提供。

治療藥之投予途徑較佳為使用在治療時有效者，例如亦可為靜脈內、皮下、肌內、腹腔內、或經口投予等。作為投予形態，例如亦可為注射劑、膠囊劑、錠劑、顆粒劑等。於投予本發明之成分之情形時，有效的是製成注射劑而使用。注射用之水溶液例如亦可於小玻璃瓶、或不鏽鋼容器中保存。又，注射用之水溶液例如亦可調配生理鹽水、糖(例如海藻糖)、NaCl、或NaOH等。又，治療藥例如亦可調配緩衝劑(例如磷酸鹽緩衝液)、穩定劑等。

通常，本發明之組合物、醫藥、治療劑、預防劑等包含治療有效量之治療劑或有效成分、及藥學上可容許之載體或者賦形劑。於本說明書中，「藥學上可容許」係指於用於動物、並且更詳細而言人體之經政府之監督政府機構許可、或藥典或其他通常所認可之藥典中被列舉。於本說明書中，所使用之「載體」係指與治療劑一併投予之稀釋劑、佐劑、賦形劑、或媒劑。此種載體亦可為無菌液體、例如水及油，包含石油、動物、植物或合成起源者，並無限定，包含花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。於經口投予醫藥之情形時，水為較佳之載體。於將醫藥組合物靜脈內投予之情形時，生理鹽水及水性葡萄糖為較佳之載體。較佳為將生理鹽水溶液、以及水性葡萄糖及甘油溶液用作可注射之溶液之液體載體。於適當之賦形劑中，包含輕質無水矽酸、結晶纖維素、甘露醇、澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、小麥粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油、滑石、氯化鈉、脫脂粉乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、羧甲基纖維素鈣、羧甲基纖維素鈉、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯基縮醛(二乙基胺基)乙酸酯、聚乙烯基吡咯啶酮、明膠、中鏈脂肪酸三甘油酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、白糖、羧甲基纖維素、玉米澱粉、 無機鹽等。於較理想之情形時，組合物亦可含有少量濕潤劑或乳化劑、或pH值緩衝劑。該等組合物亦可採用溶液、懸浮物、乳膠、錠劑、丸劑、膠囊、粉末、緩釋調配物等形態。亦可使用傳統之結合劑及載體、例如三酸甘油酯，調配組合物而製成栓劑。經口調配物亦可包含醫藥等級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等標準載體。適當之載體之例係記載於E.W.Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences(Mark Publishing Company,Easton,U.S.A)中。關於此種組合物，為了提供向患者適當地投予之形態，含有適當量之載體及治療有效量之治療劑、較佳為純化型者。調配物必須適合投予方式。除該等以外，例如亦可含有界面活性劑、賦形劑、著色料、著香料、防腐劑、穩定劑、緩衝劑、懸浮劑、等張劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、流動性促進劑、矯味劑等。

於本發明之一實施形態中，「鹽」例如包含由任意酸性(例如羧基)基所形成之陰離子鹽、或由任意鹼性(例如胺基)基所形成之陽離子鹽。鹽類包含無機鹽或有機鹽，例如包含Berge et al.,J.Pharm.Sci.,1977,66,1-19中所記載之鹽。又，例如可列舉：金屬鹽、銨鹽、與有機鹼之鹽、與無機酸之鹽、與有機酸之鹽等。於本發明之一實施形態中，「溶劑合物」係由溶質及溶劑所形成之化合物。關於溶劑合物，例如可參照J.Honiget al.,The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650(1953)。若溶劑為水，則所形成之溶劑合物為水合物。該溶劑較佳為不阻礙溶質之生物活性者。作為此種較佳溶劑之例，並無特別限定，可列舉水、或各種緩衝液。於本發明之一實施形態中，「化學修飾」例如可列舉：利用PEG(Polyethylene Glycol，聚乙二醇)或者其衍生物所進行之修飾、螢光素修飾、或生物素修飾等。

於將本發明製成醫藥而投予之情形時，已知有各種傳遞(Delivery)系統，並且亦可使用此種系統，向適當之部位(例如食道)投 予本發明之治療劑，此種系統中例如有於脂質體、微小粒子、及微小膠囊中之囊封；可表現治療劑(例如多肽)之重組細胞之使用，受體所介導之內噬作用(endocytosis)之使用；治療核酸作為反轉錄病毒載體或其他載體之一部分之構建等。導入法包括皮內、肌內、腹腔內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、及經口途徑，但不限定於該等。亦可藉由適宜途徑之任一種，例如藉由注入、藉由團注(bolus injection)、藉由通過上皮或皮膚黏膜內層(例如口腔黏膜、直腸黏膜及腸黏膜等)之吸收而投予醫藥，視需要可使用霧劑，使用吸入器或噴霧器，並且亦可與其他生物學活性劑一併投予。投予亦可為全身性或局部。於本發明用於癌之情形時，進而可藉由向癌(病變部)直接注入等適當途徑之任一種而進行投予。

於較佳實施形態中，可依據公知之方法，以適合向人類之投予之醫藥組合物之形式調配組合物。此種組合物可藉由注射而投予。用於注射投予之組合物代表性而言為無菌等張水性緩衝劑中之溶液。又，於必要時，組合物亦可包含助溶劑及緩解注射部位之疼痛之利多卡因等局部麻醉劑。通常，分別供給成分或於單位劑量投藥器中一併混合而供給，例如可於顯示活性劑之量之安瓿或藥囊(sachet)等密封容器中，以冷凍乾燥粉末或不含水之濃縮物之形式供給。欲藉由注入組合物而進行投予之情形時，亦可使用含有無菌藥劑等級之水或生理鹽水之注入器而進行分配。於欲藉由注射組合物而進行投予之情形時，亦可於投予前，以可混合成分之方式提供注射用之無菌水或生理鹽水之安瓿。

亦可於中性型或鹽型或其他前驅藥(例如酯等)中調配本發明之組合物、醫藥、治療劑、預防劑。藥學上可容許之鹽包括與源自鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之游離型之羧基一併形成者，與源自異丙基胺、三乙基胺、2-乙基胺基乙醇、組胺酸、普魯卡因等者等之游 離型之胺基一併形成者，以及源自鈉、鉀、銨、鈣、及氫氧化鐵等者。

對於特定障礙或狀態之治療有效之本發明之治療劑之量可根據障礙或狀態之性質而變化，熟知本技藝者可基於本說明書之記載根據標準臨床技術而確定。進而，視情形亦可使用活體外分析，而輔助最佳投藥量範圍之鑑定。又，欲用於調配物中之準確之用量亦可根據投予途徑、及疾病或障礙之重大性而變化，故而應依據主治醫師之判斷及各患者之狀況而確定。但是，投予量並無特別限定，例如可為每1次0.001、1、5、10、15、100、或1000mg/kg體重，亦可為該等任兩個值之範圍內。投予間隔並無特別限定，例如可每1、7、14、21、或28天投予1或2次，亦可每該等任兩個值之範圍投予1或2次。關於投予量、投予間隔、投予方法，亦可根據患者之年齡或體重、症狀、對象臟器等而進行適當選擇。又，治療藥較佳為包含治療有效量、或發揮所需作用之有效量之有效成分。於惡性腫瘤標記物於投予後顯著減少之情形時，亦可判斷為具有治療效果。有效用量可根據由活體外或動物模型試驗系統獲得之用量-反應曲線而進行推定。

於本發明之一實施形態中，「患者」或「被實驗體」包括人類、或除人類以外之哺乳動物(例如小鼠、豚鼠、倉鼠、大鼠、老鼠、兔、豬、綿羊、山羊、牛、馬、貓、狗、狨猿(marmoset)、猴、或黑猩猩(chimpanzee)等之1種以上)。

本發明之醫藥組合物或治療劑或者預防劑可以套組之形式提供。

於特定實施形態中，本發明提供一種藥劑包或套組，其包含填充有本發明之組合物或醫藥之1種以上之成分的1個以上之容器。視情形亦可於此種容器上，以由控制醫藥或生物學製品之製造、使用或銷售之政府機關所規定之形式附帶顯示表明政府機關許可用於人類投予 之製造、使用或銷售之資訊。

於特定實施形態中，可藉由脂質體、微小粒子、或微小膠囊而投予包含本發明之成分之醫藥組合物。於本發明之多樣化態樣中，亦有使用此種組合物而於實現本發明之成分之緩釋方面有用之可能性。

本發明之治療藥、預防藥等作為醫藥等之製劑化順序係於該領域中公知，例如記載於日本藥典、美國藥典、其他國家之藥典等中。因此，只要有本說明書之記載，則從業者可在不過度進行實驗之情況下決定應使用之量等實施形態。

(一般技術)

本說明書中可使用之分子生物學方法、生物化學方法、微生物學方法係於該領域中周知且慣用者，例如係記載於Sambrook J.et al.(1989).Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor及其3rd Ed.(2001)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Ausubel,F.M.(1989).Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience；Innis,M.A.(1990).PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications,Academic Press；Ausubel,F.M.(1992).Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates；Ausubel,F.M.(1995).Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates；Innis,M.A.et al.(1995).PCR Strategies,Academic Press；Ausubel,F.M.(1999).Short Protocols in Molecular Biology：A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology,Wiley,and annual updates；Sninsky,J. J.et al.(1999).PCR Applications：Protocols for Functional Genomics,Academic Press、增刊實驗醫學「基因導入&表現解析實驗法」羊土社、1997等中，且於本說明書中係以參考之形式引用該等之相關部分(可為全部)。

關於用於製作人工合成之基因的DNA合成技術及核酸化學，例如記載於Gait,M.J.(1985).Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach,IRL Press；Gait,M.J.(1990).Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach,IRL Press；Eckstein,F.(1991).Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach,IRL Press；Adams,R.L.et al.(1992).The Biochemistry of the Nucleic Acids,Chapman & Hall；Shabarova,Z.et al.(1994).Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids,Weinheim；Blackburn,G.M.et al.(1996).Nucleic Acids in Chemistry and Biology,Oxford University Press；Hermanson,G.T.(I996).Bioconjugate Techniques,Academic Press等中，且於本說明書中係以參考之形式引用該等之相關部分。

例如，於本說明書中，亦可藉由該領域中已知之標準法，例如藉由使用自動化DNA合成裝置(由Biosearch、Applied Biosystems等所銷售者等)，而合成本發明之寡聚核苷酸。例如亦可藉由Stein等人(Stein et al.,1988,Nucl.Acids Res.16：3209)之方法，而合成硫代磷酸-寡聚核苷酸，亦可藉由使用調節孔玻璃聚合物支持體(Sarinet al.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：7448-7451)等，而製備膦酸甲酯-寡聚核苷酸。

於本說明書中，「或」係於可採用文章中所列舉之事項之「至少1個以上」之時使用。「或者」亦相同。於本說明書中，於明確記載為「兩個值之範圍內」之情形時，該範圍亦包括兩個值本身。

於本說明書中，關於所引用之科學文獻、專利、專利申請等參 考文獻，其所有內容係以與分別具體地記載者相同之程度，以參考之形式引用至本說明書中。

以上，為了使本發明易於理解，揭示較佳實施形態而進行了說明。以下，基於實施例對本發明進行說明，但上述說明及以下之實施例係僅基於例示之目的而提供，並非為了限定本發明而提供。因此，關於本發明之範圍，並不限定於本說明書中具體地記載之實施形態及實施例，而僅受申請專利範圍所限定。

[實施例]

以下，記載實施例。必要時，關於以下之實施例中所使用之動物之處理，所有動物實驗係依據日本醫藥基盤研究所及大阪大學動物設施之機關指南而實施。又，基於赫爾辛基(Helsinki)宣言而進行。試劑類具體而言係使用實施例中所記載之製品，但亦可利用其他製造商(Sigma-Aldrich、和光純藥、Nacalai、R&D Systems、USCN Life Science INC等)之同等品代替使用。

(製造實施例)

以下之CpG ODNs係Genedesign股份有限公司所合成(下劃線表示硫代磷酸酯鍵)。

K3(5'-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-3')(序列編號1)；K3-dA₄₀(5'-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-40mer A-3')(序列編號2)；dA₄₀-K3(5'-40mer A-ATC GAC TCT CGA GCG TTC TC-3')(序列編號3)；Alexa 488-labeled K3；Alexa 488-labeled K3-dA40；Alexa 647-labeled K3；Alexa 647-labeled K3-dA40

特別是，除上述K3-dA40(序列編號2)外，記載關於K3-dA35(序列編號7)、K3-dA30(序列編號6)、K3-dA25(序列編號5)及K3-dA20(序列編號4)之合成(表2)。

K3-dA40：AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA(序列表之序列編號2)

K3-dA35：AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA(序列表之序列編號7)

K3-dA30：AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA(序列表之序列編號6)

K3-dA25：AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA(序列表之序列編號5)

K3-dA20：AsTsCsGsAsCsTsCsTsCsGsAsGsCsGsTsTsCsTsCsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsAsA(序列表之序列編號4)

(上述序列中之s表示核苷間之磷酸二酯鍵被取代為硫代磷酸酯鍵)

本寡聚去氧核苷酸係使用作為常法之固相亞磷醯胺法(Nucleic Acids in Chemistry and Biology,3.Chemical synthesis(1990)ed.G.Michael Blackburn and Michael J.Gait.Oxford University Press)而進行合成。

卵白蛋白(OVA)係自生化學工業股份有限公司購買。DQ-OVA、Alexa488-OVA、CFSE、及Lipofectamine 2000係自Invitrogen購買。Hoechst 33258、酵母聚糖(zymosan)及卡德蘭多糖係自SIGMA購買。Zymosan-Depleted係自Invivogen購買。氯屈膦酸鹽脂質體係自FormuMax購買。流行性感冒裂解產物疫苗、福馬林不活化全病毒(WIV)、及純化流行性感冒病毒(H1N1)係如先前所記載般製備(Koyama,S.,et al.,Science translational medicine 2,25ra24(2010))。

CpG ODN與SPG之複合體化(製造實施例圖1)

將7.22mg之K3-dA40溶解於水(3.7mL)中。將SPG(三井製糖)15 mg溶解於0.25N之NaOH(1mL)中。將1mL之330mM之NaH₂PO₄添加至DNA溶液中，繼而將SPG溶液添加至DNA/NaH₂PO₄溶液中，並於4℃下維持一晚，藉此結束複合體化。莫耳比(MSPG/MDNA)係固定為0.27。關於複合體之形成，利用微晶片電泳裝置(SHIMADZU：MultiNA)所確認之複合體之形成係藉由使用尺寸排除層析法，監測260nm下之吸收而確認CpG ODN之向高分子量側之位移(系統：Agilent 1100系列，管柱(Column)：將Asahipak GF7M-HQ(Shodex)2根進行連結，流速：0.8mL/min，緩衝液：10mM之EDTA(Ethylenediamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)PBS(Phosphate Buffer Solution，磷酸鹽緩衝液)，pH值7.4，溫度：40℃)。

(為了用於實施例之準備)

於以下之實施例中，揭示可進行如下全身性之單劑治療，該全身性之單劑治療係利用誘發較強之腫瘤縮小之以腫瘤微環境中之巨噬細胞作為標靶之奈米粒子狀TLR9促效劑而進行。

(材料及方法)

以下，對本實施例中所使用之試劑、材料、動物、細胞及其方法進行說明。於各實施例中亦適當進行補充說明。

(動物及試劑)

自Nihon CLEA購買6週齡之雌性C57BL/6J小鼠。自Jackson Laboratory購買Il12p40缺損小鼠及Batf3缺損小鼠。Ifnar2缺損小鼠、Myd88缺損小鼠及Dectin-1缺損小鼠係如上述所記載(Kobiyama,K.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,3086-3091(2014))。依據醫藥基盤研究所之機關指南進行所有動物實驗。K3係藉由Gene Design(基因設計)而合成。自生化學工業購買卵白蛋白(OVA)。

(細胞株)

EL4及表現OVA之EL4(EG7)為C57BL/6J小鼠之胸腺瘤細胞株，係自ATCC購買。自Japanese Collection of Research Bioresourses(日本細胞庫)購買B16(黑色素瘤)。自理研細胞庫購買B16F10(黑色素瘤)，MC38(結腸癌)係由F.JAMES Primus博士提供。自Jackson's Laboratory購買Pan02(胰臟癌)。於完全RPMI(追加有10%(v/v)胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)、青黴素、及鏈黴素之RPMI 1640)中培養EL4、EG7、MC38、及Pan02。於完全DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium，杜貝克改良伊格爾培養基)(追加有10%(v/v)胎牛血清(FBS)、青黴素、及鏈黴素之DMEM)中培養B16及B16F10。

(腫瘤實驗及治療方法)

將EG7、EL4、B16、B16F10、及MC38細胞(於10%受質膠/PBS中以5×10⁶細胞/mL計為100μl)(s.c)接種至小鼠之右側腹部之皮下。對於腫瘤尺寸，測定腫瘤之長度(L)、寬度(W)、及高度(H)，將腫瘤體積(V)根據V=L×W×H而計算。藉由腫瘤內注射(i.t.)而直接注射至腫瘤部位。CpG治療係於腫瘤體積達到約100mm³後開始，該時期為EG7及B16F10之接種7天後、B16之接種10天後、以及MC38之接種14天後。每隔1天利用K3(30μg)或K3-SPG(10μg)對帶有腫瘤之小鼠進行3次處理。

(Pan02之腹膜接種模型)

於Pan02之腹膜接種模型中，向腹腔內注射1×10⁶個Pan02細胞(於PBS中以1×10⁷細胞/mL計為100μl)。於接種11天後開始CpG治療，於第21天自小鼠之腹膜摘除所有腫瘤小結節，其後測定該等之重量(g)。CpG治療中之投予量如上所述。

(活體內成像實驗)

為了評價K3及K3-SPG之存在，於第0天對C57BL/6小鼠s.c.接種EG7，於第12天i.v.投予PBS(對照)、Alexa 647-K3(30μg)、或Alexa 647-K3-SPG(10μg)。投予1小時後，利用IVIS(註冊商標)螢光成像系統(Lumina Imaging System)及分析軟體(Ver.2.6，Xenogen)對小鼠進行分析，將藉由相對螢光測得之影像轉換為表面放射亮度之物理單位(光子/sec/cm²/sr)。為了檢測於活體內經標記之CD8⁺T細胞，於第14天自於第7、9、11天利用K3-SPG進行處理、或未經處理之帶有EG7之C57BL/6小鼠或Il12p40-Ifnar2基因雙剔除小鼠回收脾細胞。於脾細胞之懸浮後，利用ACK溶解緩衝液(150mM之NH₄Cl、10mM之KHCO₃、0.1mM之Na₂EDTA)將紅血球溶解，並將細胞維持於完全RPMI中。藉由MACS(Magnetic Activated Cell Sorting，磁性激活細胞分選)(Miltenyi Biotec)對CD8α⁺T細胞進行分選。藉由陰性選擇之方法而分選CD8α⁺T細胞。其後，利用Xenolight DiR(註冊商標)對所分選之CD8α⁺T細胞進行染色。於第14天(於第0天接種EG7，於7、9、第11天利用K3-SPG進行i.v.處理、或未經處理之C57BL/6小鼠或Il12p40-Ifnar2基因雙剔除小鼠)將經染色之CD8α⁺T細胞移植至受移植小鼠。移植經染色之細胞24小時後，利用IVIS(註冊商標)螢光成像系統(Lumina Imaging System)(Ver.2.6)對小鼠進行分析。將目標區域彙集於腫瘤區域，利用活動影像軟體(Living Image Software)(Ver.2.6、Xenogen)對螢光強度進行分析。

(免疫組織化學)

對C57BL/6J小鼠(6-8週齡，雌，CLEA Japan)，自尾靜脈i.v.注射Alexa 647-K3(30μg)、Alexa 647-K3-SPG(10μg)、及葡聚糖-PE(20μg)。注射後1小時後將腫瘤回收，利用4%(w/v)多聚甲醛將冷凍切片固定10分鐘，利用Hoechst 33258及抗CD3e抗體、抗CD8β抗體進行染色。使用Olympus IX81系統對細胞進行拍攝。利用MetaMorph而分析影像資料。

(耗竭實驗)

為了使吞噬細胞(樹狀細胞及巨噬細胞)耗竭，於接種EG7 5天後對C57BL/6小鼠i.v.注射氯屈膦酸鹽脂質體或對照脂質體(100nm)(片山化學)。為了使CD8⁺T細胞耗竭，於接種EG7 6天後及13天後向尾靜脈i.v.注射200μg之抗CD8α抗體。

(脾細胞之分析)

於第14天自於第7、9、11天利用K3-SPG進行i.v.處理、或未經處理之帶有EG7之C57BL/6小鼠或Il12p40-Ifnar2基因雙剔除小鼠回收脾細胞。於製備脾細胞後，利用ACK溶解緩衝液將紅血球溶解，並於完全RPMI中維持細胞。利用H-2K^b OVA四聚物(MBL)、抗CD8α抗體(KT15)、抗TCRβ抗體(H57-597)、抗CD62L抗體(MEL-14)、及抗CD44抗體(IM7)、以及7-胺基放線菌素D(7AAD，7-Aminoactinomycin D)對脾細胞進行染色。利用流式細胞儀確定OVA四聚物⁺CD44⁺CD8α⁺TCRβ⁺之細胞數。關於其他實驗，將所製備之脾細胞與抗CD45抗體、抗CD3e抗體、抗CD8α抗體、及抗CD11a抗體一併培養，其後利用流式細胞儀進行分析。

(CD45陰性細胞之分析及免疫化)

於第12天自於第7、9、11天利用K3-SPG進行i.v.處理、或未經處理之帶有EG7之C57BL/6小鼠或Il12p40-Ifnar2基因雙剔除小鼠回收脾細胞。於製備脾細胞後，利用ACK溶解緩衝液將紅血球溶解，並於完全RPMI中維持細胞。利用抗CD45抗體(APC)對脾細胞進行染色，利用流式細胞儀確定CD45^-細胞之數量。進而，利用PI及Hoechst 33342對凋亡細胞、壞死細胞、及CD45陰性活細胞之亞群進行染色，其後利用流式細胞儀進行分析。其次，自利用K3-SPG進行處理之帶有腫瘤之C57BL/6小鼠中，利用INFLUX(BD Bioscience)而分選CD45^-細胞。

(疫苗接種模型)

對C57BL/6小鼠於第-7天i.v.投予5×10⁵個CD45^-細胞。免疫化7天後，於第0天對小鼠s.c.接種5×10⁵個EG7細胞。

(細胞激素之測定)

使用R & D之ELISA套組測定小鼠IL-12p40、小鼠IL-13、及人類IFNγ之量。

(統計分析)

將包括Mann-Whitney之U檢定、Student之t檢定或Bonferroni之多重比較檢定在內之單向變方分析(one-way analysis of variance)用於統計分析(* p<0.05；* * p<0.01；* * * p<0.001)。使用GraphPad Prism software(La Jolla、CA、USA)進行統計分析。

(實施例1：關於K3-SPG之靜脈內注射，即便完全未添加腫瘤抗原，亦會誘發較強之腫瘤生長之抑制)

於本實施例中，藉由K3-SPG之靜脈內注射，證明即便完全未添加腫瘤抗原，亦會誘發較強之腫瘤生長之抑制。

(利用EG7(表現OVA之小鼠胸腺瘤細胞株)模型之實驗)

於第0天對C57BL/6小鼠於右側腹部接種EG7(表現OVA之小鼠胸腺瘤細胞株)，經由尾基部附近之皮下(i.d.)投予、腫瘤內(i.t.)投予、或靜脈內(i.v.)投予之3種不同途徑，利用PBS、及等莫耳量之K3(30μg)或K3-SPG(10μg)進行3次處理(接種7、9、11天後)。每2~3天測定腫瘤尺寸直至第23天為止。

(結果)

結果示於圖2(A~B)以下。於PBS之群(對照)中，腫瘤生長經由任一投予途徑均未受到抑制(圖2a、b、c(圖2A))。於K3處理中，腫瘤縮小僅於i.t.中觀察到，於其他途徑中未觀察到(圖2d、e、f(圖2A))。於K3-SPG處理中，藉由i.t.及i.v.之兩者觀察到較強之腫瘤縮小，i.d.投予未顯示出對腫瘤生長之影響(圖2g、h、i(圖2A))。將比較對照、 K3及K3-SPG而表示之圖示於圖(圖2a、d、g(圖2A))中。

於先前技術中，由於針對癌之全身性CpG ODN治療中之大部分嘗試並未成功(Lou,Y.,et al.Journal of immunotherapy(Hagerstown,Md.：1997)34,279-288(2011)；Nierkens,S.,et al.PLoS One 4,e8368(2009))，故而無法預測利用K3-SPG之i.v.單劑治療可較強地抑制腫瘤生長之事實，於該方面證明本發明產生了無法預料之效果。

(利用其他腫瘤細胞株之實驗)

為了調查該K3-SPG全身性單劑治療之潛能，其他腫瘤細胞株亦藉由在EG7模型中所使用之同樣之實驗方法進行試驗。

(結果)

K3-SPG之靜脈內投予亦抑制黑色素瘤(B16及B16F10)及結腸癌(MC38)之生長(圖2j、k、l(圖2B))。本發明者等人進而藉由製作臨床惡性度更高之腫瘤接種性模型而進行試驗。將小鼠胰臟腫瘤株、Pan02(1×10⁶細胞)接種至腹腔內(亦稱為「i.p.」)，其後，於接種11天後開始利用K3或K3-SPG之治療(每隔1天進行3次)。於第21天處死所有小鼠，評價腹腔之腫瘤之總重量(圖2m(圖2B))。關於腫瘤生長，於K3-SPG i.v.處理群中顯著地得到抑制，但於K3 i.p.及K3-SPG i.p.處理群中，未受到抑制(圖2m(圖2B))。與此相應地，於K3-SPG i.v.處理群中觀察到顯著之存活之延長，但於K3 i.v.群中未觀察到(圖2n(圖2B))。該等結果證明，K3-SPG之全身性i.v.投予係針對大部分不同之癌之有前景之單劑治療，進而亦無需任一腫瘤肽及抗原。

(實施例2：K3-SPG係於腫瘤微環境中以吞噬細胞作為標靶)

其次，本發明者等人闡明了K3-SPG之腫瘤微環境之機制。

K3-SPG形成約30nm之尺寸之奈米粒子(Kobiyama,K.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,3086-3091(2014))。本發明者等人假設K3-SPG係經由及至腫瘤之藥物傳遞系統而發揮功能(Na,J.H.,et al. Journal of controlled release：official journal of the Controlled Release Society 163,2-9(2012)；Petros,R.A.et al.Nat Rev Drug Discov 9,615-627(2010)；Pante,N.et al.Molecular biology of the cell 13,425-434(2002)；Davis,M.E.,et al.Nat Rev Drug Discov 7,771-782(2008)；Farokhzad,O.C.et al.ACS Nano 3,16-20(2009))。

(螢光標記成像)

為了對活體內之分佈進行試驗，將K3及K3-SPG進行螢光標記。對帶有EG7腫瘤之小鼠i.v.注射PBS、Alexa647-K3(30μg)、或Alexa647-K3-SPG(10μg)，其後利用活體內成像系統(IVIS)對螢光之分佈進行試驗。

將結果示於圖4以下。

IVIS成像表明，於i.v.投予1小時後，並非K3蓄積於腫瘤部位，而是K3-SPG蓄積於腫瘤部位(圖4a)。觀察到腫瘤中之K3-SPG之蓄積係與CpG單劑治療之腫瘤縮小之有效性密切相關(圖2)。於免疫組織化學(IHC，Immunology Histology Chemistry)試驗中，本發明者等人未能於腫瘤微環境中檢測出Alexa647-K3(圖4b)。另一方面，Alexa647-K3-SPG於腫瘤區域中被觀察到(圖4c)。本發明者等人於24小時後未能檢測到IHC中之Alexa647訊號。EG7細胞於其表面上表現CD3e(其原因在於EG7係源自胸腺瘤細胞株)，K3-SPG未聚集於CD3e，此顯示出K3-SPG係被非腫瘤細胞取入。奈米粒子係選擇被巨噬細胞及樹狀細胞(DC)等吞噬細胞取入，該等細胞可於活體內藉由TRITC(Tetramethyl Rhodamine Iso-thiocyanate，四甲基異硫氰酸羅丹明)-葡聚糖進行標記。因此，本發明者將經螢光染色之K3、K3-SPG、或SPG及TRITC-葡聚糖進行靜脈內注射，對利用IHC之該等之共存進行試驗(圖4d、e、f)。i.v.注射1小時後，葡聚糖於全部試樣之腫瘤區域中被觀察到(圖4d、e、f)，此顯示出腫瘤微環境包含吞噬細胞。與先前之結果一 致，Alexa647-K3於腫瘤內未被觀察到(圖4d)。於腫瘤內觀察到之約50%之Alexa647-K3-SPG及FITC-SPG與TRITC-葡聚糖陽性細胞共存(圖4e、f、g)，此顯示出於腫瘤微環境中K3-SPG被吞噬細胞取入。一部分K3-SPG未與葡聚糖聚集，本發明者等人推測藉由增強血管透過性及增強滲透滯留(EPR，Enhanced permeability and retention)效應，該等被動地蓄積於腫瘤組織內之空間。為了試驗吞噬細胞對K3-SPG i.v.處理之重要性，本發明者等人將氯屈膦酸鹽脂質體進行靜脈內注射。本發明者等人並未使用通常之200~300nm之脂質體，而是使用100nm之氯屈膦酸鹽脂質體，並將其注射，藉此使腫瘤內之吞噬細胞耗竭(Pante,N.et al.Molecular biology of the cell 13,425-434(2002)；Pante,N.et al.Molecular biology of the cell 13,425-434(2002))，藉由該注射，腫瘤中之F4/80陽性細胞於2天內幾乎耗竭(圖5)。於第5天(最初之K3-SPG處理之2天前)對帶有腫瘤之小鼠注射氯屈膦酸鹽脂質體，或不注射，與圖2(A~B)相同地利用K3-SPG對小鼠進行處理。於先注射氯屈膦酸鹽脂質體之情形時，顯著地抵消K3-SPG介導腫瘤生長之抑制(p<0.05)(圖4h)，另一方面，氯屈膦酸鹽脂質體之注射本身與PBS處理小鼠相比，未對腫瘤生長產生影響。該等結果顯示，K3-SPG係以腫瘤微環境中之吞噬細胞作為標靶，K3-SPG之抗腫瘤效果大部分依賴於K3-SPG向腫瘤微環境中之吞噬細胞中之導入。

(實施例3：產生腫瘤微環境中之IL12及IFN-I細胞激素之兩者對K3-SPG單劑治療較重要)

其次，於本實施例中，本發明者等人對K3-SPG單劑治療之成功所需之因子進行試驗。

揭示有IL-12及IFN-I等細胞激素係包含K3-SPG(Kobiyama,K.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,3086-3091(2014))之CpG ODN(Krieg,A.M.,et al.Journal of immunology 161,2428-2434(1998)； Klinman,D.M.,et al.Immunity 11,123-129(1999)；Ishii,K.J.,et al.Current opinion in molecular therapeutics 6,166-174(2004))之重要免疫刺激因子。因此，本發明者等人針對IL-12及IFN-I對於利用K3-SPG之治療之腫瘤縮小是否為必須進行了試驗。

於第0天對Il12p40及IFNAR2缺損小鼠皮下接種EG7細胞，如圖2(A~B)般利用PBS或K3-SPG(10μg)進行3次i.v.處理。其後，觀察K3-SPG對腫瘤縮小之影響。

(結果)

將結果示於圖6(A~B)以下。K3-SPG對腫瘤縮小之影響部分地依賴於IL-12p40及IFN-I訊號傳遞(圖6a、b(圖6A))。又，本發明者等人對IL12p40及IFNAR2之雙剔除(DKO)小鼠進行試驗，發現K3-SPG之影響於DKO小鼠中被完全抑制(圖6c(圖6A))。IFN-β及IL-12p40亦因IHC染色而於腫瘤內被檢測到(圖7、圖8)。該等資料顯示，腫瘤內之IL12p40及IFN-I細胞激素之兩者之分泌對K3-SPG介導性腫瘤抑制較重要。

又，本發明者等人對完全缺損T細胞及B細胞介導性之適應免疫應答之Rag2小鼠進行試驗。得知關於Rag2小鼠，即便進行K3-SPG處理，亦無法控制所有腫瘤生長(圖6d(圖6A))，但本發明者等人於利用K3-SPG之3次處理之期間，成功地部分控制rag2缺損小鼠之腫瘤生長(圖6f(圖6A))。為了確認該觀察，本發明者等人製作rag2小鼠之6次處理群(第7、9、11天及第14、16、18天)，並於rag2小鼠之該實驗方法中，發現更明顯之腫瘤控制(圖6f(圖6A))。頗具意味的是，IL12p40及IFNAR2 DKO小鼠即便藉由該範圍較寬之處理實驗方法，亦對K3-SPG單劑治療完全無應答(圖6e(圖6A))。該等資料顯示，K3-SPG之治療會誘發腫瘤內IL-12p40及IFN-I之兩者，其結果為，產生對腫瘤之自然免疫應答及適應免疫應答之兩者。

(實施例4：K3-SPG處理於依賴於IL12p40及IFN-I之兩者之態樣中，會誘發腫瘤細胞死亡)

於本實施例中，證明K3-SPG處理於依賴於IL12p40及IFN-I之兩者之態樣中，會誘發腫瘤細胞死亡。

由於觀察到於rag2小鼠中觀察到之不依賴於適應免疫之部分腫瘤生長之抑制、及IL12p40及IFNAR2 DKO小鼠中之不依賴於適應免疫之部分腫瘤生長之完全抑制，故而本發明者等人對範圍較寬之K3-SPG處理中之腫瘤-宿主交互作用進行試驗。

本發明者等人發現，於第12天摘除之脾臟(利用K3-SPG之3次處理之第二天)與經PBS處理之脾臟相比，包含大量CD45陰性細胞(圖6g(圖6B))。頗具意味的是，該等CD45陰性細胞於IL12p40及IFNAR2 DKO小鼠中顯著地減少(圖6g、h(圖6B))。本發明者等人分選該等CD45陰性細胞。該尺寸及形態充分顯示該等係源自腫瘤細胞。藉由對GFP小鼠之EG7接種實驗，進一步確認該等CD45陰性細胞亦為GFP陰性，該情況顯示該等細胞係源自腫瘤細胞(圖9)。由於EG7細胞未表現CD45，故而CD45為陰性之情況亦支持該假設。關於Hoechst及PI染色，脾臟中之大部分CD45陰性細胞係包含凋亡及壞死之兩者之特徵的死細胞(圖6i(圖6B))。該等資料顯示，因K3-SPG而成為標靶之腫瘤吞噬細胞於腫瘤微環境中分泌IL-12p40及IFN-I，該等細胞激素會誘發腫瘤細胞死亡，並循環地釋出該等，而最終被脾臟捕捉到。

(實施例5：所釋出之腫瘤死細胞誘發針對複數個腫瘤抗原之抗腫瘤CTL)

於本實施例中，證明所釋出之腫瘤死細胞誘發針對複數個腫瘤抗原之抗腫瘤CTL。

為了對在經K3-SPG處理之小鼠之脾臟中發現之該等CD45陰性細胞之免疫原性進行試驗，本發明者等人分選該等細胞，作為免疫化而 對未處理小鼠進行靜脈內注射。其後，於投予經分選之細胞7天後，對經免疫化之小鼠移植EG7腫瘤細胞。CD45陰性細胞免疫化小鼠對EG7腫瘤之增生顯著地進行防禦(圖6j(圖6B))。頗具意味的是，對照小鼠及免疫化小鼠中之OVA257四聚物陽性細胞(圖6k(圖6B)中之紅點)顯示出不與腫瘤尺寸相關(圖6k(圖6B)之柱體)，且關於因CD45陰性細胞所引起之免疫化，相較於單純之OVA257抗原決定基，會誘發針對EG7腫瘤之更有效之進一步之免疫應答(圖6k(圖6B))。該等結果顯示，K3-SPG單劑治療會誘發依賴於IL-12及IFN-I之兩者之腫瘤細胞死亡，該腫瘤死細胞係作為用於抗腫瘤免疫應答之有效之免疫原而發揮功能。

(CD8T細胞係對於K3-SPG介導性之腫瘤縮小而言重要之效應物)

Rag2小鼠之結果顯示，K3-SPG之腫瘤抑制效果亦依賴於適應免疫應答。因此，本發明者等人對K3-SPG治療所需之CD8T細胞進行試驗。顯示活體內之CD8 T細胞之耗竭顯著地抑制K3-SPG之抗腫瘤效果(圖10a(圖10A))，CD8T細胞係該K3-SPG治療中之重要效應細胞。又，顯示利用K3-SPG之腫瘤縮小亦依賴於Batf3(缺損交叉呈現(cross presentation)CD8α⁺ DC)(圖10b(圖10A))，且K3-SPG單劑治療亦增強CD8α⁺ DC介導性交叉呈現。本發明者等人觀察到CD8T細胞之腫瘤浸潤與腫瘤生長間之明顯之相關性。CD8T細胞於K3-SPG i.v.群中係蓄積於腫瘤區域中，但於i.d.群中未蓄積(圖10c(圖10A))。

最後，本發明者等人對為了使該等CD8T細胞進入至腫瘤區域而必須者進行試驗。於第0天對WT小鼠及Il12p40-Ifnar2 DKO小鼠接種EG7細胞，並於第7、9、及11天利用K3-SPG或PBS進行i.v.處理。於第14天，自該等小鼠之脾臟中純化CD8α⁺T細胞，利用Xenolight DiR(註冊商標)進行染色，並移植至經K3-SPG處理之(第7、9、及11天)其他帶有EG7之小鼠(接種14天後)，其後藉由IVIS於第15天分析利 用Xenolight DiR(註冊商標)進行標記之CD8T細胞之分佈(圖11)。於第15天，關於源自帶有未處理腫瘤之供體小鼠之CD8T細胞，即便利用K3-SPG進行處理，亦未蓄積於WT受移植小鼠之腫瘤部位(圖10d(圖10B)、II)。另一方面，源自帶有利用K3-SPG進行處理之腫瘤之供體小鼠之CD8T細胞於受移植小鼠之腫瘤部位被檢測到(圖10d(圖10B)、I)，顯示K3-SPG單劑治療誘發可向腫瘤微環境移動並進行浸潤之抗腫瘤CD8T細胞。該等活體內活化CD8T細胞可進入至DKO受移植小鼠之腫瘤微環境(圖10e(圖10B))。即便IL-12及IFN-I對因全身性之K3-SPG單劑治療所產生之自然免疫及CD8T細胞之誘發較重要，其結果亦顯示，若CD8T細胞於K3-SPG治療中經活化，則腫瘤微環境中之IL-12及IFN-I細胞激素之分泌對於CD8T細胞之腫瘤浸潤而言未必必須。總之，該等結果顯示，腫瘤特異性CD8T細胞之活化對於向腫瘤之浸潤而言充分。令人驚訝的是，該等CD8T細胞之浸潤不依賴於腫瘤微環境中之細胞激素之產生。

(探討)

本發明者等人揭示了新穎癌免疫療法之可能性。其係CpG經腫瘤微環境中之吞噬細胞標靶化之新穎治療(圖12)。經由TLR9之刺激，CpG誘發免疫細胞之免疫應答，尤其是將巨噬細胞及DC活化(Klinman,D.M.,et al.Immunity 11,123-129(1999)；Ishii,K.J.,et al.Current opinion in molecular therapeutics 6,166-174(2004))。該活化對抗癌免疫應答非常重要。於先前之報告中，必須直接向腫瘤內投予CpG，但若為SPG與CpG之複合體，則即便於附加有DDS(Drug Delivery System，藥物傳遞系統)功能之全身投予中，亦顯示出與腫瘤內投予同等或者其以上之有效性(Schettini,J.,et al.Cancer immunology,immunotherapy：CII 61,2055-2065(2012)；Lou,Y.,et al.Journal of immunotherapy(Hagerstown,Md.：1997)34,279-288(2011)； Nierkens,S.,et al.PLoS One 4,e8368(2009)；Heckelsmiller,K.,et al.Journal of immunology 169,3892-3899(2002)；Ishii,K.J.,et al.Current opinion in molecular therapeutics 6,166-174(2004))，本發明者等人解決了該課題。因奈米粒子之形成所產生之SPG與CpG之複合體(Kobiyama,K.,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,3086-3091(2014))可於活體內穩定化。得知該效果能以腫瘤環境作為標靶，TLR9免疫活性細胞被供於腫瘤環境中。關於由本發明者等人開發出之該新穎CpG，由於形成奈米粒子，故而被吞噬細胞吞噬。

其後，於腫瘤環境中，吞噬有該新穎CpG之吞噬細胞產生IFN及IL-12等細胞激素。非常重要的是該等細胞激素於腫瘤環境中得以誘發。於先前之報告中記載有以腫瘤環境作為直接標靶之IFNβ治療中，使樹狀細胞於腫瘤內移動，增加腫瘤內微環境內之抗原交叉呈現，藉此使CTL再活化。該等細胞激素會引起腫瘤細胞之細胞死亡。進而，本發明者等人發現該效果係由自然免疫之活化所引起。該細胞死亡承擔非常重要之作用。其成為自然免疫與適應免疫間之協作。藉由自腫瘤微環境釋出腫瘤細胞死亡，而誘發後天性免疫。該免疫原性腫瘤細胞死亡會誘發複數個細胞毒殺性T淋巴球。如上所述般活體內之腫瘤特異性誘發之CTL可對腫瘤進行應答而浸潤於腫瘤微環境。認為該抗腫瘤免疫系統可使用內因性抗原而應對作為癌免疫療法之障礙之免疫編輯(Immunoediting)。

K3-SPG單劑治療後之腫瘤細胞之循環可作為針對腫瘤之處理效果優異之生物標記物而發揮功能。

(實施例6：製劑例)

以下，揭示進行製劑化之情形時之組成

製劑例如係使7.22mg之K3-dA₄₀(序列編號2)溶解於水(3.7mL)中，並使SPG(15mg)溶解於0.25N之NaOH(1mL)中。將1mL之容積 之330mM NaH₂PO₄添加至DNA溶液中，繼而將SPG溶液添加至該DNA/NaH₂PO₄溶液中，並於4℃下維持一晚，而完成複合體化。莫耳比(M_SPG/M_DNA)可固定為0.27而製造。

製劑中所使用之藥劑可自Genedesign、invivogen、Wako等獲取。

如上所述，使用本發明之較佳實施形態對本發明進行了例示，但理解為本發明應僅藉由申請專利範圍對其範圍進行解釋。於本說明書中，關於所引用之專利、專利申請及文獻，理解為與將其內容本身具體地記載於本說明書中之情況同樣地，其內容應以對本說明書之參考之形式引用。

[產業上可之利用性]

根據本發明，可提供能以單劑之形式使用之新穎形態之抗癌劑。因此，本發明之複合體作為抗癌劑而於醫藥領域有用。

[序列表自由內容]

序列編號1：K3

序列編號2：K3-dA₄₀

序列編號3：dA₄₀-K3

序列編號4：K3-dA20

序列編號5：K3-dA25

序列編號6：K3-dA30

序列編號7：K3-dA35

<110> 獨立行政法人醫藥基盤研究所

<120> 具有免疫賦活活性之核酸多糖複合體作為抗腫瘤藥之應用

<130> NIB006PCT

<160> 7

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K3

<220>

<221> 硫代磷酸酯連鎖

<222> (1)..(19)

<400> 1

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K3-dA40

<220>

<221> 硫代磷酸酯連鎖

<222> (1)..(59)

<400> 2

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> dA40-K3

<220>

<221> 硫代磷酸酯連鎖

<222> (1)..(59)

<400> 3

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K3-dA20

<220>

<221> 硫代磷酸酯連鎖

<222> (1)..(39)

<400> 4

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K3-dA25

<220>

<221> 硫代磷酸酯連鎖

<222> (1)..(44)

<400> 5

<210> 6

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K3-dA30

<220>

<221> 硫代磷酸酯連鎖

<222> (1)..(49)

<400> 6

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> K3-dA35

<220>

<221> 硫代磷酸酯連鎖

<222> (1)..(54)

<400> 7

Claims (22)

1. 一種複合體用以製造抗癌醫藥之用途，該複合體包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖；其中上述人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸為5'-atcgactctcgagcgttctc-3'(K3)，上述β-1,3-葡聚糖為裂褶菌多糖(SPG)，上述複合體為抗癌藥，且上述聚去氧腺苷酸長度為20~100個核苷酸。
2. 如請求項1之用途，其中上述複合體係於無癌抗原之情況下進行投予。
3. 如請求項1或2之用途，其中上述複合體係以傳遞至網狀內皮系統及/或淋巴結之方式進行投予。
4. 如請求項3之用途，其中上述網狀內皮系統及/或淋巴結包含腫瘤及巨噬細胞。
5. 如請求項3之用途，其中上述網狀內皮系統包含脾臟及/或肝臟。
6. 如請求項2之用途，其中上述投予包括全身性投予。
7. 如請求項6之用途，其中上述全身性投予係選自靜脈內投予、腹腔內投予、經口投予、皮下投予、肌內投予、及腫瘤內投予之中。
8. 如請求項1或2之用途，其中上述寡聚去氧核苷酸係選自由K3-dA₄₀(序列編號2)、K3-dA20(序列編號4)、K3-dA25(序列編號5)、K3-dA30(序列編號6)及K3-dA35(序列編號7)所組成之群中。
9. 一種複合體用以製造用於使癌之死細胞集聚於網狀內皮系統及/ 或淋巴結之醫藥的用途，該複合體含有如下成分：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸及聚去氧腺苷酸者，並且聚去氧腺苷酸係配置於人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸之3'側；及(b)β-1,3-葡聚糖；其中上述人類化K型CpG寡聚去氧核苷酸為5'-atcgactctcgagcgttctc-3'(K3)，上述β-1,3-葡聚糖為裂褶菌多糖(SPG)，且上述聚去氧腺苷酸長度為20~100個核苷酸。
10. 如請求項9之用途，其中上述寡聚去氧核苷酸係選自由K3-dA₄₀(序列編號2)、K3-dA20(序列編號4)、K3-dA25(序列編號5)、K3-dA30(序列編號6)及K3-dA35(序列編號7)所組成之群中。
11. 如請求項9或10之用途，其中上述網狀內皮系統及/或淋巴結包含腫瘤及巨噬細胞。
12. 如請求項9或10之用途，其中上述網狀內皮系統包含脾臟及/或肝臟。
13. 如請求項9或10之用途，其中上述投予包括全身性投予。
14. 如請求項13之用途，其中上述全身性投予係選自靜脈內投予、腹腔內投予、經口投予、皮下投予、肌內投予、及腫瘤內投予之中。
15. 如請求項1之用途，其中上述寡聚去氧核苷酸中之一部分或全部磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代。
16. 如請求項15之用途，其中上述寡聚去氧核苷酸中之全部磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代。
17. 一種複合體用以製造抗癌醫藥之用途，該複合體包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含K3-dA₄₀(序列編號2)；及(b)裂褶菌多糖(SPG)； 其中上述複合體為抗癌藥。
18. 如請求項17之用途，其中上述複合體係於無癌抗原之情況下進行投予。
19. 如請求項17之用途，其中上述複合體係以傳遞至網狀內皮系統及/或淋巴結之方式進行投予。
20. 如請求項9之用途，其中上述寡聚去氧核苷酸中之一部分或全部磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代。
21. 如請求項9之用途，其中上述寡聚去氧核苷酸中之全部磷酸二酯鍵經硫代磷酸酯鍵取代。
22. 一種複合體用以製造用於使癌之死細胞集聚於網狀內皮系統及/或淋巴結之醫藥的用途，該複合體包含：(a)寡聚去氧核苷酸，其係包含K3-dA₄₀(序列編號2)；及(b)裂褶菌多糖(SPG)。

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