CN101874112B - 特别是作为免疫刺激剂/佐剂的式(I)：GlXmGn或式(II)：ClXmCn的核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种通式(I)：G1XmGn，或(II)：C1XmCn的核酸，其可以被脂质修饰。本发明的核酸用作诱导先天免疫反应的免疫刺激剂。本发明进一步涉及药物组合物(在第一实施方式中)，每个包含与药物活性载体(和，可选地，另外的辅助物质、添加剂和/或另外的佐剂)结合的根据本发明的免疫刺激剂。在另一种实施方式中，本发明的核酸与至少一种药物活性成分、药用载体(和，可选地，另外的辅助物质、添加剂和/或另外的佐剂)结合。因此，本发明涉及一种疫苗，其相应于本发明的药物组合物(第二实施方式)，其中药物活性成分诱导特定的免疫反应(例如，抗原)。本发明同样涉及本发明的核酸或根据本发明的药物组合物在用于治疗传染病、自身免疫性疾病、变态反应或癌症疾病中的应用。

Description

特别是作为免疫刺激剂/佐剂的式(I)：GlXmGn或式(II)：ClXmCn 的核酸
本发明涉及一种通式(I)：GlXmGn，或通式(II)：ClXmCn的核酸，可选地被脂质修饰，优选地用作如免疫刺激剂或，可替换地，与其它生物活性剂结合，由此本发明的免疫刺激剂用作组合物中的佐剂，其可以可选地与其它佐剂结合。因此，本发明还涉及一种药物组合物或疫苗，每种包含作为免疫刺激剂的式(I)和/或(II)的核酸。如果药物组合物包含本发明的免疫刺激剂作为佐剂，则所述药物组合物包含至少一种另外的药物活性组分，如抗原剂(antigenicagent)。本发明的药物组合物通常可以包含药用载体(药学上可接受的载体)，以及可选地，进一步的辅助物质、添加剂和/或进一步的佐剂。本发明同样涉及根据本发明的药物组合物或疫苗在治疗传染病、癌症疾病(cancer disease)、变态反应和自身免疫性疾病(自身免疫病)中的应用。同样地，本发明包括根据本发明的免疫刺激佐剂在用于制备用于治疗癌症疾病、传染病、变态反应和自身免疫性疾病的药物组合物中的应用。
在常规和基因接种疫苗中，经常存在的问题是在要被治疗或接种的生物体(有机体)中仅有少量并由此产生经常不足的免疫反应。为此，经常将所谓的佐剂加入到疫苗或药物活性组分中，即，能够以靶向方式增强和/或影响例如对抗原的免疫反应的物质或组合物。例如，已知一些可注射医学活性成分的有效性(效能)可以通过结合所述活性成分与佐剂来显著提高，所述佐剂能够影响所述活性成分释放到宿主细胞系统中并可选地摄取到宿主细胞中。以这种方式，可以实现与许多小剂量以一定间隔周期性给予的效果相当的效果。术语“佐剂”在该上下文中常规指的是用作用于免疫原和/或其它药物活性化合物的粘合剂、载体或辅助物质的化合物或组合物。
许多化合物和组合物已经在本领域中被建议作为佐剂，例如弗氏佐剂(弗洛因德佐剂)、金属氧化物(氢氧化铝等)、明矾、无机螯合物或其盐、各种石蜡样油、合成树脂、藻酸盐、类粘蛋白、多糖化合物、酪蛋白酸盐、以及从血液和/或血块分离的化合物，如，例如，纤维蛋白衍生物等。然而，在多数情况下这样的佐剂产生不希望的副作用，例如在给药(给予)部位的皮肤刺激和发炎(炎症)。此外，还观察到毒性副作用，尤其是组织坏死。最后，在多数情况下这些已知的佐剂仅产生细胞免疫反应的不足刺激，因为仅B细胞被激活。
例如，明矾、金属氧化物和螯合物的盐与无菌脓肿的产生相关。此外，在科学专家中怀疑这样的化合物被再次充分地排泄。相反，假定它们在体内导致不希望的无机残留物。虽然这样的化合物通常具有低毒性，但是它们可能被网状内皮系统的细胞(肝和脾的窦岸(littoral)细胞和窦状(sinusoidal)细胞)作为不溶残渣(碎片)而吞噬。此外，存在这样的残渣对身体的多个过滤机构(如肾、肝或脾)具有破坏作用的迹象。这样的残留物因此代表潜伏的，并且通常对于免疫系统的总是存在的危险源。
在现有技术中用作佐剂的合成油和石油衍生物同样导致不良作用。然而，这些化合物尤其是不希望的，因为它们在体内迅速代谢并分解成它们的芳香烃化合物。然而，已知这样的芳香烃化合物可以具有最大程度的致癌作用和/或以其它方式(例如通过插入到DNA中)可以导致不可恢复的DNA损伤。此外，已经显示这样的化合物同样与无菌脓肿的形成相关并且很少可以再次从身体完全去除。
从动物分离的化合物，如，例如，明胶，作为用于免疫刺激目的的佐剂也通常是不合适的。虽然这样的化合物通常对于所述的宿主生物体或宿主细胞不具有破坏性作用，但是它们通常从注射部位太快速地移动到宿主生物体或宿主细胞中，使得很少实现对于佐剂通常希望的性质，例如，如可选地与佐剂一起注射的活性成分的延迟释放等。在一些情况下这样的快速分布可以被丹宁类(鞣酸类)或其它(无机)化合物抵消。然而，这样的另外的化合物的代谢及它们在体内的行踪还没有被充分地解释。因此，在这种情况下，设想这些化合物聚集在残渣中并因此显著地干扰过滤机构(如肾、肝和/或脾细胞)是合理的。并且，明胶在肠胃外给予时的肿胀性质可以导致在体内条件下的不愉快的副作用，如，例如，肿胀，尤其是在给药部位，以及疾病的感觉。
在从血液和/或血块分离化合物的情况下，如，例如，纤维蛋白衍生物等，通常已经显示免疫刺激作用。然而，大多数这些化合物，当作为佐剂存在时，是不合适的，因为它们对免疫系统的副作用(其与需要的免疫原性性质平行存在)。例如，许多这些化合物被分类为引起过敏症的并且在一些情况下，产生远超出希望的程度的免疫系统的过度反应。因此这些化合物由于提及的原因同样不适合作为用于免疫刺激的佐剂。
因此，本发明的第一目的在于提供免疫刺激剂，如果与其它生物活性化合物结合给予，尤其是如果与免疫调节化合物一起给予，优选与特异性刺激免疫系统的化合物如抗原结合给予，则其用作佐剂。
然而，(非特异性)免疫刺激作用也可以通过直接利用核酸来触发非特异性免疫反应(先天免疫反应)来产生。细菌CpG-DNA序列不仅用作遗传信息，如，DNA，已知还在非特异性免疫反应的产生中起主要作用。细菌DNA，例如，已知用作“危险”信号以警告免疫细胞，如巨噬细胞和树突细胞，并促进保护性Th1极化的 T细胞免疫反应。免疫刺激作用似乎起因于未甲基化的CG基序的存在，并且这样的CpG-DNA因此被同样提议为免疫刺激剂(参见美国专利5,663,153)。CpG-DNA直接造成先天免疫系统的成员的活化，产生共刺激分子和前-炎性细胞因子的上调。DNA的这种免疫刺激性质还可以通过DNA寡核苷酸(其通过硫代磷酸酯修饰被稳定)来实现(美国专利6,239,116)。最后，美国专利6,406,705披露了免疫刺激组合物，其包含CpG寡脱氧核糖核苷酸和非核酸化合物的协同组合以对先天免疫系统施加刺激作用。
然而，使用DNA来施加非特异性免疫反应从几个观点来说可能是益处较少的。DNA在体内仅相对较慢分解，使得，当使用免疫刺激(外来)DNA时，可能发生抗DNA抗体的形成，其已经在小鼠中在动物模型中确认(Gilkeson et al.，J.Clin.Invest.1995，95：1398-1402)。(外来)DNA在生物体中的持续因此可以导致免疫系统的过度活化，其已知导致小鼠脾大(Montheith et al.，AnticancerDrug Res.1997，12(5)：421-432)。此外，(外来)DNA可以与宿主基因组相互作用，并造成突变，尤其是通过整合入宿主基因组。例如，可能发生引入的(外来)DNA插入完整的基因中，其代表可以阻挡或者甚至完全消除内源基因的功能的突变。由于这样的整合事件，一方面对细胞至关重要的酶系统可能被破坏，而另一方面还存在这样的风险，如果通过(外来)DNA的整合，对于细胞生长的调节关键的基因被改变，则这样改变的细胞将被转化到退化状态。因此，在迄今已知的方法中，当利用(外来)DNA作为免疫刺激剂时不能排除癌形成的可能风险。
因此利用特异性RNA分子作为用来引发通过先天免疫系统的非特异性免疫反应的化合物通常是更有利的。已知RNA寡核苷酸结合到TLR-7/-8受体，从而施加免疫刺激作用。作为免疫刺激剂的RNA通常具有基本上比DNA更短的体内半寿期。然而，即使那些在本领域已知作为免疫刺激剂的特异性RNA分子的使用具有限制。 例如，本领域迄今披露的特异性RNA序列在体内仅表现出有限的细胞渗透性。这可能需要用于免疫刺激的RNA的增加的量，其，不考虑由于要被给予的RNA的增加的量而提高成本，还涉及上文通常描述的大部分不希望的副作用的风险，例如给药部位的刺激和炎症。并且，当给予大量免疫刺激剂时不能排除毒性副作用。
尽管迄今展示了成功，但由此存在对于可以通过它们自身施加患者的先天免疫系统的免疫反应的改进的免疫刺激剂的持续需要并且对它们是相当感兴趣的。因此，本发明的第二目的在于提供通过激活患者的先天免疫系统而施加非特异性免疫反应的免疫刺激剂。
本发明的两个目的均通过提供下面的式(I)和(II)的核酸分子而得以解决。这些本发明的核酸分子激活先天免疫系统，由此引发非特异性免疫反应，并作为支持特异性激活需要的免疫系统的第二化合物的免疫刺激活性的佐剂(如，作为疫苗的成分)。
本发明提供了一种式(I)的核酸：
GlXmGn，
其中：
G为鸟苷、尿嘧啶或鸟苷或尿嘧啶的类似物；
X为鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上面提及的核苷酸的类似物；
l为1至40的整数，
其中，当l＝1时，G为鸟苷或其类似物，
当l＞1时，至少50％的核苷酸为鸟苷或其类似物；
m为整数并至少为3；
其中当m＝3时，X为尿嘧啶或其类似物，
当m＞3时，至少3个连续尿嘧啶或尿嘧啶的类似物存在；
n为1至40的整数，
其中当n＝1时，G为鸟苷或其类似物，
当n＞1时，至少50％的核苷酸为鸟苷或其类似物。
此外，本发明提供了一种式(II)的核酸：
ClXmCn，
其中：
C为胞嘧啶、尿嘧啶或胞嘧啶或尿嘧啶的类似物；
X为鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或上面提及的核苷酸的类似物；
l为1至40的整数，
其中当l＝1时，C为胞嘧啶或其类似物，
当l＞1时至少50％的核苷酸为胞嘧啶或其类似物；
m为整数并至少为3；
其中当m＝3时，X为尿嘧啶或其类似物，
当m＞3时，至少3个连续尿嘧啶或尿嘧啶的类似物存在；
n为1至40的整数，
其中当n＝1时，C为胞嘧啶或其类似物，
当n＞1时，至少50％的核苷酸为胞嘧啶或其类似物。
根据本发明的式(I)或(II)的核酸通常为相对短的核酸分子。因此，根据本发明的式(I)或(II)的核酸通常具有大约从5到100(但是对于特别的实施方式也可以长于100个核苷酸，如，直到200个核苷酸)，从5到90或从5到80个核苷酸的长度，优选大约从5 到70的长度，更优选大约从8到60的长度，并且更优选大约从15到60个核苷酸，更优选从20到60个，最优选从30到60个核苷酸的长度。如果本发明的核酸具有例如100个核苷酸的最大长度，则m将通常为＜＝98。
根据本发明的式(I)或(II)的核酸可以为RNA或DNA(例如cDNA)，它可以为单链或双链的，以同源或异源双链体的形式，以及线形或环形的。根据本发明的式(I)或(II)的核酸特别优选为单链RNA的形式。
根据本发明的式(I)的核酸中的G为鸟苷或尿嘧啶或其类似物。就此而论，鸟苷或尿嘧啶核苷酸类似物被定义为天然存在的核苷酸的非天然存在的变体。因此，鸟苷或尿嘧啶类似物为具有非天然存在的官能团的化学衍生的核苷酸，其优选被加入到天然存在的鸟苷或尿嘧啶核苷酸中或从天然存在的鸟苷或尿嘧啶核苷酸中去除，或者其取代鸟苷或尿嘧啶核苷酸的天然存在的官能团。因此，天然存在的鸟苷或尿嘧啶核苷酸的每种成分可以被修饰，即，碱基成分(base component)、糖(核糖)成分和/或形成寡核苷酸的骨架的磷酸酯成分。磷酸酯部分可以被例如氨基磷酸酯(磷酰胺酯，phosphoramidate)、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯等取代。
因此，鸟苷或尿嘧啶的类似物包括，而不意味着任何限制，已经例如通过乙酰化、甲基化、羟基化等被化学改变的任何天然存在或非天然存在的鸟苷或尿嘧啶，包括，例如，1-甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、2，2-二甲基-鸟苷、7-甲基-鸟苷、二氢-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫-尿嘧啶、5-(羧基-羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫-尿嘧啶、5′-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)。这样的类似物的制备对于本领域技术人员来说是已知的，例如来自美国专利 4,373,071、美国4,401,796、美国4,415,732、美国4,458,066、美国4,500,707、美国4,668,777、美国4,973,679、美国5,047,524、美国5,132,418、美国5,153,319、美国5,262,530和5,700,642，将其全部披露内容以引用方式并入本文中。在如上所述的类似物的情况下，尤其优选根据本发明的那些类似物，其提高根据本发明的式(I)的核酸的免疫原性和/或不干扰已经被引入的另外的修饰。至少一个类似物可以存在于侧翼序列Gl和/或Gn中，可选地至少10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％、90％的侧翼序列Gl和/或Gn的核苷酸表现出如本文所定义的类似物的性质，如果所述侧翼序列完全包含至少一个类似物。最优选地，侧翼序列的所有核苷酸为类似物，其可以-最优选地-对于相同类型的核苷酸为相同的类似物(例如，所有的鸟苷核苷酸提供为1-甲基-鸟苷)或者它们可以不同(例如，至少两个不同的鸟苷类似物取代天然存在的鸟苷核苷酸)。优选地，l和n为1到20，更优选地为1到10，并且还更优选地为2到8。
根据本发明的式(I)的核酸中的核苷酸G的数量由l或n确定。l和n，相互独立地每个为1到40的整数，其中当l或n＝1时，G为鸟苷或其类似物，当l或n＞1时，至少50％的核苷酸为鸟苷或其类似物。例如，不意味着任何限制，当l或n＝4时，Gl或Gn可以为，例如，GUGU、GGUU、UGUG、UUGG、GUUG、GGGU、GGUG、GUGG、UGGG或GGGG等；当l或n＝5时，Gl或Gn可以为，例如，GGGUU、GGUGU、GUGGU、UGGGU、UGGUG、UGUGG、UUGGG、GUGUG、GGGGU、GGGUG、GGUGG、GUGGG、UGGGG、或GGGGG等。根据本发明的式(I)的核酸中相邻于Xm的核苷酸优选不为尿嘧啶。
根据本发明的式(II)的核酸中的C为胞嘧啶或尿嘧啶或其类似物。就此而论，胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸类似物被定义为天然存在的胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸的非天然存在的变体。因此，胞嘧啶或尿嘧啶类似物为具有非天然存在的官能团的化学衍生的核苷酸，其优选被加入到天然存在的胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸或从天然存在的胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸中去除，或者其取代胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸的天然存在的官能团。因此，天然存在的胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸的每种成分可以被修饰，即，碱基成分、糖(核糖)成分和/或形成寡核苷酸的骨架的磷酸酯成分。磷酸酯部分可以被例如氨基磷酸酯(phosphoramidate)、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯等取代。
因此，胞嘧啶或尿嘧啶的类似物包括，而不意味着任何限制，已经例如通过乙酰化、甲基化、羟基化等被化学改变的任何天然存在或非天然存在的胞嘧啶或尿嘧啶，包括，例如，2-硫-尿嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、二氢-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫-尿嘧啶、5-(羧基-羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫-尿嘧啶、5′-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)。这样的类似物的制备对于本领域技术人员来说是已知的，例如来自美国专利4,373,071、美国4,401,796、美国4,415,732、美国4,458,066、美国4,500,707、美国4,668,777、美国4,973,679、美国5,047,524、美国5,132,418、美国5,153,319、美国5,262,530和5,700,642，将其全部披露内容以引用方式并入本文中。在如上所述的类似物的情况下，尤其优选根据本发明的那些类似物，其提高根据本发明的式(II)的核酸的免疫原性和/或不干扰已经被引入的另外的修饰。至少一个类似物可以存在于侧翼序列Cl和/或Cn中，可选地至少10％、20％、30％、50％、60％、70％、80％、90％的侧翼序列Cl和/或Cn的核苷酸表现出如本文所定义的类似物的性质，如果所述侧翼序列完全包含至少一个类似物。最优选地，侧翼序列的所有核苷酸为类似物，其可以-最优选地-对于相同类型的核苷酸为相同的类似物(例如，侧翼序列的所有胞嘧啶核苷酸提供为2-硫-胞嘧啶)或者它们可以不同(例如，至少两个不同的胞嘧啶类似物取代侧翼序列的天 然存在的胞嘧啶核苷酸)。优选地，l和n为1到20，更优选地为1到10，以及还更优选为2到8。
类似地，根据本发明的式(II)的核酸中的核苷酸C的数量由l或n确定。l和n，相互独立地每个为1到40的整数，其中当l或n＝1时，C为胞嘧啶或其类似物，而当l或n＞1时，至少50％的核苷酸为胞嘧啶或其类似物。例如，不意味着任何限制，当l或n＝4时，Cl或Cn可以为，例如，CUCU、CCUU、UCUC、UUCC、CUUC、CCCU、CCUC、CUCC、UCCC或CCCC等；当l或n＝5时，Cl或Cn可以为，例如，CCCUU、CCUCU、CUCCU、UCCCU、UCCUC、UCUCC、UUCCC、CUCUC、CCCCU、CCCUC、CCUCC、CUCCC、UCCCC、或CCCCC等。根据本发明的式(II)的核酸中相邻于Xm的核苷酸优选不为尿嘧啶。
本申请中术语“同一性”意味着序列相对于参考序列被进行比较并且百分比同一性(percentage identity)通过比较它们而确定。例如，为了确定两个核酸序列的百分比同一性，所述序列可以首先相对于彼此排列(序列对比)，以便允许随后的序列的比较。为此，例如，间隙可以被引入到第一核酸序列的序列中，而核苷酸可以与第二核酸序列的相应位置比较。当第一核酸序列中的位置被与第二序列中的位置中相同的核苷酸占据时，那么这两个序列在该位置是同一的。两个序列之间的百分比同一性是由序列分开的同一位置的数目的函数。如果，例如，特定序列同一性被假定用于与具有规定长度的参考核酸比较中的特别核酸，那么这个百分比同一性相对于参考核酸相对地表明。因此，例如，起始于与具有100个核苷酸的长度的参考核酸具有50％序列同一性的核酸，该核酸可以代表与具有50个核苷酸的长度的参考核酸的段完全同一的具有50个核苷酸的长度的核酸。然而，它还可以代表具有100个核苷酸的长度的核酸，其与参考核酸在其全部长度上具有50％同一性，即在这种情况下50％同一的核酸。可替换地，该核酸可以为具有200个核苷酸的 长度的核酸，其在具有100个核苷酸的长度的核酸的段中，与具有100个核苷酸的长度的参考核酸是完全同一的。其它核酸自然同等满足这些标准。
可以借助于数学算法进行两个序列的百分比同一性的确定。可以用于比较两个序列的数学算法的优选的但非限制性的实例为Karlin et al.(1993)，PNAS USA，90：5873-5877的算法。这样的算法被整合入NBLAST程序中，借助其与本发明的序列具有期望的同一性的序列可以被鉴定。为了获得如上所述的间隙序列对比(间隙排列)，可以使用“GappedBLAST”程序，如在Altschul et al.(1997)，Nucleic Acids Res，25：3389-3402中所描述的。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用特别程序(如，NBLAST)的缺省参数。可以进一步利用来自“Genetic Computing Group”的GAP(global alignment program)的版本9，利用具有-12的间隙开放罚分(对于间隙的第一零)和-4的间隙延展罚分(对于间隙中每个另外的连续的零)的缺省(BLOSUM62)矩阵(值为-4到+11)对序列进行序列对比。在序列对比后，通过将对应的数量表达为要求保护的序列中的核酸的百分比来计算百分比同一性。用于确定两个核酸序列的百分比同一性的所述方法还可以相应地应用于利用合适程序的氨基酸序列。
同样优选地，对于式(I)，当l或n＞1时，至少60％、70％、80％、90％或甚至100％的核苷酸为鸟苷或其类似物，如上所述。在侧翼序列Gl和/或Gn中的其余核苷酸到100％(当鸟苷构成少于100％的核苷酸时)为尿嘧啶或其类似物，如上文中所定义的。还优选地，l和n，相互独立地每个为2到30的整数，更优选2到20的整数，以及还更优选2到15的整数。如果有必要，l或n的下限可以变化，并且至少为1，优选至少为2，更优选至少为3、4、5、6、7、8、9或10。这个定义相应地应用于式(II)。
根据本发明的式(I)或式(II)的核酸中的X为鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或它们的类似物。就此而论，核苷酸类似物被定义为天然存在的核苷酸的非天然存在的变体。因此，类似物为具有非天然存在的官能团的化学衍生的核苷酸，其优选加入到天然存在的核苷酸中或从天然存在的核苷酸中去除，或其取代核苷酸的天然存在的官能团。因此，天然存在的核苷酸的每种成分可以被修饰，即，碱基成分、糖(核糖)成分和/或形成寡核苷酸的骨架的磷酸酯成分。磷酸酯部分可以被例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯等取代。优选地，所有“X”核苷酸的至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少50％、更优选至少70％、以及甚至更优选至少90％展现出如本文所定义的类似物的性质，如果本发明的核酸完全包含至少一个类似物。在由“Xm”形成的核心序列中取代特定的核苷酸类型的类似物可以是相同的，如，存在于核心序列中的所有胞嘧啶核苷酸由2-硫-胞嘧啶形成，或者它们对于特定的核苷酸是不同的，例如，至少两个不同的胞嘧啶类似物被包含在核心序列中。
鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶的类似物包括，而不意味着任何限制，已经被化学改变(例如通过乙酰化、甲基化、羟基化等)的任何天然存在的或非天然存在的鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷或胞嘧啶，包括1-甲基-腺苷、2-甲基-腺苷、2-甲基硫-N6-异戊烯基-腺苷、N6-甲基-腺苷、N6-异戊烯基-腺苷、2-硫-胞嘧啶、3-甲基-胞嘧啶、4-乙酰基-胞嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、1-甲基-鸟苷、2-甲基-鸟苷、2，2-二甲基-鸟苷、7-甲基-鸟苷、肌苷、1-甲基-肌苷、二氢-尿嘧啶、4-硫-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫-尿嘧啶、5-(羧基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲基-2-硫-尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫-尿嘧啶、5′-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、Q核苷(queosine)、β-D-甘露糖基-Q核苷、假尿苷 (wybutoxosine)、以及肌苷。这样的类似物的制备对于本领域技术人员来说是已知的，例如来自美国专利4,373,071、美国4,401,796、美国4,415,732、美国4,458,066、美国4,500,707、美国4,668,777、美国4,973,679、美国5,047,524、美国5,132,418、美国5,153,319、美国5,262,530和5,700,642。在如上所述的类似物的情况下，特别优选根据本发明的那些类似物，其提高根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的免疫原性和/或不干扰已经被引入的另外的修饰。
根据本发明的式(I)或式(II)的核酸中的X的数目由m确定。m为整数并且通常为至少3、4、5、6、7、8、9或10，其中当m＝3时，X为尿嘧啶或其类似物，而当m＞3时，至少3个直接连续的尿嘧啶或其类似物存在。与本申请相关的至少3个直接连续的尿嘧啶的这样的序列被称为“单调尿嘧啶序列”。单调尿嘧啶序列通常具有至少3、4、5、6、7、8、9或10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50或50-90个尿嘧啶或如上定义的可选的尿嘧啶的类似物的长度。这样的单调尿嘧啶序列在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸中至少存在一次。因此，例如，可以存在具有至少3个尿嘧啶或其类似物的1个、2个、3个、4个、5个或更多个单调尿嘧啶序列，其单调尿嘧啶序列可以被至少一个鸟苷、腺苷、胸苷、胞嘧啶或其类似物，优选2个、3个、4个、5个或更多个中断。例如，当m＝3时，Xm为UUU。当m＝4时，Xm可以为，例如，不意味着限制，UUUA、UUUG、UUUC、UUUU、AUUU、GUUU或CUUU等。当n＝10时，Xm可以为，例如，不意味着限制，UUUAAUUUUC、UUUUGUUUUA、UUUGUUUGUU、UUGUUUUGUU、UUUUUUUUUU等。与根据本发明的式(I)的核酸的Gl或Gn相邻的核苷酸优选包括尿嘧啶或其类似物。类似地，与根据本发明的式(II)的核酸的Cl或Cn相邻的核苷酸优选包括尿嘧啶或其类似物。
当m＞3时，通常至少50％，优选至少60％、70％、80％、90％或甚至100％的核苷酸为尿嘧啶或其类似物，如上所定义的。如此 到100％的其余核苷酸(其中在序列Xm中存在少于100％的尿嘧啶)为鸟苷、尿嘧啶、腺苷、胸苷、胞嘧啶或其类似物，如上所定义的。同样优选地，m为整数并且为至少4、5、6、7、8、9或10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-50或50-90。
根据本发明的式(I)的核酸特别优选包含下面的SEQ ID NO：1-80的序列中的至少一个：
GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：1)；
GGGGGUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO：2)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO：3)；
GUGUGUGUGUGUUUUUUUUUUUUUUUUGUGUGUGUGUGU(SEQ ID NO：4)；
GGUUGGUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUUGGUUGGUUGGUU(SEQ ID NO：5)；
GGGGGGGGGUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO：6)；
GGGGGGGGUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO：7)；
GGGGGGGUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO：8)；
GGGGGGGUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO：9)；
GGGGGGUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO：10)；
GGGGGGUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO：11)；
GGGGGGUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO：12)；
GGGGGUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO：13)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：14)；
GGGGUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：15)；
GGGGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：16)；
GGUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：17)；
GUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQ ID NO：18)；
GGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGG(SEQ ID NO：19)；
GGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGG(SEQ ID NO：20)；
GGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO：21)；
GGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO：22)；
GGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO：23)；
GGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO：24)；
GGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO：25)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO：26)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO：27)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO：28)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：29)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：30)；
GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：31)；
GGGGGGGGGGGUUUGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：32)；
GGGGGGGGGGUUUUGGGGGGGGGG(SEQ ID NO：33)；
GGGGGGGGGUUUUUUGGGGGGGGG(SEQ ID NO：34)；
GGGGGGGGGUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO：35)；
GGGGGGGGUUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO：36)；
GGGGGGGGUUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO：37)；
GGGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO：38)；
GGGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO：39)；
GGGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO：40)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO：41)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO：42)；
GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO：43)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：44)；
GUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQID NO：45)；
GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：46)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：47)；
GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：48)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO：49)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO：50)；
GGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO：51)；
GGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO：52)；
GGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO：53)；
GGUUUGG(SEQ ID NO：54)；
GGUUUUGG(SEQ ID NO：55)；
GGUUUUUGG(SEQ ID NO：5 6)；
GGUUUUUUGG(SEQ ID NO：57)；
GGUUUUUUUGG(SEQ ID NO：58)；
GGUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：59)；
GGUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：60)；
GGUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：61)；
GGUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：62)；
GGUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：63)；
GGUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：64)；
GGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：65)；
GGUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO：66)；
GGGUUUGGG(SEQ ID NO：67)；
GGGUUUUGGG(SEQ ID NO：68)；
GGGUUUUUGGG(SEQ ID NO：69)；
GGGUUUUUUGGG(SEQ ID NO：70)；
GGGUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：71)；
GGGUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：72)；
GGGUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：73)；
GGGUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：74)；
GGGUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：75)；
GGGUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：76)；
GGGUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO：77)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG SEQ ID NO：78；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG SEQ ID NO：79；
GGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGGUUUGGG SEQ ID NO：80；
根据本发明的式(II)的核酸特别优选包含下面的SEQ ID NO：81-83的序列中的至少一个：
CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCC SEQ ID NO：81
CCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCCUUUCCC SEQ ID NO：82
CCCUUUUUUUUUUUUUUUCCCCCCUUUUUUUUUUUUUUUCCC SEQ ID NO：83
根据本发明的式(I)或式(II)的核酸序列优选为病毒或细菌起源的非天然或合成制备的序列。
根据本发明的式(I)或式(II)的核酸通常被作为“稳定的寡核苷酸”提供，即作为在体内抵抗降解(例如通过核酸外切酶或核酸内切酶)的寡核糖核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸。这样的稳定性可以例如通过根据本发明的式(I)或式(II)核酸的修饰的磷酸骨架而被影响。在这点上优选使用的核苷酸包含硫代磷酸酯修饰的磷酸骨架，优选包含在磷酸骨架中的磷酸氧(phosphate oxygen)的至少一个被硫原子代替。其他稳定的寡核苷酸包括，例如：非离子类似物，如，例如，烷基和芳基膦酸酯(其中带电的膦酸氧被烷基或芳基基团代替)，或磷酸二酯和烷基磷酸三酯(其中带电的氧残基以烷基化的形式存在)。
根据本发明的式(I)或式(II)的核酸可以同样地被稳定化。如上面所提及的，任何核酸，例如DNA或RNA，原则上可以用于根据本发明的式(I)或式(II)的核酸。然而，从安全的观点来看，RNA用于这样的核酸是优选的。尤其是，RNA不涉及被稳定地整合入转染的细胞的基因组中的风险。此外，RNA基本上更易于在体内被降解。同样地，迄今没有检测到抗-RNA抗体，推测由于RNA在体内与DNA相比相对较短的半寿期。然而，与DNA相比，RNA在溶液中显著较不稳定，其基本上是由于RNA-降解酶，所谓的RNA酶(核糖核酸酶)。甚至最小的核糖核酸酶污染足以完全降解溶液中的RNA。这样的RNA酶污染通常可以仅通过特别的处理去除，尤其是借助焦性碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate)(DEPC)。因此，细胞的胞质中的mRNA的天然降解被细微地调节。在这点上，许多机 制在现有技术中是已知的。因此，对于mRNA，在体内的最终结构通常是至关重要的。在天然存在的mRNA的5’端，通常存在所谓的“帽结构”(修饰的鸟苷核苷酸)，而在3’端通常存在直到200个腺苷核苷酸的序列(所谓的聚-A尾)。
根据本发明的式(I)或式(II)的核酸，尤其是如果作为RNA提供，由此可以通过添加所谓的“5’帽”结构针对通过RNA酶的降解而被稳定化。在这点上，特别优选m7G(5′)ppp(5′(A，G(5′)ppp(5′)A或G(5′)ppp(5′)G作为5’帽结构。然而，只有当修饰，例如脂质修饰，还没有在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的5’端被引入时或者当修饰不干扰根据本发明的式(I)或式(II)的(未修饰或化学修饰的)核酸的免疫原性性质时，这样的修饰被引入。
可替换地，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’端，尤其是如果作为RNA提供，可以被至少50个腺苷核糖核苷酸、优选至少70个腺苷核糖核苷酸、更优选至少100个腺苷核糖核苷酸、特别优选至少200个腺苷核糖核苷酸的序列(所谓的“聚-A尾”)修饰。类似地，也在这种情况下，只有在没有修饰，例如脂质修饰，已经在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’端被引入或者在修饰不干扰根据本发明的式(I)或式(II)的(未修饰的或化学修饰的)核酸的免疫原性性质时，这样的修饰可以被引入。上述两种修饰，即，“5’帽”结构的插入或在3’端的“聚-A尾”的插入，防止根据本发明的式(I)或式(II)的核酸在体内过早降解并因此稳定体内根据本发明的式(I)或式(II)的核酸。
根据特别的实施方式，根据本发明的式(I)，GlXmGn的核酸，或式(II)，ClXmCn的核酸，可以包含脂质修饰。根据本发明的这样的脂质修饰的核酸通常包含如上定义的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸、与根据本发明的核酸共价连接的至少一种连接剂(连接体，linker)、以及与分别的连接剂共价连接的至少一种脂质。可替换地，根据本发明的脂质修饰的核酸包含如上所述的(至少一个)根据本 发明的式(I)或式(II)的核酸和至少一种与根据本发明的核酸共价连接的(没有连接剂)的(双功能)脂质。根据第三种替换方案，根据本发明的脂质修饰的核酸包含如上所述的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸、至少一种与根据本发明的核酸共价连接的连接剂、以及至少一种与分别的连接剂共价连接的脂质、以及至少一种与根据本发明的核酸共价连接的(没有连接剂)的(双功能)脂质。
包含在根据本发明的脂质修饰的核酸中的脂质通常为优选本身为生物活性的脂质或亲脂性残基。这样的脂质优选包括天然物质或化合物，如，例如，维生素，如α-生育酚(维生素E)，包括RRR-α-生育酚(以前D-α-生育酚)、L-α-生育酚、消旋体D，L-α-生育酚、维生素E琥珀酸酯(VES)，或维生素A及其衍生物，如，视黄酸、视黄醇，维生素D及其衍生物，如维生素D及其麦角固醇前体，维生素E及其衍生物，维生素K及其衍生物，如维生素K和相关的醌或植醇化合物，或类固醇，如胆汁酸，例如胆酸、脱氧胆酸、脱氢胆酸、可的松、洋地黄毒苷(digoxygenin)、睾酮、胆固醇或硫代胆固醇(thiocholesterol)。本发明的范围内的另外的脂质或亲脂性残基包括，而不意味着任何限制，聚亚烷基二醇(Oberhauser et al.，Nucl.Acids Res.，1992，20，533)，脂族基团如，例如C1-C20-链烷、C1-C20-烯烃或C1-C20-烷醇化合物等，如，例如，十二烷醇、十六烷醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.，EMBOJ，1991，10，111；Kabanov et al.，FEBS Lett.，1990，259，327；Svinarchuk et al.，Biochimie，1993，75，49)，磷脂，如，例如磷脂酰甘油、二酰基磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、二-十六烷基-rac-甘油，鞘脂，脑苷脂，神经节苷脂，或三乙基铵1，2-二-O-十六烷基-rac-甘油基-3-H-磷酸酯(Manoharan et al.，Tetrahedron Lett.，1995，36，3651；Shea etal.，Nucl.Acids Res.，1990，18，3777，多胺或聚亚烷基二醇，如，例如聚乙二醇(PEG)(Manoharan et al.，Nucleosides & Nucleotides，1995，14，969)，六乙二醇(HEG)，棕榈精或棕榈基残基(Mishra et al.， Biochim.Biophys.Acta，1995，1264，229)，十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇残基(Crooke et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923)，以及蜡，萜，脂环烃，饱和和单-或聚-不饱和脂肪酸残基等。
脂质和根据本发明的式(I)或式(II)的核酸之间的连接原则上可以发生在任何核苷酸、本发明的核酸的任何核苷酸的碱基或糖成分、3’和/或5’端、和/或根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的磷酸骨架处。根据本发明特别优选根据本发明的核酸在其3’和/或5’端的末端脂质修饰。末端修饰具有许多超出序列内的修饰的优点。一方面，序列内的修饰可以影响杂交行为，其在空间要求的残基的情况下可能具有不利影响。另一方面，在仅末端被修饰的根据本发明的脂质修饰的核酸的合成制备的情况下，可以借助大量可得到的商业上可获得的单体进行根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的合成，并且可以使用现有技术中已知的合成方案。
根据第一优选的实施方式，使用的根据本发明的核酸与至少一个脂质之间的连接经由“连接剂”被作用(与根据本发明的式(I)或式(II)的核酸共价连接)。本发明的范围内的连接剂通常具有至少2个并且可选的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、10-20个、20-30个或更多个反应基团，选自，例如，羟基基团、氨基基团、烷氧基基团等。一个反应基团优选用于结合上述根据本发明的式(I)或式(II)的核酸，例如RNA寡核苷酸。这个活性基团可以以被保护的形式存在，例如作为DMT基团(二甲氧基三甲苯基氯)、作为Fmoc基团、作为MMT(单甲氧基三苯甲基)基团、作为TFA(三氟乙酸)基团等。此外，硫基可以通过二硫化物(例如烷基硫醇如，例如，3-硫丙醇)或通过活化的成分(如2-硫吡啶)被保护。一个或多个另外的反应基团根据本发明用于一个或多个脂质的共价结合。根据第一实施方式，因此，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸可以优选经由共价结合的连接剂结合至少一个脂质，例如1个、2个、3个、4个、5个、5-10个、10-20个、20-30个或更多个脂质， 特别优选每个根据本发明的式(I)或式(II)的核酸至少3-8个或更多个脂质。结合的脂质可以由此在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的不同位置分别地相互结合，或者它们可以在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的一个或多个位置以复合体(complex)的形式存在。连接剂的另外的反应基团可以用于直接或间接(可分裂地)结合到载体物质，例如固相。根据本发明的优选的连接剂为，例如，二醇、甘油和甘油衍生物、2-氨基丁基-1，3-丙二醇和2-氨基丁基-1，3-丙二醇衍生物/骨架、吡咯烷连接剂或包含吡咯烷的有机分子(尤其是对于在3′端的修饰)等。甘油或甘油衍生物(C3锚)或2-氨基丁基-1，3-丙二醇衍生物/骨架(C7锚)根据本发明特别优选用作连接剂。当脂质修饰经由醚键被引入时，作为连接剂的甘油衍生物(C3锚)是特别优选的。例如，如果脂质修饰经由酰胺或尿烷键被引入时，则例如，2-氨基丁基-1，3-丙二醇骨架(C7锚)是优选的。在这点上，连接剂和根据本发明的式(I)或式(II)的核酸之间形成的键的性质是优选的，使得它与酰胺(amidite)化学的条件和化学品相容，即它优选既不是酸-不稳定的又不是碱-不稳定的。特别优选容易合成地获得并不被核酸合成方法的氨裂解(ammoniacal cleavage)过程水解的键。合适的键原则上为所有相应合适的键，优选酯键、酰胺键、尿烷和醚键。除了起始物质的良好的可达到性(少量合成步骤)外，特别优选醚键，因为其对酶法水解的相对高的生物学稳定性。
根据第二优选的实施方式，根据本发明的式(I)或式(II)的(至少一个)核酸直接与如上所述的至少一个(双功能)脂质连接，即，没有使用如上所述的连接剂。在这种情况下，根据本发明所用的(双功能)脂质优选包含至少两个反应基团或可选的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个反应基团，第一反应基团用于将脂质直接或间接结合到本文所述的载体物质，并且至少一个另外的反应基团用于结合根据本发明的式(I)或式(II)的核酸。根据第二实施方式，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸由此优选可以结合至少一个脂质(直接地而无需连接剂)，例如1、2、3、4、5、5-10、10-20、 20-30或更多个脂质，特别优选每个根据本发明的式(I)或式(II)的核酸至少3-8个或更多个脂质。结合的脂质可以在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的不同位置分别地彼此结合，或者它们可以在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的一个或多个位置以复合体的形式存在。可替换地，根据本发明的式(I)或式(II)的至少一个核酸，例如可选地根据本发明的式(I)或式(II)的3、4、5、6、7、8、9、10、10-20、20-30或更多个核酸，根据第二实施方式可以经由其反应基团结合到如上所述的脂质。可以用于该第二实施方式的脂质特别优选包括那些(双功能)脂质，其允许偶联(优选在它们的末端或可选的分子内)，如，例如，聚乙二醇(PEG)及其衍生物、六乙二醇(HEG)及其衍生物、烷二醇(alkanediol)、氨基烷(aminoalkane)、硫代烷醇等。(双功能)脂质与根据本发明的式(I)或式(II)的核酸之间的键的性质，如上所述，优选如针对第一优选的实施方式所描述的。
根据第三实施方式，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸与如上所述的至少一个脂质之间的连接可以同时经由上面提及的两个实施方式发生。例如，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸可以经由连接剂(类似于第一实施方式)在核酸的一个位置与至少一个脂质连接，并且在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的不同位置直接与至少一个脂质连接而无需利用连接剂(类似于第二实施方式)。例如，在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’端，如上所述的至少一个脂质可以经由连接剂与核酸共价连接，而在根据本发明的核酸的5’端，如上所述的脂质可以与核酸共价连接而无需连接剂。可替换地，在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的5’端，至少一个如上所述的脂质可以经由连接剂与根据本发明的式(I)或式(II)的核酸共价连接，而在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’端，如上所述的脂质可以与根据本发明的式(I)或式(II)的核酸共价连接而无需连接剂。同样地，共价连接不仅可以发生在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的末端，而且还可以发生在分子内，如上所述，例如在3’端和分子内、在5’端和分子内、在3’和5’端和分子内、仅在分子内等。
根据本发明的式(I)或式(II)的脂质修饰的核酸可以优选地通过各种方法获得。脂质修饰可以原则上-如上所述-在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的任何位置被引入，例如在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’和/或5’端或在磷酸骨架处和/或在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的任何核苷酸的糖处。根据本发明，优选在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’和/或5’端的末端脂质修饰。通过这样的末端化学修饰，根据本发明可以获得大量不同衍生的核酸。包括在本发明中的变体的实例在图4中示出。用于制备这样的脂质修饰的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的方法优选根据脂质修饰的位置选择。
如果，例如，脂质修饰发生在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’端，那么脂质修饰通常在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的制备之前或之后进行。根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的制备可以通过核酸的直接合成或可选地通过加入已经合成的核酸或来自从其他来源分离的样品的核酸来进行。
根据第一备选方案，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸在脂质引入前直接合成，通常借助于现有技术中已知的用于合成核酸的方法。为此，起始核苷优选经由偶联分子，例如琥珀酰残基，结合到固相，并且根据本发明的式(I)或式(II)的核酸例如通过酰胺化学(amidite chemistry)的方法合成。如上文所述的连接剂然后优选经由连接剂的第一反应基团共价结合到根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’端。然后如上文所述的脂质经由连接剂的第二反应基团与连接剂共价连接。可替换地，连接剂可以在其结合到根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’端之前与脂质共价连接。在这种情况下，仅连接剂的第一反应基团与根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’端的结合是必须的。在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸合成后，或脂质结合后，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸可以从固相中分离并脱保护。如果合成已经在溶液中进行，则用于去除未反应的反应物 以及溶剂和不希望的第二产物的冲洗和纯化步骤可以在根据本发明的脂质修饰的核酸的合成后进行(以及可选地在从载体物质中分离前进行)。
根据进一步的备选方案，根据本发明的式(I)或式(II)的3’-脂质-修饰的核酸，如上所述，在连接剂的反应基团上引入脂质后被合成，或作为式(I)或式(II)的已经合成的核酸或已经从样品分离的式(I)或式(II)的核酸(参见例如图5)被结合到连接剂的反应基团。为此，例如，如上所述的连接剂的第一反应基团可以与如上文所述的脂质反应。然后，优选在第二步骤中，连接剂的第二反应基团设置有酸稳定的保护基团，如DMT、Fmoc等，以便允许随后根据本发明的式(I)或式(II)的核酸结合到该反应基团。随后连接剂可以经由连接剂的第三反应基团而直接或间接地结合到固相。间接结合是可能的，例如，经由(偶联)分子，其可以共价结合到连接剂和固相。这样的(偶联)分子为，例如，琥珀酰残基等，如下文所述。随后通常发生连接剂的第三反应基团处的保护基团的去除和在现在可接近的反应基团处的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的结合或合成。最后，根据本发明的脂质修饰的核酸通常从载体物质裂开(以及核酸上的保护基团被可选地去除)。然而，另外的脂质也可以可选地偶联到根据本发明的偶联的核酸的3’端，优选根据下文所述的步骤之一。
根据该上述备选方案的变体，如上所述的连接剂可以经由第一反应基团直接或间接地结合到固相。随后酸稳定的保护基团首先结合到连接剂的第二反应基团。在保护基团结合到第二反应基团后，如上所述的脂质可以首先结合到连接剂的第三反应基团。随后同样地优选进行在连接剂的第三反应基团处的保护基团的去除、在现在可接近的反应基团处的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的结合或合成、以及根据本发明的脂质修饰的核酸从载体物质的裂开(以及可选的在核酸处的保护基团的去除)。
按照根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’-脂质修饰的特别优选的实施方式，如上所述，根据本发明的这样的脂质-修饰的核酸可以经由具有基于甘油基础物质(C3锚)的三个反应基团(三官能锚化合物)并具有单功能脂质，如，例如，棕榈酰残基、胆固醇或生育酚的连接剂而合成。作为用于合成连接剂的起始物质，可以使用，例如，α，β-异亚丙基-甘油(包含缩酮保护基团的甘油)，其优选首先借助氢化钠转化成醇化物，并与十六烷基溴和在Williamson合成中的脂质反应以形成相应的醚。可替换地，醚键可以通过不同的方法在第一步骤中被连接，例如，通过α，β-异亚丙基-甘油的甲苯磺酸盐(酯)的形成，以及甲苯磺酸盐与脂质的反应基团例如酸性质子的反应，以形成相应的醚。在第二阶段，缩酮保护基团可以用酸，例如乙酸、稀盐酸等去除，然后二醇的伯(primary)羟基可以通过二甲氧基三苯甲基氯(DMT-Cl)选择性地被保护。在最后阶段中，优选进行在前述步骤中获得的产物与琥珀酐的反应以形成具有DMAP的琥珀酸酯作为催化剂。这样的连接剂特别适合，例如，用于作为脂质的棕榈酰残基或生育酚的结合(参见例如图5)。
根据另一备选方案，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的3’-脂质修饰，如上所定义的，利用(双功能)脂质，如，例如，聚乙二醇(PEG)或六乙二醇(HEG)实现，而不利用如上所述的连接剂。这样的双功能脂质通常具有如上所述的两个官能团，其中双功能脂质的一端可以优选经由(偶联)分子，例如碱-不稳定的琥珀酰锚等，结合到载体物质，如本文所述，并且根据本发明的式(I)或式(II)的核酸可以在双功能脂质的另一端被合成(E.Bayer，M.Maier，K.Bleicher，H.-J.Gaus Z.Naturforsch.50b(1995)671)。通过分别地省去第三功能化和连接剂，如上文所使用的，根据本发明的这样的脂质修饰的核酸的合成被简化(参见例如图6)。对于制备，根据本发明所用的双功能脂质，例如聚乙二醇，通常首先用保护基团，例如DMT单取代。在第二阶段，在反应基团处被保护的脂质的酯化通常借助琥珀酐进行，用DMAP催化，以形成琥珀酸酯。其后，在第三阶段，双功能 脂质可以偶联到载体物质并被脱保护，随后根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的合成可以按照如上文所述的方法在第四步骤中发生。随后可选地进行根据本发明的式(I)或式(II)的合成的核酸的脱保护和脂质修饰的核酸从载体物质的裂开。
根据另一优选的实施方式，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的脂质修饰，如上所述，发生在核酸的5’端。从而脂质修饰通常在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的提供后或合成后进行。根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的提供可以被进行-如上所定义的-经由根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的直接合成或通过加入已经合成的式(I)或式(II)的核酸或从样品分离的式(I)或式(II)的核酸。根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的合成的发生，优选类似于上述方法，根据现有技术中已知的核酸合成过程，更优选根据亚磷酰胺(phosphoramidite)过程(参见例如图7)。
根据特别优选的实施方式，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的脂质修饰按照用于合成核酸的亚磷酰胺过程，通过特别修饰的亚磷酰胺，在根据本发明的核酸的5’端发生。这样的酰胺(其可相对简单地通过合成获得)作为最后的单体被常规地偶联到商业上可获得的或已经合成的核酸。这些反应的特征为相对快的反应动力学和非常高的偶联产率。修饰的酰胺的合成优选通过亚磷酰胺，例如β-氰基乙基-单氯亚磷酰胺(亚磷酸单-(2-氰基乙基酯)-二异丙基-二氯代酰胺)与如上定义的脂质的醇(溶解在合适的溶剂中，例如纯二氯甲烷中，例如生育酚、胆固醇、十六烷醇、DMT-PEG等的脂质醇)的反应发生。同样优选地，DIPEA作为酸受体被加入到反应溶液中。
用于根据本发明的5’-脂质-修饰的核酸的合成的亚磷酰胺对于水解是相对抵抗的并且可以(在合成前)借助于硅胶通过色谱法纯化。为此，少量的弱碱，如，例如，三乙胺，通常被加到洗脱液中以便避免酰胺的分解。重要的是这种碱从产物被再次完全去除，以便避免不良的偶联产率。这可以例如通过在真空中简单干燥进行， 但是优选通过亚磷酰胺的纯化通过利用戊烷从叔丁基甲基醚沉淀其进行。如果所用的脂质修饰的酰胺具有非常高的粘度，例如以粘性油的形式存在，则也可以进行(快速)柱色谱，其使得可以无需三乙胺作为碱。然而，在PEG-修饰的酰胺的情况下，通常不进行这样的纯化，因为它们包含酸-不稳定的DMT保护基团。
对于脂质-修饰的亚磷酰胺与根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的5’端的偶联反应，优选使用那些溶剂，其中所用的酰胺是充分溶解的。例如，由于根据本发明所用的酰胺的高亲油性，它们在乙腈中的溶解度可以被限制。除了通常所用的作为溶剂的乙腈，氯代烃类溶液因此优选用于偶联反应，例如，(纯)二氯甲烷中的0.1M溶液。然而，二氯甲烷的使用需要合成循环的标准方案的一些变化。例如，为了避免酰胺在自动合成装置的管中和载体物质上的沉淀，与酰胺接触的所有阀和管在实际偶联步骤之前和之后用(纯)二氯甲烷冲洗并吹干。
当使用脂质-修饰的酰胺时，通常获得高偶联产率，其与现有技术中常规使用的酰胺的偶联产率相当。脂质修饰的酰胺的反应动力学通常进行的更慢。为此，当使用脂质修饰的酰胺时，与标准方案相比，偶联时间优选(显著)延长。这样的偶联时间可以容易地由本领域技术人员确定。因为偶联后的帽化步骤可以被省去，因此如果需要，同样可以用同样的脂质修饰的酰胺进行进一步的合成循环，以便提高反应的总产率。在这种情况下，通常不进行脱三苯甲基步骤，例如在DMT-修饰的脂质如DMT-PEG的情况下。
在根据本发明的5’-脂质-修饰的核酸的合成中，亚磷酸三酯(脂质经由其被结合到根据本发明的式(I)或式(II)的核酸)可以通过硫化剂(sulfurising agent)被氧化。为此，优选使用尽可能完全实现磷酸三酯的氧化的硫化剂。否则，硫化反应，例如因为空间原因，可能进行得不完全，使得在氨裂解(裂开)和MON脱保护后，仅获得少量产物，或者完全没有产物。这种现象依赖于修饰的类型、所 使用的硫化剂以及硫化条件。氧化因此优选用碘进行。结果，虽然引入了磷酸二酯键，但由于脂质残基的邻近，预期该键将不被核酸酶识别为底物。
在脂质修饰中，包含在根据本发明的式(I)或式(II)的核酸中的连接剂或(双功能)脂质，或者可选地根据本发明的式(I)或式(II)的核酸本身，如上文所述，可以被直接或间接地偶联到载体物质。直接偶联优选直接与载体物质进行，而间接偶联到载体物质通常经由进一步的(偶联)分子进行。通过偶联到载体物质形成的键优选表现出与连接剂或双功能脂质的(可裂开的)共价键和/或与固相(可裂开的)共价键。适合作为(偶联)分子的化合物为，例如，二羧酸，例如，琥珀酰残基(＝琥珀酰锚)、草酰残基(＝草酰锚)等。连接剂、(双功能)脂质或可选地根据本发明的式(I)或式(II)的核酸(其，象，例如，氨基烷基残基(例如氨基丙基或氨基己基残基)，携带自由氨基功能)，可以经由酞亚胺连接剂被结合到载体物质。含硫醇连接剂、(双功能)脂质或可选地根据本发明的式(I)或式(II)的核酸可以以二硫化物形式被结合到载体物质。与本发明相关的合适的载体物质特别为固相，如CPG、氨基-功能化的PS-PEG(S NH2)等，优选或氨基-功能化的PS-PEG(S NH2)。根据特别的实施方式，对与偶联到载体物质，优选用TBTU/NMM(1H-苯并三唑-1-基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(tetramethyluroniumtetrafluoroborate)/N-甲基吗啉)作为偶联剂，将例如所述连接剂或根据本发明所用的双功能脂质的琥珀酸酯偶联到氨基-功能化的PS-PEG(S NH2)是可能的。在常规使用的1μmol规模上的PS-PEG载体物质的情况下，最好的结果通常用从50-100μmol/g的负载获得(E.Bayer，K.Bleicher，M.Maier Z.Naturforsch.50b(1995)1096)。然而，如果，根据本发明大规模合成核苷酸，则载体物质的加载(负载)优选尽可能高(≥100μmol)。根据本发明，这样的过程同样导致良好的偶联产率(M.Gerster，M.Maier，N.Clausen，J.Schewitz，E.Bayer Z.Naturforsch.52b(1997) 110)。例如，载体物质，如，例如，具有直到138μmol/g或可选地更多的加载(负载)的树脂的使用可以具有良好的合成产率。因为用上述连接剂或双功能脂质的偶联产率为大约100％，载体物质的加载可以经由这些化合物的化学计量相对精确地调整。优选通过裂开的DMT保护基团的光谱定量监测加载(参见实验部分)。仍然存在在载体物质上的残留氨基功能可以用乙酸酐帽化。这个帽化通常在载体物质加载后进行，但也可以直接在核酸合成中发生，例如在DNA合成器中。对于脂质修饰的核酸在衍生的PS-PEG载体物质上的合成，优选使用对于特别开发的合成循环，其考虑物质的特性(E.Bayer，M.Maier，K.Bleicher，H.-J.Gaus Z.Naturforsch.50b(1995)671，E.Bayer，K.Bleicher，M.Maier Z.Naturforsch.50b(1995)1096.)。与标准方案相比优选的改变包括：
●在偶联、帽化和氧化步骤中延长反应时间；
●增加脱三苯甲基步骤的数量；
●延长每一步骤后的冲洗步骤；
●在酰胺过程期间通常必须(用于亚磷酸三酯的氧化)的氧化步骤后使用包含抗坏血酸的洗涤溶液(在二噁烷/水＝9∶1中的0.1M)，以便去除痕量的碘。
应当注意到，修饰的性质可以对合成循环的单独的步骤具有影响。例如，在PEG1500-衍生的载体物质的情况下，观察到相当慢的反应动力学，其需要再次延长的脱三苯甲基步骤，和此外延长的偶联时间。这样的改变和适应在本领域技术人员的正常能力范围内，并且可以在本披露内容的上下文中的任何时间进行。借助如此修饰的这些反应循环，脂质修饰的磷酸二酯和硫代磷酸酯两者可以被合成。根据本发明所用的连接剂或双功能脂质上的酰胺的偶联产率没有被脂质残基消弱但是相应于常规值(97-99％)。5’衍生和进一步的例如在碱、糖或磷酸骨架处的修饰的引入的可能性在使用这样的3’修饰时被维持。
式(I)或式(II)的核酸，作为化学未修饰的核酸或作为(化学)修饰的核酸，如作为式(I)或式(II)的脂质修饰的核酸，可以同样通过形成式(I)或式(II)的核酸与例如以下物质(不限于此)的复合体而被稳定：阳离子聚合物、阳离子肽或多肽、优选与聚阳离子聚合物如多溶素或聚精氨酸或可替换地与阳离子脂质或lipofectants、与组蛋白、核仁素、鱼精蛋白、oligofectamine、精胺或亚精胺、和阳离子多糖、尤其是壳聚糖、TDM、MDP、胞壁酰基二肽、聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(聚醚)，pluronics)、和/或它们的衍生物之一等。组蛋白和鱼精蛋白为天然压缩DNA的阳离子蛋白。它们由此在体内负责非转录DNA和一些病毒的DNA的缩合。作为在本发明的上下文中可以用于与式(I)或式(II)的核酸形成复合物的组蛋白，可以更特别地提及组蛋白H1、H2a、H3和H4。然而，鱼精蛋白(鱼精蛋白P1或P2)或鱼精蛋白的阳离子部分序列是特别优选的。在本发明的上下文中，所述化合物可以有利地由衍生自鱼精蛋白P1或P2的肽序列代表，并且更精确地相应于(阳离子)序列(SRSRYYRQRQRSRRRRRR(SEQ IDNo.85)或RRRLHRIHRRQHRSCRRRKRR(SEQ ID NO：86)。适合于与根据本发明的式(I)或式(II)的核酸形成复合物的其他化合物可以选自如本文所定义的佐剂化合物，不限于此。
在该上下文中，“形成复合体”将意味着式(I)或式(II)的核酸通过形成核酸与稳定化合物之间的非共价复合体而被结合到如上所定义的稳定化合物，如，阳离子聚合物、阳离子肽或多肽等。这里，“非共价”意味着核酸和稳定化合物的可逆缔合通过这些分子的非共价相互作用形成，其中所述分子通过一些类型的电子的相互作用(除了共价键之外)而缔合到一起，例如，通过范德瓦尔斯键，即起因于两个分子之间的非特异性吸引力的弱静电吸引。式(I)或式(II)的核酸与稳定化合物的缔合与该复合体的离解平衡。不受任何理论约束，预期所述平衡在细胞内移向式(I)或式(II)的核酸与稳定剂的离解。
根据实施方式，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸可以为免疫刺激剂(如果没有任何其它药物活性成分被给予)或者可以用作佐剂(如果与药物活性成分一起给予，例如，作为包含药物活性成分和佐剂成分的组合物(例如，包含特异性抗原和作为佐剂的根据式(I)或(II)的核酸的疫苗组合物))。
作为“免疫刺激剂”的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸优选能够触发非抗原特异性免疫反应(如由先天免疫系统所提供的)，优选以免疫刺激方式。免疫反应通常可以以多种方式产生。用于合适的免疫反应的重要因素为不同T细胞亚群的刺激。T淋巴细胞通常分化为两个亚群，T辅助1(Th1)细胞和T辅助2(Th2)细胞，借助其免疫系统能够消灭细胞内(Th1)和细胞外(Th2)病原体(如，抗原)。这两个Th细胞群在由它们产生的效应蛋白(细胞因子)的模式方面不同。因此，Th1细胞通过活化巨噬细胞和细胞毒性T细胞辅助细胞免疫反应。另一方面，Th2细胞通过刺激B细胞转化为浆细胞并通过抗体的形成(如，针对抗原)促进体液免疫反应。因此，Th1/Th2比率在免疫反应中是非常重要的。关于本发明，免疫反应的Th1/Th2比率优选由免疫刺激剂移位(displaced)，即，根据本发明的式(I)或式(II)的核酸在朝向细胞反应，即，Th1反应的方向上，主要的细胞免疫反应由此被诱导。如上所定义的，本发明的核酸自身施加非特异性免疫反应，其允许要被使用的那样的核酸(没有加入另外的药物活性成分)作为免疫刺激剂。如果与另外的药物活性成分一起给予，则优选特异地免疫刺激成分，本发明的核酸用作支持由其他药物活性成分引发的特异性免疫反应的佐剂。
本发明还涉及包含根据本发明的式(I)或式(II)的核酸、或两者，以及可选的药用载体和/或进一步的辅助物质和添加剂和/或佐剂的药物组合物(本发明的组合物的第一实施方式)。此外，本发明涉及包含根据本发明的式(I)或式(II)的核酸、或两者，药物活性成分以 及可选的药用载体和/或进一步的辅助物质和添加剂和/或佐剂的药物组合物(本发明的组合物的第二实施方式)。
根据本发明的药物组合物通常包括安全和有效量的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸，或者两者，如上所述。如这里所使用的，“安全和有效量”意味着根据本发明的式(I)或式(II)的核酸，或者两者的量足以显著地诱导要被治疗的病症如肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应或传染病的积极改变。然而，同时，“安全和有效量”小的足以避免严重副作用，即，允许优点和风险之间的敏感关系。这些界限的确定通常在明智的医疗判断的范围内。关于根据本发明的式(I)或式(II)的核酸，表达“安全和有效量”优选意味着适合于以这样的方式刺激免疫系统的量，其使得没有过度或破坏免疫反应实现，但是，优选地，也没有这样的免疫反应在可测量的水平之下。根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的“安全和有效量”将根据要被治疗的特定病症、以及要被治疗的患者的年龄和身体状况、状况的严重性、治疗的持续时间、伴随治疗的性质、所用的特定的药用载体的性质、以及类似的因素而变化，在伴随的医生的知识和经验范围内。根据本发明的药物组合物可以根据本发明用于人类，并且也可用于兽医医疗目的。
根据第一实施方式，根据本发明的式(I)或式(II)的上述核酸自身可以为免疫刺激剂(不加入任何其他药物活性成分)。如果根据本发明的式(I)或式(II)的核酸包含脂质修饰，这特别地维持。脂质可以提高本发明的核酸的免疫刺激性质或者也可以形成治疗活性分子，如，例如，维生素、或类固醇，如上所述，例如α-生育酚(维生素E)、D-α-生育酚、L-α-生育酚、D，L-α-生育酚、维生素E琥珀酸酯(VES)、维生素A及其衍生物、维生素D及其衍生物、维生素K及其衍生物等。
根据本发明的第二实施方式的药物组合物包含(除了根据本发明的式(I)或式(II)的核酸之外)至少一种另外的药物活性成分。在这 一点上药物活性成分是针对特定适应症，优选癌症疾病、自身免疫性疾病、变态反应或传染病具有治疗作用的化合物。这样的化合物包括，而不意味着任何限制，肽、蛋白质、核酸、(治疗活性)低分子量有机或无机化合物(分子量小于5000，优选小于1000)、糖、抗原或抗体、现有技术中已知的治疗剂、抗原细胞、抗原细胞片段、细胞分段；修饰的、消弱的或减活的(例如化学或通过刺激)病原体(病毒、细菌等)等。
根据(根据本发明的组合物的)第二实施方式的第一备选方案，包含在药物组合物中的药物活性成分为免疫调节成分，优选免疫刺激成分。最优选地，药物活性成分为抗原或免疫原。“抗原”和“免疫原”被理解为任何结构，其能够导致抗体的形成和/或细胞免疫反应的活化，即，特异性(以及没有佐剂)免疫反应。根据本发明，因此，术语“抗原”和“免疫原”同义使用。抗原的实例为肽、多肽，也即蛋白质、细胞、细胞提取物、多糖、多糖共轭物、脂质、糖脂和碳水化合物。考虑到作为抗原的有，例如，肿瘤抗原、病毒、细菌、真菌和原生动物抗原。优选肿瘤细胞的表面抗原和尤其是分泌形式的病毒、细菌、真菌或原生动物病原体的表面抗原。所述抗原当然可以以例如根据本发明的疫苗的形式存在，还可以作为偶联到合适的载体的半抗原。其他抗原成分，如，减活或消弱的病原体(如上所述)，也可以使用。
抗原(多)肽包括所有已知的抗原肽，例如肿瘤抗原等。肿瘤抗原的具体实例尤其是肿瘤特异性表面抗原(TSSA)，例如5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、BAGE、β-联蛋白(catenin)/m、Bcr-abl、MN/C IX抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、β-联蛋白/m、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2/新、 HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HAST-2、hTERT(或hTRT)、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/草木犀浆-A、MART-2/Ski、MC1R、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1，-2，-3、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、p190次要bcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1或RU2、SAGE、SART-1或SART-3、存活素(survivin)、TEL/AML1、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF和WT1、或来自序列，如，例如，NY-Eso-1或NY-Eso-B。任何类型的肿瘤抗原适合于本发明的目的，例如，已知在新血管形成中涉及的肿瘤抗原，影响细胞外基质结构等。肿瘤抗原可以在药物组合物中作为蛋白抗原或作为编码肿瘤抗原的mRNA或DNA提供，优选上述肿瘤抗原。
(包含本发明的核酸(作为佐剂)和另外的药物活性成分的用于根据本发明的组合物)的第二实施方式的第二备选方案，药物活性成分为抗体。关于这一点，可以使用任何治疗学上合适的抗体。根据本发明特别优选针对以下的抗体：抗原、在癌症疾病或传染病中起重要作用的蛋白质或核酸、例如细胞表面蛋白、肿瘤抑制基因或其抑制剂、生长和延长因子、凋亡相关蛋白、肿瘤抗原、或如上文所述的抗原等。
根据第二实施方式的第三备选方案，包含在根据本发明的药物组合物中的药物活性成分为核酸。这样的核酸可以为单链或双链的，并且可以为同源或异源双链体的形式，也可以为线形或环形形式。包含在药物组合物中的作为药物活性成分的核酸在其长度方面没有限制并且可以包括任何天然存在的核酸序列或它的补体或其片段。同样地，在这一点上所用的核酸可以为部分或完全合成性质。例如，所述核酸可以包括编码(治疗相关)蛋白和/或能够引起免疫反应的核酸，例如，抗原或编码抗原的核酸。这里的抗原优选为如上文所述的抗原。
优选地，包含在根据本发明的药物组合物中作为药物活性成分的核酸为mRNA。这样的mRNA可以以其裸露的形式被加入到根据本发明的药物组合物中或以减少或甚至防止核酸在体内的降解的稳定的形式，例如，通过核酸外切酶和/或核酸内切酶。
例如，包含在根据本发明的药物组合物中作为药物活性成分的mRNA可以通过至少50个核苷酸、优选至少70个核苷酸、更优选至少100个核苷酸、特别优选至少200个核苷酸的上面限定的5’帽和/或3’端的聚-A尾被稳定化。如已经提及的，末端结构在体内至关重要。RNA经由这些结构被识别为mRNA，并且降解被调节。此外，然而，存在进一步的稳定或不稳定RNA的过程。这些过程中的许多仍是未知的，但是RNA和蛋白质之间的相互作用通常因此似乎是决定性的。例如，最近已经描述了“mRNA监督系统”(Hellerin and Parker，Ann.Rev.Genet.1999，33：229-260)，其中不完全或非有义mRNA通过胞液中的特别反馈蛋白质相互作用被识别，并受到降解的作用，这些过程的大部分通过核酸外切酶进行。
包含在根据本发明的药物组合物中作为药物活性成分的mRNA的稳定化同样可以通过缔合或复合mRNA与阳离子化合物或结合mRNA到阳离子化合物，尤其是聚阳离子化合物，例如(聚)阳离子肽或蛋白质来进行。尤其是，使用鱼精蛋白、核仁素、精胺或亚精胺作为聚阳离子、核酸结合蛋白是特别有效的。此外，使用其它阳离子肽或蛋白质，如聚-L-赖氨酸或组蛋白同样是可能的。这种用于稳定mRNA的过程描述在EP-A-1083232中，将其全部披露内容以引用方式并入本发明中。可以用于稳定作为药物活性成分存在的mRNA的进一步优选的阳离子物质包括阳离子多糖，例如壳聚糖、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚乙烯亚胺(PEI)或聚-L-赖氨酸(PLL)等。除了根据本发明的脂质修饰的核酸以佐剂的形式在改善细胞渗透性方面的作用(其已经是有利的)外，mRNA与阳离子化合物(例如，阳离子蛋白或阳离子 脂质，如，oligofectamine，作为基于脂质的复合试剂)的缔合或复合优选提高作为药物活性成分存在的mRNA转移入要被处理的细胞或要被处理的生物体。还涉及本文的披露内容是关于本发明的核酸通过复合的稳定作用，其也适用于mRNA的稳定化。
另一稳定作为根据本发明的药物组合物中的药物活性成分的mRNA的方法(途径)是通过去除或改变所谓的去稳定序列元件(DSE)靶向改变mRNA的序列。信号蛋白能够结合到这些去稳定序列元件(DSE)，其尤其发生在真核生物mRNA中，并调节mRNA在体内的酶降解。因此，为了进一步稳定作为药物活性成分存在的mRNA，优选进行与野生型mRNA的相应区相比较的一个或多个改变，使得没有去稳定序列元件存在。当然，根据本发明同样优选的是从mRNA去除可选地存在于非翻译区(3’-和/或5’-UTR)中的DSE。上述DSE的实例为富含AU-的序列(“AURES”)，其存在于许多不稳定的mRNA的3’-UTR段中(Caput et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1986，83：1670-1674)。因此，用作药物活性成分的mRNA优选与野生型mRNA相比以不包含任何这样的去稳定序列的方式被修饰。对于那些被可能的核酸内切酶识别的序列基序来说这也是成立的，例如序列GAACAAG，其包含在编码转铁蛋白受体的基因的3’-UTR节段中(Binder et al.，EMBO J.1994，13：1969-1980)。这样的序列基序优选也从根据本发明的脂质修饰的核酸中被去除。
在根据本发明的药物组合物中作为药物活性成分的mRNA可以被进一步修饰，例如为了可能希望的有效翻译，以这样的方式使得核糖体有效结合到核糖体结合位点(Kozak序列：GCCGCCACCAUGG(SEQ ID NO：84)，AUG形成起始密码子)发生。在这点上已经注意到，在这个位置周围的提高的A/U含量允许更有效的核糖体结合到mRNA。
此外，可以将一个或多个所谓的IRES(内核糖体进入侧)引入到用作药物活性成分的mRNA中。IRES由此可以作为唯一的核 糖体结合位点起作用，并且它还可以用于提供编码将被核糖体彼此独立地翻译的多个肽或多肽的mRNA(“多顺反子mRNA”)。根据本发明可以被使用的IRES序列的实例为那些来自细小核糖核酸病毒(例如FMDV)、鼠疫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、足-和-口病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、常见猪瘟病毒(CSFV)、鼠角膜白斑病毒(MLV)、猴(simian)免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的序列。
在根据本发明的药物组合物中可选的用作药物活性成分的mRNA同样可以在其5’-和/或3’-非翻译区包含能够提高mRNA在胞液中的半衰期的稳定序列。这些稳定序列可以表现出与存在于病毒、细菌和真核生物中的天然存在的序列的100％的序列同源性，但是它们还可以为部分或全部合成性质。作为可以用在本发明中的稳定序列的实例，可以被提及的有例如Homo sapiens或Xenopuslaevis的β-珠蛋白基因的非翻译序列(UTR)。稳定序列的另一实例具有通式(C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC(SEQ ID NO：88)，其包含在编码α-珠蛋白、α-(I)-胶原、15-酯加氧酶或酪氨酸-羟化酶的非常稳定的mRNA的3’-UTR中(参见Holciket al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997，94：2410-2414)。当然，这样的稳定序列可以单独或以相互结合使用以及与本领域技术人员已知的其它稳定序列结合使用。
为了进一步增加最终希望的翻译，用作药物活性成分的mRNA可以表现出与相应的野生型mRNA相比的下面的修饰，所述修饰可以作为替代物或互相组合存在。另一方面，编码肽或多肽的修饰的mRNA的区的G/C含量可以大于编码肽或多肽的野生型mRNA的编码区的G/C含量，被编码的氨基酸序列与野生型相比未被修饰。这种修饰基于这个事实，即，为了mRNA的有效翻译，mRNA的稳定性同样是重要的。各种核苷酸的组成和序列由此起大的作用。尤其是，具有提高的G(鸟苷)/C(胞嘧啶)含量的序列比具有提高的 A(腺苷)/U(尿嘧啶)含量的序列更稳定。因此，根据本发明，虽然保持翻译的氨基酸序列，但与野生型mRNA相比，密码子以它们包含更多的G/C核苷酸的方式被改变。因为多个密码子编码同样的氨基酸(遗传密码的简并性)，所以对于稳定性有利的密码子可以被确定(可替换的密码子选择)。依赖于要由mRNA编码的氨基酸，与野生型序列相比对于mRNA序列的修饰的不同可能性是可能的。在由包含单独的G或C核苷酸的密码子编码的氨基酸的情况下，没有密码子的修饰是必要的。因此，对于Pro(CCC或CCG)、Arg(CGC或CGG)、Ala(GCC或GCG)和Gly(GGC或GGG)的密码子不需要任何改变，因为没有A或U存在。在下面的情况中，包含A和/或U核苷酸的密码子通过编码同样的氨基酸但是不包含A和/或U的不同密码子的替换而被改变。实例为：对于Pro的密码子可以从CCU或CCA改变为CCC或CCG；对于Arg的密码子可以从CGU或CGA或AGA或AGG改变为CGC或CGG；对于Ala的密码子可以从GCU或GCA改变为GCC或GCG；对于Gly的密码子可以从GGU或GGA改变为GGC或GGG。在另外的情况下，虽然A和U核苷酸无法从密码子去除，但是可以通过利用包含更少的A和/或U核苷酸的密码子减少A和U含量。例如：对于Phe的密码子可以从UUU改变为UUC；对于Leu的密码子可以从UUA、CUU或CUA改变为CUC或CUG；对于Ser的密码子可以从UCU或UCA或AGU改变为UCC、UCG或AGC；对于Tyr的密码子可以从UAU改变为UAC；终止密码子UAA可以从UAG改变为UGA；对于Cys的密码子可以从UGU改变为UGC；密码子His可以从CAU改变为CAC；对于Gln的密码子可以从CAA改变为CAG；对于Ile的密码子可以从AUU或AUA改变为AUC；对于Thr的密码子可以从ACU或ACA改变为ACC或ACG；对于Asn的密码子可以从AAU改变为AAC；对于Lys的密码子可以从AAA改变为AAG；对于Val的密码子可以从GUU或GUA改变为GUC或GUG；对于Asp的密码子可以从GAU改变为GAC；对于Glu的密码子可以从 GAA改变为GAG。另一方面，在对于Met(AUG)和Trp(UGG)的密码子的情况下，不存在序列修饰的可能性。当然，上面列出的替换可以个别地使用，而且可以以用于提高与原始序列相比修饰的mRNA的G/C含量的所有可能的组合使用。因此，例如，用于存在于原始(野生型)序列中的Thr的所有密码子可以被改变为ACC(或ACG)。然而，优选地，上述替换可能性的组合被使用，例如：原始序列中编码Thr的所有密码子替换为ACC(或ACG)并且原始地编码Ser的所有密码子替换为UCC(或UCG或AGC)；原始序列中编码Ile的所有密码子替换为AUC并且原始地编码Lys的所有密码子替换为AAG并且原始地编码Tyr的所有密码子替换为UAC；原始序列中编码Val的所有密码子替换为GUC(或GUG)并且原始地编码Glu的所有密码子替换为GAG并且原始地编码Ala的所有密码子替换为GCC(或GCG)并且原始地编码Arg的所有密码子替换为CGC(或CGG)；原始序列中编码Val的所有密码子替换为GUC(或GUG)并且原始地编码Glu的所有密码子替换为GAG并且原始地编码Ala的所有密码子替换为GCC(或GCG)并且原始地编码Gly的所有密码子替换为GGC(或GGG)并且原始地编码Asn的所有密码子替换为AAC；原始序列中编码Val的所有密码子替换为GUC(或GUG)并且原始地编码Phe的所有密码子替换为UUC并且原始地编码Cys的所有密码子替换为UGC并且原始地编码Leu的所有密码子替换为CUG(或CUC)并且原始地编码Gln的所有密码子替换为CAG并且原始地编码Pro的所有密码子替换为CCC(或CCG)；等等。优选地，编码肽或多肽的mRNA的区(或可选地存在的每个其他另外的段)的G/C含量，与编码相应的肽或多肽的野生型mRNA的编码区的G/C含量相比，提高至少7％个点，更优选至少15％个点，特别优选至少20％个点，并且优选至少50％，更优选至少70％，以及最优选至少90％。在这点上尤其优选的是与野生型序列相比提高如此修饰的mRNA的G/C含量到最大可能的程度。
用作药物组合物中的药物活性成分的mRNA的进一步优选的修饰基于以下发现：翻译效率还由细胞中tRNA存在的不同频率决定。因此，如果所谓的“稀有”密码子在RNA序列中以增加的数量存在，那么与其中存在编码相对“频繁的”tRNA的密码子的情况相比，相应的mRNA的翻译显著更少。因此，根据本发明，用作药物活性成分的mRNA中的编码区与野生型mRNA的相应区相比以这样的方式被修饰，使得编码细胞中相对稀有的tRNA的野生型序列的至少一个密码子被细胞中编码相对频繁的tRNA的密码子取代，其运载与相对稀有的tRNA相同的氨基酸。借助于这种修饰，RNA序列被如此修饰，使得密码子被引入(对于其频繁存在的tRNA是可获得的)。哪个tRNA相对频繁地存在于细胞中，并且相反，哪个tRNA相对稀有，对于本领域技术人员是已知的；参见，例如，Akashi，Curr.Opin.Genet.Dev.2001，11(6)：660-666。借助于这个修饰，根据本发明编码细胞中相对稀有的tRNA的野生型序列的所有密码子被编码细胞中相对频繁的tRNA的密码子取代(其运载与相对稀有的tRNA相同的氨基酸)是可能的。尤其优选的是结合如上述的mRNA中增加的，尤其是最大化的，连续的G/C含量与“频繁”密码子，而无需改变由mRNA的编码区编码的抗原肽或多肽(一个或多个)的氨基酸序列。优选的可以由G/C富集的/最优化的mRNA编码的抗原在上面列出。
根据第二实施方式的第四备选方案(用于本发明的组合物)，作为药物活性成分包含在根据本发明的药物组合物中的核酸为dsRNA，优选siRNA。dsRNA，或siRNA特别是在RNA干涉现象方面是感兴趣的。在免疫学研究的过程中注意力被吸引到RNA干涉现象。近些年，基于RNA的防御机制已经被发现，其发生在真菌领域和植物和动物领域，并用作“基因组的免疫系统”。所述系统最初描述在相互独立的多个物种中，首先在C.elegans中，不久可以鉴定所述过程的潜在机制(其是相同的：植物中RNA-介导的病毒抗性、植物中的PTGS(转录后基因沉默)、以及真核生物中的 RNA干涉)是由此基于共同的过程。RNA干涉(RNAi)的体外技术是基于双链RNA分子(dsRNA)，其触发基因表达的序列特异性抑制(Zamore(2001)Nat.Struct.Biol.9：746-750；Sharp(2001)GenesDev.5：485-490：Hannon(2002)Nature41：244-251)。在用长dsRNA的哺乳动物细胞转染中，蛋白激酶R和核糖核酸酶L的活化导致非特异性的作用，如，例如，干扰素反应(Stark et al.(1998)Annu.Rev.Biochem.67：227-264；He and Katze(2002)Viral Immunol.15：95-119)。在使用较短的，例如21-mer到23-mer，所谓的si-RNA(小干涉RNA)时，这些非特异性作用被避免，因为非特异性作用不被短于30bp的siRNA触发(Elbashir et al.(2001)Nature 411：494-498)。最近，dsRNA分子也在体内被使用(McCaffrey et al.(2002)，Nature 418：38-39；Xia et al.(2002)，NatureBiotech.20：1006-1010；Brummelkamp et al.(2002)，Cancer Cell 2：243-247)。
在根据本发明的药物组合物中最终用作药物活性成分的双链RNA(dsRNA)由此优选包含具有通用结构5’-(N17-29)-3’的序列，其中N为任何碱，并代表核苷酸。通用结构由具有由核糖核甘酸构成的大分子的双链RNA构成，所述核糖核苷酸包含戊糖(荷塘)、有机碱和磷酸。这里RNA中的有机碱包括嘌呤碱腺苷(A)和鸟苷(G)和嘧啶碱胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在根据本发明的药物组合物中最终用作药物活性成分的dsRNA包含具有定向结构的这样的核苷酸或核苷酸类似物。根据本发明用作药物活性成分的dsRNA优选具有通用结构5’-(N19-25)-3’，更优选5’-(N19-24)-3’，还更优选5’-(N21-23)-3’，其中N为任何碱。用作药物活性成分的dsRNA的优选至少90％，更优选95％，并且尤其是100％的核苷酸将互补于上文所述的(作为药物活性成分)(治疗相关)蛋白或抗原的(m)RNA序列的段。90％互补意味着：根据本发明使用的dsRNA的长度为例如20个核苷酸，这包含不超过2个不与(m)RNA的相应段相应互补的核苷酸。然而，可选地用在根据本发明的药物组合物中的双链 RNA的序列优选在它的通用结构中完全与上文作为药物活性成分描述的蛋白或抗原的(m)RNA的段互补。
原则上，存在于(m)RNA的编码区中的具有17到29个，优选19到25个碱基对的长度的所有的段可以用作最终在根据本发明的药物组合物中用作药物活性成分的dsRNA的靶序列。同等地，用作药物活性成分的dsRNA也可以针对不存在于编码区，尤其是m(RNA)的5’非编码区中的上文描述的(作为药物活性成分)的(治疗相关)蛋白或抗原的核苷酸序列，例如，由此，针对具有调节功能的(m)RNA的非编码区。用作上文所述的蛋白或抗原的药物活性成分的dsRNA的靶序列可以由此存在于(m)RNA的翻译和非翻译区中和/或控制元件的区中。在根据本发明的药物组合物中用作药物活性成分的dsRNA的靶序列也可以存在于非翻译和翻译序列的重叠区中；尤其是，靶序列可以包括(m)RNA的编码区的起始三联体的上游的至少一个核苷酸。
修饰的核苷酸可以优选地存在于在根据本发明的药物组合物中最终用作药物活性成分的dsRNA中。表达“修饰的核苷酸”根据本发明意味着所讨论的核苷酸已经被化学修饰。本领域技术人员理解表达“化学修饰”为通过取代、添加或去除一个或多个原子或原子群与天然存在的核苷酸相比修饰的核苷酸已经被改变。根据本发明所用的dsRNA中至少一个修饰的核苷酸一方面用于稳定性，而另一方面用于防止解离。根据本发明所用的dsRNA中的优选2到10个，更优选2到5个核苷酸已被修饰。有利地，双链结构中的dsRNA的核苷酸的至少一个2’-羟基已经被化学基团，优选2’-氨基或2’-甲基基团取代。双链结构的至少一条链中的至少一个核苷酸也可以为所谓的“闭锁核苷酸”，其具有已经被化学修饰，优选被2’-O、4’-C-亚甲基桥修饰的糖环。根据本发明所用的dsRNA的多个核苷酸有利地为闭锁的核苷酸。此外，通过修饰根据本发明所用的dsRNA的骨架，其过早降解可以被防止。在这点上特别优 选这样的dsRNA，其已经以硫代磷酸酯、2’-O-甲基-RNA、LNA、LNA/DNA gapmers等的形式被修饰，并因此在体内具有较长的半衰期。
在根据本发明的药物组合物中用作药物活性成分的双链RNA(dsRNA)的末端可以优选被修饰以便阻碍细胞中的降解或解离为个体的链，尤其是为了避免被核酸酶过早降解。通常不希望的dsRNA的个体链的解离尤其发生在使用其低浓度或短链长度时。为了特别有效的抑制解离，根据本发明使用的dsRNA的双链结构的粘着力(由核苷酸对作用)可以通过至少一个、优选多于一个的化学键提高。解离已经被减少的根据本发明的药物组合物中用作药物活性成分的dsRNA在细胞中或在生物体中(体内)或体外具有对酶和化学降解的较高的稳定性，由此具有较长的半衰期。用于防止根据本发明所用的dsRNA在细胞中的过早解离的进一步的可能性在于在链的每个末端形成发卡环。在特别的实施方式中，根据本发明的药物组合物中所用的dsRNA由此具有发卡结构以便减慢解离动力学。在这样的结构中，环结构优选在5′和/或3′端形成。这样的环结构没有核苷酸碱基之间的氢桥，通常因此没有互补性。通常，这样的环具有至少5个，优选至少7个核苷酸的长度，并且以那样的方式连接根据本发明所用的dsRNA的两条互补的个体的链。为了防止链的解离，根据本发明所用的dsRNA的两条链的核苷酸可以同样优选被如此修饰以便实现氢桥键的加强，例如通过提高可选地修饰的核苷酸的碱基之间的氢桥键容量。结果，链之间的相互作用的稳定性被提高，并且dsRNA被保护不受RNA酶的攻击。
根据特别优选的实施方式，根据本发明的药物组合物中用作药物活性成分的dsRNA针对如上文所述的蛋白或抗原的(m)RNA。由此优选使用的dsRNA抑制上述蛋白或抗原在细胞中的翻译到至少50％，更优选60％，还更优选70％，以及最优选至少90％的程度，即，所述细胞优选包含不超过上述蛋白或抗原的天然存在的(没有 用根据本发明所用的dsRNA处理)细胞浓度的一半。在加入根据本发明使用的dsRNA分子后这些蛋白或抗原在细胞中的翻译的抑制是基于由这样的分子引起的RNA干涉现象。根据本发明使用的dsRNA于是为所谓的siRNA，其触发RNA干涉现象，并且可以结合上述蛋白或抗原的(m)RNA。由根据本发明使用的dsRNA在细胞中触发的翻译抑制的测量或证实可以通过RNA印迹、定量实时PCR或在蛋白水平上，用针对上述蛋白或抗原的特异性抗体进行。在根据本发明的药物组合物中最终用作药物活性成分的dsRNA，和相应的siRNA，可以通过本领域技术人员已知的方法制备。
根据本发明的药物组合物(根据第一或第二实施方式)通常包含药用载体。这里所用的表达“药用载体”优选包括组合物的液体或非液体基础(non-liquid basis)。如果组合物以液体形式提供，则载体将通常为不含致热原的水；等张盐或缓冲(水)溶液，如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲溶液。特别对于本发明的药物组合物的注射，可以使用缓冲剂，优选含水缓冲剂，包含钠盐，优选至少50mM的钠盐、钙盐，优选至少0.01mM的钙盐，以及可选的钾盐，优选至少3mM的钾盐。根据优选的实施方式，钠盐、钙盐以及，可选地，钾盐可以以它们的卤化物的形式存在，例如，氯化物、碘化物、或溴化物，以它们的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐、或硫酸盐等的形式存在。不限于此，钠盐的实例包括，例如NaCl、NaI、NaBr、Na2CO3、NaHCO3、Na2SO4，可选的钾盐的实例包括例如KCl、KI、KBr、K2CO3、KHCO3、K2SO4，以及钙盐的实例包括例如CaCl2、CaI2、CaBr2、CaCO3、CaSO4、Ca(OH)2。此外，上述阳离子的有机阴离子可以包含在缓冲剂中。根据更优选的实施方式，适合于如上所定义的注射目的的缓冲剂可以包含选自氯化钠(NaCl)、氯化钙(CaCl2)和可选的氯化钾(KCl)的盐，其中除了氯化物以外，可以存在另外的阴离子。通常，注射缓冲剂中的盐以至少50mM氯化钠(NaCl)，至少3mM氯化钾(KCl)以及至少0.01mM氯化钙(CaCl2)的浓度存在。
相对于特定的参考介质，注射缓冲剂可以为高张、等张或低张的，即，缓冲剂可以相对于特定参考介质具有更高、相同或更低的盐含量，其中优选上述盐的这样的浓度可以被使用，其不由于渗透作用或其他浓度效应导致细胞的损害。参考介质为，例如，“体内”方法中存在的液体，如血液、淋巴、胞液液体，或其他体液，或例如液体，其可以在“体外”方法中用作参考介质，如常见的缓冲剂或液体。这样的常见的缓冲剂或液体对于本领域技术人员是已知的。林格乳酸盐(Ringer-Lactate)溶液特别优选作为液体基础。
然而，也可以使用一种或多种相容的固体或液体填料或稀释剂或封装化合物(encapsulating compound)，其适合于给予人。这里所使用的术语“相容的”意味着药物组合物的成分能够与药物活性成分、与作为免疫刺激剂或同样地作为佐剂的本发明的核酸、以及与一种另外的成分以这样的方式混合，使得没有将在通常使用条件下基本上降低组合物的药物有效性的相互作用存在。药用载体当然必须具有足够的高纯度和足够的低毒性，以使它们适合于给予要治疗的人。可以用作药用载体或其成分的化合物的一些实例为糖，如，例如，乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如，例如，玉米淀粉或马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；牛脂；固态助流剂，如，例如硬脂酸、硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和来自可可属的油；多元醇，如，例如聚丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；藻酸。
药用载体的选择原则上由根据本发明的药物组合物被给予的方式确定。根据本发明的药物组合物可以被例如全身给予。用于给药的途径包括，例如，经皮、口、肠胃外，包括皮下或静脉注射、局部和/或鼻内途径。要使用的药物组合物的合适的量可以通过借助动物模型的例行试验确定。这样的模型包括，不意味着任何限制，兔、羊、小鼠、大鼠、狗和非人类灵长动物模型。用于注射的优选 的单位剂量形式包括无菌水溶液、生理盐水或其混合物。这样的溶液的pH应当被调节到约7.4。用于注射的合适的载体包括水凝胶、用于控制或延迟释放的装置、聚乳酸和胶原基质。用于局部施用的合适的药用载体包括那些适用于洗剂、乳膏、凝胶等的药用载体。如果化合物要被经口给予，则片剂、胶囊等是优选的单位剂量形式。用于可以用于口服给药的单位剂量形式的制备的药用载体在现有技术中是熟知的。其选择将依赖于第二考虑因素，如味道、成本和耐贮性，其对于本发明的目的不是关键性的，并且可以由本领域的技术人员毫无困难地实施。
为了进一步提高免疫原性，根据本发明的药物组合物可以另外包含一种或多种辅助物质。根据本发明的式(I)或式(II)的核酸与可选地另外包含在如上所述的药物组合物(以及最终，药物活性成分)中的辅助物质的协同作用优选由此实现。依赖于各种类型的辅助物质，在这方面可以考虑多种机制。例如，允许树突细胞(DC)成熟的化合物，例如脂多糖、TNF-α或CD40配体，形成第一类合适的辅助物质。通常，可以使用以“危险信号”(LPS，GP96等)或细胞因子(如GM-CFS)方式影响免疫系统的任何试剂作为辅助物质，其允许以靶向方式提高和/或影响由根据本发明的免疫刺激佐剂产生的免疫反应。特别优选的辅助物质为细胞因子，如单核因子、淋巴因子、白介素或趋化因子，其促进免疫反应，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、INF-α、IFN-β、INF-γ、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、LT-β或TNF-α、生长因子，如hGH。
可以包括在根据本发明的组合物中的另外的添加剂为乳化剂，如，例如，润湿剂，如，例如，十二烷基硫酸钠；着色剂；口味给予剂，药物载体；片剂形成剂；稳定剂；抗氧化剂；防腐剂。
根据本发明的药物组合物(第一(没有药物活性成分)和第二(具有药物活性成分)实施方式)还可以另外包含佐剂。因此，作为免疫刺激剂或作为佐剂(对于本发明的药物组合物的第二实施方式)的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸可以与另外的免疫刺激剂/佐剂组合。在本发明的范围内，用于这些目的的合适的试剂/佐剂尤其是那些提高(通过一种或多种机制)根据本发明的式(I)或式(II)的(修饰或未修饰的)核酸的生物性质/性能的化合物，即，尤其是加强根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的免疫刺激作用的物质。根据本发明可以使用的试剂/佐剂的实例包括，不意味着任何限制，如上所述的稳定阳离子肽或多肽，如鱼精蛋白、核仁素(nucleoline)、精胺或亚精胺、和阳离子多糖，尤其是壳聚糖、TDM、MDP、胞壁酰基二肽、聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(聚醚)(pluronics)、明矾溶液、氢氧化铝、ADJUMERTM(聚磷腈)；磷酸铝凝胶；来自藻类的葡聚糖；algammulin；氢氧化铝凝胶(明矾)；高蛋白吸附氢氧化铝凝胶；低粘度氢氧化铝凝胶；AF或SPT(异三十烷的乳剂(5％)、吐温80(0.2％)、Pluronic L121(1.25％)、磷酸缓冲盐水，pH7.4)；AVRIDINETM(丙烷二胺)；BAYR1005TM((N-(2-脱氧-2-L-亮氨酰氨基-b-D-吡喃葡糖基)-N-十八烷基十二烷酰-酰胺氢化乙酸酯(hydroacetate))；CALCITRIOLTM(1α，25-二羟基-维生素D3)；磷酸钙凝胶；CAPTM(磷酸钙纳米粒子)；霍乱全毒素、霍乱-毒素-A1-蛋白-A-D-片段融合蛋白、霍乱毒素的亚单位B；CRL 1005(嵌段共聚物P1205)；包含细胞因子的脂质体；DDA(二甲基二十八烷基溴化铵)；DHEA(脱氢表雄酮)；DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)；DMPG(二肉豆蔻酰磷脂酰甘油)；DOC/明矾复合物(脱氧胆酸钠盐)；弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐剂；γ菊糖；Gerbu佐剂(以下物质的混合物：i)N-乙酰基葡糖胺基(acetylglucosaminyl)-(P1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺(GMDP)，ii)二甲基双十八烷基氯化铵(DDA)，iii)锌-L-脯氨酸盐复合物(ZnPro-8)；GM-CSF)；GMDP(N-乙酰基葡糖胺基 -(b1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺)；咪喹莫特(imiquimod)(1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺)；ImmTherTM(N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈酸甘油酯)；DRVs(由脱水-再水化泡囊制备的免疫脂质体)；干扰素-γ；白介素-1β；白介素-2；白介素-7；白介素-12；ISCOMSTM(“免疫刺激复合物”)；ISCOPREP 7.0.3.TM；脂质体；LOXORIBINETM(7-烯丙基-8-氧鸟苷)；LT口服佐剂(大肠杆菌不稳定的肠毒素-毒素原(前毒素，protoxin))；任何组合物的微球和微粒；MF59TM；(鲨烯-水乳剂)；MONTANIDE ISA 51TM(纯化的不完全弗氏佐剂)；MONTANIDE ISA 720TM(可代谢的油性佐剂)；MPLTM(3-Q-去酰基-4′-单磷酰基脂质A)；MTP-PE和MTP-PE脂质体((N-乙酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-(羟基磷酰基氧))-乙基酰胺，单钠盐)；MURAMETIDETM(Nac-Mur-L-Ala-D-Gln-OCH3)；MURAPALMITINETM和D-MURAPALMITINETM(Nac-Mur-L-Thr-D-异GIn-sn-甘油二棕榈酰)；NAGO(神经氨酸酶-半乳糖氧化酶)；任何组合物的纳米球或纳米颗粒：NISV(非离子型表面活性剂泡囊)；PLEURANTM(β-葡聚糖)；PLGA、PGA和PLA(乳酸和甘醇酸的均聚体和共聚物；微球/纳米球)；PLURONICL121TM；PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)；PODDSTM(类蛋白微球)；聚氨基甲酸亚乙基酯衍生物；聚-rA：聚-rU(聚腺苷酸-聚尿甘酸复合物)；聚山梨醇酯80(吐温80)；蛋白蜗形体(蛋白脂质体卷，protein cochleates)(Avanti PolarLipids，Inc.，Alabaster，AL)；STIMULONTM(QS-21)；Quil-A(Quil-A皂苷)；S-28463(4-氨基-otec-二甲基-2-乙氧基甲基-1H-咪唑基[4，5-c]喹啉-1-乙醇)；SAF-1TM(“Syntex佐剂制剂”)；仙台蛋白脂质体(Sendai proteoliposomes)和包含仙台(Sendai)的脂质基质；Span-85(山梨聚糖三油酸酯)；Specol(Marcol 52、Span 85和吐温85的乳剂)；鲨烯或(2，6，10，15，19，23-六甲基二十四烷(hexamethyltetracosan)和 2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳己烷(tetracosahexane))；硬脂酰酪氨酸(盐酸十八烷基酪氨酸)；(N-乙酰基葡糖胺基-N-乙酰基胞壁酰基-L-Ala-D-异Glu-L-Ala-二棕榈氧丙基酰胺(dipalmitoxypropylamide))；Theronyl-MDP(TermurtideTM或[thr1]-MDP；N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺)；Ty粒子(Ty-VLPs或病毒样粒子)；Walter-Reed脂质体(包含吸附在氢氧化铝上的脂质A的脂质体)等。脂肽，如Pam3Cys，同样特别适合于与以免疫刺激佐剂形式存在的根据本发明的式(I)或式(II)的核酸组合(参见Deres et al.，Nature1989，342：561-564)。
如上面提及的佐剂可以被分为多个类别，包括适合于贮藏和递送的佐剂，适合于共刺激的佐剂，适于作为拮抗剂的佐剂等。适合于贮藏和递送的优选的佐剂可以包括例如铝盐，如Adiu-phos、Alhydrogel、Rehydragel等，乳剂，如CFA、SAF、IFA、MF59、Provax、TiterMax、Montanide、Vaxfectin等，共聚物，如Optivax(CRL1005)、L121、Poloaxmer4010)等，脂质体，如Stealth等，蜗形体(脂质体卷，cochleates)，如BIORAL等，植物来源的佐剂，如QS21、Quil A、Iscomatrix、ISCOM等。适合于共刺激的优选的佐剂可以包括，例如番茄苷(番茄素，Tomatine)、生物聚合物，如PLG、PMM、菊糖(Inulin)等，微生物来源的佐剂，如Romurtide、DETOX、MPL、CWS、甘露糖(Mannose)、CpG7909、ISS-1018、IC31、咪唑喹啉(Imidazoquinolines)、安普利更(Ampligen)、Ribi529、IMOxine、IRIVs、VLPs、霍乱毒素、热不稳定毒素、Pam3Cys、鞭毛蛋白(Flagellin)、GPI锚、LNFPIII/LewisX、抗微生物肽、UC-1V150、RSV融合蛋白、cdiGMP等。适于作为拮抗剂的优选的佐剂可以例如包括CGRP神经肽等。
任何化合物，其由于其(作为配体)与Toll样受体(TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、 TLR11、TLR12或TLR13)的结合亲和力而已知为免疫刺激性的，可以被适当地用作另外的成分以进一步刺激由本发明的药物组合物中的本发明的核酸引起的免疫反应。
可以被加入到本发明的药物组合物中的另一类化合物为CpG核酸，尤其是CpG-RNA或CpG-DNA。CpG-RNA或CpG-DNA可以为单链CpG-DNA(ss CpG-DNA)、双链CpG-DNA(dsDNA)、单链CpG-RNA(ss CpG-RNA)或双链CpG-RNA(ds CpG-RNA)。CpG核酸优选为CpG-RNA的形式，更优选为单链CpG-RNA(ssCpG-RNA)的形式。CpG核酸优选包含至少一个或多个(促有丝分裂)胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸序列(CpG基序)。根据第一优选的备选方案，包含在这些序列中的至少一个CpG基序，即，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)，为非甲基化的。可选地包含在这些序列中的所有另外的胞嘧啶或鸟嘌呤可以为甲基化的或非甲基化的。然而，根据另外的优选的备选方案，CpG基序的C(胞嘧啶)和G(鸟嘌呤)也可以以甲基化形式存在。
根据特别优选的实施方式，根据本发明的药物组合物也可以作为疫苗提供。根据本发明的疫苗通常包括(相应于)根据本发明的药物组合物。根据本发明的这样的疫苗的组合物的特征在于并入疫苗组合物中的特定类别的药物活性成分。通常，药物活性化合物将是免疫刺激物质，其引发针对一些抗原的特定免疫反应。引发的特定免疫反应允许受试者发展针对，例如，特定病原体或特定肿瘤的免疫反应(通过主动或被动方式引发)。
本发明的药物组合物，并且尤其是疫苗，特别的特征在于它们被给予的方式。通常，本发明的药物组合物，尤其是疫苗，优选全身给予。用于这样的组合物/疫苗的给药途径通常包括经皮、经口、肠胃外，包括皮下或静脉注射、局部和/或鼻内途径。可替换地，本发明的疫苗或药物组合物可以通过皮内、皮下、肌肉内途径给予。由此组合物/疫苗优选以液体或固体形式被配制。另外的辅助物质 (如上定义的)可以进一步提高尤其是疫苗的免疫原性，其可以优选地被并入根据本发明的疫苗中。有利地，依赖于根据本发明的疫苗中的药物活性成分的免疫原性和其他性质，选择如上文定义的一种或多种这样的辅助物质。
根据本发明的进一步优选的目的，根据本发明的药物组合物，特别优选根据本发明的疫苗，用于处理(治疗)通过下文的实例提及的适应症。借助根据本发明的药物组合物，特别优选的根据本发明的疫苗，可以在治疗的范围内处理例如，与多种病理缺陷免疫反应相关或需要免疫反应(优选提高的免疫反应)的疾病或状况，例如肿瘤特异性或病原体特异性疾病、传染病等或可以通过将(过度)免疫反应转移到TH1主导的免疫反应和/或通过使遭受过度免疫反应的患者(如处在变态反应或自身免疫性疾病中)不敏感(脱敏)来处理的疾病。通过根据本发明的药物组合物的这样的免疫反应的产生，或已经存在但是可选的不足的免疫反应的提高，基本上是基于其触发非抗原特异性免疫反应的能力。对于适合的免疫反应的重要因素是不同T细胞亚群的刺激。T淋巴细胞通常分化为两个亚群，T辅助1(Th1)细胞和T辅助2(Th2)细胞，借助其免疫系统能够消灭细胞内(Th1)和细胞外(Th2)病原体(如抗原)。这两个Th细胞群在由它们产生的效应蛋白(细包因子)的模式方面不同。因此，Th1细胞通过活化巨噬细胞和细胞毒性T细胞辅助细胞免疫反应。另一方面，Th2细胞通过刺激B细胞转化为浆细胞并通过形成抗体(如，针对抗原)促进体液免疫反应。由此Th1/Th2比率在免疫反应中是非常重要的。与本发明相关，免疫反应的Th1/Th2比率优选通过包含根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的根据本发明的药物组合物朝向细胞反应，即，Th1反应的方向移位，并且主要的细胞免疫反应由此产生。仅通过这个移位和优先的，或者甚至排外的，Th1免疫反应的存在，上面提及的适应症的有效处理是可能的。因此，优选地，本发明的药物组合物或根据本发明的疫苗用于触发肿瘤特异性或病原体特异性免疫反应。这样的根据本发明的组合物或疫苗可以 特别优选用于提高抗原呈递细胞(APC)的免疫反应。同样特别优选地，根据本发明的药物组合物或疫苗可以用于处理癌症或肿瘤疾病，优选选自结肠癌、黑色素瘤、肾癌、淋巴瘤、急性骨髓白血病(AML)、急性淋巴白血病(ALL)、慢性骨髓白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、胃肠肿瘤、肺癌、胶质瘤、甲状腺肿瘤、乳腺癌、前列腺肿瘤、肝细胞瘤、多种病毒-诱导的肿瘤如，例如，乳头瘤病毒-诱导的癌(例如，宫颈癌)、腺癌、疱疹病毒-诱导的肿瘤(例如，伯基特氏淋巴瘤、EBV-诱导的B-细胞淋巴瘤)、乙型肝炎-诱导的肿瘤(肝细胞癌)、HTLV-1-和HTLV-2-诱导的淋巴瘤、听神经瘤/神经鞘瘤(neurinomas)、宫颈癌、肺癌、咽癌、肛门癌、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、直肠癌、星形细胞瘤、脑肿瘤、胃癌、成视网膜细胞瘤、基底细胞癌(basaliomas)、脑转移、髓母细胞瘤、阴道癌、胰腺癌、睾丸癌、黑色素瘤、甲状腺癌、膀胱癌、何杰金氏综合症、脑膜瘤、施耐博格病(Schneeberger disease)、支气管癌、垂体肿瘤、蕈样肉芽肿病、食道癌、乳腺癌、类癌、神经鞘瘤、spinaliomas、伯基特氏淋巴瘤、喉癌、肾癌、胸腺瘤、体癌(corpuscarcinomas)、骨癌、非何杰金氏淋巴瘤、尿道癌、CUP综合症、头/颈肿瘤、少突神经胶质瘤、阴门癌、肠癌、结肠癌、食管癌、疣侵犯(wartinvolvement)、小肠的肿瘤、颅咽管瘤(craniopharyngeomas)、卵巢癌、软组织肿瘤/肉瘤、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、肝转移、阴茎癌、舌癌、胆囊癌、白血病、浆细胞瘤、子宫癌、眼睑肿瘤(lid tumour)、前列腺癌等。特别优选地，如果在脂质修饰的核酸中或者作为组合物中的药物活性成分使用的脂质为α-生育酚(维生素E)、D-α-生育酚、L-α-生育酚、D，L-α-生育酚或维生素E琥珀酸酯(VES)。α-生育酚(维生素E)不是非常有毒的并表现出强大的抗肿瘤活性(A.Bendich，L.J.Machlin Am.J.Clin.Nutr.48(1988)612)，这使得它在癌症治疗中似乎非常有希望。作为用于抑制肿瘤细胞增殖或其上的细胞毒性活性的解释，其中两种机制是已知的：一方面，维生素E为强大的抗氧化剂和良好的自由基 受体(C.Borek Ann.NYAcad.Sci.570(1990)417)；另一方面，它能够通过刺激免疫反应防止肿瘤生长(G.Shklar，J.Schwartz，D.P.Trickler，S.Reid J.Oral Pathol.Med.19(1990)60)。在最近的著作中，已经发现肿瘤细胞中(口磷状癌)肿瘤抑制基因p53的表达与用维生素E琥珀酸酯(VES)处理之间的联系(J.Schwartz，G.Shklar，D.Trickler OralOncol.Europ.J.Cancer 29B(1993)313)。由此已经可以观察作为肿瘤抑制基因的野生型p53的产生的刺激，以及变异的p53的减少，其发展致瘤活性。有趣地是，VES对这些肿瘤细胞的生物活性在两个方面是剂量依赖性的：在生理剂量(0.001-50μmol/l)中，提高细胞生长将被观察到；在药理剂量(100-154μmol/l)中，细胞生长被抑制。这已经在细胞培养中被显示(T.M.A.Elattar，A.S.Virji Anticancer Res.19(1999)365)。通过用VES处理还可以在多种乳腺癌细胞系中诱导凋亡(W.Yu，K.Israel，Q.Y.Liao，C.M.Aldaz，B.G.Sanders，K.Kline Cancer Res.59(1999)953)。诱导的凋亡经由Fas配体与Fas受体的相互作用被引发。这是要特别强调的，因为迄今还没有可能在相应的细胞系中观察这样的机制。存在维生素E的各种异构体，其在芳香环上的甲基基团的数量和位置方面不同。在所述的著作中，使用天然存在的维生素E的生物学上最活性的形式，α-生育酚。这又存在于各种立体异构体中，因为分子包含三个光学活性中心。维生素E的天然形式为RRR-α-生育酚(以前的D-α-生育酚)，但是当前主要使用消旋体(D，L-α-生育酚)。维生素E的所有上面提及的形式同样作为脂质包含在本发明的范围内。
同样特别优选地，根据本发明的药物组合物用于传染病的处理。不意味着任何限制，这样的传染病优选选自流行性感冒、疟疾、SARS、黄热病、AIDS、莱姆疏螺旋体病(Lymeborreliosis)、利什曼病、炭疽、脑膜炎、病毒传染病如AIDS、尖锐湿疣、中空疣(hollowwarts)、登革热、三日热、埃博拉病毒、伤风、夏初脑膜脑炎(FSME)、流感、带状疱疹、肝炎、单纯疱疹I型、单纯疱疹II型、带状疱疹、流行性感冒、日本脑炎、拉沙热、马尔堡病毒、麻疹、口蹄疫、单 核细胞增多症、腮腺炎、诺沃克病毒感染(Norwalk virus infection)、普法伊费尔氏腺热(Pfeiffer′s glandular fever)、天花、脊髓灰质炎(小儿麻痹症)、假格鲁布、传染性红斑(五号病)、狂犬病、疣、西尼罗热、水痘、巨细胞病毒(cytomegalic virus)(CMV)、选自细菌传染病，如流产(miscarriage)(前列腺炎)、炭疽、阑尾炎、疏螺旋体病(borreliosis)、肉毒中毒、弯曲杆菌(Camphylobacter)、沙眼衣原体(尿道炎、结膜炎)、霍乱、白喉、杜诺凡病(腹股沟肉芽肿，donavanosis)、会厌炎、斑疹伤寒、气性坏疽、淋病、兔热病、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、百日咳、气候性腹股沟淋巴结炎(climatic bubo)、骨髓炎、军团病(Legionnaire′s disease)、麻风、利斯特菌病、肺炎、脑膜炎、细菌性脑膜炎、炭疽、中耳炎、人型支原体(Mycoplasma hominis)、新生儿败血症(绒毛膜羊膜炎)、走马疳、伤寒、鼠疫、赖特尔综合症、落矶山斑疹热、沙门氏菌副伤寒(Salmonella paratyphus)、沙门氏菌伤寒(Salmonella typhus)、猩红热、梅毒、破伤风、淋病(tripper)、恙虫病、肺结核、伤寒、阴道炎(阴道炎)、软下疳，以及选自由寄生虫、原生动物、或真菌引起的传染病，如阿米巴病、血吸虫病、查格斯氏病、脚癣、酵母霉斑、疥疮、疟疾、盘尾丝虫病(riverblindness)、或真菌病、弓形体病、滴虫病、锥虫病(睡眠病)、内脏利什曼病(visceralLeishmaniosis)、尿布皮炎、血吸虫病、鱼中毒(鱼肉中毒)、念珠菌病、皮肤利什曼病、贾弟虫病(贾第鞭毛虫病)、或]昏睡病，或选自由棘球蚴、阔节裂头绦虫、狐绦虫、犬绦虫、虱、牛绦虫、猪绦虫、微型绦虫(miniature tapeworm)引起的传染病。
因此，本发明的核酸或本发明的药物活性组合物可以用于制备用于治疗变应性障碍或疾病的药物。变态反应是通常涉及对一些外来抗原或变应原的异常、获得性免疫学超敏感性(超敏反应)的状况。变态反应通常导致对这些抗原或变应原的局部或全身炎性反应并导致体内针对这些变应原的免疫。在该上下文中变应原包括例如草、花粉、霉菌、药物、或多个环境触发剂等。不限于理论，据说 在变态反应的发展中涉及多种不同的疾病机制。根据P.Gell和R.Coombs的分类表，词语“变态反应”限于I型超敏反应(超敏感性，hypersensitivity)，其由经典的IgE机制引起。I型超敏反应的特征为通过IgE过度活化肥大细胞和嗜碱细胞，导致全身炎性反应，其可以导致如流涕鼻一样的良性症状，到威胁生命的过敏性休克和死亡。变态反应的熟知类型包括，不限于此，变应性哮喘(导致鼻粘膜的肿胀)、变应性结膜炎(导致结膜的发红和发痒)、变应性鼻炎(“干草热”)、过敏症、血管性水肿(angiodema)、特应性皮炎(湿疹)、荨麻疹(麻疹)、嗜酸性粒细胞增多、呼吸的，对昆虫螫刺(stings)的变态反应、皮肤变态反应(导致并包括各种皮疹，如湿疹、麻疹(荨麻疹)和(接触性)皮炎)、食物变态反应、对药物的变态反应等。关于本发明，例如，提供了药物组合物，其包含变应原(例如，来自猫的变应原、灰尘变应原、螨抗原、植物抗原(如桦木抗原)等)，作为蛋白、编码该蛋白变应原的mRNA(或DNA)(与本发明的核酸组合)。本发明的药物组合物可以将(过度)免疫反应移向较强的TH1反应，从而抑制或减弱不希望的IgE反应。
同样地，本发明提供了用于治疗自身免疫性疾病的药物。依赖于每种疾病的主要临床病理学特征，自身免疫性疾病可以大致被分为全身和器官特异性或局部自身免疫性疾病。自身免疫性疾病可以被分为全身综合症或局部综合症的类别，全身综合征包括SLE、氏综合症、硬皮病、类风湿性关节炎和多肌炎，局部综合症可以为内分泌的(DM类型1、桥本甲状腺炎、阿狄森氏病等)、皮肤病的(寻常型天疱疮)、血液的(自身免疫性溶血性贫血)、神经系统的(多发性硬化)或者可以实际上涉及身体组织的任何有圆形肿块(circumscribed mass)。待治疗的自身免疫性疾病可以选自由下面组成的组：I型自身免疫性疾病或II型自身免疫性疾病或III型自身免疫性疾病或IV型自身免疫性疾病，如，例如，多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎、糖尿病、I型糖尿病(糖尿病)、系统性红斑狼疮(SLE)、慢性多关节炎、巴西多氏病、慢性肝炎的自身免疫形式、 溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、I型变态反应疾病、II型变态反应疾病、III型变态反应疾病、IV型变态反应疾病、纤维肌痛(fibromyalgia)、脱发、别赫捷列夫氏病(Bechterew’s disease)、克罗恩氏病、重症肌无力、神经性皮炎、风湿性多肌痛、进行性系统性硬化病(PSS)、银屑病、赖特尔综合症、风湿性关节炎、银屑病、血管炎等、或II型糖尿病。
虽然关于为什么免疫系统诱导针对自身抗原的免疫反应的精确模式迄今还没有被阐明，但是关于病因学存在多个发现。因此，自身反应可能是由于T细胞旁路。正常的免疫系统需要通过T细胞的B细胞活化(在前者可以产生大量抗体前)。在少数情况下，T细胞的这种要求可以为旁路的，如被产生超抗原的生物体感染，其能够通过以非特异性方式直接结合到T细胞受体的β-亚单位来引发B细胞，或者甚至T细胞的多克隆活化。另一种解释从分子模拟推论自身免疫性疾病。外来抗原可以与一些宿主抗原分享结构类似性；因此，理论上，针对这种抗原(其模拟自身抗原)产生的抗体也可以结合到宿主抗原并扩大免疫反应。分子模拟的最显著的形式在组Aβ-溶血链球菌属中观察到，其与人类心肌膜分享抗原，并负责风湿热的心脏表现。本发明由此允许提供一种包含自身抗原(如蛋白，编码自身抗原蛋白的mRNA或DNA)和通常允许免疫系统不敏感的本发明的核酸的药物组合物。
本发明还涉及根据本发明的式(I)或式(II)的核酸，如上所述或者两者在制备用于治疗上文所述的适应症，例如用于治疗提及的肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应和传染病的根据本发明的药物组合物或根据本发明的疫苗中的应用。可替换地，本发明包括根据本发明的式(I)或式(II)的核酸或两者在用于治疗肿瘤或传染病中的应用，如上文所述。
同样包括在本发明中的是试剂盒，该试剂盒包含根据本发明的式(I)或式(II)的核酸，或两者，和/或根据本发明的药物组合物和/或 根据本发明的疫苗，以及可选地，具有关于根据本发明的式(I)或式(II)的核酸和/或根据本发明的药物组合物和/或根据本发明的疫苗的给药和剂量信息的技术使用说明书。
通过给予需要其的患者药物有效量的根据本发明的核酸治疗选自由癌症疾病、传染病、自身免疫性疾病和变态反应组成的组的障碍或疾病的方法。
在下文中，借助于附图和实施例进一步描述本发明，其并不用于将本发明的主题限制于此。
附图说明
图1：示出了用根据本发明的SEQ ID NO：1和2的核酸刺激小鼠BMDC(骨髓树突细胞)。在SEQ ID NO：1的情况下可以最清楚地观察到刺激。作为免疫刺激的量度，测量了IL-6和IL-12(ng/ml)的释放(参见实施例2)。作为阳性对照使用的是免疫刺激β-半乳糖苷酶(lacZ)的未帽化的野生型mRNA，复合有鱼精蛋白。
图2：示出了用根据本发明的SEQ ID NO：1和2的寡核苷酸刺激人PBMC(hPBMC)。在SEQ ID NO：1的情况下可以最清楚地观察到刺激。作为免疫刺激的量度，测量了白介素-6(IL-6)和TNFα(ng/ml)的释放(参见实施例2)。
图3：示出了用根据本发明的SEQ ID NO：1、2、3、4和5的寡核苷酸刺激人PBMC(hPBMC)。在SEQ ID NO：1的情况下可以最清楚地观察到刺激。作为免疫刺激的量度，测量了白介素-6(IL-6)(ng/ml)的释放(参见实施例2)。
图4：示出了用脂质末端修饰根据本发明的式(I)或式(II)的核酸的根据本发明的各种可能性。尤其分别示出了脂质修饰的连接剂和双功能肽，其可以用于偶联或与核酸序列(ODN序列简称)合成。
图5：以实例的方式描述了(三功能)脂质修饰的连接剂的合成途径，借助其，例如，生育酚修饰可以在核酸的3’端被引入。以实例方式示出的这样的化合物代表根据本发明的5’-或3’-脂质-修饰的核酸和根据本发明的佐剂的制备中的中间体。
图6：以实例的方式示出了具有琥珀酰锚的双功能脂质，其允许借助双功能脂质，例如借助PEG的核酸的3’-修饰。
图7：图解示出了脂质修饰的酰胺偶联到核酸的5’端。
图8：示出了用根据本发明的SEQ ID NO：78和79(式(I))的寡核苷酸刺激人PBMC(hPBMC)。在SEQ ID NO：78和SEQ ID NO：79的情况下可以最清楚地观察到刺激。
图9：示出了用具有和没有鱼精蛋白的根据本发明的SEQ IDNO：78(式(I))和81(式(II))的寡核苷酸刺激人PBMC(hPBMC)。在SEQ ID NO：81的情况下具有鱼精蛋白时可以最清楚地观察到更好的刺激。出人意料地，在SEQ ID NO：78的情况下，具有和没有鱼精蛋白时可以观察到类似的刺激(参见图9)。
图10：示出了用根据本发明的SEQ ID NO：81、82和83(式(II))的寡核苷酸刺激人PBMC(hPBMC)。在每种情况下，即，对于SEQID NO：81、82和83，均可以最清楚地观察到显著的刺激。
图11：描述了在用根据本发明的式(I)的寡核苷酸刺激人PBMC(hPBMC)后TNFα的释放。在具有和没有oligofectamine的情况下进行转染。用oligofectamine转染的序列为a)SEQ ID NO：1(Seq.1)，b)作为比较用生育酚3’5’修饰的SEQ ID NO：1，c)RNA40(SEQ ID NO：87)；没有oligofectamine的转染的序列为d)培养基(没有序列)，e)SEQ ID NO：1(Seq.1)和f)用生育酚3’5’修饰的SEQ ID NO：1。在连同oligofectamine一起转染SEQ ID NO： 1(Seq.1)，用生育酚3’5’修饰的SEQ ID NO：1时获得了最佳结果。因此，生育酚提高了RNA的转染并由此增强了免疫刺激。
图12：描绘了在用根据本发明的式(I)的寡核苷酸i.v.(静脉内)注射后IL-12的全身释放。该图示出了用a)作为对照的缓冲剂，b)RNA40(SEQ ID NO：87)，c)RNA40(SEQ IDNO：87)，复合有oligofectamine，d)SEQ ID NO：1(Seq.1)和e)用生育酚3’5’修饰的SEQ IDNO：1转染的结果。从图中可以看出，用生育酚5’3’修饰的本发明的SEQ ID NO：1获得了最佳结果并由此获得了显著的免疫刺激。
图13：描述了比较实验，并示出了根据SEQ ID NO：1的本发明的序列的不同修饰对人PBMC(hPBMC)的免疫刺激作用和TNFα的释放。用胆固醇修饰的SEQ ID NO：1(式(I))、用生育酚修饰的SEQ ID NO：1(式(I))、以及用生育酚3’5’修饰的SEQ ID NO：1被用在所述实验中，其中用后面的修饰获得了最佳结果。然而，用胆固醇或生育酚对SEQ ID NO：1的修饰也导致hPBMC的显著刺激。
图14：示出了使用a)IFA、b)IFA和鸡卵清蛋白、c)IFA和鸡卵清蛋白和RNA40(SEQID NO：87)，以及d)IFA和鸡卵清蛋白和本发明的序列SEQ ID NO：1(在与鱼精蛋白复合时)接种对肿瘤大小的作用。用IFA和鸡卵清蛋白和本发明的序列SEQ ID NO：1(a))获得了最佳结果，即，肿瘤大小的显著减小，表明本发明的序列表现出优良的佐剂性质。
图15：描绘了利用a)仅PBS、b)PBS中用生育酚3’5’修饰的本发明的序列SEQ IDNO：1、c)PBS中的本发明的序列SEQ IDNO：1、以及d)PBS中的RNA40(SEQ ID NO：87)肿瘤内注射对肿瘤大小的作用。用生育酚3’5’修饰的本发明的序列SEQ ID NO：1获得了最佳结果，即，肿瘤大小的显著减小，随后是未修饰的本发明的序列SEQ ID NO：1。
实施例：
1.根据本发明的式(I)的示例性核酸的合成
RNA寡核苷酸，作为根据本发明的通式(I)GlXmGn(SEQ ID NO：1-80)和通式(II)ClXmCn(SEQ ID NO：81-83)的核酸的实例，借助于亚磷酰胺化学通过自动固相合成制备。在每种情况下，用TBDMS保护基团保护核苷酸的RNA-特异性2’-羟基基团。在硫代磷酸酯的合成中，Beaucage试剂用于氧化。用甲胺进行载体物质和碱不稳定的保护基团的裂开(cleavage)，TBDMS保护基团的裂开用氢氟化三乙胺实现。
借助于HPLC，通过离子对色谱、通过离子交换色谱或通过两种方法的组合来纯化粗制品，脱盐并干燥。通过质谱法检测产物的纯度和正确碱基组成。
2.用根据本发明的式(I)的示例性核酸的体外免疫刺激
a)为了刺激小鼠BDMC(骨髓来源的树突细胞)，将3μl的oligofectamine与30μl的无FCSIMDM培养基(BioWhittaker，catalogue no.BE12-722F)混合并在室温下孵育(温育)5分钟。将RNA形式的6μg的SEQ ID NO：1-2的根据本发明的式(I)的核酸与60μl的无FCS IMDM混合并与oligofectamine/IMDM混合，并在室温下孵育20分钟。然后，将33μl的该混合物放置在包含在200μl的无FCS IMDM培养基中的200,000小鼠BDMC的96孔微滴定培养板的孔中，用于过夜培养。4小时后，加入100μl的包含20％FCS的IMDM，并在16小时的共同孵育后，去除上清液，然后通过细胞因子ELISA测试白介素-6(IL-6)和白介素-12(IL-12)。利用免疫刺激复合有鱼精蛋白的β-半乳糖苷酶(lacZ)的未帽化的野生型mRNA类似于根据本发明的序列SEQ ID NO：1和2进行比较测试。
可以表明以RNA形式存在的根据本发明的式(I)的核酸，尤其是SEQ ID NO：1和2的根据本发明的序列，具有良好的免疫刺激性质。尤其是SEQ ID NO：1表现出基本上超过用于比较目的的免疫刺激β-半乳糖苷酶(lacZ)的未帽化野生型mRNA的刺激性质的免疫刺激。
b)经由Ficoll密度梯度获得人PBMC，并在RNA形式的10μg/ml的根据本发明的式(I)的核酸的存在下，尤其是分别在根据本发明的序列SEQ ID NO：1和2(参见图2)和SEQ IDNO：1-5(参见图3)的存在下，在包含1％谷氨酰胺和1％青霉素的X-VIVO-15培养基(BioWhittaker，catalogue no.BE04-418Q)中过夜培养。
为了刺激，将3μl的oligofectamine与30μl的X-VIVO-15培养基(Bio Whittaker，catalogue no.BE04-418Q)混合并在室温下孵育5分钟。将RNA形式的6μg/ml的根据本发明的式(I)的核酸，尤其分别是根据本发明的序列SEQ ID NO：1和2(参见图2)和SEQ IDNO：1-5(参见图3)与60μl的X-VIVO-15培养基(Bio Whittaker，catalogue no.BE04-418Q)混合，并与oligofectamine/X-VIVO培养基混合，在室温下孵育20分钟。然后，将33μl的该混合物放置在包含在200μl的X-VIVO-15培养基(BioWhittaker，catalogue no.BE04-418Q)中的200,000个PBMC的96孔微滴定培养板的孔中，用于过夜培养。在共同孵育16小时后，去除上清液，并借助于细胞因子ELISA测试白介素-6(IL-6)和白介素-12(IL-12)以及TNFα。利用免疫刺激寡RNA40(5’-GCCCGUCUGUUGUGUGACUC-3’，SEQ ID NO：87)类似于根据本发明的序列SEQID NO：1和2进行比较测试。
可以表明RNA形式的根据本发明的式(I)的核酸，尤其是分别具有根据本发明的序列SEQ ID NO：1和2(参见图2)和SEQ ID NO：1-5(参见图3)的核酸，具有良好的免疫刺激性质。SEQ ID NO：1 尤其表现出基本上超过用于比较目的RNA寡核苷酸的刺激性质的免疫刺激。
3.借助于根据本发明的式(I)的示例性核酸的体内免疫刺激-用作佐剂
在第0天和10天用β-半乳糖苷酶蛋白和佐剂(如本文所定义的)注射BALB/c小鼠(每组5只)。在第20天杀死小鼠，并借助于ELISA，血清被用于针对β-半乳糖苷酶蛋白的抗体测试，然后类似于上述体外培养确定IL-6、IL-12和TNF-α值。
4.1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-聚乙二醇(DMT-PEG 1500 )的合成
过程：对21g的PEG1500(14mmol)进行两次溶解，用于干燥，每次溶解在30ml的纯吡啶中，其随后被共沸地馏出。将干燥的起始物质溶解在35ml的纯吡啶中。在30分钟的期间将溶解在35ml的纯吡啶中的4.7g的4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(13.9mmol)逐滴加入到该溶液中。在RT(室温)下进行搅拌另外的2小时，其间借助于TLC监测反应进程。除了借助于UV灯检测DMT组外，TLC板可以在两个步骤中发育：1、在HCl饱和的气氛下用于检测DMT；2、在碘室中用于检测PEG；PEG可以另外地用Dragendorff-Bürger喷显剂检测。当反应完成时，去除溶剂，并在50ml的DCM中提取产物。用25ml的5％NaHCO3溶液冲洗有机相两次，并用25ml 的H2O冲洗两次。水相和有机相之间的相分离是冗长的，因为PEG具有疏水和亲水性质两者。在用Na2SO4干燥后，去除溶剂，并通过在硅胶上柱色谱用DCM/MeOH/TEA＝18∶2∶0.5纯化粗制品。包含产物的部分通过TLC鉴定，合并并浓缩至干燥。获得了淡黄色油，其在高真空中完全干燥后变成蜡样固体。
产率：18.3g(理论的72.5％)
TLC(DCM/MeOH/TEA＝18∶2∶0.5)：Rf值≈0.55(通过PEG的摩尔量分布的信号展开)
5.1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-六乙二醇(DMT-HEG)的合成
过程：将10g的六乙二醇(35mmol)通过与2×30ml的纯吡啶共蒸发而干燥，然后溶解在20ml的纯吡啶中。类似于实施例1的过程，使HEG与10g溶解在50ml的纯吡啶中的DMT-Cl(29.5mmol)反应。用乙酸乙酯/TEA＝95∶5进行通过柱色谱的纯化。获得了作为干燥产物的粘性黄油。
产率：12.5g(理论的60.5％)
TLC(DCM/MeOH＝95∶5)：Rf值t＝0.59
MS(FD)：m/z 583.9(M+)
1H-NMR(CDCl3)：δ3.21(t，DMT-O-CH2-)，3.47-3.68(m，-CH2-)，3.76(s，-CH3)，6.77-7.46(m，芳香族化合物)
6.1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-聚琥珀酸乙二醇酯(DMT-PEG-Suc)的合成
下面的过程可以用于DMT-PEG1500和DMT-HEG两者。
过程：将5g的DMT-PEG1500(2.8mmol)溶解在25ml的DCM/吡啶＝5∶1中，并将溶解在7ml的吡啶中的420mg的琥珀酐(4.2mmol，即1.5当量)，和溶解在3ml的吡啶中的170mg的DMAP(1.4mmol，即0.5当量)加入到其中。在RT下搅拌12小时后，在真空中去除溶剂，并将残留物吸收在DCM中。用NaHCO3溶液(H2O中的10％)彻底冲洗有机相三次，并用饱和NaCl水溶液冲洗两次，以便分离出过量的琥珀酸。在用Na2SO4干燥后，去除溶剂。在高真空下完全干燥后，琥珀酸酯可以被使用而无需进一步处理用于偶联到氨基-修饰的载体物质。
TLC：DMT-PEG1500-Suc(DCM/MeOH/TEA＝18∶2∶0.5)：Rf值＝0.41
DMT-HEG-Suc(DCM/MeOH＝9∶2)：Rf值＝0.70
7.1-甲苯磺酰基-2，3-异亚丙基甘油的合成
过程：将200mmol的异亚丙基甘油(26.4g)溶解在200ml的乙腈中，并将22.2g的三乙胺(220mmol)加入到其中。将220mmol的对甲苯磺酰氯(41.9g)溶解在250ml的乙腈中并在2小时的时间内伴随搅拌逐滴加入到反应混合物中。在RT下持续搅拌另外的20小时，由此白色沉淀物形成，其在反应完成时被滤出。去除溶剂，并通过用正己烷/乙酸乙酯＝2∶1在硅胶上柱色谱纯化粗制品。通过TLC鉴定包含产物的部分，合并并浓缩至干燥。在高真空下干燥产物。获得了淡黄色油(L.N.Markovskii et al.J.Org.Chem.UdSSR 26(1990)2094.)。
产率：31.3g(理论的54.7％)
TLC(正己烷/乙酸乙酯＝2∶1)：Rf值＝0.2
MS(FD)：m/z 272.0(M+-CH)(286.3，计算的)
1H-NMR(CDCl3)：δ1.31(s)；1.34(s)；2.45(s)；3.74-3.79(m)；3.90-4.08(m)；4.23-4.32(m)；7.36(d)；7.77(d)
13C-NMR：δ21.7；25.2；26.7(甲基-C)；66.2；69.5；72.9(甘油-C)；110.1(亚甲基-C)；128.0；129.9；132.7；145.1(芳香族化合物-C)
8.2，3-异亚丙基-1-D，L-α-生育酚甘油(Toc1)的合成
过程：将5.6g的粉末状氢氧化钾(100mmol)加入到在280ml的DMSO中的56mmol的D，L-α-生育酚(24.06g)中。在RT下避光2小时搅拌后，逐滴加入溶解在20ml的DMSO中的56mmol的1-甲苯磺酰基-2，3-异亚丙基甘油(16g)，并在60℃使搅拌持续另外的12小时。然后在1升冰水上水解反应混合物，并用1.5升的 甲苯萃取水相。在用硫酸钠干燥后，去除溶剂。通过用正己烷/乙酸乙酯＝1∶1在硅胶上柱色谱纯化粗制品。通过TLC鉴定包含产物的部分，合并并浓缩至干燥。在高真空下干燥产物，并避光储存。获得了淡黄色油(D.W.Will，T.BrownTetrahedron Lett.33(1992)2729.)。
产率：24.2g(理论的79.2％)
TLC(正己烷/乙酸乙酯＝1∶1)：Rf值＝0.69
MS(FD)：m/z 544.6(M+)
9.1-D，L-α-生育酚基甘油(Toc2)的合成
过程：将16.9mmol的Tocl(9.2g)溶解在100ml的HCl(2M)/THF(1∶1)中，并避光在RT下搅拌2小时。然后，去除溶剂，将2×50ml的纯乙醇加入到残留物中，并将混合物浓缩以再次干燥。通过用二乙醚/甲苯＝1∶1在硅胶上柱色谱纯化粗制品。通过TLC鉴定包含产物的部分，合并并浓缩至干燥。产物在高真空下干燥并避光储存。获得了黄色油。
产率：6.6g(理论的77.5％)
TLC(二乙醚/甲苯＝1∶1)：Rf值＝0.22
MS(FD)：m/z 504.4(M+)
10.[1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)]-3-D，L-α-生育酚基甘油(Toc3)的合成
过程：将6.6g的Toc2(13mmol)两次溶解在15ml的纯吡啶中，其共沸地再次蒸馏出。将干燥的起始物质溶解在50ml的纯吡啶中，并将5.34g的DMT-Cl(15.8mmol)加入到其中。在RT下避光搅拌12小时后，通过加入50ml的甲醇终止反应，并将反应混合物浓缩至干燥。残留物被溶解到(吸到)500ml的二氯甲烷中并用150ml的含水，饱和NaCl溶液冲洗两次，然后用150ml的水冲洗一次。在用Na2SO4干燥后，去除溶剂，并通过在硅胶上柱色谱(正己烷/二乙醚/三乙胺＝40∶60∶1)纯化残留物。通过TLC鉴定包含产物的部分，合并并浓缩至干燥。在高真空下干燥产物。获得了淡黄色油，其被避光储存。
产率：8.5g(理论的81％)
TLC(正己烷/二乙醚/TEA＝40∶60∶1)：Rf值＝0.43
MS(FD)：m/z 807.2
11.[1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)]-2-琥珀酰-3-D，L-α-生育酚基甘油(Toc4)的 合成
过程：将1.45g的Toc3(1.8mmol)溶解两次，用于干燥，每次溶解在5ml的纯吡啶中，其共沸地再次蒸馏出。当起始物质被溶解在8ml的纯吡啶中后，在氩逆流中将140mg的DMAP(1.08mmol)和194.4mg的琥珀酐(1.8mmol)加入到其中。然后，在RT下避光搅拌18小时。为了处理，将45ml的DCM加入到反应溶液中，并且每次用50ml的水进行四次冲洗。在用硫酸钠干燥后，去除溶剂，并通过用乙酸乙酯/甲醇/NH3(H2O中的25％)＝5∶1∶1在硅胶上柱色谱纯化粗制品。通过TLC鉴定包含产物的部分，合并并浓缩至干燥。在高真空下干燥后，获得了淡褐色(brownish)粘性油，并避光储存。
产率：1.35g(理论的82.8％)
TLC(EtOAc/NH3/MeOH＝5∶1∶1)：Rf值＝0.30
MS(FD)：m/z 906.2(M+)，604.2(M+-DMT)
12.D，L-α-生育酚基-β-氰基乙基-N，N-二异丙基-亚磷酰胺的合成
过程：将2×25ml的吡啶加入到5g的D，L-α-生育酚(11.6mmol)中，并通过共沸夹带(entrainment)干燥混合物。将起始物质溶解在40ml的DCM纯(DCMabs)中。在氩逆流下，缓慢逐滴加入7.9ml的DIPEA纯(46.4mmol)和2.5ml的2-氰基乙基-N，N-二异丙基氯化膦(11mmol)。当反应混合物避光在RT下被搅拌1小时后，用100ml的乙酸乙酯/TEA(20∶1)稀释反应混合物，并用25ml的10％NaHCO3冲洗两次，然后用饱和NaCl溶液冲洗两次。随后，用Na2SO4干燥有机相，并在真空下去除溶剂。通过用乙酸乙酯在硅胶上柱色谱纯化粗制品。
产率：5.62g(理论的81％)
TLC(EtOAc)：Rf值＝0.75
MS(FD)：m/z 630.1(M+)
31P-NMR：δ152.24
13.[1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)]-(3-D，L-α-生育酚基)-甘油-2-亚磷酰胺的合 成
过程：将1g的Toc3(1.24mmol)溶解两次，用于干燥，每次溶解在10ml的纯吡啶中，其再次共沸地被蒸馏出。然后，将起始物质溶解在20ml的DCM纯中，并在氩逆流下逐滴加入0.84ml的DIPEA纯(4.96mmol)。随后在氩逆流下逐滴缓慢加入0.27ml的2-氰基乙基-N，N-二异丙基氯化膦(1.19mmol)。在RT下搅拌反应混合物1小时，其后用50ml的乙酸乙酯/TEA(20∶1)稀释溶液。用15ml的10％NaHCO3冲洗有机相两次，并用饱和的NaCl溶液冲洗两次，然后用Na2SO4干燥。去除溶剂，并通过硅胶上的柱色谱借助乙酸乙酯/TEA(99∶1)纯化粗制品。通过TLC鉴定包含产物的部分，合并并浓缩至干燥。在高真空下干燥后，获得了淡黄色-棕色、非常粘的油，其被冷却并避光储存。
产率：0.76g(理论的63.4％)
TLC(EtOAc，1％TEA)：Rf值＝0.68
MS(FD)：m/z 1006.4(M+)，953.6(M+-氰基乙基)，651.4(M+-DMT，-氰基乙基)，603.1(M+-DMT，-二异丙基胺)，303.1(DMT+)
31P-NMR：δ150.5
14.1-十六(烷)基-2，3-异亚丙基甘油(Pam1)的合成
过程：将0.11mol的氢化钠(2.42g)在氩逆流下部分地加入到在500ml的THF纯中的0.1mol的D，L-α，β-异亚丙基-甘油(12.4ml)中。在RT下搅拌12小时后，将在80ml的THF纯中的0.11mol的1-溴代十六烷(33.6ml)逐滴加入到所得的醇化物中。在加入作为催化剂的0.5mmol的碘化四丁铵后，将混合物加热到沸腾12小时。 在反应混合物冷却后，将所得到的溴化钠滤出，并将滤液浓缩至干燥。将残留物溶解在二乙醚中，并通过用H2O摇动三次萃取醚相。在用Na2SO4干燥有机相后，将混合物浓缩至干燥，并通过柱色谱在硅胶上纯化残留物(EtOAc/正己烷＝1∶9)(S.Czernecki，C.Georgoulis，C.Provelenghiou TetrahedronLett.39(1976)3535)。
产率：18.5g(理论的52％)
TLC(EtOAc/正己烷＝1∶9)：Rf值＝0.47
^^MS(FD)：m/z 357.6(M++1)
1H-NMR(CDCl3)：δ0.80(t)，1.18(s)，1.35(s)，1.37(s)，3.30-3.48(m)，3.63-3.69(dd)，3.96-4.01(dd)，4.19(q)
13C-NMR(CDCl3)：δ14.1；22.7；25.4；26.1；26.8；29.4；29.6；29.7；31.9(烷基链)，67.0(烷基-C-O-)，71.8；71.9；74.7(甘油-C)，109.3(羰游基-C)
15.1-十六基甘油(Pam2)的合成
过程：在40℃下，将18.5g的Pam1(52mmol)搅拌在300ml的乙酸(65％)中24小时。滤出白色沉淀物并用正己烷浓缩多次至干燥。为了纯化，将产物悬浮在正己烷中三次并滤出。没有被去保护的起始物质，不同于产物，在正己烷中是可溶的，因此可以被分离出。在真空中干燥残留的残留物。将合并的滤液同样浓缩至干燥并再次经受分离过程(H.Paulsen，E.Meinjohanns，F.Reck，I.Brockhausen Liebigs Ann.Chem.(1993)721)。
产率：14.6g(理论的88％)
TLC(EtOAc/正己烷＝1∶1)：Rf值＝0.2
MS(FD)：m/z 317.4(M++1)
1H-NMR(CDCl3)：δ0.86(t)，1.23(s)，3.30-3.48(m)，3.41-3.49(m)，3.55-3.75(m)，3.78-3.9(m)
13C-NMR(CDCl3)：δ14.1；22.7；25.4；26.1；29.4；29.5；29.6；31.9(烷基链)，70.5(烷基-C-O-)，64.2；71.8；72.4(甘油-C)
16.[1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)]-3-十六基甘油(Pam3)的合成
过程：为了干燥，将10mmol的Pam2(3.16g)溶解在15ml的吡啶纯中，并再次去除溶剂。重复该过程。将12mmol(4.06g)的二甲氧基三苯甲基氯(溶解在50ml的吡啶中)逐滴缓慢加入到在100ml的吡啶纯中的二醇溶液中，并在RT下进行搅拌达24小时。然后用5ml的甲醇终止反应，并将反应混合物浓缩至干燥。借助甲苯通过共沸夹带去除吡啶的最终痕迹(痕量，trace)。将残留物溶解在300ml的DCM中，用饱和含水KCl溶液和H2O冲洗，并用Na2SO4干燥。在去除溶剂后，在硅胶上对残留物进行色谱(正己烷/二乙醚/TEA＝40∶60∶1)(R.A.Jones“Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach”ed.M.J.Gait，IRL Press(1984)23)。
产率：4.9g(理论的79.3％)
TLC(正己烷/二乙醚/TEA＝40∶60∶1)：Rf值＝0.42
MS(FD)：m/z 618.2(M+)，303(DMT+)
1H-NMR(CDCl3)：δ0.80(t)，1.20(s)，1.96(s)，2.36(d)，2.72(s)，3.27(d)，3.32-3.48(m)，3.75(m)，6.61-6.76(m)，7.08-7.37(m)
17.[1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)]-2-琥珀酰基-3-十六基甘油(Pam4)的合成
过程：用吡啶干燥1.26mmol的Pam3(0.78g)两次。将0.76mmol的DMAP(92mg)和1.26mmol的琥珀酐(126mg)加入到在5ml的吡啶纯中的醇溶液中。在RT下搅拌12小时后，将反应溶液吸到30ml的DCM中，用30ml的水冲洗两次，并用Na2SO4干燥。在去除溶剂后，在硅胶上对残留物进行色谱(乙酸乙酯/甲醇/NH3(在H2O中的25％)＝5∶1∶1)(D.W.Will，T.BrownTetrahedron Lett.33(1992)2729.)。
产率：0.6g(66.3％)
TLC(EtOAc/MeOH/NH3(H2O)＝5∶1∶1)：Rf值＝0.32
MS(FD)：m/z 718(M+)，303(DMT+)，1020.7(M+DMT)+
18.用脂质修饰的核酸形式的根据本发明的佐剂刺激人类细胞
a)为了确定佐剂形式的根据本发明的核酸的免疫原性活性，使包含根据SEQ IDNO：1、2、3、4或5的序列的脂质修饰的核酸与人类细胞共同孵育。为此，人PBMC细胞，例如，在X-VIVO-15 培养基(BioWhittaker，catalogue no.BE04-418Q)(富集有2mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker)、10U/ml青霉素(BioWhittaker)和10μg/ml链霉素)中与10μg/ml的RNA(编码β-半乳糖苷酶的mRNA或已经被脂质修饰的根据本发明的式(I)的核酸)和可选地与10μg/ml鱼精蛋白共同孵育16小时。去除上清液，并借助于ELISA分析IL-6和TNFα的释放。
b)在进一步的实验中，在用根据本发明使用的RNA寡核苷酸(参见上文)和根据本发明使用的佐剂刺激后，确定通过人PBMC细胞的TNF-α的释放。
为此，人PBMC细胞与10μg/ml的RNA寡核苷酸在富集有2mM L-谷氨酰胺(BioWhittaker)、10U/ml青霉素(BioWhittaker)和10μg/ml链霉素的X-VIVO 15培养基(BioWhittaker)中共同孵育16小时。去除上清液，并借助于ELISA分析。
19.hPBMC中TNFα的释放
将人PBMC接种在无血清培养基中的96孔微滴定板上(每孔200μl中的2×105个)。将含水RNA溶液(与鱼精蛋白复合或非复合的)加入到细胞(最终RNA浓度：10μg/ml(在33μl中))中，彻底混合并在37℃下孵育24小时。在无细胞细胞上清液中利用ELISA测量TNFα分泌。试验一式三份进行。
a)在第一实验中，测量借助SEQ ID NO：78和79(式(I))的根据本发明的寡核苷酸的人PBMC(hPBMC)的刺激。在SEQ ID NO：78以及SEQ ID NO：79的情况下可以最清楚地观察到刺激(参见图8)。
b)在第二(比较)实验中，借助SEQ ID NO：78(式(II))和81(式(II))的根据本发明的寡核苷酸(有或没有鱼精蛋白)测试人 PBMC(hPBMC)的刺激。在SEQ ID NO：81的情况下用鱼精蛋白可以最清楚地观察到更好的刺激。出人意料地，在SEQ ID NO：78的情况下，有和没有鱼精蛋白可以观察到类似的刺激(参见图9)。
c)在第三实验中，测量用SEQ ID NO：81、82和83(式(II))的根据本发明的寡核苷酸测试人PBMC(hPBMC)的刺激。在每种情况下，即，对于SEQ ID NO：81、82和83，可以最清楚地观察到显著的刺激(参见图10)。
20.hPBMC中TNFα的释放-基于与oligofectamine或不与oligofectamine复合的转 染
将人PBMC接种在无血清培养基中的96孔微滴定板上(每孔200μl中的2×105个)。将RNA溶液或与oligofectamine复合的RNA溶液加入到细胞(最终RNA浓度：10μg/ml)中，彻底混合并在37℃下孵育24小时。利用ELISA在无细胞细胞上清液中测量TNF分泌。基于与oligofectamine复合的转染的序列为a)SEQ ID NO：1(Seq.1)，b)用生育酚3’5’修饰的SEQID NO：1作为比较，c)RNA40(SEQ ID NO：87)；转染的序列(没有oligofectamine复合)为d)培养基(没有序列)，e)SEQ ID NO：1(Seq.1)和f)用生育酚3’5’修饰的SEQ ID NO：1。当转染SEQ ID NO：1(Seq.1)，用生育酚3’5’修饰的SEQ ID NO：1(与oligofectamine一起)时获得了最佳结果。试验一式三份进行。
21.i.v.(静脉内)注射后hPBMC中IL-12的全身释放
将在100μlRinger-Lactate溶液中的10μg RNA i.v.给予。给予后4小时，从患者采集血液，并确定血清细胞因子水平。图12示出了用a)缓冲剂作为对照，b)RNA40(SEQ ID NO：87)，c)与oligofectamine复合的RNA40(SEQ ID NO：87)，d)SEQ ID NO：1(Seq.1)和e)用生育酚3’5’修饰的SEQ ID NO：1转染的结果。 从图中可以看出，借助用生育酚5’3’修饰的本发明的SEQ ID NO：1获得了最佳结果，由此获得了显著的免疫刺激。
22.hPBMC中TNFα的释放-利用不同修饰的SEQ ID NO：1
再次，将人PBMC接种在无血清培养基中的96孔微滴定板上(每孔200μl中的2×105个)。将10μl RNA溶液(与oligofectamine复合或不加入oligofectamine的RNA)加入到细胞(最终RNA浓度：10μg/ml)中，彻底混合并在37℃下孵育24小时。利用ELISA在无细胞细胞上清液中测量TNF分泌。在比较实验中，测量根据SEQ ID NO：1的本发明的序列的不同修饰对人PBMC(hPBMC)的免疫刺激和TNFα释放的作用。将用胆固醇修饰的SEQ ID NO：1(式(I))、用生育酚修饰的SEQ ID NO：1(式(I))、以及用生育酚3’5’修饰的SEQ ID NO：1用在实验中，其中用后面的修饰获得了最好结果。然而，用胆固醇或生育酚修饰SEQ ID NO：1也导致hPBMC的显著刺激(参见图13)。
23.在用卵清蛋白和本发明的寡核苷酸预防性接种后肿瘤大小的减小
在侧面用10μl蛋白(鸡卵清蛋白)皮下接种6-8周大的C57/Bl6小鼠。将蛋白(鸡卵清蛋白)和如果可应用的寡核苷酸溶解在IFA中(不完全弗氏佐剂)中，并每次注射使用100μl的总体积。溶液包含a)IFA，b)IFA和鸡卵清蛋白，c)IFA和鸡卵清蛋白和RNA40(SEQ ID NO：87)，以及d)IFA和鸡卵清蛋白和本发明的序列SEQID NO：1(在与鱼精蛋白复合时)，按照下面的方案：
IFA 蛋白(鸡卵清蛋白) 蛋白+RNA 40 蛋白+RNA Seq.1+鱼精蛋白
每只小鼠 100μl PBS 10μg蛋白IFA 10μg蛋白50μg RNAIFA 10μg蛋白50μg RNA IFA
然后，10天后，用相同的接种鸡尾酒(cocktail)推进小鼠(boost)。推进后12天，用1×106肿瘤细胞(EG7.Ova)挑战小鼠，每天测量肿瘤大小达2周。
用IFA和鸡卵清蛋白和本发明的序列SEQ ID NO：1(a))获得了最佳结果，即，肿瘤大小的显著减小，表明本发明的序列表现出优良的佐剂性质(参见图14)。
24.在肿瘤内注射后肿瘤大小的减小
在第0天，将小鼠1×106个肿瘤细胞(EG7.Ova)在6-8周大的C57/Bl6小鼠的侧面皮下植入。在第3天，开始处理。将50μg的RNA稀释在PBS中，并将总体积100μl注入到肿瘤的附近。每日进行肿瘤大小的处理和测量。当肿瘤大小达到超过160mm3的体积时，处死小鼠。每组4只小鼠被处理，并且显示的值代表4只小鼠的中值(中间值)。对于肿瘤内注射，按照下面的方案使用a)单独的PBS，b)PBS中用生育酚3’5’修饰的本发明的序列SEQ ID NO：1(Seq.1)，c)在PBS中的本发明的序列SEQ ID NO：1，以及d)在PBS中的RNA40(SEQ ID NO：87)：
PBS RNA Seq.1 5’3’Toc RNA Seq.1 RNA 40
每只小鼠 100μl PBS 50μg RNAPBS 50μg RNAPBS 50μg RNAPBS
用用生育酚3’5’修饰的本发明的序列SEQ ID NO：1获得了最佳结果，即，肿瘤大小的显著减小，其次是未修饰的本发明的序列SEQ ID NO：1(参见图15)。
本发明的优点：
根据本发明的通式(I)：GlXmGn的核酸或通式(II)：ClXmCn的核酸的形式的核酸可以同样地用作免疫刺激剂。优选地，本发明的核酸包含脂质修饰并且可以同样地使用(如，溶解在药物活性载体或赋形剂中)。由此，本发明的核酸刺激先天免疫系统并引发非特异性免疫反应。这种免疫刺激性质也可以通过将作为活性刺激先天免 疫反应的本领域已知的其它化合物加入到本发明的核酸中而提高。例如，根据本发明，已经披露了3’-胆固醇-修饰的磷酸二酯寡核苷酸作为能够在特定肿瘤细胞上诱导细胞毒性作用的免疫刺激佐剂。这种出人意料的效果基本上基于被使用的根据本发明的通式(I)或(II)的可选的脂质修饰的核酸的免疫刺激作用，3’或5’修饰(脂质修饰)的性质起重要作用。总之，根据通式(I)或(II)的核酸的免疫刺激性质通过它们自身(免疫刺激剂)或-作为佐剂-与其它药物活性成分组合(其通常是活化针对药物活性化合物的特异性免疫反应的免疫刺激成分)使得这些分子作为用于引发非特异性免疫刺激反应的疗法是有效的。

Claims (53)

1.用作免疫刺激剂的式(I)的核酸：
G1XmGn,
其中：
G为鸟苷或尿苷；
X为鸟苷或尿苷；
l为2到10的整数，至少50％的核苷酸为鸟苷；
m为整数并且至少为3；
其中当m＝3时，X为尿苷，
当m>3时，至少3个连续的尿苷存在；
n为2到10的整数，
其中至少50％的所述核苷酸为鸟苷，
其中式(I)的核酸是20-60核苷酸长度，并且其中Xm包含具有至少10个尿苷长度的单调尿苷序列。
2.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，式(I)的所述核酸为RNA或包括cDNA的DNA的形式，为单链或双链的，为同源-或异源-双链体的形式，并且为线形或环形的。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的核酸，其特征在于，式(I)的所述核酸为单链或双链RNA的形式。
4.根据权利要求1至2中任一项所述的核酸，其特征在于，式(I)的所述核酸包含选自下面的序列中的至少一个序列：
GGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:1)；
GGGGGUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO:2)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO:3)；
GUGUGUGUGUGUUUUUUUUUUUUUUUUGUGUGUGUGUGU(SEQ ID NO:4)；
GGUUGGUUGGUUUUUUUUUUUUUUUUUGGUUGGUUGGUU(SEQ ID NO:5)；
GGGGGGUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO:12)；
GGGGGUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO:13)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:14)；
GGGGUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:15)；
GGGGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:16)；
GGUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:17)；
GUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQ ID NO:18)；
GGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO:25)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO:26)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO:27)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO:28)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:29)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:30)；
GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:31)；
GGGGGGGGUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO:38)；
GGGGGGGUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO:39)；
GGGGGGGUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO:40)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO:41)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO:42)；
GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO:43)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:44)；
GUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUG(SEQ ID NO:45)；
GGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:46)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:47)；
GGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:48)；
GGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGG(SEQ ID NO:49)；
GGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGG(SEQ ID NO:50)；
GGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGG(SEQ ID NO:51)；
GGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGG(SEQ ID NO:52)；
GGGGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGGG(SEQ ID NO:53)；
GGUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:61)；
GGUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:62)；
GGUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:63)；
GGUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:64)；
GGUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:65)；
GGUUUUUUUUUUUUUUUGG(SEQ ID NO:66)；
GGGUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:74)；
GGGUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:75)；
GGGUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:76)；
GGGUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:77)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:78)；
GGGUUUUUUUUUUUUUUUGGGGGGUUUUUUUUUUUUUUUGGG(SEQ ID NO:79)。
5.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，式(I)的所述核酸的至少一个核苷酸为天然存在的核苷酸的非天然存在的类似物。
6.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，式(I)的所述核酸以RNA的形式存在并另外地具有在5’末端的“帽结构”和/或在3’末端的聚-A尾。
7.根据权利要求1所述的核酸，其特征在于，式(I)的所述核酸包含脂质修饰，其中所述脂质选自α-生育酚、RRR-α-生育酚、L-α-生育酚、消旋体D,L-α-生育酚，维生素E琥珀酸酯，胆固醇或硫代胆固醇。
8.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述脂质-修饰的核酸包含根据权利要求1至7中任一项所述的式(I)的核酸、至少一个与该核酸共价连接的连接剂、以及与各自的连接剂共价连接的脂质。
9.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述脂质-修饰的核酸包含至少一个根据权利要求1至7中任一项所述的式(I)的核酸和至少一个与该核酸共价连接的脂质。
10.根据权利要求9所述的核酸，其中所述脂质是双功能的。
11.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述脂质-修饰的核酸共包含至少一个根据权利要求1至7中任一项所述的式(I)的核酸、至少一个与该核酸共价连接的连接剂和至少一个与各自的连接剂共价连接的脂质，并且还共包含至少一个与该核酸共价连接的双功能脂质。
12.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，每个核酸所述脂质-修饰的核酸包含至少3到8个脂质，其中：
a)所有的所述脂质经由连接剂与所述核酸共价连接；
b)所有的所述脂质直接与所述核酸共价连接；
c)一些所述脂质经由连接剂与所述核酸共价连接，而一些所述脂质直接与所述核酸共价连接。
13.根据权利要求8所述的核酸，其特征在于，所述连接剂选自包含至少两个、三个或四个选自羟基基团、氨基基团和烷氧基基团的反应基的化合物。
14.根据权利要求13所述的核酸，其特征在于，所述连接剂选自甘醇、甘油、甘油衍生物、2-氨基丁基-1,3-丙二醇、2-氨基丁基-1,3-丙二醇衍生物或2-氨基丁基-1,3-丙二醇骨架、吡咯烷连接剂或包含吡咯烷的有机分子。
15.根据权利要求7所述的核酸，其特征在于，式(I)的所述核酸和所述脂质之间或式(I)的所述核酸和与所述脂质连接的连接剂之间的连接发生在式(I)的所述核酸的3’和/或5’端。
16.药物组合物，包含根据权利要求1至15中任一项所述的核酸、药用载体，以及可选地另外的辅助物质、添加剂和/或佐剂。
17.根据权利要求16的药物组合物，还包含至少一种另外的药物活性成分。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其特征在于，所述至少一种药物活性成分选自由肽、蛋白质、核酸、具有小于5000的分子量的治疗活性低分子量有机或无机化合物、糖、抗原、抗体、病原体、削弱的病原体、失活的病原体、细胞、细胞片段或部分和其它治疗剂组成的组，其适于呈现提高的转染性能。
19.根据权利要求18的药物组合物，其特征在于所述提高的转染性能是通过与脂质和/或聚阳离子化合物络合实现的。
20.根据权利要求19的药物组合物，其特征在于所述聚阳离子化合物是聚阳离子肽。
21.根据权利要求18的药物组合物，其特征在于所述细胞是人细胞。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物包含至少一种另外的佐剂，所述佐剂为免疫刺激剂，选自阳离子多糖，MDP、胞壁酰基二肽、pluronics、明矾溶液、氢氧化铝、ADJUMERTM；磷酸铝凝胶；来自藻类的葡聚糖；algammulin；氢氧化铝凝胶；高蛋白吸附氢氧化铝凝胶；低粘度氢氧化铝凝胶；AF或SPT；AVRIDINETM；BAYR1005TM；CALCITRIOLTM；磷酸钙凝胶；霍乱全毒素、霍乱-毒素-A1-蛋白-A-D-片段融合蛋白、霍乱毒素的亚单位B；CRL 1005；包含细胞因子的脂质体；DDA；DHEA；DMPC；DMPG；DOC/明矾复合物；弗氏完全佐剂；弗氏不完全佐剂；γ菊糖；Gerbu佐剂，其是以下物质的混合物：i)N-乙酰基葡糖胺基-(P1-4)-N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺，ii)二甲基二十八烷基氯化铵，和iii)锌-L-脯氨酸盐复合物；GM-CSF；GMDP；咪喹莫特；ImmTherTM；干扰素-γ；白介素-1β；白介素-2；白介素-7；白介素-12；ISCOMSTM，其是“免疫刺激复合物”；ISCOPREP7.0.3.TM；脂质体；LOXORIBINETM；LT口服佐剂；任何组合物的微球和微粒；MF59TM；MONTANIDEISA 51TM；MONTANIDE ISA 720TM；MPLTM；MTP-PE和MTP-PE脂质体；MURAMETIDETM；MURAPALMITINETM和D-MURAPALMITINETM；NAGO；NISV；PLEURANTM；PLGA、PGA和PLA；PLURONICL121TM；PMMA；PODDSTM；聚-rA：聚-rU；聚山梨醇酯80；蛋白蜗形体；STIMULONTM；Quil-A；S-28463；SAF-1TM；仙台蛋白脂质体和包含仙台的脂质基质；Span-85；Specol；鲨烯或硬脂酰酪氨酸；Theronyl-MDP；Ty粒子；Walter-Reed脂质体、以及脂肽，包括Pam3Cys；乳剂；共聚物；脂质体。
23.根据权利要求16-21任一项的药物组合物，其特征在于所述组合物包含至少一种另外的佐剂，所述佐剂为免疫刺激剂，选自由铝盐组成的组。
24.根据权利要求16-21任一项的药物组合物，其特征在于所述组合物包含至少一种另外的佐剂，所述佐剂为免疫刺激剂，选自由Adju-phos，Alhydrogel，Rehydragel，CFA，IFA，MF59，Optivax和Poloaxmer401组成的组。
25.根据权利要求16-21任一项的药物组合物，其特征在于所述组合物包含至少一种另外的适于共刺激的佐剂，所述佐剂为免疫刺激剂，选自由生物聚合物，微生物来源的佐剂，咪唑喹啉，IRIV，霍乱毒素，热不稳定的毒素，Pam3Cys和鞭毛蛋白佐剂组成的组。
26.根据权利要求16-21任一项的药物组合物，其特征在于所述组合物包含至少一种另外的适于共刺激的佐剂，所述佐剂为免疫刺激剂，选自由PLG，DETOX，MPL和CpG7909组成的组。
27.根据权利要求16-21任一项的药物组合物，其特征在于所述组合物包含至少一种另外的佐剂，所述佐剂为免疫刺激剂，选自由明矾组成的组。
28.根据权利要求16至21中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为疫苗。
29.根据权利要求1至15中任一项所述的核酸作为免疫刺激剂在用于制备用于治疗癌症疾病、自身免疫性疾病、变态反应或传染病的包含药物活性成分的药物中的应用。
30.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，癌症疾病选自结肠癌、黑色素瘤、肾癌、急性骨髓白血病、急性淋巴白血病、慢性骨髓白血病、慢性淋巴细胞白血病、肺癌、胶质瘤、甲状腺肿瘤、乳腺癌、肝细胞瘤、腺癌、疱疹病毒-诱导的肿瘤、乙型肝炎-诱导的肿瘤、HTLV-1-和HTLV-2-诱导的淋巴瘤、听神经瘤、宫颈癌、咽癌、肛门癌、成胶质细胞瘤、直肠癌、星形细胞瘤、脑肿瘤、胃癌、成视网膜细胞瘤、基底细胞癌、脑转移、髓母细胞瘤、阴道癌、胰腺癌、睾丸癌、膀胱癌、何杰金氏综合症、脑膜瘤、Schneeberger病、支气管癌、垂体肿瘤、蕈样肉芽肿病、食道癌、spinaliomas、伯基特氏淋巴瘤、喉癌、胸腺瘤、骨癌、非何杰金氏淋巴瘤、尿道癌、CUP综合症、少突神经胶质瘤、阴门癌、小肠的肿瘤、颅咽管瘤、卵巢癌、软组织肿瘤、子宫内膜癌、肝转移、阴茎癌、舌癌、胆囊癌、浆细胞瘤、眼睑肿瘤和前列腺癌。
31.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，癌症疾病选自胃肠肿瘤、神经鞘瘤、甲状腺癌和肉瘤。
32.根据权利要求29的应用，其特征在于，癌症疾病选自白血病、类癌、头/颈肿瘤、肠癌、淋巴瘤和子宫癌。
33.根据权利要求29的应用，其特征在于所述癌症疾病选自乳头瘤病毒-诱导的癌，伯基特氏淋巴瘤、EBV-诱导的B-细胞淋巴瘤和肝细胞癌。
34.根据权利要求29的应用，其特征在于所述癌症疾病是宫颈癌。
35.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，传染病选自流行性感冒、疟疾、SARS、黄热病、AIDS、莱姆疏螺旋体病、利什曼病、炭疽、脑膜炎、尖锐湿疣、中空疣、登革热、三日热、埃博拉病毒、伤风、夏初脑膜脑炎、带状疱疹、肝炎、单纯疱疹I型、单纯疱疹II型、日本脑炎、拉沙热、马尔堡病毒、麻疹、口蹄疫、单核细胞增多症、腮腺炎、诺沃克病毒感染、普法伊费尔氏腺热、天花、脊髓灰质炎、假格鲁布、传染性红斑、狂犬病、西尼罗热、水痘、巨细胞病毒，阑尾炎、疏螺旋体病、肉毒中毒、弯曲杆菌、沙眼衣原体、霍乱、白喉、杜诺凡病、会厌炎、斑疹伤寒、气性坏疽、淋病、兔热病、幽门螺杆菌、百日咳、气候性腹股沟淋巴结炎、骨髓炎、军团病、麻风、利斯特菌病、肺炎、中耳炎、人型支原体、新生儿败血症、走马疳、副伤寒、瘟疫、莱特尔综合症、落矶山斑疹热、沙门氏菌副伤寒、猩红热、梅毒、破伤风、恙虫病、肺结核、阴道炎、软下疳，以及选自由寄生虫、原生动物或真菌引起的传染病。
36.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，传染病选自细菌性脑膜炎和沙门氏菌斑疹伤寒。
37.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，传染病选自病毒传染病和细菌传染病。
38.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，传染病是疣。
39.根据权利要求35的应用，其特征在于传染病选自AIDS，小儿麻痹症，尿道炎和结膜炎。
40.根据权利要求29的应用，其特征在于传染病选自阿米巴病、血吸虫病、查格斯氏病、脚癣、酵母霉斑、疥疮、疟疾、盘尾丝虫病、或真菌病、弓形体病、滴虫病、锥虫病、内脏利什曼病、尿布皮炎、血吸虫病、鱼中毒、念珠菌病、皮肤利什曼病、贾弟虫病、或昏睡病，或选自由棘球蚴、阔节裂头绦虫、狐绦虫、犬绦虫、虱、牛绦虫、猪绦虫和微型绦虫引起的传染病。
41.根据权利要求29的应用，其特征在于传染病是前列腺炎。
42.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，自身免疫性疾病选自由糖尿病、系统性红斑狼疮、慢性多关节炎、巴西多氏病、慢性肝炎的自身免疫形式、溃疡性结肠炎、纤维肌痛、脱发、别赫捷列夫氏病、克罗恩氏病、重症肌无力、神经性皮炎、风湿性多肌痛、进行性系统性硬化病、银屑病、赖特尔综合症、风湿性关节炎、银屑病和血管炎组成的组。
43.根据权利要求29的应用，其特征在于自身免疫疾病选自由多发性硬化、类风湿性关节炎、II型糖尿病和I型糖尿病组成的组。
44.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述变态反应选自由变应性哮喘、变应性结膜炎、变应性鼻炎、血管性水肿、特应性皮炎、荨麻疹、嗜酸性粒细胞增多、呼吸的对昆虫螫刺的变态反应、和对药物的变态反应组成的组。
45.据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述变态反应是过敏症。
46.据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述变态反应是皮肤变态反应。
47.据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述变态反应是食物变态反应。
48.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述变态反应选自由导致鼻粘膜的肿胀的变应性哮喘和导致结膜的发红和发痒的变应性结膜炎组成的组。
49.根据权利要求29所述的应用，其特征在于，所述变态反应选自由导致并包括各种皮疹的皮肤变态反应组成的组。
50.根据权利要求29所述的应用，其特征在于所述变态反应选自由湿疹、麻疹和皮炎组成的组。
51.根据权利要求29所述的应用，其特征在于所述变态反应选自由干草热，荨麻疹和接触性皮炎组成的组。
52.包含根据权利要求1至15中任一项所述的核酸或根据权利要求16至28中任一项所述的药物组合物的试剂盒.
53.权利要求52的试剂盒，其中所述试剂盒还包含具有关于所述核酸或所述药物组合物的给药和剂量的信息的技术使用说明书。
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