BRPI0617254A2 - "oligonucleotìdeo de filamento único, composição farmacêutica, métodos para estimular a atividade de tlr7 em uma célula que expressa tlr7, para estimular a atividade de tlr8 em uma célula que expressa tlr8, e, para estimular uma resposta imune em um paciente - Google Patents

Abstract

OLIGONUCLEOTìDEO DE FILAMENTO úNICO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODOS PARA ESTIMULAR A ATIVIDADE DE TLR7 EM UMA CéLULA QUE EXPRESSA TLR7, PARA ESTIMULAR A ATIVIDADE DE TLR8 EM UMA CéLULA QUE EXPRESSA TLR8, E, PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM PACIENTE. A presente invenção fornece oligonucleotídeos, composições que os compreendem e métodos que usam os oligonucleotídeos e composições para estimular células que expressam o receptor de TLR7 e/ou TLR8. Os oligonucleotideos para estimular TLR7 compreendem regiões ricas em uracila. Os oligonucleotídeos para estimular TLR8 compreendem regiões ricas em guanina. Os presentes métodos e composições são úteis, inter alia, para tratar ou prevenir condições tais como doença infecciosa e câncer.

Description

"OLIGONUCLEOTÍDEO DE FILAMENTO ÚNICO, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA ESTIMULAR A ATIVIDADE DETLR7 EM UMA CÉLULA QUE EXPRESSA TLR7, PARA ESTIMULAR AATIVIDADE DE TLR8 EM UMA CÉLULA QUE EXPRESSA TLR8, E,PARA ESTIMULAR UMA RESPOSTA IMUNE EM UM PACIENTE."

Campo da InvençãoA presente invenção, no geral, diz respeito ao campo daimunologia. Mais particularmente, a invenção diz respeito a composições emétodos para alterar a função imune, particularmente por estimular receptorestais como o receptor semelhante ao Toll 7 (TLR7) e receptor semelhante aoToll 8 (TLR8) presente nas membranas de células tais como célula dendríticaplasmocitóides.

Fundamentos

Uma das respostas mais precoces ao influenza e a outros vírusé a produção do tipo I IFNs, citocinas críticas que estabelecem um estadoantiviral e ligação em ponte aos sistemas imunes inatos e adaptativos (Le Bonet al., (2002) Curr. Opin. Immunol. 14:432). O sistema imune inato mamíferoreconhece a presença de patogênios invasores por uma família de receptoresque pertencem à família de receptor semelhante Toll (TLR). TLRs tal comoTLR3, TLR7, TLR8 e TLR9 todos envolvidos em reconhecer padrõesmoleculares associados a patogênios virais (PAMPs) são expressadosintracelularmente e testam o teor de endossomas quanto a presença de PAMPsvirais entre o material extracelular que estas células absorveram. No caso deCD8a+ células dendríticas (DCs) que absorvem material a partir de célulasapoptóticas, estes PAMPs virais de sentido TLRs presentes em célulasinfectadas, enquanto a DC plasmacitóide parecem absorver partículas viraisem vez de material celular e reconhecer os ácidos nucleicos genômicos dentrode partículas virais na absorção.

Diversas características de genoma viral, tal como RNA defilamento duplo (dsRNA) e teor de CpG alto, podem servir como assinaturasmoleculares que podem ser distinguidas pelo hospedeiro como não sozinho.As interações hospedeiro-vírus que levam à secreção do tipo I IFNs pelascélulas infectadas, provavelmente envolvendo reconhecimento padrão atravésde TLRs. Embora mais tipos de células podem produzir IFNa e IFNp eminfecção viral, as célula dendrítica plasmocitóides (pDCs) são particularmentecompetentes nos níveis muito altos de secreção do tipo I IFNs em resposta a certos vírus.

Como membros da família de receptor de interleucina 1 pró-inflamatório (IL-IR), os TLRs dividem homologias em seus domínioscitoplásmicos denominado domínio de homologia de Toll/IL-IR (TIR) (verpor exemplo, pedidos publicados PCT PCT/US98/08979 e PCT/USO1/16766;as divulgações inteiras de que são incorporadas neste por referência).Mecanismos de sinalização intracelular mediados por TLRs aparecemgeralmente similar, com MyD88 e fator associado de receptor do fator denecrose do tumor 6 (TRAF6) acreditado ter papéis críticos (Wesche H et ai.(1997) Immunity 7:837-47; Medzhitov R et al. (1998) Mol Célula 2:253-8;Adachi O et al. (1998) Immunity 9:143-50; Kawai Tetal. (1999) Immunity11:115-22); Cao Z et al. (1996) Nature 383:443-6; Lomaga M A et al. (1999)Genes Dev 13:1015-24; as divulgações inteiras de que são incorporadas nestepor referência). Transdução de sinais entre MyD88 e TRAF6 é conhecido porenvolver membros da família de cinase associada ao receptor IL-1 de serina-treonina cinase (IRAK), incluindo pelo menos IRAK-I e IRAK-2 (Muzio Met al. (1997) Science 278:1612-5).

Na ativação de TLRs, o domínio de homologia Toll de MyD88ligado ao domínio de TIR de TLR e domínio de morte de MyD88 ligado aodomínio de morte de serina cinase IRAK. IRAK interage com TRAF6, queatua como uma entrada em pelo menos dois caminhos, um levando paraativação do fator de transcrição NF-kB e outro levando para ativação de Jun eFos, membros da família de fator de transcrição (AP-I) de proteína ativadora.

A ativação de NF-kB envolve a ativação de TAK-1, um membro da família decinase MAP 3 (MAPK) e cinases IkB. As IkB cinases fosforilam IkB, levandoa sua degradação e à translocação de NF-kB aos núcleos. A ativação de Jun eFos é acreditada envolver a MAP cinase cinases (MAPKKs) e MAP cinasesERK, p38 e JNK/SAPK. Tanto NF-kB quanto AP-I são envolvidos emcontroles de transcrição de um número de genes de resposta imune chave,incluindo genes por várias moléculas de citocinas e co-estimuladoras (ver, porexemplo, Aderem A et al. (2000) Nature 406:782-7; Haicker H et al. (1999)EMBO J. 18:6973-82).

Os ligandos para muitos mas não para todos os TLRs foramdescritos. Por exemplo, foi relatado que sinais de TLR2 em resposta aospeptideoglicano e lipopeptídeos (Yoshimura A et al. (1999) J Immunol 163:1-5; Brightbill H D et al. (1999) Science 285:732-6; Aliprantis A 0 et al. (1999)Science 285:736-9; Takeuchi et al. (1999) Immunity 11:443-51; Underhill DM et al. (1999) Nature 401:811-5). TLR4 foi relatado ao sinal em resposta aoslipopolisacarídeo (LPS) (Hoshino K et al. (1999) J Immunol 162:3749-52;Poltorak A et al. (1998) Science 282:2085-8; Medzhitov R et al. (1997)Nature 388:394-7). Flagelina bacteriana foi relatado ao ser um ligando naturalpara TLR5 (Hayashi F et al. (2001) Nature 410:1099-1103). TLR6, emconjunção com TLR2, foi relatado ao sinal em resposta aos proteoglicanos(Ozinsky et al. (2000) PNAS 97:13766-71; Takeuchi et al. (2001) IntImmunol 13:933-40).O TLR7 é um receptor de reconhecimento padrão paradetecção de RNA viral genômico. 0 IFNa mediado por TLR7 de indução emcélulas dendrítica plasmocitóides (PDC) pode ser disparada pelo RNA viral,mRNA mamífero e o GFP RNA transcrito in vitro não respectivo daseqüência de RNA. Uma variedade de seqüências foram previamentemostradas a ser capaz de estimular TLR7 em PDCs até certo grau, incluindofilamentos longos de poliU de comprimento variável (Diebold et al. (2004)Science 303: 1529), oligonucleotídeos contendo uma proporção alta denucleotídeos GU (Heil et al. (2004) Science 303: 1526; Pedido de PatenteU.S. US2003/0232074), certas seqüências de siRNA específicas (Hornung etal. (2005) Nature Med. 11:263); e análogos de guanina nucleotídeo (Lee et al(2003) PNAS 100: 6646-6651). Foi relatado que certos compostosimidazoquinolina antiviral, tal como imiquimod e resiquimod (R848), podemativar TLR7 (Hemmi H et ai. (2002) Nat Immunol 3:196-200; Jurk M et al.(2002) Nat Immunol 3:499).

O TLR8 é um receptor de reconhecimento padrão paradetecção de filamento único de RNA. Este parece ser funcional em célulasdendríticas humanas, particularmente célula dendrítica mielóides, mas não emcélulas dendríticas de camundongo (Jurk M et al. (2002) Nat Immunol 3:499).TLR8 também é funcional em células T reguladoras CD4+. Ribonucleotídeose desoxiribonucleotídeos rico em GU. Os análogos de guanina nucleotídeo ecompostos imidazoquinolina, tal como imiquimod e resiquimod (R848) queestimulam TLR7 também foram mostrados para estimular o TLR8 humano. Aimportância de falta de TLR8 em camundongos e porque TLR7 e TLR8parecem possuir até certo grau, funções de reconhecimento redundantes emcélulas imune humanas não que não são conhecidas.

No aspecto da importância de o estímulo mediado por TLR7 eTLR8 de respostas imune inato para a defesa contra vírus e outros agentesinfecciosos e geralmente para estimular a resposta imune para ajudar a tratar eprevenir condições tal como câncer, existe uma grande necessidade na técnicaquanto a compostos novos capazes de eficaz e confiavelmente ativas o TLR7e TLR8 independentemente um do outro in vitro e in vivo. A presenteinvenção indica estas e outras necessidades.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção fornece oligonucleotídeode filamentos únicos isolados, composições que compreendem e métodos paraopcionalmente estimular sinalização mediada por TLR, especificamenteatravés do receptor TLR7. Os oligonucleotídeos, composições e métodosdescritos neste são úteis for intensificar à ativação de TLR7 que expressamcélulas, por exemplo, células dendríticas tais como célula dendríticaplasmocitóides e certas subséries de células T reguladoras, in vitro e in vivo.Tais oligonucleotídeos, composições e métodos são úteis em um número deaplicações clínicas, incluindo como agentes farmacêuticos e métodos para tratar ou prevenir condições tais como câncer ou doença infecciosas,particularmente infecções virais. Os oligonucleotídeos e composições dainvenção também podem ser usadas em métodos para estimar os efeitos deoutros compostos em atividade de TLR7, por exemplo, em ensaios paraidentificar ou caracterizar outros moduladores candidatos de TLR7 ou deTLR7 que expressam células. Os oligonucleotídeos e composições sãotambém úteis em métodos de indução de produção e/ou liberação de IFNa,particularmente por células dendríticas.

Os oligonucleotídeos presentemente descritos são baseados emestudos presentes neste em que vários parâmetros estruturais foram variados em a fim de determinar aqueles mais importantes para estimulação de TLR7.Surpreendentemente, foi descoberto que o nucleotídeo uridina é o aspectoessencial que determina o reconhecimento pela ativação de receptores deTLR7. De acordo, em uma forma de realização, a presente invenção forneceum oligonucleotídeo de filamento único que consiste dentre 10 e 50nucleotídeos e que compreende uma seqüência selecionada de: UUUr -(X)n-UUUr, ou UUr-X-UUr-X-UUr, em que cada U é um independentementeselecionado de nucleotídeo contendo uracila; cada X é independentementeselecionado de qualquer nucleotídeo, opcionalmente um nucleotídeo nãouracila ou um uracila; r é um número inteiro de 1 a 20, preferivelmente de 1 aIOe preferivelmente 1,2, 3,4 ou 5 ené um número inteiro de 1 a 4, em queo dito oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo não contendouracila ou pelo menos uma ligação não natural.

Em uma forma de realização preferida, os nucleotídeos (porexemplo, nucleotídeos não uracila, derivados) da invenção não conferem, nooligonucleotídeo, a capacidade de induzir quantidades substanciais de IL-6quando levado em contato com uma amostra biológica, preferivelmente umaamostra que compreende uma célula dendrítica (por exemplo, onde pDC ououtro TLR7 que expressam DC são presentes). Preferivelmente, os agonistasTLR7 de acordo com a invenção são selecionados por sua habilidade deinduzir IFN-alfa como contrário ao IL-6 e oligonucleotídeos com a razãomaior de IFN-alfa: indução de IL6 são preferidos, particularmente para otratamento de por exemplo, doença infecciosa.

Por exemplo, foi descoberto que oligonucleotídeos curtos decomprimento definido que consiste totalmente de uridina ou desoxiuridinanucleotídeos possuem capacidade de estimular TLR7 potente. Deste modo,em uma forma de realização preferida cada um dos nucleotídeos em um ditooligonucleotídeo é uma uracila contendo oligonucleotídeo e o ditooligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação de cadeia principal nãonatural. Mais preferivelmente, cada nucleotídeo é uridina. Foi tambémdescoberto que oligonucleotídeos contendo dois ou mais tripletos de uridinasou cinco ou mais dupletos de uridinas, são também ativadores potentes,particularmente quando os dupletos ou tripletos são separados por umpequeno número, preferivelmente um, de nucleotídeos de intervenção. Deacordo, em uma outra forma de realização preferida, o dito oligonucleotídeocompreende a seqüência (UUUr-(X)n)m ou (UUUU-(X)n)m, em que X équalquer nucleotídeo, m é um número inteiro maior do que dois.

Opcionalmente X é um nucleotídeo não uracila; opcionalmente X é umauridina e r é um número inteiro de 1 a 20, preferivelmente de 1 a 10 epreferivelmente de 1, 2, 3, 4 ou 5. Preferivelmente , m é 3 ou 4. Maispreferivelmente, cada U é de uridina. Ainda mais preferivelmente, cada η é 1.Foi também constatado que a extensão de mais do que cinco, preferivelmentedez, uridinas consecutivas dentro um oligonucleotídeo é suficiente paraconferir capacidade de ativação de TLR7 forte. Deste modo, em uma outraforma de realização, a presente invenção fornece um oligonucleotídeo defilamento único que consiste dentre 10 e 50 nucleotídeos e que compreende aseqüência: Y(U)pY, em que cada U é independentemente selecionado de umnucleotídeo contendo uracilas, cada Y é independentemente selecionado deum nucleotídeo não contendo uracila; e ρ é um número inteiro maior do que4. Mais preferido é quando ρ é um número inteiro maior do que 5, 6, 7, 8, 9,10, 11 ou 12. Em cada uma destas forma de realização descrita, é preferidoque cada U é uridina.

Foi também constatado que um oligonucleotídeo quecompreende cinco dupletos de uridina, cada um separado por um simplesnucleotídeo não uridina e um oligonucleotídeo similarmente dimensionadocom dez uridinas de consecução foram ambas iguais em sua capacidade deestimular TLR7 como um oligonucleotídeo do mesmo tamanho que consistetotalmente de uridinas. Deste modo, de acordo com outra forma de realizaçãopreferida, o oligonucleotídeo compreende a seqüência:

UUXUUXUUXUUXUU (SEQ ID N° 1).

Foi também constatado que estas características da seqüênciamantêm-se independentes da cadeia principal de oligonucleotídeo. Porexemplo, o oligonucleotídeo pode ser compreendido de nucleotídeos de RNAou DNA. Também, os oligonucleotídeos que compreendem as ligações defosforotioato trabalham tão eficazmente quanto aqueles que compreendemligações de fosfodiéster. Fosforotioato e outra ligação não natural comunicahabilidade intensificada aos oligonucleotídeos que compreendem tais ligações. Deste modo, a presença de uma ou mais de tal ligação não naturalsão preferidas em qualquer dos oligonucleotídeos descritos acima. Em umaforma de realização preferida, pelo menos uma ligação não natural é umaligação de fosforotioato.

Em uma forma de realização, todos os nucleotídeos nos oligonucleotídeo são ribonucleotídeos. Em uma outra forma de realização,todos os nucleotídeos no oligonucleotídeo são desoxiribonucleotídeos. Emuma outra forma de realização, o comprimento do oligonucleotídeo está entre10 a 30 nucleotídeos. Em uma outra forma de realização, o oligonucleotídeoestá entre 15 e 30 nucleotídeos em comprimento. Ainda em outra forma derealização, o oligonucleotídeo está entre 15 e 21 nucleotídeos emcomprimento. Ainda em outra forma de realização, o oligonucleotídeo estáentre 21 e 30 nucleotídeos em comprimento. Preferivelmente ooligonucleotídeo é 15 ou 21 nucleotídeos em comprimento. Ainda, em umaforma de realização mais preferida, o oligonucleotídeo é 21 nucleotídeos emcomprimento. Em uma outra forma de realização, uma maioria de nucleotídeocontendo uracilas dentro do oligonucleotídeo são adjacentes de pelo menosum outro nucleotídeo contendo uracila.

Em uma outra forma de realização, o oligonucleotídeocompreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste de SSD8 (SEQID N0 12), SSD9 (SEQ ID N0 13), SSD10 (SEQ ID N0 14), SSD21 (SEQ IDN0 18), SSD22 (SEQ ID N0 19), SSD23 (SEQ ID N0 20), SSD24 (SEQ ID N021), SSD28 (SEQ ID N0 24), SSD29 (SEQ ID N0 25), poliUs-21 (SEQ ID N05), poliUs-15 (SEQ ID N0 6) ou poliUs-10 (SEQ ID N0 7). Em uma outraforma de realização, a seqüência de nucleotídeo de oligonucleotídeo consistede uma seqüência selecionada do grupo que consiste de SSD8, SSD9, SSD10,SSD21, SSD22, SSD23, SSD24, SSD28, SSD29, poliUs-21, polidUs21 (SEQID N0 9), poliUs-15 ou poliUs-10 (SEQ ID N0 4). Ainda em outra forma derealização, o oligonucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeoselecionada de poliUolS, poliUo21 (SEQ ID N0 8) ou polidUs21 (SEQ ID N09), em que o dito oligonucleotídeo que compreende pelo menos uma base quenão contém uracila ou pelo menos ligação não natural. Ainda em outra formade realização, o oligonucleotídeo adicionalmente que compreende pelo menosum CG dinucleotídeo, em que C é uma nucleotídeo contendo citocina nãometilada e G é um nucleotídeo contendo guanina. O dupleto CG pode estarpresente como parte de uma seqüência selecionada de UUU-(X)n-UUU, UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY ou fora daquelas seqüências. Uma tal seqüência éconhecida por agonizar o receptor TLR9 que será desejável em certosterapêuticos e outro uso dos oligonucleotídeos desta invenção. Em uma formade realização alternativa, o oligonucleotídeo especificamente exclui qualquerdupletos de CG. Tais oligonucleotídeos não agonizam o receptor TLR9. Aevitação do agonismo do receptor TLR9 que será desejável em terapêuticoespecífico e outro uso dos oligonucleotídeos desta invenção.

Em um exemplo, o oligonucleotídeo da invenção é umagonista TLR7 que induz apoptose em células alvo. O composto imiquimod,um agonista de TLR7 e TLR8, bem como agonistas TLR3 foram relatadospor induzir apoptose (Meyer T, Nindl I, Schmook T, Ulrich C, Sterry W,Stockfleth E. Induction of apoptosis by Receptor Iike a Toll-7 agonist intissue cultures. Br J Dermatol. 2003 Nov;149 Suppl 66:9-14.; Schon et al.(2004) J. Invest. Dermatol. 122:1266-1276; e W0/2006054177 (André et al)).

Em uma forma de realização, os inventores fornecem que osoligonucleotídeo da invenção podem ser usados para induzir apoptose de umacélula alvo, incluindo em uma forma de realização preferida, uma célula queexpressa um polipeptídeo de TLR7. A célula é preferivelmente uma célula detumor. Deste modo, em um aspecto, a invenção fornece a determinação decomo uma célula, preferivelmente uma célula de tumor, em um indivíduo queexpressa um polipeptídeo TLR7 e se a dita célula de tumor expressa opolipeptídeo TLR7, ligando um oligonucleotídeo da invenção em contato coma dita célula em uma quantidade efetiva para induzir apoptose da célula. Emuma outra forma de realização, a invenção que fornece a determinação decomo uma célula, preferivelmente uma célula de tumor, em um indivíduo queexpressa um polipeptídeo TLR7 e se a dita célula de tumor expressa opolipeptídeo TLR7, administrar o dito oligonucleotídeo da invenção ao ditoindivíduo em uma quantidade efetiva para induzir apoptose de uma célula.

Ainda em uma outra forma de realização adicional, umoligonucleotídeo que compreende pelo menos um dinucleotídeo CG, em queC é um nucleotídeo contendo citocina não metilada e G é um nucleotídeocontendo guanina e o dito oligonucleotídeo não contém qualquer uridinacontendo seqüências descritas nestas, incluindo, UUUU, UUU-(X)n-UlJU,UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY. Um tal oligonucleotídeo agonizará o receptorTLR9 sem agonizar o receptor TLR7.

A presente invenção também fornece uma composição quecompreende um oligonucleotídeo de filamento único isolado dentre 10 e 50nucleotídeos em comprimento e que compreende uma seqüência selecionadade: UUU-(X)n-UUU, UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY, em que cada U éindependentemente selecionado de um nucleotídeo contendo uracila; cada X éindependentemente selecionado de qualquer nucleotídeo; cada Y éindependentemente selecionado de qualquer nucleotídeo não contendouracila; η é um número inteiro de 1 a 4; e ρ é um número inteiro maior do que4; e um carreador farmaceuticamente aceitável. Cada um dosoligonucleotídeos contendo uracila preferidos apresentados acima podemestar presentes em uma composição desta invenção. Outros oligonucleotídeospreferidos que podem estar presentes nas composições desta invenção sãooligonucleotídeos que compreendem uma seqüência de nucleotídeoselecionado de poliUol5, poliUo21 ou polidUo21 e oligonucleotídeos queconsistem de uma seqüência de nucleotídeo selecionados de poliUol5,poliUo21 ou polidUo21.

Também foram constatados que a eficácia das presentescomposições de oligonucleotídeos podem ser intensificadas pelocomplexamento do oligonucleotídeo com um composto secundário capaz deintensificar a estabilidade ou capacidade do oligonucleotídeo para entrar nascélulas. Deste modo, em uma forma de realização preferida, a composição compreende um oligonucleotídeo complexo para um composto catiônico talcomo PEI ou um lipossoma catiônico. Particularmente em uma forma derealização preferida, o composto catiônico é PEI.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um métodode intensificar a sinalização mediada por TLR7 em uma célula, o método quecompreende constatar a dita célula com um oligonucleotídeo ou composiçãoda invenção. Em uma forma de realização preferida, o método é usado in vivopara realçar a sinalização mediada por TLR7 em um paciente e ooligonucleotídeo ou composição desta invenção é administrado ao paciente.Em uma outra forma de realização, a célula em que a sinalização mediada por TLR7 é intensificada é uma célula imune. Em uma outra forma de realização,a célula é uma célula dendrítica, uma célula B ou um monócito, cada um queexpressa TLR7. Em uma outra forma de realização, a célula dendrítica é umacélula dendrítica plasmocitóide (PDC). Em uma outra forma de realização, aestimulação do receptor TLR7 resulta na ativação da célula. Em uma outra forma de realização, a célula é uma célula de camundongo. Em uma outraforma de realização, a célula é uma célula humana. Em uma outra forma derealização, a célula é isolada a partir de um paciente com câncer ou umadoença infecciosa. Em uma outra forma de realização, a célula naturalmenteexpressa TLR7. Em uma outra forma de realização, a célula compreende umvetor de expressão cuja a presença leva à expressão de TLR7 na célula.

Em uma outra forma de realização, o método aindacompreende uma etapa em que a ativação da célula é detectada subseqüente adita etapa de contato. Em uma outra forma de realização, a ativação édetectada por examinar o nível de produção pela célula de uma citocinaselecionada do grupo que consiste um interferon tipo I, por exemplo IFNoc,IP-10, IL-8, RANTES, IFNgama, IL-6 e IL-12 p40. Em uma outra forma derealização, a etapa de examinação é realizada usando-se ELISA. Em umaforma de realização, em um método de identificação ou caracterização de umcandidato a agonista TLR7, razões de IFN-alfa a IL-6 são detectados eoligonucleotídeos com a razão maior de IFN-alfa:IL-6 são selecionados comocandidatos a agonistas TLR7.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um métodode estimular uma resposta imune em um paciente, o método que compreendeadministrar ao paciente uma composição farmacêutica que compreendequalquer dos oligonucleotídeos descritos neste e um carreadorfarmaceuticamente aceitável.

Em uma forma de realização, o paciente tem câncer ou umadoença infecciosa. Em uma outra forma de realização, a doença infecciosa éum infecção viral. Em uma outra forma de realização, a administração dacomposição resulta na estimulação de célula dendrítica plasmocitóides (PDC),células B ou monócitos no paciente.

Em uma outra forma de realização, o método aindacompreende uma etapa em que a atividade da célula imune é detectada no paciente a seguir da etapa de administração, em que um detecção de atividadeaumentada da célula imune indica que a administração é eficaz. Em uma outraforma de realização, a atividade é detectada por exame da atividade de céluladendrítica plasmocitóides (PDC), células B ou monócitos no dito paciente.Em uma outra forma de realização, a atividade de uma célula é detectada porexaminar o nível de expressão de uma citocina selecionada do grupo queconsiste de um interferon tipo I, por exemplo IFNa, IP-10, IL-8, RANTES,IFN γ , IL-6 e IL-12 p40. Em uma outra forma de realização, a etapa deexaminação é realizada usando-se ELISA. Em uma forma de realizaçãopreferida, o oligonucleotídeo agonista TLR7 da invenção induz a expressãoou secreção de IFNa mas não induz substancialmente a expressão de IL-6.

Em um outro aspecto, a presente invenção forneceoligonucleotídeo de filamento únicos isolados, composições quecompreendem e métodos para opcionalmente estimular a sinalização mediadapor TLR, através do receptor TLR8. Estes oligonucleotídeos, composições emétodos descritos neste são úteis para intensificar à ativação de células queexpressam TLR8, por exemplo, células dendríticas humanas, tal como céluladendrítica mielóides e certas subséries de células T reguladoras, in vitro e invivo. Tais oligonucleotídeos, composições e métodos são úteis em váriasaplicações clínicas, incluindo como agentes farmacêuticos e métodos paratratar ou prevenir condições tais como câncer ou doença infecciosas,particularmente infecções virais. Estes oligonucleotídeos e composições dainvenção também podem ser usadas em métodos para estimar os efeitos deoutros compostos em atividades de TLR8, por exemplo, em ensaios paraidentificar ou caracterizar outros moduladores candidatos de TLR8 ou decélulas que expressam TLR8. Os oligonucleotídeos e composições sãotambém úteis em métodos de indução de produção e/ou liberação de IFNa,particularmente por células dendríticas; e no bloqueio da atividadeimunossupressiva da célula T reguladora de CD4+S.

Os oligonucleotídeos agonistas de TLR8 são baseados emestudos presentes nestes agonistas TLR7 e em outra parte que demonstram aatividade agonista de TLR7 e TLR8 de G, oligonucleotídeos de RNA rico emU (Pedido de Patente dos Estados Unidos N°. 0030232074; e Heil, F. et ai.,(2004) Science 303, pp. 1526-29) e a capacidade de vários oligonucleotídeoscontendo desoxiguanosina ligado por fosforotioato para agonizar TLR8 emcélula T reguladora de CD4+s (Peng G., et ai. (2005) Science 309, pp. 1380-1384). De acordo, em uma forma de realização, a presente invenção forneceum oligonucleotídeo de filamento único que consiste dentre 11 e 50nucleotídeos e que compreendem uma seqüência selecionada de: GGG-(X)n-GGG, GG-X-GG-X-GG ou Z(G)pZ, em que cada G é independentementeselecionado de um nucleotídeo contendo guanina; cada X éindependentemente selecionado de qualquer nucleotídeo; cada Z éindependentemente selecionado de qualquer nucleotídeo que não guanina; η éum número inteiro de 1 a 4; e ρ é um número inteiro maior do que 4, em que odito oligonucleotídeo compreende pelo menos uma guanina não contendonucleotídeo ou pelo menos uma ligação não natural.

Em uma forma de realização preferida cada um dosnucleotídeos no dito oligonucleotídeo é um oligonucleotídeo contendoguanina e o dito oligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação decadeia principal não natural. Mais preferivelmente, cada nucleotídeo éguanosina ou desoxiguanosina.

Em uma outra forma de realização preferida, o ditooligonucleotídeo compreende uma seqüência selecionada de (GGG(X)n)m, emque m é um número inteiro maior do que dois. Preferivelmente, m é 3 ou 4.Mais preferivelmente, cada G é de guanosina. Ainda mais preferivelmente,cada η é 1.

Em uma outra forma de realização preferida, ooligonucleotídeo compreende a seqüência Z(G)pZ; e ρ é um número inteiromaior do que 9. Ainda mais quando cada G é guanosina ou cada G édesoxiguanosina.

De acordo com outra forma de realização preferida, ooligonucleotídeo compreende a seqüência: GGXGGXGGXGGXGG.

Também, a presença de um ou mais de ligação não natural sãopreferidas em qualquer dos oligonucleotídeos descritos acima. Em uma formade realização preferida, pelo menos uma ligação não natural é uma ligaçãofosforotioato.

Em uma forma de realização, todos os nucleotídeos nosoligonucleotídeo são ribonucleotídeos. Em uma outra forma de realização,todos os nucleotídeos no oligonucleotídeo são desoxiribonucleotídeos. Emuma outra forma de realização, o comprimento do oligonucleotídeo está entre11 a 30 nucleotídeos. Em uma outra forma de realização, o oligonucleotídeoestá entre 21 e 30 nucleotídeos em comprimento. Ainda em outra forma de realização, o oligonucleotídeo está entre 15 e 21 nucleotídeos emcomprimento. Em uma outra forma de realização, uma maioria denucleotídeos contendo guanina dentro do oligonucleotídeo são adjacentes apelo menos um outro oligonucleotídeo contendo guanina.

Ainda em outra forma de realização, o oligonucleotídeo adicionalmente compreende pelo menos um dupleto de CG, em que C é umnucleotídeo contendo citocina não metilada e G é um nucleotídeo contendoguanina. O CG pode estar presente como parte de uma seqüência selecionadade GGG-(X)n-GGG, GG-X-GG-X-GG ou Z(G)pZ ou fora daquelas seqüênciasnos oligonucleotídeo. Em uma forma de realização alternativa, ooligonucleotídeo especificamente exclui qualquer dupleto de CGs.

Em uma outra forma de realização, o oligonucleotídeoagonista TLR8 ainda compreende uma seqüência selecionada de UUU-(X)n-UUU, UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY. Tais seqüências contendo uracila podemsobrepor as seqüências contendo guanina ou podem ser completamenteseparadas nos oligonucleotídeos. Um tal oligonucleotídeo agonizará TLR7bem como TLR8, que é útil em certos terapêuticos humanos e outros usos.

A presente invenção também fornece uma composição quecompreende um oligonucleotídeo de filamento único isolado dentre 11 e 50nucleotídeos em comprimento e que compreende uma seqüência selecionadade: GGG-(X)n-GGG, GG-X-GG-X-GG ou Z(G)pZ5 em que cada G éindependentemente selecionado de um nucleotídeo contendo guanina; cada Xé independentemente selecionado de qualquer nucleotídeo; cada Z éindependentemente selecionado de qualquer nucleotídeo que não guanina; η é um número inteiro de 1 a 4; e ρ é um número inteiro maior do que 4. Cada umdos oligonucleotídeos contendo nucleotídeos de guanina preferidosapresentados acima podem estar presentes em uma composição destainvenção. Outros oligonucleotídeos preferidos que podem estar presentes nascomposições desta invenção são oligonucleotídeos que consiste totalmente denucleotídeos contendo guanina que são ligados por um ou outro porintermédio de ligações fosfodiéster.

Em uma forma de realização preferida, a composiçãocompreende um oligonucleotídeo complexado a um composto catiônico talcomo PEI ou um lipossoma catiônico. Particularmente em uma forma de realização preferida, o composto catiônico é PEI.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um métodode intensificar a sinalização mediada por TLR8 em uma célula, o método quecompreende contatar a dita célula com um oligonucleotídeo ou composição dainvenção. Em uma forma de realização preferida, o método é usado in vivo para realçar a sinalização mediada por TLR8 em um paciente e ooligonucleotídeo ou composição desta invenção é administrado ao paciente.Em uma outra forma de realização, a célula em que a sinalização mediada porTLR8 é intensificada é uma célula imune. Em uma outra forma de realização,a célula é uma célula dendrítica. Em uma outra forma de realização, a célula é uma célula T reguladora de CD4+. Em uma outra forma de realização, aestimulação do receptor TLR8 resulta na ativação da célula. Em uma outraforma de realização, a estimulação do receptor TLR8 resulta na desativaçãode uma célula T reguladora de CD4+. Em uma outra forma de realização, acélula é uma célula de camundongo. Em uma outra forma de realização, acélula é uma célula humana. Em uma outra forma de realização, a célula éisolada a partir de um paciente com câncer ou uma doença infecciosa. Emuma outra forma de realização, a célula naturalmente expressa TLR8. Emuma outra forma de realização, a célula compreende um vetor de expressãocuja a presença leva à expressão de TLR8 na célula.

Em uma outra forma de realização, o método aindacompreende uma etapa em que a ativação da célula é detectada subseqüente àdita etapa de contato. Em uma outra forma de realização, a ativação édetectada por examinar o nível de produção pela célula de uma citocinaselecionada do grupo que consiste de um interferon tipo I, por exemplo IFNa,IP-10, IL-8, RANTES, IFNgama, IL-6 e IL-12 p40. Em uma outra forma derealização, a etapa de examinação é realizada usando-se ELISA.

Em uma outra forma de realização, o método aindacompreende uma etapa em que a desativação de uma célula T reguladora deCD4+ é detectada subseqüente à dita etapa de contato. Em uma outra forma derealização, a desativação é detectada por que determina a capacidade dascélulas T reguladoras de CD4+ para suprimir proliferação de célula CD4+ Tsimples. Em uma outra forma de realização, a etapa de examinação érealizada por detectar a incorporação de [ H]timidina em células CD4 Tsimples incubadas com células T reguladoras de CD4+.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um métodode estimular uma resposta imune em um paciente, o método que compreendeadministrar ao paciente uma composição farmacêutica que compreendequalquer dos descritos neste oligonucleotídeos e um carreadorfarmaceuticamente aceitável.

Em uma forma de realização, o paciente tem câncer ou umadoença infecciosa. Em uma outra forma de realização, a doença infecciosa éum infecção viral. Em uma outra forma de realização, a administração dacomposição resulta na estimulação de células dendríticas no paciente.Em uma outra forma de realização, o método aindacompreende uma etapa em que a atividade de célula imune é detectada nopaciente a seguir da etapa de administração, em que um detecção de atividadeaumentada de célula imune indica que a administração é eficaz. Em uma outraforma de realização, a atividade é detectada por exame da atividade de célulasdendríticas no dito paciente. Em uma outra forma de realização, a atividade deuma células é detectada por examinar o nível de expressão de uma citocinaselecionada do grupo que consiste de um interferon tipo I, por exemplo IFNa,IP-10, IL-8, RANTES, IFNgama, IL-6 e IL-12 p40. Em uma outra forma derealização, a etapa de examinação é realizada usando-se ELISA. Em umaoutra forma de realização, a atividade é detectada por exame da atividade decélulas T reguladoras de CD4+ no dito paciente.

Breve Descrição dos DesenhosA Figura 1 mostra que os oligonucleotídeos PoliU RNA 21-mer induz a IFNa por Flt3L-DC não respectivo de ligações de fosfodiéster oufosforotioato. As culturas volumosas de C57BL/6 Flt3L-DC foramestimuladas com doses diferentes de níveis de RNA e IFNa em sobrenadantesforam medidos por ELISA após cultura durante a noite (amostra em triplicata± 1 SD). (A) Complexos de PEI com RNA fosfodiéster de poliUhomopoliméricos de comprimento não definido foram comparados porcomplexos de PEI com oligonucleotídeos de fosfodiéster (poliUo-21) efosforotioato (poliUs-21) de poliU RNA 21-mero. O fosfodiéster (B) oufosforotioato (C) de poliU RNA de 21-mer foram usados para estimulação deBM-DC derivado de Flt3L em forma de complexos com PEI (+ PEI) oucomo oligonucleotídeos livres (p/o PEI). A concentração de RNA é descritaem μg/ml em vez de μηιο^Γ, visto que o peso molecular médio da preparaçãode poliU não é conhecido. Os dados são representativos de pelo menos trêsexperimentos independentes.

A Figura 2 mostra que o oligonucleotídeo de PoliU RNAmediou a indução de IFNa em culturas de Flt3L-DC correlacionadas com otamanho dos oligonucleotídeos. Culturas volumosas de C57BL/6 Flt3LDCforam estimuladas com doses diferentes de RNA oligonucleotídeos e níveisde IFNa em sobrenadantes foram medidos por ELISA após cultura durante a noite (amostra em triplicata ± 1 SD). Complexos de PEI comoligonucleotídeos de poliU fosfodiéster (UM) ou fosforotioato (B) RNA de21-mer, 15-mer e 10-mer foram usados para estimulação de células. Aconcentração de RNA é descrita em μηιο^Γ para normalizar o peso molecularde oligonucleotídeos diferentes. Os dados são representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 3 mostra que modificações da cadeia principal afeta aatividade estimuladora de IFNa de oligonucleotídeos de poliU. As culturasvolumosas de C57BL/6 Flt3L-DC foram estimuladas com doses diferentes decomplexos de RNA oligonucleotídeo/PEI de 21-mer e níveis de IFNa em sobrenadantes foram medidos por ELISA após cultura durante a noite(amostra em triplicata ± 1 SD). (A) oligonucleotídeo de poliU fosfodiésterRNA (poliUo-21) foi comparado por oligonucleotídeo poliU fosfodiésterDNA (polidUo-21). (B) Similarmente, oligonucleotídeos poliU fosforotioatoRNA (poliUs21) e DNA (polidUs-21) foram usados para estimulação de Flt3L-DC. (C) as células foram tratadas com oligonucleotídeos poliU RNAcontendo fosforotioato (poliUs-21) ou modificações 2'-0-metil (poliA-21) dacadeia principal. Os dados são representativos de pelo menos trêsexperimentos independentes.

A Figura 4 mostra que a atividade estimuladora de oligonucleotídeos de RNA correlacionam-se com diversas porções de uridina,as que contém porções de uridina duplas ou triplas são mais estimuladoras doque as porções de uridina simples. (A-D) As culturas volumosas de C57BL/6Flt3L-DC foram estimuladas com doses diferentes de complexos de RNAoligonucleotídeo/PEI de 21-mer e níveis de IFNa em sobrenadantes forammedidos por ELISA após cultura durante a noite (amostra em triplicata ± 1SD). O PoliU fosforotioato RNA oligonucleotídeo (poliUs-21) serviu como oligando TLR7 de referência em todos os experimentos. Para a composição deoligonucleotídeos de 21-mer diferentes, ver a Tabela 1. Os dados sãorepresentativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 5 mostra que nem os oligonucleotídeos poliA, poliC,poliT RNA nem as porções riboespaçadoras induzem a indução de IFNa emFlt3L-DC. (A, B) As culturas volumosas de C57BL/6 Flt3L-DC foramestimuladas com doses diferentes de complexos de RNA

o oligonucleotídeo/PEI de 21-mer e níveis de IFNa em sobrenadantes forammedidos por ELISA após cultura durante a noite (amostra em triplicata ± 1SD). (A) PoliU (poliUs-21), poliA (poliAs-21), poliC (poliCs-21) e poliT(poliTs-21) fosforotioato RNA oligonucleotídeos foram usados paraestimulação de Flt3L-DC. (B) Indução de IFNa pelo oligonucleotídeo poliUhomopolimérico foi comparado pela indução de IFNa pelosoligonucleotídeos do compósito contendo uma mistura de porções de uridinae cistidina (SSD13), porções de uridina e riboespaçadoras (poliUespaçador)ou porções de cistidina e riboespaçadoras (poliCespaçador). Para acomposição de oligonucleotídeos de 21-mer diferentes, ver Tabela 1. Osdados são representativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 6 fornece uma representação esquemática daestrutura molecular de nucleotídeos de RNA e os análogos de nucleotídeoloxoribine e R848. (A) A descrição de um dímero que consiste de uridinaRNA nucleotídeos. As modificações da cadeia principal (DNA versus RNA,modificações de 2'-0-metil e fosforotioato) que foram testados são indicadosem azul e a base orgânica é realçada em cinza. (B) A representaçãoesquemática da estrutura de base orgânica das purina citosinas e timinarealçada em cinza. (C) A descrição da estrutura molecular de R848,loxoribina e um nucleotídeo de uridina. As porções que são compartilhadasentre as estruturas destas três moléculas e que são indicadas desempenhar umpapel no reconhecimento destes ligandos pelo TLR7 são realçados em cinza.

A Figura 7 mostra que os poliU RNA oligonucleotídeos sãofortes indutores de IFN" a partir do plasmacitóide DC diferente dos ligandosde TLR7 loxoribina e R848, que são melhores na indução de IL-6. As culturasvolumosas de C57BL/6 Flt3L-DC foram estimuladas com ligandos de TLR7diferentes e com o DNA oligonucleotídeo CpG 1668 (0,5 μηι/ml) estimularTLR9. Os ligandos TLR7 usados foram o RNA oligonucleotídeo poliUs-21 (1μg/ml) complexados com PEI e as imidazoquinolinas loxoribina (100 mM) eR848 (10 μg/ml). Todos os ligandos de TLR foram usados em doses, queinduzem os níveis máximos de produção de citocina pelo plasmacitóide DC.Níveis de IFNa (A) e IL-6 (B) em sobrenadantes foram medidos por ELISAapós cultura durante a noite (amostra em triplicata ± 1 SD). Os dados sãorepresentativos de pelo menos três experimentos independentes.

A Figura 8 mostra que os ligandos TLR7 induzem IFNa e IL-6 em plasmacitóide DC humanos. (A) As culturas de pDC humano foramestimuladas com doses diferentes (expressados em μπιο^Γ) de poliUs 21-merversus 1 μΜ de poliAs 21-mer, ambos como complexos de PEI. Os níveis deIFNa em sobrenadantes foram medidos por ELISA após a cultura durante anoite. (B) As culturas de pDC humano foram estimuladas com poliUs 21-mer(10 μΜ) como complexos de PEI versus poliAs 21-mer (10 μΜ) comocomplexos de PEI, RNA9.2DR (1 μΜ) como complexos de LyoVec e R848(1 μΜ). Os níveis de IFNa (B) e IL-6 (C) em sobrenadantes foram medidospor ELISA depois da cultura durante a noite. Os dados são a média daamostra em triplicata ± 1 SEM e são representativos de pelo menos trêsexperimentos independentes.

A Tabela 1 fornece um lista de oligonucleotídeos testados. Asligações de fosfodiéster (Uo), ligações de fosforotioato (Us, As, Cs, Gs, Ts),modificação 2'-0-metil (Um) e DNA oligos (dUs, dUo).Descrição Detalhada da Invenção

DEFINIÇÕES

A não ser de outra maneira definidos, todos os termoscientíficos e técnicos usados neste tem o mesmo significado como entendidocomumente por uma pessoa habilitada na técnica à qual esta invençãopertence.

Como usado neste, o termo "antígeno" refere-se a qualquermolécula capaz de ser reconhecida pelo receptor de antígeno e célula T oureceptor antígeno de célula Β. O termo amplamente inclui qualquer tipo demolécula que é reconhecida por um sistema imune do hospedeiro como sendoestranha. Antígenos geralmente incluem mas não limitam-se a células,extratos celulares, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos,polissacarídeo conjugados, peptídeo e imitações não peptídicas depolissacarídeos e outros moléculas, moléculas pequenas, lipídeos,glicolipídeos, polissacarídeos, carboidratos, vírus e extratos virais eorganismos multicelulares tais como parasitas e alergenos. Com respeito aosantígenos que são proteínas, polipeptídeos ou peptídeos, tais antígenos podemincluir moléculas de ácido nucleico que codifica tais antígenos. Antígenosmais especificamente incluem, mas não limitam-se a, antígenos canceriginos,que incluem células e moléculas cancerígenas expressadas em célulascancerígenas; antígenos virais, que incluem vírus e moléculas totais eatenuadas expressados em vírus; e alergenos.

Como usado neste, os termos "receptor semelhante a Toll" e,equivalentemente, "TLR" referido a qualquer membro de uma família de pelomenos onze receptores de mamífero altamente conservados de proteínas dereconhecimento padrão (TLR1-TLRl 1) que reconhecem padrões molecularesassociados ao patogênio (PAMPs) e atuam como elementos de sinalizaçãochave em imunidade inata. Os polipeptídeos TLR divide uma estrutura decaracterística que inclui um domínio extracelular (extracitoplásmico) que temrepetições ricas em leucina, um domínio transmembrana e um domíniointracelular (citoplásmico) que é envolvido em sinalização de TLR. TLRsincluem mas não são limitados um TLRs humano.

Como referido neste, "receptor semelhante a Toll-7," ou"TLR7," refere-se a divisão de ácidos nucleicos ou polipeptídeos pelo menos70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais identidade deseqüência para a seqüência TLR7 publicamente disponível, por exemplo,números de acessão GenBank AF240467 ou AAF60188, para TLR7 humanoou números de acessão GenBank AY035889 ou AAK62676, para TLR7O murino. Derivados e fragmentos de qualquer uma de tais seqüências tambémestão abrangidas. Os números de acessão GenBank para TLR7 humano sãofornecidos por AF240467 (SEQ ID N0 31) e AAF60188 (SEQ ID N0 32).

Como usado neste "sinalização de TLR " refere-se a umacapacidade de um polipeptídeo TLR, particularmente TLR7 e/ou TLR8, paraativar o caminho de sinalização de Toll/IL-IR (TIR), também referido nestecomo a transdução de sinais do caminho TLR. Mudanças nas atividades TLRpodem ser medidas, por exemplo, por ensaios projetados para medir aexpressão de genes sob controle de promotores sensíveis a NF-kB- eintensificadores. Tais genes podem ser naturalmente genes de ocorrência oupodem ser genes artificialmente introduzidos em uma célula. Naturalmentegenes repórter de ocorrência incluem os genes que codificam IL-I β, IL-6, IL-8, a subunidade p40 de interleucina 12 (IL-12 p40) e as moléculas co-estimuladoras CD80 e CD86. Outro genes podem ser colocados sob ocontrole de tais elementos reguladores e deste modo servem para reportar onível de sinalização de TLR.

Como usado neste, os termos "estimular" ou "ativação" comrespeito ao efeito dos oligonucleotídeos descritos neste em TLR7 ou TLR8refere-se a capacidade do oligonucleotídeo para ligar, diretamente ouindiretamente, ao presente TLR7 ou TLR8 na superfície ou em umacompartimento citoplasmático de uma célula, por exemplo, superfície deendosoma e para induzir a sinalização TLR. Qualquer diferença detectável nasinalização TLR pode indicar que um oligonucleotídeo estimula ou ativa umreceptor TLR7 ou TLR8. A diferença de sinalização pode ser manifestado emqualquer uma de diversas maneiras, incluindo mudanças na expressão degenes alvo, na fosforilação de componentes de transdução de sinais, nalocalização intracelular de elementos a jusante tal como NK-kB, naassociação de certos componentes (tal como IRAK) com outras proteínas ouestruturas intracelulares ou na atividade bioquímica de componentes taisΌ como cinases (tais como MAPK). Com respeito aos ensaios usados, umaalteração de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %,80 %, 90 %,100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 % ou mais em qualquer aspectoda sinalização TLR é indicativo da estimulação ou ativação.

O termo "ativar uma célula" como usado neste, significa fazercom que a célula aumente a expressão de uma ou mais citocina selecionadado grupo que consiste de IFNa, IL-6 e IL-12 p40.

Como usado neste, uma "quantidade efetiva " refere-se aqualquer quantidade que seja necessária ou suficiente para atingir oupromover um resultado desejado. Em alguns exemplos uma quantidade eficazé uma quantidade terapeuticamente efetiva. Uma quantidadeterapeuticamente efetiva é qualquer quantidade que seja necessária ousuficiente para promover ou atingir uma resposta biológica desejada em umpaciente. A quantidade efetiva para qualquer aplicação particular pode variardependendo de tais fatores como a doença ou condição sendo tratada, oagente particular sendo administrado, o tamanho do paciente ou a gravidadeda doença ou condição. Uma pessoa habilitada na técnica podemempiricamente determinar a quantidade efetiva de um agente particular semnecessidade de experimentação indevida.

Como usado neste, o termo "célula imune" refere-se a umacélula que pertence ao sistema imune. As células imunes incluem linfócitos T(células T), linfócitos B (células B), células matadoras naturais (NK),granulócitos, neutrófilos, macrófragos, monócitos, células dendríticas eformas especializadas de qualquer dos precedentes, por exemplo, célula dendrítica plasmocitóides, células de plasma, NKT, ajudante T, células Treguladoras, células delta gama T e linfócitos T citotóxicos (CTL).

Como usado neste, os termos "câncer" e, equivalentemente,"tumor" referido a uma condição em que células anormalmente replicantes deorigem hospedeira estão presentes em uma quantidade detectável no paciente. O câncer pode ser câncer maligno ou não maligno. Cânceres ou tumoresincluem mas não limitam-se a câncer do trato biliar; câncer do cérebro; câncerde mama; câncer cervical; coriocarcinoma; câncer do cólon; câncerendometrial; câncer do esôfago; câncer gástrico (estômago); neoplasmasintraepiteliais; leucemias; linfomas; câncer do fígado; câncer do pulmão (por exemplo, Célula pequena e célula não pequena); melanoma; neuroblastomas;câncer oral; câncer do ovário; câncer pancreático; câncer de próstata; câncerretal; (rim) câncer renal; sarcomas; câncer de pele; câncer testicular; câncer detireóide; bem como outros carcinomas e sarcomas. Os cânceres podem serprimários ou metastáticos.

Como usado neste, os termos "infecção" e, equivalentemente,"doença infecciosa" referido a uma condição em que um organismo ou agenteinfeccioso está presente em uma quantidade detectável no sangue ou no tecidoestéril normalmente ou compartimento estéril normalmente de um paciente.Organismos e agentes infecciosos incluem vírus, bactérias, fungos e parasitas. Os termos abrangem tanto infecções agudas quanto crônicas, bem comosepse.

Como usado neste, o termo "resposta imune inata" refere-se aqualquer tipo de resposta imune para certos padrões moleculares associadosao patogênio (PAMPs). Imunidade inata, que é também conhecida na técnicacomo imunidade natural ou nativa, envolve principalmente neutrófilos,granulócitos, fagócitos mononucleares, células dendríticas, células NKT ecélulas NK. Respostas imune inatas podem incluir, sem limitação, produçãode interferon do tipo I (por exemplo, IFN-alfa), ativação neutrófila, ativaçãode macrófago, fagocitoses, opsonização, ativação de complemento e qualquercombinação destes.

Como usado neste, "citocina" refere-se a qualquer uma devárias proteínas ou glicoproteínas solúveis que atuam nas células imunesatravés de receptores específicos que afetam o estado de ativação e função dascélulas imunes. Citocinas incluem interferons, interleucinas, fator de necrosede tumor, transformação do fator de desenvolvimento beta, fatoresestimuladores de colônia (CSFs), quimiosínteses, bem como outros. Váriascitocinas afetam a imunidade inata, imunidade adquirida ou ambas. Citocinasespecificamente incluem, sem limitação, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, TNF-a, TGF-β, fatorestimulador da colônia de granulócito (G-CSF) e fator estimulador da colôniade granulócito-macrófago (GMCSF). Quimiosínteses especificamenteincluem, sem limitação, IL-8, IP-10,1-TAC, RANTES, ΜΙΡ-Ια, MIP-I β, Gro-a, Gro-β, Gro-γ, MCP-1, MCP-2 e MCP-3.

Como usado neste, os termos "tratar," "terapia," ou"terapêutico," como usado em referência a um distúrbio, doença ou condiçãosignificam intervir em tal distúrbio, doença ou condição em uma maneira queé projetada para prevenir ou diminuir o desenvolvimento, para evitar,diminuir ou interromper a progressão ou para eliminar o distúrbio, doença oucondição. Estimará que o distúrbio, doença ou condição não necessitam defato ser interrompidos ou eliminados para um método a ser considerado umtratamento ou terapia. Os termos "prevenir" e "profilático" com respeito a umdistúrbio, doença ou condição são relatados para o tratamento, mas são usadoscom indivíduos que estão em risco de desenvolver o distúrbio, doença oucondição, mas que não apresentam qualquer sinais ou sintomas no período deadministração.

Os termos "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" são usadosintercambiabilidade para significar uma cadeia de ligação de nucleotídeosmúltiplos para um outro. O termo "nucleotídeo" como usado neste significauma molécula que compreende um açúcar ligado a um grupo de fosfato e poruma base orgânica permutável. Um nucleotídeo nos oligonucleotídeos destainvenção podem ser modificados nas porções de açúcar, fosfato e/ou base. Aporção de açúcar pode ser uma ribose, desoxiribose ou arabinose, preferivelmente uma ribose ou uma desoxiribose e mais preferivelmente umaribose. O açúcar também podem compreender outras modificações na posição2' (por exemplo, modificações de 2'-0-metila, modificações de 2'-0-metoxietila, modificações de 2'-amino, modificações de 2'-desoxi,modificações de 2'-halo tal como 2'-fluoro; combinações do acima, tal como modificações de 2'-desoxi-2'-fluoro) naqueles nucleotídeos. Entretanto, outrastais modificações de açúcar de 2' são limitadas aos nucleotídeos que não sãocruciais para agonismo TLR. Deste modo uma modificação de açúcar de 2'não está presente em qualquer nucleotídeo contendo uracila em uma regiãorica em U ou qualquer nucleotídeo contendo guanina em uma região rica em G dos oligonucleotídeos desta invenção. Mais preferivelmente, umamodificação de açúcar de 2' não está presente em qualquer nucleotídeo eregião rica em U ou rica em G do oligonucleotídeo. Moléculas de ácidonucleico podem ser obtidos a partir de fontes de ácido nucleico em existentes(por exemplo, genômico ou cDNA), mas são preferivelmente sintéticos (por exemplo, produzido pela síntese do ácido nucleico).

A porção base de um nucleotídeo é uma purina ou umapirimidina. Purinas e pirimidinas incluem mas não são limitadas anaturalmente bases de ocorrência, tal como adenina, citosina, guanina,timidina e uracila e bases quimicamente modificadas, tais como inosina, 2,4-diaminopurina; 2,6-diaminopurina; 2-alquil adenina; 2-alquil inosina; 2-amino purina; 2-amino-6-cloropurina; 2-halo purina; 2-tiocpirimidina; 4-tiouracila; 5-alquila (C1-C6) pirimidina; 5-alquenila (C2-C6) pirimidina; 5-alquinila (C2-C6) pirimidina; 5-(hidroximetil)uracila; 5- amino pirimidina; 5-halo pirimidina; 5-hidróxi pirimidina; 5-hidroximetil pirimidina; 6-azopirimidina; 6-metil purina; 7-deazapurina; 7-metil purina; 8-azapurina; outraspurinas de 8-substituídas; diidrouracila; hipoxantina; N2-dimetil purina;pseudouracila; deazapurina de 7 substituída; e xantina. Esta lista é entendidaser exemplar e não pode ser interpretada como limitante.

O grupo fosfato em um nucleotídeo presente nooligonucleotídeo desta invenção pode ser modificado por um outro fosforosocontendo porção capaz de ligar a um outro nucleotídeo. Tais gruposmodificados incluem um fosforamidato, um fosforotioato e umfosforoditioato. Uma ligação formada entre nucleotídeos nosoligonucleotídeos desta invenção por qualquer outra ligação do que porligações de fosfodiéster é denominado uma "ligação não natural."

Outras modificações são aquelas que podem estar presentes nonucleotídeo terminal 3' ou 5' de um oligonucleotídeo desta invenção e incluemuma extremidade de terminal 3' e/ou 5', uma ligação de terminal 3'-5' e umgrupo fosfato de terminal 5' ou grupo fosfato modificado.

Exemplos de uma extremidade 5' incluem, mas não limitam-seao, glicerila, resíduo abásico de desóxi invertido (porção); 4',5' metilenonucleotídeo; l-(beta-D-eritrofuranosil) nucleotídeo, 4'-tio nucleotídeo;nucleotídeo carbocíclico; 1,5-anidroexitol nucleotídeo; L-nucleotídeos; alfa-nucleotídeos; nucleotídeo de base modificada; ligação de fosforoditioato;treo-pentofuranosila nucleotídeo; acíclico 3',4'-seco nucleotídeo; acíclico 3,4-diidroxibutil nucleotídeo; acíclico 3,5 diidroxipentil nucleotídeo, 3-3'- porçãode nucleotídeo invertida; 3'-3'-porção abásica invertida; 3'-2'- porçãonucleotídeo invertida; 3'-2'-porção abásica invertida; 1,4-butanodiol fosfato;3'-fosforamidato; hexilfosfato; aminoexil fosfato; 3'- fosfato; 3'-phosphorotioato; fosforoditioato; ou porção de metilfosfonato ligado emponte ou não ligado em ponte.

Exemplos não limitantes de extremidade 3' incluem, mas nãolimitam-se a, glicerila, resíduo abásico desóxi invertido (porção), 4', 5'-metileno nucleotídeo; l-(beta-D-eritrofuranosil) nucleotídeo; 4'-tionucleotídeo, nucleotídeo carbocíclico; 5'-amino-alquil fosfato; 1,3- diamino-2-propil fosfato; 3-aminopropil fosfato; 6-aminoexil fosfato; 1,2-aminododecil fosfato; hidroxipropil fosfato; 1,5-anidroexitol nucleotídeo; L-nucleotídeo; alfa-nucleotídeo; nucleotídeo de base modificada;fosforoditioato; treopentofuranosil nucleotídeo; acíclico 3',4'-seconucleotídeo; 3,4 dibidroxibutil nucleotídeo; 3,5-diidroxipentil nucleotídeo, 5-5'- porção de nucleotídeo invertida; 5-5'- porção abásica invertida; 5'-fosforamidato; 5'-fosforotioato; 1,4 butanodiol fosfato; 5'-amino; 5-fosforamidato ligado em ponte e/ou não ligado em ponte, fosforotioato e/oufosforoditioato, metilfosfonato ligado em ponte ou não ligado em ponte eporções de 5'-mercapto (para mais detalhes ver Beaucage e Iyer, 1993,Tetrahedron 49, 1925; incorporado por referência neste).

O termo "nucleotídeo contendo uracila" como usado nesteabrange uracila e desoxiuracila e qualquer nucleotídeo contendo uma uracilamodificada. O termo " nucleotídeo contendo não uracila " como usado nestesignifica qualquer nucleotídeo que não compreende uracila ou uma uracilamodificada como uma base. O termo "nucleotídeo não contendo guanina"como usado neste significa qualquer nucleotídeo que não compreendeguanina ou guanina modificada como uma base.

Como usado neste, um gene codificador e um gene deseqüência de expressão são ditos serem operacionalmente ligados quandoestes são convalentemente ligados em uma tal maneira como para colocar aexpressão ou transcripção e/ou tradução da seqüência codificadora sob ainfluência ou controle da seqüência de expressão do gene. Duas seqüências deDNA são ditas serem operacionalmente ligadas se a indução de um promotorna seqüência de expressão do gene 5' resulta na transcrição da seqüênciacodificadora e se a natureza da ligação entre as duas seqüências de DNA não(1) resultam na introdução de uma mutação de estrutura-mudança, (2)interferem com a capacidade da região promotora de direcionar a transcriçãoda seqüência codificadora ou (3) interferem com a capacidade da transcriçãode RNA correspondente a ser traduzido em uma proteína. Deste modo, umgene de seqüência de expressão seria operacionalmente ligado a um genecodificador se a seqüência de expressão do gene for capaz de realizar atranscrição da seqüência codificadora tal que a transcrição resultante étraduzida na proteína ou polipeptídeo desejado.

A presente invenção fornece oligonucleotídeos novos,composições e métodos para estimular respostas imunes. A presente invençãoé baseada em estudos que envolve análises sistemáticas de oligonucleotídeosdiferentes com respeito à sua capacidade para estimular a sinalização mediadapor TLR, particularmente através de células dendríticas tais como céluladendrítica plasmocitóides e especificamente através do receptor TLR7.

Oligonucleotídeos, composições e métodos descritos neste sãoúteis para intensificar a estimulação imune in vitro e in vivo. Taisoligonucleotídeos, composições e métodos deste modo encontraram uso emum número de aplicações clínicas, incluindo agentes farmacêuticos e métodospara tratar ou prevenir condições tais como câncer ou doença infecciosas,particularmente infecções virais. Os oligonucleotídeos e composições dainvenção também podem ser usados em métodos para a preparação demedicamentos para uso no tratamento de tais condições. As composições dainvenção foram aproximadamente 30 vezes mais potentes em indução deIFNa por Flt3L-DC do que os compostos anti-virais de peso molecular baixoR848 e loxoribina que também foram relatados atuar por intermédio de TLR7e TLR8. Estimará que descritos neste oligonucleotídeos também podem serusados em ensaios para identificar moduladores de TLR7 ou TLR8, porexemplo, ativadores ou inibidores da sinalização de TLR7 ou TLR8 ou decélulas que expressam TLR7- ou TLR8-.

A presente invenção é baseada na surpreendente descobertaque o nucleotídeo uridina ou desoxiuridina é o elemento de controle essencialem que determina se ou não um oligonucleotídeo pode ativar TLR7. Deacordo, mesmo os oligonucleotídeos curtos, que compreendemoligonucleotídeos contendo uracila suficiente, em termos de número absolutode uridinas ou em termos de sua disposição dentro do oligonucleotídeo,podem ser usados para efetivamente estimular o receptores TLR7 in vivo ouin vitro.

Os oligonucleotídeos da invençãoEm uma forma de realização geral, a invenção fornece um oligonucleotídeo de filamento único que consiste dentre 10 e 50 nucleotídeos(por exemplo, que compreende 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos; preferivelmente entre 10 e 19nucleotídeos em comprimento, entre 15 e 30 nucleotídeos em comprimento, entre 19 e 50 nucleotídeos em comprimento, entre 15 e 21 nucleotídeos emcomprimento ou entre 21 e 30 nucleotídeos em comprimento; maispreferivelmente 15 ou 21 nucleotídeos em comprimento e maispreferivelmente 21 nucleotídeos em comprimento); e que compreende umaseqüência selecionada de: UUU-(X)n-UUU ou UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY,em que cada U é independentemente selecionado de um nucleotídeo contendouracila; cada X é independentemente selecionado de qualquer nucleotídeo; η éum número inteiro de 1 a 4; e ρ é um número inteiro maior do que 4; e em queo dito oligonucleotídeo compreende pelo menos um nucleotídeo não contendouracila ou pelo menos uma ligação não natural. Um tal oligonucleotídeoI demonstrará uma capacidade intensificada para estimular TLR7.Preferivelmente os oligonucleotídeos da invenção compreende uma extensãode pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 uridinas consecutivas.

Em uma forma de realização preferida, o dito oligonucleotídeocompreende a seqüência UUU-(X)n-UUU e η é 1. Em uma outra forma derealização preferida, o oligonucleotídeo compreende a seqüência (UUU-(X)n)m, em que η é um número inteiro de 1 a 4, mais preferivelmente 1; e m éum número inteiro maior do que 2, preferivelmente 3 ou 4. Em uma outraforma de realização preferida, o dito oligonucleotídeo compreende aseqüência Y(U)pY e ρ é um número inteiro maior do que 9. Em cada umadestas forma de realização descritas, é preferida que cada U é uridina.

Particularmente preferidos são um oligonucleotídeo 21-mercom um ou mais ligações de fosforotioato que consiste totalmente de uridinas(por exemplo, poliUs21); um 21-mer que compreende uma extensão de pelomenos 10 uridinas consecutivas (por exemplo, SSD30); e um 21-mer quecompreende a seqüência de UUXUUXUUXUUXUU, em que cada U éuridina e cada X é independentemente selecionado de qualquer nucleotídeo(por exemplo, SSD 28).

Geralmente, a proporção maior de nucleotídeo contendouracilas presente dentro de um oligonucleotídeo, a capacidade maior paraestimular TLR7. De acordo, em uma forma de realização preferida, ooligonucleotídeo de filamento único compreende pelo menos 50 %, 60 %, 70%, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % nucleotídeo contendouracilas. Preferivelmente, cada um dos nucleotídeo contendo uracilas éuridina. Em uma forma de realização particularmente preferida, ooligonucleotídeo é feito totalmente de uridinas e compreende pelo menos umaligação não natural.

Outros oligonucleotídeos preferidos incluem oligonucletídeos,opcionalmente com um ou mais ligações de fosforotioato, entre 10 e 50nucleotídeos em comprimento e que compreende uma extensão de pelo menosuridinas consecutivas; e um oligonucleotídeo que compreende a seqüênciade UUXUUXUUXUUXUU, em que cada U é uridina e cada X éindependentemente selecionado de qualquer outro nucleotídeo do que G(guanina), e outro do que C ou outro do que G e C.

Também foram descobertos que o teor de guanina dosoligonucleotídeos não é geralmente importante para atividade de TLR7. Deacordo, em uma forma de realização, o presente oligonucleotídeos podeconter menos do que 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % ou 5 % nucleotídeoscontendo guanina.

Um número de oligonucleotídeos que seguem a presenteexplicação e que são deste modo capazes de estimular TLR7 são mostradas naTabelai, particularmente poliUo-21, poliUo-15, poliUo-10, poliUs-21,poliUs-15, polidUo-21, polidUs-21, SSD8, SSD9, SSD10, SSD13, SSD14,SSD15, SSD21, SSD22, SSD23, SSD24, SSD28, SSD29 e SSD30. Qualquerdestes oligonucleotídeos ou variantes, derivados ou oligonucleotídeos maislongos que compreendem qualquer destes oligonucleotídeos, podem serusados.

Em uma outra forma de realização geral, a invenção forneceum oligonucleotídeo de filamento único que consiste dentre 11 e 50nucleotídeos (por exemplo, que compreende 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleotídeos; preferivelmente entre 10e 19 nucleotídeos em comprimento, entre 15 e 30 nucleotídeos emcomprimento, entre 19 e 50 nucleotídeos em comprimento, entre 15 e 21nucleotídeos em comprimento ou entre 21 e 30 nucleotídeos emcomprimento; mais preferivelmente 15 ou 21 nucleotídeos em comprimento emais preferivelmente 21 nucleotídeos em comprimento); e que compreendemuma seqüência selecionada de: GGG-(X)n-GGG, GG-X-GG-X-GG, ouI Z(G)pZ, em que cada G é independentemente selecionado de um nucleotídeocontendo guanina; cada X é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo; cada Z é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo que não guanina; η é um número inteiro de 1 a 4; e ρ é umnúmero inteiro maior do que 4, em que o dito oligonucleotídeo compreendepelo menos um nucleotídeo não contendo guanina ou pelo menos uma ligaçãonão natural. Estes oligonucleotídeos ricos em G representarão a capacidadeintensificada para agonizar TLR8.

Em uma forma de realização preferida, o dito oligonucleotídeoO compreende a seqüência de GGG-(X)n-GGG e η é 1. Em uma outra forma derealização preferida, o oligonucleotídeo compreende a seqüência (GGG-(X)n)m, em que η é um número inteiro de 1 a 4, mais preferivelmente 1; e m éum número inteiro maior do que 2, preferivelmente 3 ou 4. Em uma outraforma de realização preferida, o dito oligonucleotídeo compreende aseqüência Z(G)pZ e ρ é um número inteiro maior do que 9. Em cada umadestas formas de realização descritas, é preferido que cada G é guanosina.

Estimará que descritos neste oligonucleotídeos podem conternucleotídeos e outros do que aqueles que comunicam capacidade deestimulação de TLR7- ou TLR-8. Por exemplo, as seqüências de ativação deTLR7 (por exemplo, seqüências mostradas na Tabelai) ou seqüências deativação TLR-8 podem estar presentes em um oligonucleotídeo junto comoutros elementos de seqüência, por exemplo, seqüências projetadas curtaspara realçar estabilidade, para direcionar o alvejamento as células oucompartimentos intracelulares específicos, para realçar a ligação de váriasproteínas, etc. Em uma forma de realização, um oligonucleotídeo destainvenção adicionalmente compreenderá um ou mais dinucleotídeos CpG e sercapaz de agonizar TLR9 bem como TLR7 ou TLR8. Em uma outra forma derealização, um oligonucleotídeo desta invenção compreenderá tantoseqüências de ativação TLR-7 e quanto TLR-8 (isto é, um) uma seqüênciaI selecionada de UUU-(X)n-UUU ou UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY; e b) umaseqüência selecionada de GGG-(X)n-GGG, GG-X-GG-X-GG ou Z(G)pZ5 emque cada Χ, η e ρ é independentemente selecionado).

Até que os descritos nesta característica de seqüência sãosatisfeitos, os presente oligonucleotídeos são relativamente flexíveis emtermos da cadeia principal que ligam os nucleotídeos juntos. A modificaçãoda cadeia principal de fosfato dos oligonucleotídeos, por exemplo, podemintensificar sua estabilidade in vitro enquanto mantém-se a atividadeestimuladora de TLR7- e/ou TLR-8. Em uma forma de realização preferida, ooligonucleotídeo compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato.Particularmente em uma forma de realização preferida, todas as ligações sãofosforotioato. Outros ácidos nucleicos modificados incluem, inter alia,alquilfosfonato, arilfosfonato, alquilfosforotioato, arilfosforotioato,metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etóxi, morfolino ecombinações destes.

Em um outro exemplo, um oligonucleotídeo podeopcionalmente especificamente excluir uma seqüência (G)p em que pé 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, opcionalmente em que cada G é umdesoxiribonucleotídeo. Em um outro exemplo, um oligonucleotídeo podeopcionalmente especificamente excluir uma seqüência (U)p em que pé 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, opcionalmente em que cada U é um ribonucleotídeo. Emum outro exemplo, um oligonucleotídeo pode opcionalmente especificamenteexcluir uma seqüência selecionada do grupo que consiste de CUGU, UUGU,CUUU, UUUU, GUUGUUUU e GUUGU, opcionalmente em que cadanucleotídeo é um ribonucleotídeo.

Em formas de realização numerosas, os oligonucleotídeosserão formulados junto com outros componentes. Por exemplo, em uma formade realização preferida, o oligonucleotídeo é complexado com uma substânciacatiônica tal como PEI. Tais compostos podem ajudar a proteger osoligonucleotídeos contra degradação e também facilitar sua absorção emcélulas in vitro ou in vivo. Em outra forma de realização, um ou maisoligonucleotídeos serão formulados com um carreador farmacêutico, napreparação para o uso em um ajuste clínico.

Sínteses de oligonucleotídeos tendo seqüências específicas eque compreendem modificações da cadeia principal e/òu base é bemconhecido na técnica e facilmente realizada. Por exemplo, oligonucleotídeosque compreende qualquer seqüência desejada e incluindo qualquer um de umgrande número de modificações de cadeia principal ou de base podem ser preparados usando sintetizadores automatizados ou encomendado dosfornecedores comerciais. Geralmente, os ácidos nucleicos da invenção podemser sintetizados de novo usando o método β-cianoetil fosforamidita (BeaucageS L et al. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); ou o método de nucleosídeo H-fosfonato (Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler et al.(1986) Nucl Acid Res 14:5399-407; Garegg et al. (1986) Tetrahedron Lett27:4055-8; Gaffiiey et al. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22).

As cadeias principais modificadas tais como fosforotioatospodem ser sintetizadas usando técnicas automatizadas utilizando químicas defosforamidato ou H-fosfonato. Fosfonatos de aril- e alquil- podem ser feitos,por exemplo, como descrito em Patente U.S. 4.469.863; e alquilfosfotriésteres(em que a porção de oxigênio carregada é alquilada como descrito em PatenteU.S. 5.023.243 e Patente européia N°. 092.574) podem ser preparados pelasíntese de fase sólida automatizada usando reagentes comercialmentedisponíveis. Métodos para fabricação de outras modificações da cadeia principal de DNA e substituições tem sido descritos. Uhlmann E et al. (1990)Chem Rev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugated Chem 1:165.Submeter a capacidade dos oligonucleotídeos a ensaio para estimular TLR7 eTLR8

Os oligonucleotídeos da presente invenção podem serestimados in vitro por sua capacidade para estimular TLR7 em pDCs ou emoutros tipos de células usando qualquer uma variedade de ensaios. Taisensaios podem ser usados, inter alia, para testar derivados de seqüênciasfornecido neste ou para estimar seqüências novas projetadas de acordo com asexplicações da presente especificação por sua capacidade para estimularTLR7. Tais ensaios também podem ser usados para identificar outrosmoduladores de células que expressam TLR7, por exemplo, usando osdescritos neste oligonucleotídeos como padrões ou controles. Na estimulaçãoin vitro de pDCs são também úteis, por exemplo, para avaliação de pDCs ououtras células que expressam TLR7 a partir de um indivíduo. Por exemplo,pDCs podem ser removidos a partir de um paciente com câncer ou umadoença infecciosa e a capacidade para estimular os pDCs usando o presenteoligonucleotídeos estimado. Uma detecção que os pDCs podem serestimulados em tais ensaios indicam que um paciente é um candidatoadequado para métodos terapêuticos ou profiláticos que envolve aadministração dos oligonucleotídeos presentes.

Os oligonucleotídeos podem ser estimados in vitro para suacapacidade para estimular TLR8 em célula dendrítica mielóides (mDCs),monócitos ou CD4+, células T reguladoras CD25+ ("Treg") ou em outros tiposde células usando uma variedade similar de ensaios. Na estimulação in vitrodestes tipos de células é também úteis para avaliação da capacidade de umpaciente a ser imunoestimulado pelos oligonucleotídeos desta invenção.

Os presentes ensaios in vitro podem ser realizados com célulasisoladas que expressam naturalmente TLR7 ou TLR8 ou com células que nãoexpressam naturalmente o requisito TLR mas que expressam construções quecodificam TLR7 e/ou TLR8 foram introduzidos.

Em uma forma de realização a célula naturalmente expressaTLR funcional e é, por exemplo, por TLR7, uma célula B, monócito, pDC ououtros tipos de célula dendrítica; e por TLR8, um mDC, um monócito ou umacélula Treg. pDCs podem ser isolados a partir de, por exemplo, medula óssea,sangue ou baço usando métodos padrão (ver, por exemplo, Diebold et ai.(2004) Science 303:1529; Heil et al. (2004) Science 303/1526; Triantafilou etal. (2005) Eur J Immunol 35:2416; Lee et al. (2003) PNAS 100: 6646;

Hornung et al. (2005) Nature Med 11: 263; Pedido de Patente U.S N°. US2003/0232074; a divulgação de cada um que são nestes incorporados na suatotalidade). Também, células murinas adequadas que expressam TLR7incluem Flt3L-DCs isolados, por exemplo, a partir de progenitores de medulaóssea isolados a partir de C57BL/6, Balb/c, CBA, 129 ou outroscamundongos, por exemplo como podem ser obtidos a partir de Charles RiverUK. Em seres humanos, tipos de células adequadas que expressam TLR7também incluem plasmacitóide DC isolados recentemente de PBMC. Estalinha celular foi estabelecida a partir do sangue periférico de um homem de61 anos no período de diagnóstico de mieloma múltiplo (tipo IgG lâmbida)(Matsuoka Y et al. (1967) Proc Soc Exp Biol Med 125:1246-50, a divulgaçãototal que é incorporada neste por referência). E conhecido que células RPMI8226 secretam diversos outras quimiosínteses e citocinas incluindo IL-8, IL-10 e IP-IO em resposta aos ácidos nucleicos imunoestimuladores. A linhacelular RPMI 8226 foi observada responder a certas moléculas pequenasincluindo compostos de imidazoquinolina. Por exemplo, incubação de célulasRPMI 8226 com o composto de imidazoquinolina R848 (resiquimod)induzindo a produção de IL-8, IL-10 e IP-10. Recentemente foram relatadosque R848 media o seus efeitos imunoestimuladores através de TLR7 e TLR8.

As células dendríticas mielóides e monócitos para submeter oTLR8 a ensaio também podem ser isolados a partir de medula óssea, sangueperiférico ou tecido fetal. Células Treg são tipicamente isoladas a partir dosangue periférico (ver, Peng G. et al., (2005), Science 309, p. 1380-84). Vistoque o TLR8 não é funcional em camundongos, somente em linhas celulareshumanas são uma fonte de TLR8 funcional. Tais linhas celulares incluemTIL102, TIL 164 e THP-1.

Qualquer uma grande variedade de tipos de células podem serfeitas para expressar TLR7 ou TLR8 para o propósito dos presentes ensaios.Por exemplo, fibroblastos humanos 293 (ATCC CRL-1573), que nãoexpressam TLR7 ou TLR8, podem ser usados. Tais células podem sertransitória ou estavelmente transferidas com vetor de expressão adequados(ou vetores) a fim de produzir células que expressam TLR7 ou TLR8. Talcélula HEK-293 estavelmente transferida são comercialmente disponíveis(InvivoGen, San Diego, CA). Em uma forma de realização, células podem serusadas que normalmente expressam TLR7 ou TLR8, embora em um nívelsignificantemente menor do que na presença da construção da expressãocorrespondente, a construção de expressão que codifica TLR7- ou TLR-8podem ser feitos usando métodos biológicos moleculares padrão, tipicamenteincluindo seqüências reguladoras capazes de conduzir constutivamente aexpressão de seqüências codificadoras operacionalmente ligadas e umaseqüência codificadora que codifica todos ou partes de TLR7 ou TLR8. Taisvetores são padrão na técnica e são descritos, por exemplo, em MolecularCloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al.; Cold Spring HarborLaboratory Press; 3rd edição (January 15, 2001) ou Short Protocols inMolecular Biology (Ausubel et al;, Current Protocols; 5a edição (18 deOutubro de 2002), cada um que é incorporado neste por referência na suatotalidade.

Promotores de mamíferos constitutivos que podem ser usadospara conduzir a expressão TLR7 ou TLR8 incluem, mas não limitam-se a, ospromotores para os seguintes genes: hipoxantina fosforibosil transferase(HPRT), adenosina deaminase, piruvato cinase, promotor β-actina e outrospromotores constitutivos. Os promotores virais exemplares que funcionamconstitutivamente em células eucarióticas incluem, por exemplo, promotoresde citomegalovírus (CMV), vírus símian (por exemplo, SV40), víruspapiloma, adenovírus, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus dosarcoma de Rous, as repetições de terminal longo (LTR) de vírus de leucemiade Moloney e outros retrovírus e o promotor de timidina cinase de vírussimples do herpes. Outros promotores constitutivos são conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Os promotores úteis como seqüência de expressão do genes dainvenção também incluem promotores indutíveis. Os promotores indutíveissão expressados na presença de um agente de indução. Por exemplo, opromotor metalotioneina é induzido para promover transcrição e tradução na presença de certos íons metálicos. Outros promotores indutíveis sãoconhecido por aqueles habilitados na técnica.

Ácido nucleico e seqüências de aminoácido para TLR7 eTLR8 humanos e outras espécies são disponíveis a partir dos bancos de dadospúblicos tal como GenBank. Por exemplo, ácido nucleico e seqüências de aminoácido para TLR7 humano (hTLR7) podem ser obrservada como númerode acessão do GenBank AF240467 (nucleotídeo que ampliam a regiãocodificadora 135-3285) e AAF60188, respectivamente. Acido nucleico eseqüências de aminoácido para TLR7 murino (mTLR7) podem serobservados como número de acessão do GenBank AY035889 (nucleotídeo que ampliam a região codificadora 493201) e AAK62676, respectivamente.

Tipicamente, as células que expressam TLR introduzirá em umrecipiente adequado, por exemplo, placas de 96 reservatórios, junto com ooligonucleotídeo e cultura média apropriada. Tipicamente, umoligonucleotídeo candidato será testado em paralelo em concentrações diferentes para obter uma resposta diferente à várias concentrações.Tipicamente, uma destas concentrações servem como um controle negativo,isto é, em concentração zero de agente ou em uma concentração de agenteabaixo dos limites de detecção do ensaio.

A ordem da adição do componentes, temperatura deincubação, tempo de incubação e outros parâmetros do ensaio podem serrealmente determinados. Tal experimentação meramente envolve otimizaçãodos parâmetros do ensaio, e não a composição fundamental do ensaio.Temperaturas de incubação tipicamente são entre 4o C e 40° C, maistipicamente cerca de 37° C. O tempo de incubação preferivelmente sãominimizados para facilitar a avaliação de resposta alta rápida e tipicamentesão entre 1 minuto e 48 horas.

Uma variedade de outros reagentes podem ser incluídos namistura. Estes incluem reagentes tais como sais, tampões, proteínas neutras(por exemplo, albumina), detergentes, etc. que podem ser usados para facilitara ligação de proteína-proteína e/ou ácido nucleico-proteína ótima. Um talreagente também pode reduzir interações não específicas ou cadeia principalde componentes de reação. Outros reagentes que melhoram a eficiência doensaio tal como inibidores de protease, inibidores de nuclease, agentesantimicrobianos e outros também podem ser usados.

Após a incubação (por exemplo, 18 a 20 horas), a ativação (ounecessidade desta) de uma célula pode ser estimada usando qualquer grandenúmero de métodos potenciais. Ensaio para detectar a ativação de TLR7 eTLR8 são descritos, inter alia, em Diebold et al. (2004) Science 303:1529;Heil et al. (2004) Science 303/1526; Triantafilou et al. (2005) Eur J Immunol35:2416; Lee et al. (2003) PNAS 100: 6646; Hornung et al. (2005) NatureMed 11: 263; Pedido de Patente U.S N°. US 2003/0232074; a divulgação decada um que são neste incorporados na sua totalidade.

Em uma forma de realização preferida, o nível de citocinasresponsivas aos TLR7- ou TLR8- é medida na cultura média seguindo aincubação de células com os oligonucleotídeos. Por exemplo, o sobrenadantepode ser isolado seguindo a incubação e o nível de uma citocina tal comoIFNa, IL-6 ou IL-12 p40 (ou qualquer outra citocina adequada conhecida porser induzida como um resultado de sinalização de TLR7 ou TLR8) pode serdeterminada usando, por exemplo, sanduíche de ELISA.

A estimulação de TLR7 e TLR8 pode ser estimada usandoqualquer um de diversos sistemas de leitura possíveis, mais com base em umcaminho de transdução de sinal TLR/IL-1R, que envolve, por exemplo,MyD88, TRAF, IRAK4, p38, e/ou ERK (Hcker H et al. (1999) EMBO J.18:6973-82). Estes caminhos ativam a cinase incluindo o complexo de cinaseKB e cinases terminal N c-Jun. A ativação de TLR7 e TLR8 pode serestimada por examinar qualquer aspecto da sinalização TLR. Por exemplo, aativação da sinalização de TLR dispara as alterações das associações deproteína-proteína (por exemplo, IRAK com MyD88 e/ou TRAF6), ematividade de proteína (por exemplo, atividade cinase de proteína tal comoTAK-1), em localização intracelular de proteínas (tal como movimento deNK-kB nos núcleos) e em expressão de gene (por exemplo, em expressão degenes sensível NKkB) e produção de citocina (por exemplo, produção esecreção de IFNa, IL-6 e/ou IL-12 p40). Qualquer alteração pode serdetectada e usada para detectar a ativação de TLR7 ou TLR8. Particularmenteem uma forma de realização preferida, a estimulação de TLR7 é detectadapela coleta dos sobrenadantes após 18 a 20 horas de níveis de cultura emedida de IFNa, IL-6 e/ou IL-12 p40 por sanduíche de ELISA. Em uma outraforma de realização preferida, a estimulação TLR8 é detectada pela coleta desobrenadante após 18 a 20 horas de níveis de cultura e medida de IL-6, TNF-α e/ou IL-12 p40 por sanduíche de ELISA.

Em uma outra forma de realização, células são usadascontendo uma construção repórter que causam a expressão de um produto dogene detectável na estimulação de TLR7 ou TLR8 e conseqüente a ativaçãodos caminhos de transdução de sinais. Genes repórter e construções de genesrepórter particularmente úteis para o ensaio incluem, por exemplo, um generepórter operativamente ligado a um promotor sensível a NF-kB. Exemplosde tais promotores incluem, sem limitação, aqueles por IL-I β, IL-6, IL-8, IL-12 ρ40, IP-10, CD80, CD86 e TNF-α. Os genes repórter operativamenteligados ao promotor sensível TLR podem incluir, sem limitação, uma enzima(por exemplo, luciferase, alcalina fosfatase, β-galactosidase, cloranfenicolacetiltransferase (CAT), etc.), um marcador de bioluminescência (por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP, por exemplo, Patente U.S.5.491.084), proteína fluorescente azul (BFP, por exemplo, Patente U.S.6.486.382), etc.), uma molécula expressada de superfície (por exemplo,CD25, CD80, CD86) e uma molécula secretada (por exemplo, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 p40, TNF-α.). Ver, por exemplo, Hcker H et al. (1999) EMBO J. 18:6973-82; Murphy TL et al. (1995) Mol Cell Biol 15:5258-67, a divulgaçãoque são incorporadas neste por referência. Plasmídeos repórteres desinalização de TLR são comercialmente disponíveis (InvivoGen, San Diego,CA).

Em ensaios que contam com a leitura da atividade da enzima, o substrato pode ser fornecido como parte do ensaio e a detecção podeenvolver medições de quimioluminescência, fluorescência, desenvolvimentode cor, incorporação do rótulo radioativo, resistência ao medicamento,densidade óptica ou outros marcadores da atividade de enzima. Para ensaioque contam com a expressão de superfície de uma molécula, a detecção pode ser realizada usando análises de citometria de fluxo (FRCS) ou ensaiofuncional. Moléculas secretadas podem ser submetidas a ensaio usando ensaioimuno-absorvente ligado por enzima (ELISA) ou bioensaio. Qualquer destes eoutros sistemas de leitura adequados são bem conhecido na técnica e sãocomercialmente disponíveis. Preferivelmente, o sistema repórter, seja qual for usado, é quantificável.

Oligonucleotídeos são ditos serem estimuladores se estesinduzirem qualquer alteração detectável no marcador usado para estimar aatividade mediada por TLR7- ou TLR8-. Por exemplo, o oligonucleotídeopode causar uma alteração na expressão, atividade, fosforilação, secreção, etc.do marcador de 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %,90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, 1000 % ou maior.

Os oligonucleotídeos descritos neste podem ser usados em taisensaios para identificar moduladores novos de células que expressam TLR7e/ou TLR7-. No geral, os métodos de avaliação envolvem o ensaio doscompostos que inibem ou intensificam a sinalização através de TLR7. Osmétodos utilizam TLR7, um ligando de referência adequada por TLR (porexemplo, um dos oligonucleotídeos descritos neste tal como poliUs-21) e umcomposto de modulação candidato. Tipicamente, o TLR7 é contatado com areferência de oligonucleotídeo e um sinal de referência mediado por TLR émedido. O TLR selecionado também é contatado com o composto candidato eum sinal de teste mediado por TLR é medido. O sinal de teste e o sinal dereferência são então comparados. Um composto candidato favorável pode sersubseqüentemente usado como um composto de referência no ensaio. Taismétodos são adaptáveis à avaliação de resposta alta automatizada deseqüências candidato e modificações de oligonucleotídeo. Exemplos de taismétodos de avaliação de resposta alta são descrito em Patente U.S. 6.103.479;6.051.380; 6.051.373; 5.998.152; 5.876.946; 5.708.158; 5.443.791;5.429.921; e 5.143.854. Em uma maneira idêntica, a ativação TLR-8 deoligonucleotídeos desta invenção pode ser usada para identificar moduladoresde células que expressam TLR8 e/ou TLR8.

Composições

A invenção fornece composições que compreende uma oumais dos oligonucleotídeos desta invenção e um carreador aceitável.Preferivelmente, uma composição desta invenção compreende umaquantidade eficaz de a) um oligonucleotídeo de filamento único que consistedentre i) 10 e 50 nucleotídeos e que compreende uma seqüência selecionadade: UUU-(X)nULnJ ou UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY, em que: cada U éindependentemente selecionado de um nucleotídeo contendo uracila; cada X éindependentemente selecionado de qualquer nucleotídeo; η é um númerointeiro de 1 a 4; e ρ é um número inteiro maior do que 4; ou ii) 11 e 50nucleotídeos e que compreende uma seqüência selecionada de: GGG-(X)n-GGG5 GG-X-GG-X-GG ou Z(G)pZ, em que: cada G é independentementeselecionado de um nucleotídeo contendo guanina; cada X éindependentemente selecionado de qualquer nucleotídeo; cada Z éindependentemente selecionado de qualquer nucleotídeo que não guanina; η éum número inteiro de 1 a 4; e ρ é um número inteiro maior do que 4; e b) umcarreador farmaceuticamente aceitável (uma "composição farmacêutica").

As soluções farmaceuticamente aceitáveis tipicamente contémconcentrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes e tamponação,conservantes, carreadores compatíveis, adjuvantes e opcionalmente outrosingredientes terapêuticos. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis,adjuvantes e veículos que podem ser usados nas composições farmacêuticasúteis nesta invenção incluem, mas não limitam-se a, trocadores de íons,alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas do soro, tal como albuminade soro humano, substâncias de tampões tais como fosfatos, glicina, ácidosórbico, sorbato de potássio, misturas glicerídeos parciais de ácidos graxosvegetáveis saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina,fosfato de hidrogênio de sódico, fosfato de hidrogênio de potássio, cloreto desódio, sais de zinco, sílica coloidal, trisilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substância com base celulose, polietileno glicol,carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco depolietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e gordura de lã.

Para uso na terapia, uma quantidade eficaz do composto podeser administrado para um paciente por qualquer modo permitindo o compostoa ser absorvido pelas células alvo apropriadas, por exemplo, pDCs,monócitos, mDCs, células Treg. A "administração" da composiçãofarmacêutica da presente invenção pode ser realizada por quaisquer meiosconhecidos pela pessoa habilitada na técnica. As composições da presenteinvenção podem ser administrados oralmente, parenteralmente, porpulverização de inalação, topicamente, transdermicamente, retalmente,nasalmente, bucalmente, sublingualmente, vaginalmente ou por intermédio de um reservatório implantado. O termo "parenteral" como usado neste incluiinjeção subscutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-sinovial,intrasternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracranial ou técnicasde infusão. Preferivelmente, as composições são administradas oralmente,intraperitoneamente ou intravenosamente. Uma injeção pode estar em um bolo ou em uma infusão contínua. Vários métodos de preparação eadministração de agentes terapêuticos são bem conhecidos na técnica e sãomostrados, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences 15aEdição, a divulgação total é incorporada neste por referência.

As composições farmacêuticas são preferivelmentepreparadas e administradas em unidades de dose. Tais métodos preparativosincluem a etapa de ligação em associação com a molécula para seradministrado ingrediente tal como o carreador que constitui um ou maisingredientes suplementares. No geral, as composições são preparadas porligações uniformemente e intimamente em associação com os ingredientes ativos como carreadores líquidos, lipossomas ou carreadores sólidosfinamente divididos ou ambos se necessária a formação do produto.

As unidades de dose líquidas são frascos ou ampolas parainjeção ou outra administração parenteral. As unidades de dose sólidas sãotabletes, cápsulas, pós e supositórios. Para tratamento de um paciente, dependendo da atividade do composto, maneira de administração, propósitoda administração (isto é, profilático ou terapêutico), natureza e gravidade dodistúrbio, idade e peso corporal do paciente, doses diferentes podem sernecessárias. A administração de uma dose dada pode ser realizada tanto naadministração simples na forma de uma unidade de dose individual quanto emdiversas unidades de doses menores. A administração repetida e múltipla dedoses em intervalos específicos de dias, semanas ou meses à parte tambémsão abrangidos pela invenção. A concentração dos compostos incluem ascomposições usadas nos métodos da invenção podem variar de cerca de 1 nMa cerca de 100 μΜ. As doses efetivas são acreditadas para variar de cerca de10 picomol/kg a cerca de 100 micromol/kg.

As composições adequadas da presente invenção paraadministração oral pode estar presente como unidades distintas tais comocápsulas, sachês ou tabletes cada um contendo uma quantidade pré-determinada de ingredientes ativos; como um pó ou grânulos; como umasolução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso;ou como uma emulsão líquida óleo-em-água ou uma emulsão líquida água-em-óleo ou embalado em lipossomas e como um bolo, etc. Cápsulas moles degelatina podem ser úteis para suspensões contendo tal, que podem beneficiaro aumento da taxa de absorção do composto.

Um tablete pode ser feito pela compressão ou moldagem,opcionalmente com um ou mais ingredientes suplementares. Os tabletescomprimidos podem ser preparados pela compressão em uma máquinaadequada dos ingredientes ativos em uma forma de fluxo livre tal como umpó ou grânulos, opcionalmente misturado com um aglutinante, lubrificante,diluente inerte, conservante, agente ativo de superfície ou dispersão. Tabletesmoldados podem ser feitos pela moldagem em uma máquina adequada emuma mistura de composto em pó umidificado com um diluente líquido inerte.Os tabletes opcionalmente podem ser revestidos ou marcados e podem serformulados a fim de fornecer liberação lenta ou controlada do ingredienteativo neste. Os métodos de formulação tais composições de liberação lenta oucontrolada de ingredientes farmaceuticamente ativo, tal como aquele neste eoutros compostos conhecidos na técnica, são conhecido na técnica e descritoem diversas Patentes US publicadas, algumas incluem, mas não limitam-se a,Patente U.S. 4.369.172; e 4.842.866 e referências citadas neste. Osrevestimentos podem ser usados para liberação de compostos ao intestino(ver, por exemplo, Patente U.S. 6.638.534, 5.217.720 e 6.569.457, 6.461.631,6.528.080, 6.800.663 e referências citadas neste).

Nos casos de tabletes para uso oral, os carreadores que sãocomumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes delubrificação, tal como estearato de magnésio, são também tipicamenteadicionados. Para administração oral em uma forma de cápsula, diluentesúteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas sãoadministradas oralmente, o ingrediente ativo é combinado com agentesemulsificantes e suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes e/ouflavorizantes e/ou corantes podem ser adicionados. O sobrenadante tal comolauril sulfato de sódio pode ser útil para realçar dissolução e absorção. Ascomposições adequadas para administração oral incluem losangos que compreendem os ingredientes em uma base flavorizada, usualmente sacarosee acácia ou tragacanto; e pastilhas que compreendem o ingrediente ativo emuma base inerte tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.

As composições adequadas para administração parenteralincluem soluções de injeção estéril aquosa e não aquosa que podem conteranti-oxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que rendem a formulaçãoisotônica com o sangue do recipiente pretendido; as suspensões estéreisaquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentesespessantes. As formulações podem estar presentes em recipientes de doseúnica ou dose múltipla, por exemplo, ampolas e frascos selados e podem serarmazenado em uma condição secada por congelamento (Iiofilizado)requerido apenas em adição do carreador líquido estéril, por exemplo águapara injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões de injeçãoextemporâneos podem ser preparados a partir de pós estéreis, grânulos etabletes.Tais soluções de injeção podem estar na forma, por exemplo,de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Esta suspensão podeser formulada de acordo com as técnicas conhecidas na técnica usandoagentes dispersantes ou de umectação adequados (tal como, por exemplo,Tween 80) e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril tambémpode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ousolvente parenteralmente aceitável não tóxico, por exemplo, como umasolução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis quepodem ser utilizados são manitol, água, solução de Ringer e solução decloreto de sódio isotônico. Além disso, estéril, óleos fixados sãoconvencionalmente utilizados como um solvente ou suspensão média. Paraeste propósito, qualquer óleo fixado brando pode ser utilizado incluindomono- ou diglicerídeos sintéticos. Ácidos graxos, tais como ácidos oléicos eseus derivados de glicerídeo são úteis na preparação de injetáveis, como sãoóleos farmaceuticamente aceitável naturais, tal como óleo de oliva ou óleo demamona, especialmente na suas versões polioxietilada. Estas soluções esuspensões oleosas também pode conter um diluente ou dispersante de álcoolde cadeia longa tal como Ph. Helv ou um álcool similar.

As composições farmacêuticas desta invenção podem seradministradas na forma de supositórios para administração retal ou vaginal.Estas composições podem ser preparadas misturando um composto destainvenção com um excipiente não irritante adequado que é sólido natemperatura ambiente mas líquida na temperatura retal e portanto fundirá noreto para liberação dos componentes ativos. Tais materiais incluem, mas nãolimitam-se a, tampão de cacau, cera de abelha e polietileno glicóis.

Administração tópica das composições farmacêuticas destainvenção é especialmente útil quando o tratamento desejado envolve áreas ouórgãos rapidamente acessíveis pela aplicação tópica. Para aplicaçãotopicamente à pele, a composição farmacêutica será formulada com umungüento adequado contendo componentes ativos colocados em suspensão oudissolvidos em um carreador. Carreadores para administração tópica doscompostos desta invenção incluem, mas não limitam-se a, óleos minerais,petróleo líquido, petróleo branco, propileno glicol, composto de polioxietilenopolioxipropileno, cera de emulsificação e água. Alternativamente, acomposição farmacêutica pode ser formulada com uma loção ou cremeadequados contendo o composto ativo colocado em suspensão ou dissolvidoem um carreador. Carreadores adequados incluem, mas não limitam-se a, óleomineral, monostearato de sorbitano, polisorbato 60, cera de ésteres cetílico," 0 álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água. As composiçõesfarmacêuticas desta invenção também podem ser topicamente aplicadas aotrato intestinal inferior pela formulação de supositório retal ou em umaformulação enema adequada. Os emplastos topicamente transdérmicos eadministração iontoforética são também incluídas nesta invenção.

As composições farmacêuticas desta invenção podem seradministradas por aerossol ou inalação nasal. Tais composições sãopreparadas de acordo com as técnicas bem conhecido na técnica daformulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em salina,utilizando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para realçar agentes de biodisponibilidade, fluorcarbonos, e/ououtros de solubilização ou dispersão conhecidos na técnica. Formulaçõesaerossol que também são utilizados nos métodos desta invenção tambémincluem aqueles descritos em Patente Estados Unidos 6.811.767, a divulgaçãoque é incorporada neste por referência.

As composições podem ser administradas por si (puras) ou naforma de um sal farmaceuticamente aceitável. Quando usado na medicina ossais podem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas não sais farmaceuticamenteaceitáveis pode convenientemente ser usado para preparar saisfarmaceuticamente aceitáveis destes. Tais sais incluem, mas não limitam-se a,aqueles preparados dos seguintes ácidos: clorídrico, bromídrico, sulfurico,nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-tolueno sulfônico, tartárico,cítrico, metano sulfônico, fórmico, malônico, succínico, naftaleno-2-sulfônicoe benzeno sulfônico. Também, tais sais podem ser preparados como sais demetal alcalino ou alcalinos terrosos, tais como sais de sódio, potássio oucálcio do grupo ácido carboxílico.

Os agentes de tamponação incluem: ácido acético e um sal (1 a2 % p/v); ácido cítrico e um sal (1 a 3 % p/v); ácido bórico e um sal (0,5 a 2,5% p/v) e ácido fosfórico e um sal (0,8 a 2 % p/v), os conservantes adequadosincluem cloreto de benzalcônio (0,003 a 0,03 % p/v); clorobutanol (0,3 a 0,9% p/v); parabenos (0,01 a 0,25 % p/v) e timerosal (0,004 a 0,02 % p/v).

Outros sistemas de liberação podem incluir sistemas deliberação de liberação por tempo, liberação atrasada, ou liberação sustentada(coletivamente referido neste como "dispositivos de liberação demedicamento implantáveis"). Tais sistemas podem evitar as administraçõesrepetidas dos compostos, aumentando a conveniência ao paciente e aomédico. Quaisquer tipos de sistemas de liberação estão disponíveis econhecidos por aqueles habilitados na técnica. Estes incluem sistemas combase em polímero, tais como poli(lactídeo-glicolídeo), copolioxalatos,policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido poliidroxibutírico epolianidridos. As microcápsulas dos polímeros precedentes contendomedicamentos são descritos, por exemplo, na Patente U.S. 5.075.109. Ossistemas de liberação também incluem sistemas não poliméricos que são:lipídeos incluindo esteróis, tais como colesterol, ésteres de colesterol e ácidosgraxos ou ácidos neutros, tais como mono-, di- e tri-glicerídeos; sistemas deliberação de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas com base em peptídeo;revestimentos de cera; tabletes comprimidos usando-se aglutinantes eexcipientes convencionais; implantes parcialmente fundidos e outros. Osexemplos específicos incluem, mas não limitam-se a: (a) sistemas erosionaisem que um agente da invenção está contido em uma forma dentro de umamatriz, tal como aquele descrito na Patente U.S. 4.452.775, 4.675.189 e5.736.152 e (b) sistemas bifusionais em que um componente ativo permeadoem uma taxa controlada a partir de um polímero, tal como descrito na PatenteU.S. 3.854.480, 5.133.974 e 5.407.686. Além disso, sistemas de liberação deequipamento com base em bomba podem ser usados, alguns dos quais sãoadaptados para o implante.

Deste modo, de acordo com outra forma de realização, ainvenção fornece um método de impregnar ou encher um dispositivo deliberação de medicamento implantável que compreende a etapa de contatar odito dispositivo de liberação de medicamento com um oligonucleotídeoagonista de TLR ou uma composição que compreende um oligonucleotídeoagonista de TLR desta invenção.

De acordo com outra forma de realização, a invenção forneceum dispositivo de liberação de medicamento implantável impregnado com oucontendo um oligonucleotídeo agonista de TLR ou uma composição quecompreende um oligonucleotídeo agonista de TLR desta invenção, tal que odito agonista de TLR é liberado do dito dispositivo e é terapeuticamente ativo.

Os presentes oligonucleotídeos também podem seradministrados (ou usados in vitro) junto com outros compostos projetadospara realçar sua capacidade de atingir ou entrar nas células, para aumentar suaestabilidade in vivo ou para outros propósitos. Em um tal forma de realizaçãopreferida, os oligonucleotídeos são complexados com um composto catiônico,tal como polietilenoimina (PEI), que liga-se e compacta os ácido nucleicos,protegendo-os da degradação e facilitando sua entrada nas células (ver, porexemplo, Boussif et ai. (1995) PNAS 92: 7297; Godbey (1999) PNAS 96:5177). Será estimado que, enquanto o PEI é preferido, outros agentes decompactação ou substâncias catiônicas também podem ser usadas.

Os agentes de compactação também podem ser usadossozinhos ou em combinação com, um vetor biológico ou químico/físico. Um"agente de compactação", como usado neste, refere-se a um agente, tal comouma histona, que neutralizas as cargas negativas no ácido nucleico e dessemodo permite a compactação do ácido nucleico em um grânulo fino. ACompactação do ácido nucleico facilita a absorção do ácido nucleico pelacélula alvo. Os agentes de compactação podem ser usados sozinhos, isto é,para a liberação de um ácido nucleico em uma forma que é mais eficazmenteabsorvido por uma célula ou, mais preferivelmente, em combinação com umou mais dos vetores descritos acima.

Em outras formas de realização, os oligonucleotídeos sãocomplexados com lipossomas. As lipossomas são úteis, inter alia, em queestes podem ser alvejados a um tecido particular pela ligação ao lipossoma aum ligando específico tal como um anticorpo monoclonal, açúcar,glicolipídeo ou proteína. Os ligandos que podem ser úteis para alvejar um lipossoma a uma célula imune incluem, mas não limitam-se a: moléculasintactas ou fragmentos de moléculas que interagem com receptores emoléculas específicos de célula imune, tais como anticorpos, que interagemcom marcadores de superfície celular de células imunes. Tais ligandos podemser facilmente identificados pelo ensaio de ligação bem conhecido por aqueles habilitados na técnica.

As lipossomas estão em duas classes amplas. Os lipossomascatiônicos são lipossomas positivamente carregados que interagem com asmoléculas de ssRNA carregados negativamente para a formação de umcomplexo estável. O complexo de ssRNA/lipossoma positivamente carregado liga-se à superfície celular negativamente carregada e é internalizado em umaendossoma. Devido ao pH ácido dentro da endossoma, a lipossomas sãorompidas, liberando seus conteúdos em um citoplasma celular (Wang et at.,Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

As lipossomas que são sensíveis ao pH ou negativamentecarregados, aprisionam ssRNA em vez do complexo com este. Visto que tantoo ssRNA quanto o lipídeo são similarmente carregados, repulsão em vez daformação de complexo ocorrer. O ssRNA é, deste modo, aprisionado nointerior aquosos destas lipossomas. Os lipossomas sensíveis ao pH foramusados, por exemplo, para liberar o ssRNA que codifica o gene de timidinacinase às monocamadas celulares na cultura (Zhou et al., Journal ofControlledRelease, 1992, 19, 269-274).

Um tipo principal de composição de lipossoma incluifosfolipídeos outro que não fosfatidilcolina. As composições de lipossomasneutras, por exemplo, podem ser formadas a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMP,C) ou dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC). Ascomposições de lipossoma aniônicas são, no geral, formadas de dimiristoilfosfatidilglicerol, enquanto as lipossomas fusogênicas aniônicas são formadasprimariamente a partir de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Um outrotipo de composição lipossômica é formada a partir de fosfatidilcolina (PC) talcomo, por exemplo, PC de soja PC e PC de ovo. Um outro tipo é formado apartir de misturas de fosfolipídeos e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.

Os lipossomas que incluem ácidos nucleicos foram descritos,por exemplo, em Thierry et al., WO 96/40062 (métodos para encapsularácidos nucleicos de peso molecular alto em lipossomas); Tagawa et al.,Patente U.S. 5.264.221 (lipossomas ligadas à proteína contendo RNA);Rahman et al., Patente U.S. 5.665.710 (métodos de encapsularoligodesoxinucleotídeos em lipossomas); Love et al., WO 97/04787(lipossomas que incluem oligonucleotídeos anti-sentido).

Um outro tipo de lipossoma, transfersomas são agregados delipídeo altamente deformáveis que são atrativos para veículos de liberação demedicamento. (Ceve et al., 1998, Biochim Biophys Acta. 1368(2): 201-15).As transfersomas podem ser descritas como gotículas líquidas que são, destamaneira, altamente deformáveis de modo que estes possam penetrar atravésdos poros que são menores do que a gotícula. As transfersomas são adaptáveisao ambiente em que estes são usados, por exemplo, estes são adaptáveis àforma, de auto-reparação, freqüentemente atingem seus alvos sem fragmentare freqüentemente de auto-carregamento. As transfersomas pode ser feitas, porexemplo, pela adição dos ativadores dos ativadores da extremidade dasuperfície, usualmente tensoativos, a uma composição lipossômica padrão.

As formulações de lipídeo para a transfecção sãocomercialmente disponíveis da QIAGEN, por exemplo, comoEFFECTENETm (um lipídeo não lipossômico com um intensificador decondensação de DNA especial) e SUPERFECT (uma nova tecnologiadendrimérica de atuação). As lipossomas são comercialmente disponíveis daGibco BRL, por exemplo, como LIPOFECTINTm e LIPOFECTACETm, quesão formados de lipídeos catiônicos, tais como cloreto de N-[l-(2,3-dioleilóxi)-propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), DOTAP e brometo dedimetil dioctadecilamônio (DDAB). Os métodos para a fabricação delipossomas são bem conhecidos na técnica e foram descritos em muitaspublicações. Os lipossomas também foram revisados por, inter alia,Gregoriadis (1985) Trends Biotechnol 3:235-241.

As composições da invenção podem compreender outrosagentes úteis para o tratamento ou prevenção da condição relevante, porexemplo, câncer ou infecção, tal como infecção viral.

Em uma forma de realização, o oligonucleotídeo destainvenção é formulado em uma composição junto com um antígeno. Oantígeno pode estar presente na composição como um componente distintoou, alternativamente, conjugado ao oligonucleotídeo para a formação de umcomplexo. Em um complexo, os dois agentes podem ser covalentementeligados ou conjugados diretamente um com o outro ou ligado por intermédiode um ligador ou porção de tether. Em uma forma de realização preferida, oantígeno é um antígeno viral, um antígeno cancerígeno ou um alergeno. Talcomposição é usada para estimular uma resposta específica do antígeno contraum doença ou condição caracterizada por aquele antígeno.

Como usado neste, o termo "antígeno viral" inclui, mas não élimitado a, vírus total intacto, atenuado ou morto vírus, qualquer proteína viralestrutural ou funcional ou qualquer porção de peptídeo de uma proteína viralde comprimento suficiente (tipicamente cerca de 8 aminoácidos ou maislongo) para ser antigênico. As fontes de um antígeno viral incluem, mas nãolimitam-se aos vírus das famílias: Retroviridae (por exemplo, vírus daimunodeficiência humana, tal como HIV-I (também aludido como HTLV-III,LAV ou HTLV-III/LAV ou HIV-III; e outro isolados, tais como HIV-LP;Picornaviridae (por exemplo, vírus da poliomielite, vírus da hepatite A;enterovírus, vírus Coxsackie humano, rhinovírus, echovírus); Calciviridae(por exemplo, cepas que causam gastroenterite); Togaviridae (por exemplo,vírus da encefalite eqüina, vírus da rubéola); Flaviviridae (por exemplo, vírusda dengue, vírus da encefalite, vírus da febre amarela); Coronaviridae (porexemplo, coronavírus); Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatitevesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus ebola);Paramyxoviridae (por exemplo, vírus da parainfluenza, vírus da caxumba,vírus do sarampo, vírus do sincicial respiratório); Orthomyxoviridae (porexemplo, vírus da influenza); Bunyaviridae (por exemplo, Vírus Hantaan,bunya vírus, flebovírus e vírus Nairo); Arenaviridae (vírus da febrehemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e rotavírus);Bornaviridae; Hepadnaviridae (vírus da Hepatite B); Parvoviridae(parvovírus); Papovaviridae (papiloma vírus, polioma vírus); Adenoviridae(most adenovírus); Herpesviridae (vírus simples do herpes (HSV) 1 e 2, víruszoster da varicela, citomegalovírus (CMV), herpes vírus; Poxyiridae (vírusvaríola, vírus da vaccínia, pox vírus); e Iridoviridae (por exemplo, vírus dafebre suína africana); e vírus não classificado (por exemplo, o agente dahepatite delta (pensado ser um satélite defeituoso do vírus da hepatite Bvírus), Hepatite C; Norwalk e vírus relacionado e astrovírus).Alternativamente, um antígeno viral pode ser produzido de maneirarecombinante.

Como usado neste, os termos "antígeno cancerígeno" e"antígeno de tumor " são usados de maneira intercambiável e referidos aantígenos que são diferencialmente expressados pelas células cancerígenas epodem ser, desse modo exploradas a fim de alvegar as células cancerígenas.Os antígenos cancerígenos são antígenos que podem, potencialmente,estimular as respostas imunes aparentemente específicas de tumor. Algunsdestes antígenos são codificados, embora não necessariamente expressado,por células normais. Estes antígenos podem ser caracterizados como aquelesque são normalmente silenciosos (isto é, não expressado) em células normais,aquelas que são expressadas apenas em certos estágios da diferenciação eaquelas que são temporariamente expressadas, tais como antígenosembriônicos e fetais. Outros antígenos cancerígenos são codificados pelosgenes celulares mutantes, tais como oncogenes (por exemplo, oncogene rasativado), genes supressores (por exemplo, p53 mutante), proteínas de fusãoque resultam de anulações internas ou translocações cromossômicas. Ainda,outros antígenos cancerígenos podem ser codificados por genes virais, taiscomo aqueles carregados em RNA e DNA de vírus tumoral.

[0168] Um antígeno cancerígeno como usado neste é umcomposto, tal como um peptídeo, proteína ou glicoproteína, que é associadocom uma superfície de célula tumoral ou cancerígena e que é capaz deprovocar uma resposta imune quando expressado na superfície de uma célulaque apresenta antígeno no contexto de uma molécula complexa dehistocompatibilidade principal (MHC). Os antígenos cancerígenos podem serpreparados a partir de células cancerígenas pela preparação de extratos brutosde células cancerígenas, por exemplo, como descrito em Cohen P A et al.(1994) Câncer Res 54:1055-8, purifícando-se parcialmente os antígenos, pelatecnologia recombinante ou pela síntese de novo de antígenos conhecidos. Osantígenos cancerígenos incluem mas não limitam-se a antígenos que sãorecombinantemente expressados, uma porção imunogênica de ou um tumortotal ou câncer ou célula deste. Tais antígenos podem ser isolados oupreparados de maneira recombinante ou por quaisquer outros meiosconhecidos na técnica.

Os exemplos de antígenos tumorais incluem MAGE3 MART-1/Melan-A, gplOO, dipeptidil peptidase IV (DPPIV), proteína de ligação deadenosina deaminase (ADAbp), ciclofilina b, antígeno associado colorretal(CRC)-OOl7- 1A/GA733, antígeno carcinoembriônico (CEA) e seus epítoposimunogênicos CAP-I e CAP-2, etvó, amll, antígeno específico de próstata(PSA) e seus epítopos imunogênicos PSA-1, PSA-2 e PSA-3, antígeno demembrana específico de próstata (PSMA), receptor de célula T/cadeia CD3-zeta, família MAGE de antígenos tumorais (por exemplo, MAGE-A1,MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7,MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A1, MAGE-A12, MAGE-Xp2,(MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-Cl, MAGEC2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-c5), família GAGE deantígenos tumorais (por exemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4,GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1,NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinase, p53, família MUC5VEGF,receptores de VEGF, A-Raf, B-Raf, C-Raf, Raf-1, HSP70, HSP90, PDGF,TGF-alfa, EGF, receptor EGF, um membro da família do receptor humanosemelhante ao EGF, tal como HER-2/neu, HER-3, HER-4 ou um receptorheterodimérico compreendido de pelo menos uma subunidade HER, antígenodo receptor de peptídeo que libera gastrina, Muc-1, CA125, ανβ3 integrinas,α5β1 integrinas, allbp3-integrinas, CTLA-4, CD20, CD22, CD30, CD33,CD52, CD56, CD80, PDGF beta receptor, Src5 VE-caderin, IL-8, hCG, IL-6,receptor IL-6, IL-15, p21ras, RCAS1, α-fetoproteína, E-caderin, a-catenina,β-catenina e 7-catenina, pl20ctn, gplOO.sup.Pmel 117, PRAME, NYESO-1,cdc27, proteína de coli da polipose adenomatosa (APC), fodrin, Connexin 37,Igidiotipo, pl5, gp75, GM2 e GD2 gangliosídeos, produtos virais, tais como,proteínas do papilomavírus humano, Família Smad de antígenos tumorais,imp-1, PIA, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-I5 glicogêniofosforilase cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL40), SSX-1, SSX-4, SSX-5,SCP-I e CT-7 e c-erbB-2 ou qualquer proteína adicional alvo apresentada emhttp://oncologyknowledgebase.com/oksite/TargetedTherapeutics/TTOExhibit2.pdf e http://oncologyknowledgebase.coM/oksite/TargetedtHerapeutics/TTOExhibit3.pdf, cuja divulgação é incorporada neste por referência. Estalista não é entendida ser limitante.

Os alergenos que podem ser usados nas composições (emétodos) desta invenção são muitos numerosos para listar. Alguns exemplosde tais alergenos incluem, mas não limitam-se a, pólens, venenos de insetos,pó de cólera animal, esporos fungicos e medicamentos (por exemplo,penicilina). Os exemplos de alergenos animais ou vegetais naturais incluemproteínas específicas ao seguinte gênero: Canis (Canis familiaris);Dermatophagoides (por exemplo, Dermatophagoides farinae); Felis (Felisdomesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (por exemplo,Lolium perenne e Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica);Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinosa); Betula(Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia(Artemisia vulgaris); Plantago (por exemplo, Plantago lanceolata); Parietaria(por exemplo, Parietaria officinalis e Parietaria judaica); Blattella (porexemplo, Blattella germanica); Apis (por exemplo, Apis multiflorum);Cupressus (por exemplo, Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica eCupressus macrocarpa); Juniperus (por exemplo, Juniperus sabinoides,Juniperus virginiana, Juniperus communis e Juniperus ashei); Thuya (porexemplo, Thuya orientalis); Chamaecyparis (por exemplo, Chamaecyparisobtusa); Periplaneta (por exemplo, Periplaneta americana); Agropyron (porexemplo, Agropyron repens); Secale (por exemplo, Secale cereale); Triticum(por exemplo, Triticum aestivum); Dactylis (por exemplo, Dactylisglomerata); Festuca (por exemplo, Festuea elatior); Poa (por exemplo, Poapratensis e Poa compressa); Avena (por exemplo, Avena sativa); Holcus (porexemplo, Holcus lanatus); Anthoxanthum (por exemplo, Anthoxanthumodoratum); Arrhenatherum (por exemplo, Arrhenatherum elatius); Agrostis(por exemplo, Agrostis alba); Phleum (por exemplo, Phleum pratense);Phalaris (por exemplo, Phalaris arundinacea); Paspalum (por exemplo,Paspalum notatum); Sorghum (por exemplo, Sorghum halepensis); e Bromus(por exemplo, Bromus inermis).

Como descrito supra, os presente oligonucleotídeos podem serusados para tratar ou prevenir qualquer condição que podem serbeneficamente afetado pela atividade de pDC intensificada ou pela atividadeintensificada de quaisquer células que expressam TLR7 ou células queexpressam TLR8, tal como alergia, asma, autoimune doença e para qualquertipo de sistema imune enfraquecido que resulta de qualquer um de umavariedade de causas potenciais. Será estimado que, com respeito à condiçãosendo tratada, qualquer outro agente que pode ser usado para tratar a condiçãorelevante pode estar presentes em uma composição desta invenção junto comum oligonucleotídeo agonista de TLR descrito neste.

Em uma outra forma de realização, o oligonucleotídeo destainvenção é formulado em uma composição junto com um outro agenteterapêutico útil no tratamento de câncer. Tais agentes incluem agonistas deoutros TLRs (por exemplo, TLR3, TLR7, TLR8, TLR9); agonistas do mesmoTLR que o oligonucleotídeo agoniza, mas tendo uma estrutura moleculardiferente (isto é, uma seqüência de nucleotídeo diferente); os agentecitotóxicos, que incluem, mas não limita-se a, radioisótopos, proteínastóxicas, moléculas pequenas tóxicas, tais como medicamentos, toxinas,imunomodulares, hormônios, antagonistas hormonais, enzimas,oligonucleotídeos, inibidores de enzima, radionuclídeos terapêuticos,inibidores da angiogênese, medicamentos quimioterapêuticos, vincaalcalóides, antraciclinas, epidofilotoxinas, taxanos, antimetabólitos, agentesde alquilação, antibióticos, inibidores de COX-2, SN-38, antimitóticos,antiangiogênico e agentes apoptóticos, particularmente doxorubicina,metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanos, nitrogeno mostardas,gemcitabina, sulfonatos de alquila, nitrosouréias, triazenos, análogos de ácidofólico, análogos de piridina, análogos de purina, complexos de coordenaçãode platina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina, 5-fluorouridina,ribonuclease (RNase), DNase I, enterotoxina-A de estafilococos, proteínaanti-viral de caruru-de-cacho, gelonina, toxina difterina, exotoxina dePseudomonas, endotoxina de Pseudomonas e outros (ver, por exemplo,Remington1S Pharmaceutical Sciences, 19° Ed. (Mack Publishing Co. 1995);Goodman e Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGrawHill, 2001); Pastan et al. (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) CâncerJournal for Clinicians 44:43; Patente U.S. 6.077.499;http://oncologyknowledgebase.coM/oksite/TargetedtHerapeutics/TTOExhibit4.pdf e http://oncologyknowledgebase.coM/oksite/TargetedtHerapeutics/TT0Exhibit5.pdf, cujas as divulgações inteiras são incorporadas neste porreferência); os agentes que alvejam um antígeno de tumor ou uma proteínaproliferativa de tumor, tal como siRNA alvejado contra VEGF, receptores deVEGF, A-Raf, B-Raf, C-Raf, Raf-1, HSP70, HSP90, PDGF, TGF-alfa, EGF,receptor de EGF, um membro da família do receptor semelhante ao EGFhumano, tal como HER-2/neu, HER-3, HER-4 ou um receptor heterodiméricocompreendido de pelo menos uma subunidade de HER, antígenocarcinoembriônico, antígeno do receptor de peptídeo que libera gastrina,Muc-I, CA125, ανβ3 integrinas, α5β1 integrinas, allbp3-integrinas, CTLA-4,CD20, CD22, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, PDGF beta receptor, Src,VE-caderin, IL-8, hCG, IL-6, IL-6 receptor, IL-15 ou um mRNAque codifica quaisquer alvos de adicionais apresentados emhttp://oncologylmowledgebasexoM/oksite/TargetedtHerapeutics/TTOExhibit2.pdf e IittprzzoncologYknowledgebase-CoMzoksitezTargetedtHerapeutiCs/TTOExhibit3.pdf, cuja divulgação é incorporada neste por referência; agentesde quimioterapias incluindo, mas não limitado a, cisplatina (CDDP),carboplatina, oxaliplatina, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida,camptotecina, ifosfamida, melfalan, clorambucila, busulfan, nitrosuréia,dactinomicina, daunorubicina, doxorubicina, bleomicina, plicomicina, mitomicina, etoposida (VP16), tanoxifen, raloxifeno, agentes de ligação doreceptor de estrogênio, taxol, gemcitablen, navelbina, inibidores da famesil-proteína tansferase, transplatina, 5-fluorouracila, vincristina, vinblastina emetotrexato ou qualquer análogo ou variante derivada dos precedentes;agentes terapêuticos e combinações de agente terapêuticos para tratamento de cânceres específicos, tais como câncer de mama; doxorubicina, epirubicina, acombinação de doxorubicina e ciclofosfamida (AC), a combinação deciclociclofosfamida, doxorubicina e 5-fluorouracila (CAF), a combinação de• Tm

ciclociclofosfamida, epirubicina e 5-fluorouracila (CEF), Herceptin ),tamoxifeno, a combinação de tamoxifeno e uma citotoxina, taxanos incluindodocetaxel e Paclitaxel, a combinação de um taxano mais doxorubicina eciclofosfamida; contra câncer de cólon: a combinação de 5-FU e leucovorina,a combinação de 5FU e levamisol, irinotecan (CPT- 11) ou a combinação deirinotecan, 5-FU e leucovorina (IFL) ou oxaliplatina; contra câncer depróstata: um radioisótopo (isto é, paládio, estrôncio-89 e Irídio), leuprolida ououtros agonistas de LHR, antiandrgênios não esteroidais (flutamida,nilutamida e bicalutamida), antiandrogênios esteroidais (acetato deciproterona), a combinação de leuprolida e flutainida, estrogênios, tais comoDES, clorotrianisene, etinil estradiol, estrogênios conjugados U.S.P., DES-difosfato, terapias hormonais de segunda linha, tal como aminoglutetimida,hidrocortisona, retirada de flutamida, progesterona e cetoconazol, prednisonade dose baixa ou outros agentes de quimioterapia ou combinação de agentesrelatados produzir melhora subjetiva nos sintomas e redução no nívelde PSA incluindo docetaxel, paclitaxel, estramustina/docetaxel,estramustine/etoposide, estramustine/vinblastina e estramustina/Paclitaxel;contra melanoma: dacarbazina (DTIC), nitrosouréias, tis como carmustina(BCNU) e lomustina (CCNU), agentes com atividade de agente simplesmodestos incluindo vinca alcalóides, compostos de platina e taxanos, oregime de Dartmouth (cisplatin, BCNU e DTIC), interferon alfa (IFN-A) einterleucina-2 (IL-2); contra o câncer ovariano: Paclitaxel, docetaxel,cisplatina, oxaliplatina, hexametilmelamine, tamoxifen, ifosfamide, acombinação de paclitaxel (Taxol) ou docetaxel (Taxotere) e cisplatina oucarboplatina, a combinação de ciclociclofosfamida e cisplatina, a combinaçãode ciclociclofosfamida e carboplatina, a combinação de 5-fluorouracila (5FU)e leucovorina, etoposida, doxorubicina lipossômica, gerucitabina outopotecan; contra câncer de pulmão: cisplatina, vincristina, vinblastina,mitomicina, doxorubicina e etoposida, sozinha ou em combinação, acombinação de ciclociclofosfamida, doxorubicina, vincristina/etoposida ecisplatina (CAV/EP), a combinação de cisplatina e vinorelbina, paclitaxel,docetaxel ou gemcitabina e a combinação de carboplatina e paclitaxel.

As composições de oligonucleotídeo desta invenção tambémpodem compreender um agente anti-angiogênico. Tais agentes incluem, masnão limitam-se ao inibidor de molécula pequena, anticorpos de neutralização,estratégias anti-sentido, siRNA, aptâmeros de RNA e ribozimas contraproteínas da família genética relacionada com VEGF; variantes de VEGF compropriedades antagonísticas (isto é, como descrito em WO 98/16551,especificamente incorporado neste por referência); agentes listados na TabelaD da Patente U.S. 6.524.583, a divulgação que os agentes e indicações sãoespecificamente incorporadas neste por referência; os agentes que inibem asinalização por um receptor de tirosina cinase incluindo mas não limitado aVEGFRl, VEGFR-2,3 PDGFR-beta, Flt-3, c-Kit, p38 alfa e FGFR-1; agentesque inibem um ou mais dos vários reguladores da expressão e produção deVEGF, tal como EGFR, HER-2, COX-2 ou HIF-Ια; talidomida ou seuanálogo CC-5013; Bevacuzimab (mAb, inibição de VEGF-A, Genentech);IMCl 12IB (mAb, inibição de VEGFR-2, ImClone Systems); CDP-791(DiFab Pegilado, VEGFR-2, Celitech); 2C3 (mAb, VEGF-A, PeregrinePharmaceuticals); PTK-787 VEGFR-1, -2, Novartis); AEE788 (TKI,VEGFR-2 e EGFR, Novartis); ZD6474 (TKI, VEGFR-1, -2, -3, EGFRAstraZeneca); AZD217I (TKI, VEGFR-1, -2, AstraZeneca); SUl 1248 (TKI,VEGFR-I,- 2, PDGFR Pfizer); A013925 (TM, VEGFR-1, -2, Pfizer);AG013736 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); CEP-7055 ("FM, VEGFR-1, -2, -3,Cephalon); CP-547,632 (TKI, VEGFR-1, -2, Pfizer); VEGF-trap (receptorhíbrido solúvel VEGF-A, PlGF (fator do desenvolvimento de placenta)Aventis/Regeneron); GW786024 (TKI, VEGFR-I, -2, -3, GlaxoSmithKline);Bay 93-4006 (TKI, VEGFR-1, -2, PDGFR Bayer/Onyx) e AMG706 (TKI,VEGFR-1, -2, -3, Amgen).

As composições de oligonucleotídeo também podem incluiroutros agentes terapêuticos, tais como agentes imunomoduladores, tais comofator de necrose de tumor, interferon alfa, beta e gama, IL-2, IL-12, IL-15, IL-21, DNA de filamento único contendo CpG, agonistas de outros TLRs, outrascitocinas e agentes imunossupressores; F42K e outros análogos de citocina;ou MIP-1, MIP-I beta, MCP-1, RANTES e outras quimiocinas; agentes quesuper-regulam os receptores de superfície celular e junções GAP; agentescitostáticos e de diferenciação ou inibidores de adesão celular.

Ainda em outra forma de realização, as composições deoligonucleotídeo podem, adicionalmente, compreender um agente anti-viral.Os agentes anti-virais úteis que podem ser usados em combinação com asmoléculas da invenção incluem, mas não limitam-se a, inibidores de protease,inibidores da transcriptase reversa de nucleosídeo, inibidores da transcriptasereversa que não de nucleosídeo e análogos de nucleosídeo. Os exemplos deagentes antivirais incluem mas não limitam-se a zidovudina, aciclovir,gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina e ribavirina, bem como foscarnet, amantadina, rimantadina, saquinavir, indinavir, amprenavir,lopinavir, ritonavir, os alfa-interferons; adefovir, clevadina, entecavir,pleconaril.

A inter-relação entre as dosagens para animais e sereshumanos (com base em miligramas por metro quadrado de superfície corporal) é descrito em Freireich et al., (1966) Câncer Chemother Rep 50:219. A área de superfície corporal pode ser aproximadamente determinada apartir da altura e do peso do paciente. Ver, por exemplo, Scientific Tables,Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N.Y., 1970, 537. Uma quantidade eficaz deum composto desta invenção pode variar de cerca de 0,001 mg/kg a cerca de1000 mg/kg, mais preferivelmente 0,01 mg/kg a cerca de 100 mg/kg, maispreferivelmente 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg ou qualquer faixa em que aextremidade inferior da faixa é qualquer quantidade entre 0,001 mg/kg e 900mg/kg e a extremidade superior da faixa é qualquer quantidade entre 0,1mg/kg e 1000 mg/kg (por exemplo, 0,005 mg/kg e 200 mg/kg, 0,5 mg/kg e 20 mg/kg). As doses eficazes também variarão, como reconhecido por aqueleshabilitados na técnica, dependendo das doenças tratadas, via deadministração, uso de excipiente e a possibilidade de co-uso com outrostratamentos terapêuticos, tais como o uso de outros agentes.

Para a composição farmacêutica que compreendem agentesterapêuticos adicionais, uma quantidade eficaz do agente terapêutico adicionalestá entre cerca de 20 % e 100 % a dosagem naturalmente utilizada em umregime de monoterapia usando-se justamente o agente adicional.Preferivelmente, uma quantidade eficaz é entre cerca de 70 % e 100 % dadose monoterapêutica normal. As dosagens monoterapêuticas normais destesagentes terapêuticos adicionais são bem conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2.sup.nd Edição,Appleton e Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, TarasconPocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, LomaLinda, Calif. (2000), cujas referências são totalmente incorporadas neste porreferência.

E esperado que alguns dos agentes terapêuticos adicionaislistados acima atuarão sinergisticamente com os compostos desta invenção.Quando isto ocorre, isto permitirá que a dosagem eficaz do agente terapêuticoadicional e/ou o composto desta invenção a ser reduzido daquela em umamonoterapia. Este tem a vantagem de minimizar os efeitos tóxicos colateraisdo agente terapêutico adicional de um composto desta invenção, melhorassinergísticas na eficácia, facilidade melhorada de administração ou uso e/oucusto total reduzido de preparação ou formulação de composto.

Será reconhecido por aqueles de habilidade na técnica quecertos agentes terapêuticos apresentados acima estão em duas ou mais dascategorias divulgadas. Para os propósitos desta invenção, tais agentesterapêuticos devem ser considerados membros de cada uma daquelascategorias de terapêuticos e a caracterização de qualquer agente terapêuticocomo estando em uma certa categoria específica não também não o impede seser considerado dentro de uma outra categoria especificada.

Ainda em outra forma de realização, a invenção fornece umacomposição de matéria que compreende um agonista de TLR7 ou TLR8 e umoutro agente selecionado de: um agente terapêutico útil no tratamento decâncer, um agente terapêutico útil no tratamento de doença infecciosa, umantígeno cancerígeno, um antígeno viral ou um alergeno; em formas dedosagem separadas, mas associados entre si. O termo "associado entre si"como usado neste significa que as formas de dosagem separadas sãoembaladas juntas ou de outra maneira ligadas um ao outro, tal que estejafacilmente evidente que as formas de dosagem separadas são pretendidasserem vendidas e administradas como parte do mesmo regime. O agente e oagonista de TLR7 são, preferivelmente embalados juntos em uma embalagemde bolhas ou outra embalagem de câmaras múltiplas ou como conectado,recipientes separadamente selados (tais como cartuchos de chapa metálica ousemelhante) que podem ser separados pelo usuário (por exemplo, pelo corteem linhas pontilhadas entre os dois recipientes).

Ainda, em uma outra forma de realização, a invenção forneceum kit que compreende em recipientes separados, a) um agonista de TLR7 ouum agonista de TLR8 desta invenção e b) um outro agente selecionado de: umagente terapêutico útil no tratamento de câncer, um agente terapêutico útil notratamento de doença infecciosa, um antígeno cancerígeno, um antígeno viralou um alergeno.

Métodos de Tratamento

Nas formas de realização numerosas da presente invenção, umoligonucleotídeo de filamento único, rico em uridina ou rico em guanidina dainvenção será administrado em uma quantidade terapêutica ouprofilaticamente eficaz a um paciente ou indivíduo a fim de atingir umaresposta específica. Conseqüentemente, a presente invenção fornece métodosde usar os oligonucleotídeos descritos neste para a imuno-estimulação úteisno tratamento ou prevenção de distúrbios onde uma resposta imuneintensificada é útil e/ou requerida, tal como câncer ou doença infecciosa, porexemplo, infecção viral. Tais métodos compreendem a etapa de administrar, aum paciente uma composição que compreende um oligonucleotídeo destainvenção. Será estimado que os presentes oligonucleotídeos podem ser usadospara tratar ou prevenir quaisquer condições que possam ser beneficamenteafetadas pela atividade de pDC intensificada, atividade de monócitointensificada, atividade de mDC intensificada, atividade de célula Treg oupela atividade intensificada de quaisquer células que expressam TLR7 ouTLR8. Conseqüentemente, os presentes métodos e composições podem serusados para tratar ou prevenir condições tal como alergia, asma, auto-imunedoença e também para, no geral, intensificar a função imune em pacientescom um sistema imune enfraquecido que resulta de doença, cirurgia ouadministração de agentes imunossupressores, tais como agentesquimioterapêuticos ou outros medicamentos ou tratamentos.

Em certas formas de realização, o método de estimular umaresposta imune em um paciente de acordo com a invenção compreende aetapa inicial de detectar atividade de célula imune no paciente a seguir daadministração de uma composição que compreende um oligonucleotídeodesta invenção. A detecção de atividade é preferivelmente realizada emcélulas dendríticas, monócitos ou células Treg obtidas do paciente depois deum período de tempo que segue a administração da composição deoligonucleotídeo. As células podem ser obtidas do sangue periférico, baço,medula óssea ou linfonodo do paciente, preferivelmente de sangue periféricoou medula óssea. As células devem ser obtidas depois do oligonucleotídeo nacomposição administrada teve tempo suficiente para afetar as células imunesno paciente. Tipicamente, este estará entre 1 e 48 horas seguindo aadministração. O sangue periférico e/ou medula são, preferivelmente, aindapurificados por técnicas conhecidas. Tipicamente, a técnica é uma técnica quecaracteriza a célula, tal como caracterização celular ativada por fluorescênciaou ativada magnética usando-se um reagente apropriado específico para o tipode célula a ser estimada.

A atividade das células imunes obtidas será determinada pelamedição de uma atividade conhecida ser afetada em uma célula particularpelo agonismo de TLR7 ou TLR8. Para determinar a ativação de TLR7, acélula preferida para o teste é um pDC do paciente. Um pDC isolado oupopulação de pDCs é estimada pelo exame do nível de expressão de umacitocina selecionada do grupo que consiste de IFNa, IL-6 e IL-12 p40. Para adeterminação da ativação de TLR8, a célula preferida para o teste éselecionada de um mDC, um monócito ou uma célula Treg. Para submeter aensaio os mDCs ou os monócitos, o nível de expressão de TNFa, IL-6 ou IL-12 p40 é medido. Para as células Treg, o ensaio usado preferivelmenteexamina o nível de expressão de IL-IO ou transformação do fator dedesenvolvimento β ou a capacidade de tais células para suprimir aproliferação de células CD4+ T simples em uma co-cultura.

Qualquer de diversos tipos de câncer podem ser tratados ouprevenidos usando-se os presentes oligonucleotídeos. Essencialmente,qualquer câncer (ou outra condição) que pode ser tratado, diminuído em suaprogressão ou prevenido por um aumento em uma atividade de pDCs, mDCs,monócitos, células Treg ou outras células que expressa, TLR7 ou TLR8podem ser tratadas. Os exemplos de tipos de câncer ou doenças proliferativasque podem ser tratadas incluem carcinoma, incluindo aquele da bexiga,mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas, estômago,cérvix, tireóide e pele, incluindo carcinoma de célula escamosa; tumoreshematopoiéticos da linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemialinfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfomade célula T, linfoma de Hodgkins, linfoma de não Hodgkins, linfoma decélula pilosa e linfoma de Burketts; tumores hematopoiéticos da linhagemmielóide, incluindo leucemias miologênicas agudas e crônicas e leucemiapromielocíticas; tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcomae rabdomiosscarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma,teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso centrale periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas;tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcoma,rabdomiossarcoma e osteossarcoma e outros tumores, incluindo melanoma,xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, câncer folicular datireóide e teratocarcinoma.Em uma forma de realização para tratar câncer, uma amostrade células que expressam TLR7- ou TLR8 é obtida do paciente antes daadministração dos oligonucleotídeos e a capacidade de uma ou mais dospresente oligonucleotídeos para ativar as células serão estimados em umaporção daquela amostra. Uma vez que um oligonucleotídeo ativo adequadofoi identificado, este pode ser usado para a ativação da porção remanescentede uma outra amostra das células que expressam TLR7- ou TLR8 do paciente(que são opcionalmente expandidas ex vivo antes da ativação) ex vivo, emque o oligonucleotídeo é aplicado às células in vitro e as células ativadasentão retornadas ao paciente. Alternativamente, seguindo a estimativa daativação potencial, a célula do paciente pode ser ativada in vivo, em que ooligonucleotídeo (em uma formulação farmacêutica adequada) é diretamenteadministrado ao paciente. Em uma forma de realização, uma amostra de pDCsou outras células que expressam TLR7- ou TLR-8 é subseqüentemente(seguindo a administração do oligonucleotídeo) obtido a partir do pacientepara estimar sua atividade in vivo. A atividade pode ser estimada usando-sequalquer um dos métodos descritos supra, por exemplo, produção de citocina.A sinalização TLR induziu a expressão de gene, afeta na proliferação deoutras células, etc. Em tais formas de realização, uma detecção que os pDCsou outras células que expressam TLR são ativos (ou sofreram proliferaçãoaumentada) é uma indicação que o oligonucleotídeo está tendo o efeitodesejado.

Quando câncer está sendo tratado usando-se os presenteoligonucleotídeos, em uma outra forma de realização o método da presenteinvenção compreende a etapa inicial de administrar ao dito paciente um outrocomposto anti-câncer ou submetendo-se o paciente a um outro métodoterapêutico. Para o tratamento de tumor sólido, por exemplo, a administraçãode uma composição da presente invenção pode ser usada em combinação commétodos clássicos, tais como cirurgia, radioterapia, quimioterapia ousemelhante. Portanto, a invenção fornece terapias combinadas em que ospresente oligonucleotídeos são usado simultaneamente com, antes ou depoisda cirurgia ou tratamento com radiação ou são administrados a pacientes com,antes ou depois de agentes quimioterapêuticos, radioterapêuticos ou anti-ahgiogênicos convencionais ou imunotoxinas alvejadas ou coaguligandos.Quando os oligonucleotídeos são administrado a um paciente com um outroagente, os dois componentes podem ser administrados como composiçõesseparadamente formuladas (isto é, como uma forma de dosagem múltipla) oucomo uma composição simples (tal como a combinação de formas dedosagem simples descrita acima contendo um oligonucleotídeo destainvenção e um outro agente terapêutico).

Os exemplos de outros compostos anti-câncer que podem serco-administrados com os oligonucleotídeos estimulantes de TLR7- e/ouTLR8- presentes incluem citocinas. Várias citocinas pode ser utilizadas emtais métodos combinados, incluindo qualquer das citocinas apresentadasacima como úteis em combinação de composições desta invenção. Exemplospreferidos de citocinas incluem IL-Ia ,IL-I β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF,M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG,MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFNbeta, IFN-gama. Particularmentepreferidos são citocinas que estimulam a atividade citotóxica da célula NK, talcomo IL-2, IL-12 ou IL-15. Citocinas são administradas de acordo com oregime padrão, consistente com indicações clínicas tais como as condições dopaciente e toxicicidade relativa da citocina.

Em outra forma de realização, as composições deoligonucleotídeo estimulante de TLR7- e/ou TLR8- da presente invençãopodem ser administradas em combinação com um agente quimioterapêuticoou de terapia hormonal. Uma variedade de agentes de terapia hormonal equimioterapêuticos podem ser usados nos métodos de tratamentoscombinados descobertos neste, incluindo qualquer dos agentes apresentadosacima como úteis em combinação das composições desta invenção. Agentesquimioterapêuticos preferidos abrangidos como exemplar incluem agentes dealquilação, antimetabólitos, antibióticos citotóxicos, vinca alcalóides, porexemplo adriamicina, dactinomicina, mitomicina, carminomicina,daunomicina, doxorubicina, tamoxifena, taxol, taxótero, vincristina,vinblastina, vinorelbina, etoposida (VP-16), 5-fluorouracila(5FU), citosinaarabinosida, ciclofosfamida, tiotepa, metotrexato, camptotecina, actinomicina-D, mitomicina C, cisplatina (CDDP), aminopterina, combretastatina(s) ederivados e pró-medicamentos destes. Também abrangidos são inibidores decinase e particularmente inibidores de angiogêneses, incluindo por exemploinibidores ou VEGFRl, VEGFR2, PDGFR, C-KIT e/ou um ou mais rafcinases (por exemplo, Raf-a, raf-b e/ou raf-c). Agentes hormonais preferidosincluem por exemplo agonistas LHRH tal como leuprorelina, goserelina,triptorelina e buserelina; anti-estrogênios tais como tamoxifeno e toremifeno;anti-androgênios tais como flutamida, nilutamida, ciproterona e bicalutamida;inibidores de aromatase tal como anastrozol, exemestano, letrozol e fadrozol;e progestagênios tais como medróxi, clormadinona e megestrol.

Em uma outra forma de realização, as composições deoligonucleotídeo estimulante de TLR7- e/ou TLR8- da presente invençãopodem ser administradas em combinação com um anticorpo terapêutico. Emuma forma de realização, a composição de oligonucleotídeo estimulante deTLR7- e/ou TLR8- intensifica a atividade ADCC com respeito a uma célulaalvo e é administrada preferivelmente em combinação com a etapa deadministrar ao dito paciente um anticorpo que liga a um antígeno em umacélula alvo que é entendida estar esgotada. Tais anticorpos terapêuticos sãofreqüentemente de subtipos IgGl ou IgG3 embora outros subtipos e versõesmodificadas (por exemplo, regiões Fc modificadas) também são consideradas.Exemplos de anticorpos terapêuticos que podem ser usados vantajosamentede acordo com a invenção são fornecidos na publicação PCT n°. WO2005/009465 designado a Innate Pharma, a divulgação que é incorporadaneste por referência em sua totalidade.

A presente invenção também fornece um método de tratar ou prevenir uma doença infecciosa em um paciente, particularmente tratar ouprevenir uma infecção viral, que compreende a etapa de administrar ao ditopaciente uma composição desta invenção. Um paciente tendo uma doençainfecciosa é um paciente que foi exposto a um organismo infeccioso e teveníveis detectáveis agudos ou crônicos do organismo no corpo. A exposiçãodos organismos infecciosos, no geral, ocorrem com a superfície exterior dopaciente, por exemplo, pele ou membranas de mucosa e/ou refere-se apenetração da superfície exterior do paciente pelo organismo infeccioso.Além disso as doenças virais, os oligonucleotídeos presentes também podemser usados para defender contra outros tipos de agentes infecciosos, incluindo bactérias, príons, fungos e vários parasitas. Ver, por exemplo,; C. G. AThomas, Medicai Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983, cujadivulgação total é incorporada neste por referência.

Um paciente que requer prevenção de uma infecção viral é umpaciente que é um candidato para uma vacinação contra uma doença viral.Para certas doenças virais, um tal paciente é um recém nascido, criança ouadolescente. Para outras doenças virais, o paciente está imunocomprometido.Para outras doenças virais, o paciente é qualquer membro ou a população.

Vírus tratáveis usando os oligonucleotídeos presentes incluem,mas não limitam-se a, enterovírus (incluindo, mas não limitado a, vírus da família picornaviridae, tal como vírus da poliomielite, vírus coxsackie, vírusecho), rotavírus, adenovírus, vírus da hepatite. Exemplos específicos de vírusque foram descobertos em seres humanos incluem mas não limitam-se a:Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodefíciência humana, tal como HIV-1 (também aludido como HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV ou MV-III; eoutro isolados, tal como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, vírus dapoliomielite, vírus da hepatite A; enterovírus, vírus Coxsackie humano,rhinovírus, echovírus); Calciviridae (por exemplo, cepas que causamgastroenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus da encefalite eqüina, vírus darubéola); Flaviviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite,vírus da febre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus);Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva);Filoviridae (por exemplo, vírus ebola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírusda parainfluenza, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus do sincicialO respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da influenza) ou vírusinfluenza aviária (por exemplo, H5N1 ou vírus relacionado); Bungaviridae(por exemplo, vírus Hantaan, vírus bunga, flebovírus e vírus Nairo);Arenaviridae (vírus da febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo,reovírus, orbiviurses e rotavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus daHepatite B); Parvoviridae (parvovírus); Papovaviridae (papilomavírus, víruspolioma); Adenoviridae (mais adenovírus); Herpesviridae (vírus simples doherpes (HSV) 1 e 2, vírus zoster da varicela, citomegalovírus (CMV));Poxviridae (vírus varíola, vírus da vaccínia, vírus pox); Iridoviridae (porexemplo, vírus da febre suína africana); e vírus não classificado (por exemplo,os agentes etiológicos de encefalopatias espongiformes, o agente da hepatitedelta (pensado ser um satélite defeituoso do vírus da hepatite B), os agentesde hepatite não-A, e hepatite não-B (classe 1= internamente transmitido;classe 2= parenteralmente transmitido (isto é, Hepatite C); Norwalk e vírusrelacionado e astrovírus).

Como com câncer, os métodos da invenção podemcompreender a etapa de adição de administrar ao dito paciente um outroagente útil para o tratamento de infecção. Os medicamentos da infecçãoincluem mas não limitam-se a agentes anti-bacterianos, agentes anti-virais,agentes anti-fungícos e agentes anti-parasitários.Agentes anti-virais são do interesse particular e incluemcompostos que evitam a infecção de células por vírus ou replicação do vírusdentro da célula. Estes diversos estágios são dentro do processo de infecçãoviral que podem ser bloqueados ou inibidos pelos agentes antivirais. Estes estágios incluem, ligação do vírus à célula hospedeira (imunoglobulina oupeptídeos de ligação), não revestimento do vírus (por exemplo, amantadina),sínteses ou tradução do mRNA viral (por exemplo, interferon), replicação deRNA ou DNA viral (por exemplo, análogo de nucleosídeos), maturação denovas proteínas de vírus (por exemplo, inibidores de protease) e enxerto eliberação do vírus. Agentes antivirais que podem ser administrados emcombinação com os oligonucleotídeos da presente invenção são apresentadosacima na descrição das composições de combinação deoligonucleotídeo/agente anti-viral da presente invenção.

Análogos de nucleosídeos preferidos incluem, mas não limitam-se a, aciclovir (usado para o tratamento de vírus simples do herpes evírus varicela-zoster), ganciclovir (úteis para o tratamento decitomegalovírus), idoxuridina, ribavirina (úteis para o tratamento de Vírussincitial respiratório), didesoxinosina, didesoxicitidina e zidovudina(azidotimidina). Uma outra classe de agentes anti-virais que podem seradministrados com os oligonucleotídeos desta invenção incluem citocinas taiscomo interferons, tal como alfa e beta-interferon. Também é possível terapiade imunoglobulina, incluindo terapia de globulina imune normal e terapia deglobulina hiper-imune. Terapia de globulina imune normal utiliza um produtode anticorpo que é preparado a partir do soro de doadores de sangue normais e unido. Este produto unido contém baixos títulos de anticorpos para umaampla faixa de vírus humanos, tais como hepatite A, parvovírus, enterovírus(especialmente em recém nascidos). Terapia de globulina hiper-imune utilizaanticorpos que são preparados a partir do soro de indivíduos que tiveram altostítulos de um anticorpo para um vírus particular. Exemplos de globulinashiper-imune incluem globulina imune zóster (úteis para a prevenção devaricella em crianças imuno-comprometidas e recém nascidos), globulinaimune de hidrofobia humana (úteis na profilaxia pós-exposição de umpaciente mordido por um animal com hidrofobia), globulina imune da hepatite B (úteis na prevenção do vírus da hepatite B, especialmente em umpaciente exposto ao vírus) e globulina imune RSV (útil no tratamento deinfecções do vírus sincicial respiratório).

Quando o método desta invenção é projetado para evitarinfecção viral, o método tipicamente compreende a etapa inicial de administrar ao dito paciente um antígeno viral. A escolha do antígeno viralpode ser feito a partir dos mesmos antígenos virais apresentados acima comoúteis na combinação de composições da presente invenção.

Quando um ou mais agentes são usados em combinação com aterapia com base em oligonucleotídeos presentes, não existe requerimento para os resultados combinados a ser aditivos dos efeitos observados quandocada tratamento é separadamente conduzido. Embora, pelo menos os efeitosaditivos sejam, no geral, desejáveis, qualquer aumento nos efeitos anti-câncerou anti-infecção acima uma das terapias simples deveriam ser benéficas.Também, não existe requerimento particular para o tratamento combinado para exibir efeitos sinérgicos, embora este seja certamente possível evantajoso.

As quantidades efetivas de outros agentes terapêuticos úteisnos métodos desta invenção são bem conhecidos por aqueles habilitados natécnica. Entretanto, está adequadamente dentro da competência do técnico habilitado determinar as outras faixas eficácia-quantidade ótimas de agentesterapêuticos. Em uma forma de realização da invenção onde um outro agenteterapêutico é administrado a um animal, a quantidade efetiva do compostodesta invenção é menor do que sua quantidade efetiva deveria ser quando ooutro agente terapêutico não é administrado. Em uma outra forma derealização, a quantidade efetiva dos agentes convencionais é menor do quesua quantidade efetiva deveria ser quando o composto desta invenção não éadministrado. Nesta maneira, os efeitos colaterais não desejados associadoscom altas doses do agente podem ser minimizados. Outras vantagenspotenciais (incluindo, sem limitação, regime de dosagem melhorado e/oucusto de medicamento reduzido) serão evidentes àqueles habilitados natécnica.

Em uma outra forma de realização a invenção fornecequalquer dos oligonucleotídeos descritos acima conjugados a um marcadordetectável. O termo "marcador detectável" como usado neste refere-se aqualquer molécula que pode ser quantitativa ou qualitativamente observadaou medida. Exemplos dos marcadores detectáveis úteis nos oligonucleotídeosconjugados desta invenção são radioisótopos, cor fluorescente ou um membrode um par de ligação complementar, tal como um membro de qualquer um de:e antígeno/anticorpo, lectina/carboidrato; avidina/biotina; receptor/ligando; ousistemas de polímero molecularmente impresso/molécula de impressão.

A conjugação de um tal marcador detectável para ooligonucleotídeo pode ser atingido pelos métodos bem conhecidos na técnica.Patentes U.S. exemplar que descrevem a preparação dos oligonucleotídeo

conjugados incluem, por exemplo, Patente U.S. 4.828.979; 4.948.8825.218.105; 5.525.465; 5.541.313; 5.545.730; 5.552.538; 5.578.7175.580.731; 5.580.731; 5.591.584; 5.109.124; 5.118.802; 5.138.0455.414.077; 5.486.603; 5.512.439; 5.578.718; 5.508.046; 4.587.0444.605.735; 4.667.025; 4.752.779; 4.789.737; 4.824.941; 4.835.2634.876.335; 4.904.582; 4.958.013; 5.482.830; 5.112.963; 5.214.1365.082.830; 5.112.963; 5.214.136; 5.245.022; 5.254.469; 5.258.5065.262.536; 5.272.250; 5.292.873; 5.317.098; 5.371.241. 5.391.7235.416.203. 5.451.463; 5.51 0.475; 5.512.667; 5.514.785; 5.565.5525.567.810; 5.574.142; 5.585.481; 5.587.371; 5.595.726; 5.597.6965.599.923; 5.599.928 e 5.688.941, cada um que é incorporado por referêncianeste em sua totalidade.

0 marcador detectável do oligonucleotídeo conjugado destainvenção pode ser usado para detectar ligação do oligonucleotídeo ao TLR correspondente. Deste modo de acordo com outra forma de realização, ainvenção fornece um método de detectar a ligação de um oligonucleotídeoque compreende uma seqüência selecionada de: a) UUU-(X)n-UUU ou UU-X-UUX-UU ou Y(U)pY; ou b) GGG-(X)n-GGG5 GG-X-GG-X-GG ouZ(G)pZ, em que cada U, G, Χ, η e ρ é definido como acima, para TLR7 ou TLR8, o dito método que compreende a etapa de contatar uma molécula quecompreende o dito oligonucleotídeo conjugado a um marcador detectável comum material contendo TLR7 ou TLR8; e detectar o dito marcador detectável.Um material contendo TLR7 ou TLR8 pode ser uma proteína TLR7 ou TLR8isolada, um fragmento de uma proteína TLR7 ou TLR8 que compreende um domínio de ligação de oligonucleotídeo funcional; ou uma célula que expressaTLR7 ou TLR8. Opcionalmente, os oligonucleotídeos agonistas TLR7 dainvenção não induz substancialmente a sinalização direta e/ou liga-se aoTLR8; opcionalmente os oligonucleotídeos agonistas de TLR8 da invençãonão induz substancialmente sinalização direta e/ou liga-se ao TLR7.

De acordo com outra forma de realização, a invenção forneceum método que determina se uma molécula de teste liga-se a TLR7 ou TLR8que compreende a etapa de contatar o dito conjugado que compreende umoligonucleotídeo que compreende uma seqüência selecionada de: a) UUU-(X)n-UUU ou UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY; ou b) GGG-(X)n-GGG, GG-X- GG-X-GG ou Z(G)pZ, em que cada U, G, Χ, η e ρ é definido como acima; eum marcador detectável; com um material contendo TLR7 ou TLR8;quantificar o marcador detectável associado com o material contendo TLR7ou TLR8; contatar o dito conjugado com o dito material contendo TLR7- ouTLR-8 na presença da dita molécula de teste; que determina se a presença dadita molécula de teste reduz a quantidade do marcador detectável associadocom o material contendo TLR7 ou TLR8. Uma redução na quantidade domarcador detectável associado com o material contendo TLR7 ou TLR8- napresença da molécula de teste indica que a molécula de teste liga-se ao TLR7ou TLR8. A molécula de teste pode então ser ainda submetida ao ensaio paraesta capacidade para ativar TLR7 ou TLR8 por qualquer ensaio descritopreviamente.

Em uma forma de realização relacionada da invenção forneceum kit que compreende, em recipientes separados: um conjugado quecompreende um oligonucleotídeo que compreende uma seqüência selecionadade: UUU-(X)n-UUU ou UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY; ou b) GGG-(X)n-GGG, GG-X-GG-X-GG ou Z(G)pZ, em que cada U, G, Χ, η e ρ é definidocomo acima; e um marcador detectável; e um material contendo TLR7 ouTLR8.

Exemplos

Aspectos e vantagens adicionais desta invenção sãodescobertos na seção experimental seguinte, que deve ser considerado comoilustrativo e não limitado ao escopo deste pedido.

Procedimentos experimentais

Reagentes. Poli I:C foi da Pharmacia e poliU foi da Sigma

(Poole, UK). Oligonucleotídeos contendo CpG 1668 foi feito em CRUK ouadquirido da Sigma (Poole, UK). Os oligonucleotídeos DNA 21-mer foramsintetizados em CRUK e oligonucleotídeos de RNA foram obtidos da Ambionou Thermo Electron. Politeilenimina (2kD) foi adquirida da Sigma-Aldrich.Todos os reagentes exceto o poliU foram livres de endotoxina.

Os animais e células. C57BL/6 foram obtidos da CharlesRiver UK. Os controles de littermate de camundongos TLR7"/y e TLR7+/Yforam produzidos no Research Institute for Microbial Disease. Flt3LDCforam gerados de suspensões celulares de medula óssea em RPMI 1640médio contendo 10 % de soro fetal bovino, 2 mM de glutaminas, 100unidades/ml de penicilina, 100 μ g/ml de estreptomicina, 50 μΜ 2-mercaptoetanol e 50 ng/ml de murina Flt3L (R&D systems) e foram usadoem 10 ou 11 dias de culturas.

Ensaio de ativação. Para estimulação com oligonucleotídeos,2xl05 Flt3L-DC foram semeados em triplicar em placas de 96 reservatórios.Os oligonucleotídeos foram adicionados e células foram cultivadas durante anoite em um volume final de 200 μΐ. Os controles continham meios apenas,0,5 μ g/ml CpG 1668, IOOmM de loxoribina ou ΙμΜ R848.

Para estimulação com oligonucleotídeo do que outro CpG1668, doses diferentes de cada oligonucleotídeo de testes foram diluídos em150 mM de solução de NaCl e misturados com um volume igual de 150 mMde solução de NaCl +/- politeilenimina (PEI; 3 μΐ/ml PEI foram usados semconsiderar a dose de RNA). Depois de 15 min de incubação em temperaturaambiente, oligonucleotídeo/complexos de PEI foram adicionados as células.Os sobrenadantes foram coletados depois de 18 a 20 horas de cultura e níveisde IFNa, IL-6 e IL-12 p40 foram determinados por sanduíche de ELISA.

Ensaio de ativação de pDC humano. R848 e RNA9.2DRcomplexado ao LyoVec foram de Invivogen. Os oligonucleotídeos de RNAforam adquiridos da Sigma Proligo. Os PMBCs humanos foram purificados apartir do sangue periférico humano normal pela centrifugação Ficoll-Hypaque. Os plasmacitóides BDCA4+ DC foram purificados a partir dosPBMC totais pela seleção positiva usando CD304+ Microbeads e MiniMacsde Miltenyi Biotec. Oligonucleotídeos/complexos de PEI, preparados comodescritos acima, foram adicionados a 1-2x105 pDC semeados em duplicar emplacas de 96 reservatórios. As células foram cultivadas durante a noite em umvolume final de 200 μΐ, os sobrenadantes foram coletados depois de 18 a 20horas de cultura e níveis de IFNa e IL-6 foram determinados por sanduíche deELISA.Resultados

Primeiro, comparamos a indução de IFNa por poliU RNA5 umhomopolímero estudado previamente de comprimento indefinido, para aindução de IFNa por um oligonucleotídeo 21-mer RNA com ligação defosfodiéster (poliUo-21) como presente em RNA natural e no homopolímeropoliU e por um oligonucleotídeo 21-mer RNA com modificação da cadeiaprincipal de fosforotioato (poliUs-21). Ambos os oligonucleotídeos 21-merpoliU sem considerar a modificação da cadeia principal induz IFNa porFlt3L-DC em uma maneira dependente da dose (Fig. IA). Ambos osoligonucleotídeos 21-mer induz o IFNa similar quando dado a cultura Flt3Lem forma de complexos com PEI e parecem ser reconhecidos comsensibilidade igual. PEI é um policátion que liga e condensa ácidos nucleicose deste modo tem a capacidade para proteger RNA da degradação. Além dissopara esta função de proteção, o PEI media absorção intracelular doscomplexos por um mecanismo diferente do que absorção de RNA livre.

Para todos os experimentos descritos aqui, usamos a mesmaconcentração de PEI sem considerar a quantidade de RNA a fim de evitar acitotoxicicidade em concentrações altas de PEI. PEI não é, entretanto,absolutamente crucial para absorção e reconhecimento de TLR7 de ligandosde ácido nucleico, visto que os oligonucleotídeos poliUs-21 induz IFNa porFlt3L-DC quando dado a cultura sem PEI (Fig. 1B). Em contraste, ooligonucleotídeo poliUo-21 falhou na indução de IFNa sob as mesmascondições (Fig. 1 C), que é mais provavelmente devido à sensibilidade maiorde ligações de fosfodiéster para digestão de nuclease. Em experimentossubseqüentes, utilizamos RNA/complexos de PEI para estimulação de Flt3L-DC em vez de RNA livre para evitar diferenças na atividade estimuladoradevido a diferenças na sensibilidade para degradação por nucleases.

Para determinar como uma redução de oligonucleotídeos depoliU por nucleotídeos 11 e 6 afetam sua atividade estimuladora, comparamosfosfodiéster 10-mer e 15-mer e oligonucleotídeos de fosforotioato poliU RNApara poliUo-21 e poliUs-21. Para fosfodiéster poliU RN A, osoligonucleotídeos 15-mer e 10-mer curtos apresentaram uma mudança naresposta de dose e foram aproximadamente 20x menos potente em indução deIFNa por Flt3L-DC (Fig. 2A). Para fosforotioato poliU RNA, a direção foi amesma, mas a redução na indução IFNa vista com o oligonucleotídeo 15-merfoi indistinguível a partir da resposta obtida com o 21-mer, considerando queo 10-mer não induziu qualquer nível mensurável de IFNa na dose testada.Deste modo, concluímos que 10-mer e 15-mer de fato podem induzir IFNa.

A seguir testamos como as modificações da cadeia principalafeta o reconhecimento dos ligandos de ssRNA por TLR7. Primeirodeterminamos como os oligonucleotídeos de ssDNA induz IFNa por Flt3L-DC. Quando estimulado com um oligonucleotídeo 21-mer poliU fosfodiésterDNA, Flt3LDC produziu IFNa. De maneira interessante, em doses inferioresde oligonucleotídeo de DNA (polidUo-21) foi menos potente do que ooligonucleotídeo RNA correspondente (poliUo-21) em estimular umaresposta de IFNa, considerando que em doses altas foram ainda mais potentesdo que poliUo-21 em indução de IFNa (Fig. 3 A). Quando fosforotioato poliU21-mer RNA e oligonucleotídeos DNA foram comparados (poliUs-21 epolidUs-21, respectivamente), ocorreu uma mudança similar na resposta dedoses, mas o oligonucleotídeo de RNA induziu níveis altos de IFNa em todasas doses testadas (Fig. 3B). Concluímos que a modificação da cadeia principalna posição C2 do açúcar afetam, mas não anulam, o reconhecimento doligando.

Foi relatado que motivos ricos em GU em ssRNA são cruciaispara reconhecimento de TLR7. Para tratar disto, comparamos diretamente ospoliUs-21 ao oligonucleotídeo RNA40 rico em GU (Heil et al. (2004) Science303: 1526). No ensaio de ativação Flt3L-DC, o oligonucleotídeo poliUs-21RNA foi muito mais potentes do que RNA40 em indução de IFNa (Fig. 4A).Isto suporta a conclusão que TLR7 exclusivamente reconhece as porções deuridina e ignora todos os outros nucleotídeos de RNA.

Para testes ou hipóteses adicionais que TLR7 reconheceexclusivamente porções de uridina, comparamos oligonucleotídeos 21-merfosforotioato RNA com composições diferentes de porções de uridina ecitosina. As porções de citocina foram escolhidas além da adenosina paraevitar a formação das estruturas de dsRNA para formação de pares de uridinacom porções de adenosina e foram parecidas além das porções de guanosinapara evitar motivos ricos em GU. Para a composição de oligonucleotídeos deRNA diferentes ver Tabela 1. Primeiro comparamos oligonucleotídeos 21-mer fosforotioato que consiste de nucleotídeos de uridina e citosina econtendo quatro, três ou dois tripletos de uridinas (oligonucleotídeos SSD8,SSD9 e SSD10, respectivamente). As diferenças entre oligonucleotídeosSSD8 e SSD9 foram apenas marginais, enquanto a indução de IFNa porSSDlO foi levemente reduzida (Fig. 4B). Todos os três oligonucleotídeoscontendo uma mistura de porções de uridina e citosina produziram níveisinferiores de IFNa do que o oligonucleotídeo 21-mer que consiste totalmentede nucleotídeos de uridina.

Em uma outra série de oligonucleotídeos 21-mer fosforotioato,mantivemos a quantidade de porções de uridina constante em três tripletos deuridinas, mas variamos a distância entre estes três tripletos de uridina a partirde uma citosina até cinco citosinas (oligonucleotídeos SSD21-SSD25). Ooligonucleotídeo com a distância mais curta entre os tripletos de uridina(SSD21, uma citosina entre os tripletos) induz os níveis altos de IFNa nestegrupo de oligonucleotídeos, mas foi, como esperado, menos eficiente naindução de IFNa do que poliUs-21, que totalmente consiste de nucleotídeosde uridina (Fig. 4C). A redução nos níveis de IFNa com o aumento dadistância entre os tripletos de uridina. Para oligonucleotídeo SSD25, para quea distância entre os tripletos de uridina seja uma extensão de cinco citosinas,dificilmente qualquer nível mensurável de IFNa foram induzidos (Fig. 4C).Para clarificar a influência da distância entre porções de uridina distintas naindução de IFNa, testamos uma segunda série de oligonucleotídeos 21-merque todos continham dez nucleotídeos de uridina, mas em forma de dez nucleotídeos de uridina simples separados por nucleotídeos de citosinasimples (SSD27), cinco nucleotídeos de uridina duplos separados pornucleotídeos de citosina simples (SSD28) ou uma extensão de 10 nucleotídeosde uridina flanqueado por extensões de nucleotídeos de citosina (SSD29).Para nossa surpresa, os oligonucleotídeos contendo uma extensão de 100 porções de uridina ou 5 dupletos de uridina foram muito potentes na induçãode IFNa e em concentrações altas produziram níveis de IFNa comparáveis aooligonucleotídeo poliUs-21 (Fig. 4D). Em contraste a isto, o oligonucleotídeoque consiste de alternar os nucleotídeos de uridina e citosina (SSD27) foramcomparavelmente deficientes em indução de IFNa nas culturas de Flt3L-DC.

Para testar se a posição de uridina no oligonucleotídeo tambémafeta a indução de IFNa, comparamos oligonucleotídeos 21-mer com omesmo número de nucleotídeos de uridina, a mesma distância entre porçõesde uridina, mas com as porções de uridina posicionadas nas extremidades dosoligonucleotídeos (SSD13 e SSDl5) ou com nenhuma porções de uridina nas extremidades (SSD8 e SSD14). Duas séries de tais oligonucleotídeos foramcomparados e em ambos os casos o oligonucleotídeo com nenhuma porção deuridina na extremidade foi levemente mais potente em indução de IFNa emudada a resposta da dose por aproximadamente metade de uma escala delogarítmico (Fig. 4E e F).

Em resumo, concluímos a partir destas séries de experimentosque não apenas o número absoluto de porções de uridina determina o nível deindução de IFNa, mas que a distância entre porções de uridina simplestambém influenciam na indução de IFNa. Além disso, os dados indicam queas porções de uridina na extremidade dos oligonucleotídeos não participam,até certo ponto, na indução de IFNa como porções de uridina que sãolocalizadas ainda no meio dos oligonucleotídeos.

PoliU RNA diferem-se a partir de outros homopolímeros deRNA em que é incapaz de formar estruturas helicoidas duplas em pH inferior.

Enquanto outros homopolímeros de RNA podem formar ligações entre doisfilamentos simples em pH inferior que não são fundamentados na formaçãode par de base Watson-Crick clássico de ácido nucleicos, o poliU RNA éincapaz atuar por causa de sua composição molecular. Portanto, uma possívelexplicação para o fato que apenas o poliU é reconhecido por TLR7 é suacapacidade persistir como filamento único de ácido nucleico em pH inferiortal como observado no compartimento endossômico, onde o reconhecimentode TLR7 acontece. Para testar suas hipóteses em seu ensaio de ativação comFlt3L-BMDC, testamos a capacidade de um oligonucleotídeo 21-merfosforotioato poliT RNA sintético (poliTs-21) para induzir IFNa por Flt3L-BMDC. Timidina difere-se a partir de nucleotídeos de uridina apenas por umgrupo metila adicional na posição C5 (Fig. 6a e B) e, portanto, o poliT RNAhomopolimérico é, semelhante ao poliU, incapaz de formar estruturasfilamentadas duplas em pH inferior. RNA contendo timidina nunca foi testadoem um ensaio de ativação TLR7, visto que os nucleotídeos timidina apenas apartir da parte de DNA naturalmente não estão presentes em moléculas deRNA. Apesar da similaridade alta na estrutura, o poliTs-21 foi incapaz deinduzir níveis mensuráveis de IFNa em qualquer das concentrações testadas(Fig. 5A). Como os oligonucleotídeo poliTs-21, os oligonucleotídeosfosforotioato RNA poliAs-21 e poliCs-21 também falharam para induzirIFNa, mas este foi esperado visto que os experimentos prévios mostraram quenem o poliA nem o poliC fosfodiéster RNA de comprimento não definidodisparou a produção de IFNa.

Em uma outra tentativa para testar se a natureza do filamentoúnico de poliU RNA é mais importante para ativação de TLR7 do que aporções de poliU presentes, fizemos uso de riboespaçador "nucleotídeos", queapenas consiste de cadeia principal de açúcar/fosfato, mas falta uma base.Projetamos oligonucleotídeos que consistem de uma mistura de uridina eriboespaçador (poliUspacer) ou citidina e nucleotídeos riboespaçador(poliCspacer). Como as porções de uridina, os nucleotídeos de riboespaçadorsão incapazes de formar ligações entre dois filamentos de RNA simples empH inferior que pode levar a formação de estruturas helicoidas duplas.Desejamos conhecer se o poliUespaçador iniciaria níveis de IFNa similar aum poliUs-21 ou similar a um oligonucleotídeo que consiste de porções deuridina e outros nucleotídeos que não são reconhecidos por TLR7 (SSD13).

Também testamos se o poliCespaçador induziria níveis de IFNa similar aooligonucleotídeo contendo uridina e porções de citosina (SSD13) ou se nãoinduziria IFNa em todos.

Quando ambos oligonucleotídeos contendo riboespaçadorforam comparados por oligonucleotídeos poliUs-21 e SSDl3, poliCespaçadorfalharam para induzir qualquer IFNa mensurável em qualquer dasconcentrações testadas e poliUespaçador de níveis induzidos bem abaixodaqueles obtidos pelo estímulo de oligonucleotídeo poliUs-21 ou SSD13 (Fig.5B). Quando juntos, a deficiência de timidina e riboespaçador "nucleotídeos"para substituir porções de uridina com respeito ao estímulo de TLR7 indicaque não é justo a natureza do filamento único de poliU RNA que é preservadoem pH inferior que leva o reconhecimento de TLR7 e estimulação, mas queantes a estrutura molecular de uracila que formam partes de motivo dereconhecimento para TLR7.

Antes do ssRNA viral ser identificado como o ligando naturalpara TLR7, foi mostrados que os modificadores de resposta imune de pesomolecular baixo tal como imidazoquinolinas e análogo de nucleosídeosestimulam o sistema imune inato por intermédio de um caminho dependentede TLR7. Para comparar a atividade de tal composto anti-viral pequeno comligando de RNA rico em uridina sintética, o Flt3L-DC foi cultivado napresença de complexos de poliUs-21/ΡΕΙ, a imidazoquinolina R848 ou aguanosina nucleosídeo loxoribina substituída. Como controle, as célulasforam tratadas com o oligonucleotídeo de DNA CpG 1668, que estimulouTLR9. Todos os ligandos de TLR foram usados em concentrações queproduziram indução de citocina máxima em experimentos prévios (dados nãomostrados). Surpreendentemente, os ligandos de ácido nucleico poliUs-21 eCpG foram aproximadamente 30 vezes mais potentes na indução de IFNa porFlt3L-DC do que o peso molecular baixo de compostos anti-virais R848 eloxoribina (Fig.7A). Em contraste a isto, a imidazoquinolina e o análogo denucleosídeo foram indutores melhores de IL-6 do que poliUs-21 (Fig.7B),embora a diferença na indução de citocina entre o ligando de RNA ecompostos anti-virais pequenos foram mais dramáticos para a indução deIFNa. Estes resultados indicam que ligandos de TLR7 diferentes podem terpreferências para as induções de citocinas particulares. Uma possívelexplicação para este fenômeno é o recrutamento de co-receptores aocomplexo de TLR/ligando, que pode ser mais importante para estimulação oscaminhos de sinalização particular levando à indução de citocinas tal comoIFNa. Uma outra possível explicação pode ser que o disparo dos caminhos desinalização diferentes a jusante de TLR7 é influenciado pela afinidade doligando. Embora a explicação para esta diferença na indução de citocina sejaincerta, pode levar a diferenças consideráveis nos tipos e na força da respostaimune que é induzida no tratamento in vivo e portanto pode influenciar noresultado terapêutico.

Os oligonucleotídeos homopoliméricos com base em uridinacurta foram também estimados por sua capacidade de ativar o pDC humano.Os modificadores de resposta imune de peso molecular baixo, tal comoimidazoquinolinas e análogo de nucleosídeos, bem como ssRNA rico em GUforam previamente relatados para ativar célula dendrítica de plasmocitóideshumanas. Para estimular se os oligonucleotídeos com base em U podemefetivamente ativar células humanas, plasmacitóide DC (pDC) forampurificados a partir de PBMC humano e ativado com o mais potenteoligonucleotídeo de RNA que liga fosforotioato (poliUs-21). Como mostradas na Fig. xA, o poliUs21+PEI induz a produção de IFN-α pelo pDC humano emuma maneira dependente da dose. Entretanto, a ótima dose de ssRNA foimaior para o pDC humano do que para camundongo Flt3L (3 μg/ml e 0,3μg/ml respectivamente). Como esperado a partir dos estudos comcamundongo mostrado acima, os oligonucleotídeos de RNA que liga fosforotioato poliAs-21 falharam para induzir IFNa (Figure 9A).

Para comparar a atividade de agonistas TLR7/8 diferentes emcélulas humanas, os pDC foram estimulados com complexos de poliUs21/PEI,controle de complexos de poliAs21/PEI, o imidazoquinolina R848, oscomplexos de RNA9.2DR oligonucleotídeos/LyoVec. Notavelmente, poliUs21, R848 e RNA9.2DR induzem os níveis equivalentes de produção deIFNa por pDC humano (Figure 9B). Além disso, enquanto ambos R848 eRNA9.2DR foram bons indutores de IL-6 por pDC humano, os poliUs21falharam para induzir a secreção de IL-6 por pDC (Figure 9C). Como relatadoacima para células de camundongo, estes resultados ainda sugerem que agonistas TLR7 diferentes podem induzir célula distintas e respostas decitocina.

As publicações totais e pedidos de patentes citadosnesta especificação são incorporados neste por referência em suatotalidade como se cada publicação individual ou pedido de patenteforam específicos e individualmente indicados a ser incorporados porreferência.

Embora a precedente invenção foi descrita em alguns detalhespor meio de ilustração e exemplo pelo propósito da claridade deentendimento, estará facilmente evidente para uma pessoa habilitada natécnica na luz das explicações desta invenção que certas mudanças emodificações podem ser feitas além disso sem divergir do espírito ou escopodas reivindicações anexas.

<table>table see original document page 90</column></row><table>Continuação

<table>table see original document page 91</column></row><table>

Tabela1

Lista de ligações de fosfodiéster com oligo de RNA (Uo),ligações de fosforotioato (Us, As, Cs, Gs, Ts), modificações 2'-0-metil (Um)ou como oligos de DNA (dUs, dUo).LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Câncer Research Technology Ltd

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA TRATAR DISTÚRBIOS HUMANOS

<130> B0511WO

<150> US 60/726,305

<151> 2005-10-12

<150> US 60/751,917

<151> 2005-12-20

<160> 32

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> DNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> η is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> η is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> η is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> η is a, c, g, t or u

<4 00> 1

uunuunuunu unuu 14

<210> 2

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<4 00> 2

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu u 21

<210> 3<211> 15<212> RNA<213> SINTÉTICO<400> 3

uuuuuuuuuu uuuuu 15

<210> 4

<211> 10

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<400> 4

uuuuuuuuuu 10

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 5

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu u 21

<210> 6

<211> 15

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1) . . (15)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 6

uuuuuuuuuu uuuuu 15

<210> 7

<211> 10

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(10)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 7

uuuuuuuuuu 10

<210><211><212>

8

21

DNA<213> SINTÉTICO

<220>

<221> modified_base<222> (1)..(21)<223> todos desoxiridina<4 00> 8

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu u 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> todos desoxiridina

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato

<4 00> 9

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(21)

<223> um

<4 00> 10

uuuuuuuuuu uuuuuuuuuu u 21

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> mi s c_RNA<222> (1)..(20)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 11

gcccgucugu ugugugacuc 20

<210> 12<211> 21<212> RNA<213> SINTÉTICO

<220>

<221> mi s c_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 12

ccuuuccuuu cuuuccuuuc c

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 13

cccccccuuu cuuuccuuuc c

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> mi s c_RNA<222> (1) .. (21)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 14

cccccccuuu cuuucccccc c

<210> 15

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> mi s c_RNA<222> (1) .. (21)

<223> todas ligações de fosforotioato<4 00> 15

uuucccuuuc ccuuucccuu u

<210> 16

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<4 00> 16

ccuuccuucc uuccuuccuu c 21

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> mi s c_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<4 00> 17

uucccuuccc uuccuucccu u 21

<210> 18

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> mi s c_RNA<222> (1) .. (21)

<223> todas ligações de fosforotioato<4 00> 18

cccccuuucu uucuuucccc c 21

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1) .. (21)

<223> todas ligações de fosforotioato<4 00> 19

ccccuuuccu uuccuuuccc c 21

<210> 20

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220><221>

mi sc RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato

<400> 20

cccuuucccu uucccuuucc c

<210> 21

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 21

ccuuuccccu uuccccuuuc c

<210> 22

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> mi s c_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 22

cuuucccccu uucccccuuu c

<210> 23

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 23

CUCUCUCUCU CUCUCUCUCU C

<210> 24

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA

<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<4 00> 24

ccccuucuuc uucuucuucc c 21

<210> 25<211> 21<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<4 00> 25

ccccccuuuu uuuuuucccc c 21

<210> 26

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<4 00> 26

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 21

<210> 27

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> mi s c_RNA<222> (1)..(21)

<223> todas ligações de fosforotioato<400> 27

cccccccccc cccccccccc c 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc-RNA

<222> (1)..(21)

<223> todos ácidos<220>

<221> misc-RNA

<222> (1) .. (21)

<223> todas ligações

ribonucleicos

de fosforotioato<400> 28

tttttttttt tttttttttt t 21

<210> 29

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA

<222> (4)..(6)

<223> ribo-espaçador

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(6)

<223> η is a, c, g, or u

<220>

<221> misc_RNA

<222> (10).. (12)

<223> ribo-espaçador

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(12)

<223> η is a, c, g, or u

<220>

<221> mi s c_RNA

<222> (16)..(18)

<223> ribo-espaçador

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(18)

<223> η is a, c, g, or u

<4 00> 29

uuunnnuuun nnuuunnnuu u 21

<210> 30

<211> 21

<212> RNA

<213> SINTÉTICO

<220>

<221> misc_RNA

<222> (1)..(3)

<223> ribo-espaçador

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (3)

<223> η is a, c, g, or u

<220>

<221> misc RNA<222> (7)..(9)

<223> ribo-espaçador

<220>

<221> misc_feature

<222> (7) . . (9)

<223> η is a, c, g, or u

<220>

<221> mi s c_RNA

<222> (13).. (15)

<223> ribo-espaçador

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(15)

<223> η is a, c, g, or u

<220>

<221> misc_RNA

<222> (19)..(21)

<223> ribo-espaçador

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(21)

<223> η é a, c, g, ou u

<400> 30

nnncccnnnc ccnnncccnn η 21

<210> 31<211> 5007<212> DNA<213> Homo sapiens

<400> 31

actccagata taggatcact ccatgccatc aagaaagttg atgctattgg gcccatctca 60

agctgatctt ggcacctctc atgctctgct ctcttcaacc agacctctac attccatttt 120

ggaagaagac taaaaatggt gtttccaatg tggacactga agagacaaat tcttatcctt 180

tttaacataa tcctaatttc caaactcctt ggggctagat ggtttcctaa aactctgccc 240

tgtgatgtca ctctggatgt tccaaagaac catgtgatcg tggactgcac agacaagcat 300

ttgacagaaa ttcctggagg tattcccacg aacaccacga acctcaccct caccattaac 360

cacataccag acatctcccc agcgtccttt cacagactgg accatctggt agagatcgat 420

ttcagatgca actgtgtacc tattccactg gggtcaaaaa acaacatgtg catcaagagg 480

ctgcagatta aacccagaag ctttagtgga ctcacttatt taaaatccct ttacctggat 540

ggaaaccagc tactagagat accgcagggc ctcccgccta gcttacagct tctcagcctt 600

gaggccaaca acatcttttc catcagaaaa gagaatctaa cagaactggc caacatagaa 660

atactctacc tgggccaaaa ctgttattat cgaaatcctt gttatgtttc atattcaata 720

gagaaagatg ccttcctaaa cttgacaaag ttaaaagtgc tctccctgaa agataacaat 780gtcacagccg tccctactgt tttgccatct actttaacag aactatatct ctacaacaac 840atgattgcaa aaatccaaga agatgatttt aataacctca accaattaca aattcttgac 900ctaagtggaa attgccctcg ttgttataat gccccatttc cttgtgcgcc gtgtaaaaat 960aattctcccc tacagatccc tgtaaatgct tttgatgcgc tgacagaatt aaaagtttta 1020cgtctacaca gtaactctct tcagcatgtg cccccaagat ggtttaagaa catcaacaaa 1080ctccaggaac tggatctgtc ccaaaacttc ttggccaaag aaattgggga tgctaaattt 1140ctgcattttc tccccagcct catccaattg gatctgtctt tcaattttga acttcaggtc 1200tatcgtgcat ctatgaatct atcacaagca ttttcttcac tgaaaagcct gaaaattctg 1260cggatcagag gatatgtctt taaagagttg aaaagcttta acctctcgcc attacataat 1320cttcaaaatc ttgaagttct tgatcttggc actaacttta taaaaattgc taacctcagc 1380atgtttaaac aatttaaaag actgaaagtc atagatcttt cagtgaataa aatatcacct 1440tcaggagatt caagtgaagt tggcttctgc tcaaatgcca gaacttctgt agaaagttat 1500gaaccccagg tcctggaaca attacattat ttcagatatg ataagtatgc aaggagttgc 1560agattcaaaa acaaagaggc ttctttcatg tctgttaatg aaagctgcta caagtatggg 1620cagaccttgg atctaagtaa aaatagtata ttttttgtca agtcctctga ttttcagcat 1680ctttctttcc tcaaatgcct gaatctgtca ggaaatctca ttagccaaac tcttaatggc 1740agtgaattcc aacctttagc agagctgaga tatttggact tctccaacaa ccggcttgat 1800ttactccatt caacagcatt tgaagagctt cacaaactgg aagttctgga tataagcagt 1860aatagccatt attttcaatc agaaggaatt actcatatgc taaactttac caagaaccta 1920aaggttctgc agaaactgat gatgaacgac aatgacatct cttcctccac cagcaggacc 1980atggagagtg agtctcttag aactctggaa ttcagaggaa atcacttaga tgttttatgg 2040agagaaggtg ataacagata cttacaatta ttcaagaatc tgctaaaatt agaggaatta 2100gacatctcta aaaattccct aagtttcttg ccttctggag tttttgatgg tatgcctcca 2160aatctaaaga atctctcttt ggccaaaaat gggctcaaat ctttcagttg gaagaaactc 2220cagtgtctaa agaacctgga aactttggac ctcagccaca accaactgac cactgtccct 2280gagagattat ccaactgttc cagaagcctc aagaatctga ttcttaagaa taatcaaatc 2340aggagtctga cgaagtattt tctacaagat gccttccagt tgcgatatct ggatctcagc 2400tcaaataaaa tccagatgat ccaaaagacc agcttcccag aaaatgtcct caacaatctg 2460aagatgttgc ttttgcatca taatcggttt ctgtgcacct gtgatgctgt gtggtttgtc 2520tggtgggtta accatacgga ggtgactatt ccttacctgg ccacagatgt gacttgtgtg 2580gggccaggag cacacaaggg ccaaagtgtg atctccctgg atctgtacac ctgtgagtta 2640gatctgacta acctgattct gttctcactt tccatatctg tatctctctt tctcatggtg 2700atgatgacag caagtcacct ctatttctgg gatgtgtggt atatttacca tttctgtaag 2760gccaagataa aggggtatca gcgtctaata tcaccagact gttgctatga tgcttttatt 2820gtgtatgaca ctaaagaccc agctgtgacc gagtgggttt tggctgagct ggtggccaaa 2880ctggaagacc caagagagaa acattttaat ttatgtctcg aggaaaggga ctggttacca 2940gggcagccag ttctggaaaa cctttcccag agcatacagc ttagcaaaaa gacagtgttt 3000gtgatgacag acaagtatgc aaagactgaa aattttaaga tagcatttta cttgtcccat 3060cagaggctca tggatgaaaa agttgatgtg attatcttga tatttcttga gaagcccttt 3120cagaagtcca agttcctcca gctccggaaa aggctctgtg ggagttctgt ccttgagtgg 3180ccaacaaacc cgcaagctca cccatacttc tggcagtgtc taaagaacgc cctggccaca 3240gacaatcatg tggcctatag tcaggtgttc aaggaaacgg tctagccctt ctttgcaaaa 3300cacaactgcc tagtttacca aggagaggcc tggctgttta aattgttttc atatatatca 3360caccaaaagc gtgttttgaa attcttcaag aaatgagatt gcccatattt caggggagcc 3420accaacgtct gtcacaggag ttggaaagat ggggtttata taatgcatca agtcttcttt 3480cttatctctc tgtgtctcta tttgcacttg agtctctcac ctcagctcct gtaaaagagt 3540ggcaagtaaa aaacatgggg ctctgattct cctgtaattg tgataattaa atatacacac 3600aatcatgaca ttgagaagaa ctgcatttct acccttaaaa agtactggta tatacagaaa 3660tagggttaaa aaaaactcaa gctctctcta tatgagacca aaatgtacta gagttagttt 3720agtgaaataa aaaaccagtc agctggccgg gcatggtggc tcatgcttgt aatcccagca 3780ctttgggagg ccgaggcagg tggatcacga ggtcaggagt ttgagaccag tctggccaac 3840atggtgaaac cccgtctgta ctaaaaatac aaaaattagc tgggcgtggt ggtgggtgcc 3900tgtaatccca gctacttggg aggctgaggc aggagaatcg cttgaacccg ggaggtggag 3960gtggcagtga gccgagatca cgccactgca atgcagcccg ggcaacagag ctagactgtc 4020tcaaaagaac aaaaaaaaaa aaacacaaaa aaactcagtc agcttcttaa ccaattgctt 4080ccgtgtcatc cagggcccca ttctgtgcag attgagtgtg ggcaccacac aggtggttgc 4140tgcttcagtg cttcctgctc tttttccttg ggcctgcttc tgggttccat agggaaacag 4200taagaaagaa agacacatcc ttaccataaa tgcatatggt ccacctacaa atagaaaaat 4260atttaaatga tctgccttta tacaaagtga tattctctac ctttgataat ttacctgctt 4320aaatgttttt atctgcactg caaagtactg tatccaaagt aaaatttcct catccaatat 4380ctttcaaact gttttgttaa ctaatgccat atatttgtaa gtatctgcac acttgataca 4440gcaacgttag atggttttga tggtaaaccc taaaggagga ctccaagagt gtgtatttat 4500ttatagtttt atcagagatg acaattattt gaatgccaat tatatggatt cctttcattt 4560tttgctggag gatgggagaa gaaaccaaag tttatagacc ttcacattga gaaagcttca 4620

gttttgaact tcagctatca gattcaaaaa caacagaaag aaccaagaca ttcttaagat 4680

gcctgtactt tcagctgggt ataaattcat gagttcaaag attgaaacct gaccaatttg 4740

ctttatttca tggaagaagt gatctacaaa ggtgtttgtg ccatttggaa aacagcgtgc 4800

atgtgttcaa gccttagatt ggcgatgtcg tattttcctc acgtgtggca atgccaaagg 4860

ctttacttta cctgtgagta cacactatat gaattatttc caacgtacat ttaatcaata 4920

agggtcacaa attcccaaat caatctctgg aataaataga gaggtaatta aattgctgga 4980

gccaactatt tcacaacttc tgtaagc 5007

<210> 32

<211> 1049

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Met Val Phe Pro Met Trp Thr Leu Lys Arg Gln Ile Leu Ile Leu Phe1 5 10 15

Asn Ile Ile Leu Ile Ser Lys Leu Leu Gly Ala Arg Trp Phe Pro Lys20 25 30

Thr Leu Pro Cys Asp Val Thr Leu Asp Val Pro Lys Asn His Val Ile35 40 45

Val Asp Cys Thr Asp Lys His Leu Thr Glu Ile Pro Gly Gly Ile Pro50 55 60

Thr Asn Thr Thr Asn Leu Thr Leu Thr Ile Asn His Ile Pro Asp Ile65 70 75 80

Ser Pro Ala Ser Phe His Arg Leu Asp His Leu Val Glu Ile Asp Phe85 90 95

Arg Cys Asn Cys Val Pro Ile Pro Leu Gly Ser Lys Asn Asn Met Cys100 105 110

Ile Lys Arg Leu Gln Ile Lys Pro Arg Ser Phe Ser Gly Leu Thr Tyr115 120 125

Leu Lys Ser Leu Tyr Leu Asp Gly Asn Gln Leu Leu Glu Ile Pro Gln130 135 140

Gly Leu Pro Pro Ser Leu Gln Leu Leu Ser Leu Glu Ala Asn Asn Ile145 150 155 160Phe Ser Ile Arg Lys Glu Asn Leu Thr Glu Leu Ala Asn Ile Glu Ile165 170 175

Leu Tyr Leu Gly Gln Asn Cys Tyr Tyr Arg Asn Pro Cys Tyr Val Ser180 185 190

Tyr Ser Ile Glu Lys Asp Ala Phe Leu Asn Leu Thr Lys Leu Lys Val195 200 205

Leu Ser Leu Lys Asp Asn Asn Val Thr Ala Val Pro Thr Val Leu Pro210 215 220

Ser Thr Leu Thr Glu Leu Tyr Leu Tyr Asn Asn Met Ile Ala Lys Ile225 230 235 240

Gln Glu Asp Asp Phe Asn Asn Leu Asn Gln Leu Gln Ile Leu Asp Leu245 250 255

Ser Gly Asn Cys Pro Arg Cys Tyr Asn Ala Pro Phe Pro Cys Ala Pro260 265 270

Cys Lys Asn Asn Ser Pro Leu Gln Ile Pro Val Asn Ala Phe Asp Ala275 280 285

Leu Thr Glu Leu Lys Val Leu Arg Leu His Ser Asn Ser Leu Gln His290 295 300

Val Pro Pro Arg Trp Phe Lys Asn Ile Asn Lys Leu Gln Glu Leu Asp305 310 315 320

Leu Ser Gln Asn Phe Leu Ala Lys Glu Ile Gly Asp Ala Lys Phe Leu325 330 335

His Phe Leu Pro Ser Leu Ile Gln Leu Asp Leu Ser Phe Asn Phe Glu340 345 350

Leu Gln Val Tyr Arg Ala Ser Met Asn Leu Ser Gln Ala Phe Ser Ser355 360 365

Leu Lys Ser Leu Lys Ile Leu Arg Ile Arg Gly Tyr Val Phe Lys Glu370 375 380

Leu Lys Ser Phe Asn Leu Ser Pro Leu His Asn Leu Gln Asn Leu Glu385 390 395 400

Val Leu Asp Leu Gly Thr Asn Phe Ile Lys Ile Ala Asn Leu Ser Met405 410 415

Phe Lys Gln Phe Lys Arg Leu Lys Val Ile Asp Leu Ser Val Asn Lys420 425 430

Ile Ser Pro Ser Gly Asp Ser Ser Glu Val Gly Phe Cys Ser Asn Ala435 440 445

Arg Thr Ser Val Glu Ser Tyr Glu Pro Gln Val Leu Glu Gln Leu His450 455 460

Tyr Phe Arg Tyr Asp Lys Tyr Ala Arg Ser Cys Arg Phe Lys Asn Lys465 470 475 480

Glu Ala Ser Phe Met Ser Val Asn Glu Ser Cys Tyr Lys Tyr Gly Gln485 490 495

Thr Leu Asp Leu Ser Lys Asn Ser Ile Phe Phe Val Lys Ser Ser Asp500 505 510

Phe Gln His Leu Ser Phe Leu Lys Cys Leu Asn Leu Ser Gly Asn Leu515 520 525

Ile Ser Gln Thr Leu Asn Gly Ser Glu Phe Gln Pro Leu Ala Glu Leu530 535 540

Arg Tyr Leu Asp Phe Ser Asn Asn Arg Leu Asp Leu Leu His Ser Thr545 550 555 560

Ala Phe Glu Glu Leu His Lys Leu Glu Val Leu Asp Ile Ser Ser Asn565 570 575

Ser His Tyr Phe Gln Ser Glu Gly Ile Thr His Met Leu Asn Phe Thr580 585 590

Lys Asn Leu Lys Val Leu Gln Lys Leu Met Met Asn Asp Asn Asp Ile595 600 605

Ser Ser Ser Thr Ser Arg Thr Met Glu Ser Glu Ser Leu Arg Thr Leu610 615 620

Glu Phe Arg Gly Asn His Leu Asp Val Leu Trp Arg Glu Gly Asp Asn625 630 635 640

Arg Tyr Leu Gln Leu Phe Lys Asn Leu Leu Lys Leu Glu Glu Leu Asp645 650 655Ile Ser Lys Asn Ser Leu Ser Phe Leu Pro Ser Gly Val Phe Asp Gly660 665 670

Met Pro Pro Asn Leu Lys Asn Leu Ser Leu Ala Lys Asn Gly Leu Lys675 680 685

Ser Phe Ser Trp Lys Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asn Leu Glu Thr Leu690 695 700

Asp Leu Ser His Asn Gln Leu Thr Thr Val Pro Glu Arg Leu Ser Asn705 710 715 720

Cys Ser Arg Ser Leu Lys Asn Leu Ile Leu Lys Asn Asn Gln Hθ Ajrg725 730 735

Ser Leu Thr Lys Tyr Phe Leu Gln Asp Ala Phe Gln Leu Arg Tyr Leu740 745 750

Asp Leu Ser Ser Asn Lys Ile Gln Met Ile Gln Lys Thr Ser Phe Pro755 760 765

Glu Asn Val Leu Asn Asn Leu Lys Met Leu Leu Leu His His Asn Arg770 775 780

Phe Leu Cys Thr Cys Asp Ala Val Trp Phe Val Trp Trp Val Asn His785 790 795 800

Thr Glu Val Thr Ile Pro Tyr Leu Ala Thr Asp Val Thr Cys Val Gly805 810 815

Pro Gly Ala His Lys Gly Gln Ser Val Ile Ser Leu Asp Leu Tyr Thr820 825 830

Cys Glu Leu Asp Leu Thr Asn Leu Ile Leu Phe Ser Leu Ser Ile Ser835 840 845

Val Ser Leu Phe Leu Met Val Met Met Thr Ala Ser His Leu Tyr Phe850 855 860

Trp Asp Val Trp Tyr Ile Tyr His Phe Cys Lys Ala Lys Ile Lys Gly865 870 875 880

Tyr Gln Arg Leu Ile Ser Pro Asp Cys Cys Tyr Asp Ala Phe Ile Val885 890 895

Tyr Asp Thr Lys Asp Pro Ala Val Thr Glu Trp Val Leu Ala Glu Leu900 905 910Val Ala Lys Leu Glu Asp Pro Arg Glu Lys His Phe Asn Leu Cys Leu915 920 925

Glu Glu Arg Asp Trp Leu Pro Gly Gln Pro Val Leu Glu Asn Leu Ser930 935 940

Gln Ser Ile Gln Leu Ser Lys Lys Thr Val Phe Val Met Thr Asp Lys945 950 955 960

Tyr Ala Lys Thr Glu Asn Phe Lys Ile Ala Phe Tyr Leu Ser His Gln965 970 975

Arg Leu Met Asp Glu Lys Val Asp Val Ile Ile Leu Ile Phe Leu Glu980 985 990

Lys Pro Phe Gln Lys Ser Lys Phe Leu Gln Leu Arg Lys Arg Leu Cys995 1000 1005

Gly Ser Ser Val Leu Glu Trp Pro Thr Asn Pro Gln Ala His Pro1010 1015 1020

Tyr Phe Trp Gln Cys Leu Lys Asn Ala Leu Ala Thr Asp Asn His1025 1030 1035

Val Ala Tyr Ser Gln Val Phe Lys Glu Thr Val1040 1045

Claims (54)

1. Oligonucleotídeo de filamento único, caracterizado pelo fatode que consiste dentre 10 e 50 nucleotídeos e que compreende uma seqüênciaselecionada de UUUr -(X)n-UUUr ou UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY em que:cada U é independentemente selecionado de um nucleotídeocontendo uracila;cada Y é independentemente selecionado de um nucleotídeonão contendo uracila cada X é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo;r é um número inteiro de 1 a 3;η é um número inteiro de 1 a 4; eρ é um número inteiro maior do que 4; eem que o dito oligonucleotídeo compreende pelo menos umnucleotídeo não contendo uracila ou pelo menos uma ligação não natural.

2. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo consiste dentre 10 e 19nucleotídeos.

3. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo consiste dentre 19 e 50nucleotídeos.

4. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo consiste dentre 15 e 30nucleotídeos.

5. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo consiste dentre 21 e 30nucleotídeos.

6. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo consiste dentre 15 e 21nucleotídeos.

7. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo consiste de 15nucleotídeos ou 21 nucleotídeos.

8. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende aseqüência UUUr-(X)n-UUUr, r é 2 e η é 1.

9. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o oligonucleotídeo compreende a seqüência(UUU-(X)n)mj em que:η é um número inteiro de 1 a 4; em é um número inteiro maior do que 2.

10. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que η é 1.

11. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que m é 3 ou 4.

12. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende aseqüência Y(U)pY e ρ é um número inteiro maior do que 9.

13. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que cada U é uridina e o dito oligonucleotídeocompreende pelo menos uma ligação não natural.

14. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é selecionado de um 21-mero que compreendeuma ou mais ligações de fosforotioato e que consiste totalmente de uridinas;um 21-mero que compreende pelo menos 10 uridinas consecutivas; e um 21-mero que compreende a seqüência UUXUUXUUXUUXUU, em que cada U éuridina e cada X é independentemente selecionado de qualquer nucleotídeo.

15. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende pelomenos 50% de nucleotídeos contendo uracila.

16. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende menos doque 50% de nucleotídeos contendo guanina.

17. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo é selecionado depoliUo-21, poliUo-15, poliUo-10, poliUs-21, poliUs-15, polidUo-21,polidUs-21, SSD8, SSD9, SSD10, SSD13, SSD14, SSD15, SSD21, SSD22,SSD23, SSD24, SSD28 ou SSD29.

18. Oligonucleotídeo de filamento único, caracterizado pelofato de que consiste dentre 11 e 50 nucleotídeos e que compreende umaseqüência selecionada de: GGG-(X)n-GGG, GG-X-GG-X-GG ou Z(G)pZ5 emque:cada G é independentemente selecionado de um nucleotídeocontendo guanina;cada X é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo;cada Z é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo que não guanina;η é um número inteiro de 1 a 4; eρ é um número inteiro maior do que 4,em que o dito oligonucleotídeo compreende pelo menos um não nucleotídeocontendo guanina ou pelo menos uma ligação não natural.

19. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende aseqüência GGG-(X)n-GGG e η é 1.

20. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende aseqüência (GGG-(X)n)m, em que:η é um número inteiro de 1 a 4; em é um número inteiro maior do que 2.

21. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que η é 1.

22. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que m é 3 ou 4.

23. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende aseqüência Z(G)pZ e ρ é um número inteiro maior do que 9.

24. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 18,caracterizado pelo fato de que cada G é guanosina.

25. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 18caracterizado pelo fato de que ainda compreende uma seqüência selecionadade: UUU-(X)n-UUU ou UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY, em que:cada U é independentemente selecionado de um nucleotídeocontendo uracila;cada Y é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo que não contenha uracila;cada η é independentemente selecionado; ecada ρ é independentemente selecionado.

26. Oligonucleotídeo de acordo com as reivindicações 1 ou 18,caracterizado pelo fato de que ainda compreende pelo menos umdinucleotídeo de CpG.

27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende:a. uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo de filamentoúnico que consiste dentre 10 e 50 nucleotídeos e que compreende umaseqüência selecionada de: UUU-(X)n-UUU ou UU-X-UU-X-UU ou Y(U)pY,em que:cada U é independentemente selecionado de um nucleotídeocontendo uracila;cada X é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo;η é um número inteiro de 1 a 4; eρ é um número inteiro maior do que 4; eb. um carreador farmaceuticamente aceitável.

28. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende:a. uma quantidade eficaz de um oligonucleotídeo de filamentoúnico que consiste dentre 11 e 50 nucleotídeos e que compreende umaseqüência selecionada de: GGG-(X)n-GGG, GG-X-GG-X-GG ou Z(G)pZ, emque:cada G é independentemente selecionado de um nucleotídeo contendo guanina;cada X é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo;cada Z é independentemente selecionado de qualquernucleotídeo que não guanina;η é um número inteiro de 1 a 4; eρ é um número inteiro maior do que 4; eb. um carreador farmaceuticamente aceitável.

29. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações-27 ou 28, caracterizada pelo fato de que o dito oligonucleotídeo é complexadocom um agente de compactação ou um lipossoma.

30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-29, caracterizada pelo fato de que o agente de compactação é polietilenimina.

31. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações-27 ou 28, caracterizada pelo fato de que ainda compreende um antígeno.

32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o dito antígeno é selecionado de umantígeno viral, um antígeno de câncer ou um alérgeno.

33. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 27 ou 28 caracterizada pelo fato de que ainda compreende um segundo agenteterapêutico.

34. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o dito segundo agente terapêutico éselecionado de um agente de quimioterapia, um agente de radioterapia, umacitotoxina, um agente anti-angiogênico, um anticorpo monoclonal direcionadocontra um antígeno de câncer, um agente imunomodulador, uma citocina, umagente que afeta a superregulagem de receptores de superfície celular oujunções GAP; um agente citostático ou de diferenciação; ou um inibidor deadesão celular ou um agente antiviral.

35. Método para estimular a atividade de TLR7 em uma célulaque expressa TLR7, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa decontactar a célula com um oligonucleotídeo como definido na reivindicação 1.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que a dita célula é uma célula dendrítica plasmocitóide.

37. Método para estimular a atividade de TLR8 em uma célulaque expressa TLR8, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa decontactar a célula com um oligonucleotídeo como definido na reivindicação 18.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que a dita célula é selecionada de uma célula dendrítica mielóide,um monócito ou uma célula T reguladora de CD4+.

39. Método para estimular uma resposta imune em umpaciente, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar aodito paciente uma composição como definida na reivindicação 27.

40. Método para estimular uma resposta imune em umpaciente, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administrar aodito paciente uma composição como definida na reivindicação 28.

41. Método de acordo com as reivindicações 39 ou 40,caracterizado pelo fato de que é usado para tratar ou prevenir o câncer, umadoença infecciosa, alergia, asma ou uma doença autoimune; ou é usado pararealçar a função imune em um paciente que resulta de doença, cirurgia ouadministração de um agente imunossupressivo.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que é usado para tratar câncer ou para tratar ou prevenir umadoença viral.

43. Método de acordo com as reivindicações 39 ou 40,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa inicial de detectaratividade de célula imune do paciente a seguir da administração dacomposição.

44. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de que o dito câncer é selecionado de carcinoma, incluindo aqueleda bexiga, mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata, pâncreas,estômago, cérvix, tireóide e pele, incluindo carcinoma de célula escamosa;tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide, incluindo leucemia, leucemialinfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda, linfoma de célula B, linfomade célula T, linfoma de Hodgkins, linfoma de não Hodgkins, linfoma decélula pilosa e linfoma de Burketts; tumores hematopoiéticos de linhagemmielóide, incluindo leucemias miologênicas agudas e crônicas e leucemiapromielocíticas; tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcomae rabdomiossarcoma; outros tumores, incluindo melanoma, seminoma,teratocarcinoma, neuroblastoma e glioma; tumores do sistema nervoso centrale periférico, incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schvanomas;tumores de origem mesenquimatosa, incluindo fibrossarcoma,rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma,xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, câncer folicular datireóide e teratocarcinoma.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa inicial de administrar ao paciente umagente selecionado de um agente quimioterapêutico, um agenteradioterapêutico, um agente anti-angiogênico, uma imunotoxina alvejada, umcoaguligando alvejado, uma citocina, um agente de terapia hormonal ou umanticorpo terapêutico, em que o dito agente é administrado como uma forma de dosagem separada ou como parte da dita composição.

46. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizadopelo fato de que a dita doença viral é selecionada de causada por um vírusselecionado de enterovírus (incluindo, mas não limitado a, vírus que a famíliapicornaviridae, tal como vírus da polimielite, vírus coxsackie, vírus echo),rotavírus, adenovírus, vírus da hepatite. Os exemplos específicos de vírus queforam descobertos em seres humanos incluem mas não são limitados a:Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiência humana, tal como oHIV-I (também aludido como HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV ou HIV-III; e outros isolados, tais como HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, vírus da poliomielite, vírus da hepatite A; enterovírus, vírus Coxsackie humano,rinovírus, ecovírus); Calciviridae (por exemplo, cepas que causamgastroenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus da encefalite eqüina, vírus darubéola); Flaviviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite,vírus da febre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus);Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular, vírus da raiva);Filoviridae (por exemplo, vírus ebola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírusda parainfluenza, vírus da caxumba, vírus do sarampo, vírus do sincicialrespiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da influenza) ou vírus dainfluenza aviária (por exemplo, H5N1 ou vírus relacionado); Bungaviridae(por exemplo, Vírus Hantaan, vírus bunga, flebovírus e vírus Nairo);Arenaviridae (vírus da febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo,reovírus, orbivírus e rotavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus daHepatite B); Parvoviridae (parvovírus); Papovaviridae (papilomavírus,polioma vírus); Adenoviridae (a maioria adenovírus); Herpesviridae (vírussimples do herpes (HSV) 1 e 2, vírus zoster da varicela, citomegalovírus(CMV)); Poxviridae (vírus varíola, vírus da vaccínia, pox vírus); Iridoviridae(por exemplo, vírus da febre suína africana); ou vírus não classificado (porexemplo, os agentes etiológicos de encefalopatias espongiformes, o agente dahepatite delta, os agentes da hepatite não A, não B; Norwalk e vírusrelacionado ou astrovírus).

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracterizadopelo fato de que compreende a etapa inicial de administrar ao paciente umagente selecionado de um análogo de nucleosídeo, um inibidor datranscriptase reversa não nucleotídeo, um inibidor da protease viral, umanticorpo contra uma proteína viral, um agente que não de revestimento viralou uma citocina, em que o dito agente é administrado como uma forma dedosagem separada ou como parte da dita composição.

48. Dispositivo de liberação de droga implantável,caracterizado pelo fato de que é impregnado com ou contendo umacomposição como definida nas reivindicações 27 ou 28, tal que o ditooligonucleotídeo na dita composição é liberado do dito dispositivo e éterapeuticamente ativo.

49. Método para impregnar ou encher um dispositivo deliberação de droga implantável, caracterizado pelo fato de que compreende aetapa de contactar o dito dispositivo de liberação de droga com umacomposição como definida na reivindicação 27 ou 28.

50. Composição de matéria, caracterizada pelo fato de quecompreende:a. uma composição como definida nas reivindicações 27 ou-28; eb. um segundo agente selecionado de: um agente terapêuticoútil no tratamento de câncer, um agente terapêutico útil no tratamento dedoença infecciosa, um antígeno de câncer, um antígeno viral ou um alérgeno;em que a dita composição e o dito segundo agente estão emformas de dosagem separadas, mas associados entre si.

51. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende emrecipientes separados:a. uma composição como definido nas reivindicações 27 ou 28; eb. um segundo agente selecionado de: um agente terapêuticoútil no tratamento de câncer, um agente terapêutico útil no tratamento dedoença infecciosa, um antígeno de câncer, um antígeno viral ou um alérgeno.

52. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende:a. um oligonucleotídeo como definido nas reivindicações 1 ou 18; eb. um marcador detectável.

53. Método para detectar a ligação de um oligonucleotídeo deteste a TLR7 ou TLR8, caracterizado pelo fato de que compreende as etapasde:a. contactar o conjugado de acordo com a reivindicação 52com um material contendo TLR7 ou TLR8, em que a dita porção deoligonucleotídeo do dito conjugado tem a mesma seqüência de nucleotídeo eligações inter-nucleotídicas como o dito oligonucleotídeo de teste; eb. detectar o dito marcador detectável.

54. Método para determinar se uma molécula de teste se liga aTLR7 ou TLR8, caracterizado pelo fato de que compreende a etapas de:a. contactar o conjugado como definido na reivindicação 52com um material contendo TLR7 ou TLR8 na ausência da dita molécula deteste;b. quantificar a quantidade de marcador detectável ligado aodito material contendo TLR7 ou TLR8;c. contactar o conjugado como definido na reivindicação 52com um material contendo TLR7 ou TLR8 na presença da dita molécula deteste; ed. determinar se a presença da dita molécula de teste reduziu aquantidade de marcador detectável ligado ao material contendo TLR7 ou TLR8.