KR101441415B1 - 신규한 ｓｉＲＮＡ, 이를 이용한 오소폭스바이러스에 대한 항바이러스 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열 번호 1의 염기서열을 갖는 siRNA 및 이를 유효 성분으로 포함하는 오소폭스바이러스에 대한 항바이러스 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 siRNA는 백시니아 바이러스 유전자 mRNA에 결합 한 후, mRNA의 분해를 유도하여 유전자의 발현을 저해함으로써 백시니아 바이러스의 증식을 억제시킬 수 있다. 또한 상기 siRNA는 백시니아 바이러스와 같은 계통의 바이러스인 바리올라 바이러스 감염에 의해 발병하는 천연두의 치료 및 예방에 사용 될 수 있다.

Description

신규한 ｓｉＲＮＡ, 이를 이용한 오소폭스바이러스에 대한 항바이러스 조성물{Novel siRNA, Antiviral composition against orthopoxvirus using the same}

본 발명은 siRNA(small interfering RNA)를 이용하여 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 증식을 억제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 사용되는 siRNA는 백시니아 B1R 유전자 염기서열 422 - 441 지역에 상응하는 이중가닥의 siRNA로써 이에 의하여 B1R 유전자 발현이 저해되어 백시니아 바이러스 증식을 억제 시킬 수 있다. 또한 제공된 핵산 화합물인 siRNA는 인간세포에서 안전함이 확인되어 같은 계통의 바이러스인 바리올라 바이러스(variola virus) 감염에 의해 발생되는 천연두 질병의 예방 및 치료제로 사용 될 수 있다.

천연두는 바리올라 바이러스에 의해 발병하는 감염성과 치사율이 매우 높은 급성 전염성 질병이다. 이병의 증상은 얼굴과 팔, 다리 부위에 발진이 생기기 시작하여 점차적으로 물집으로 발전하여 결국 사망에 이를 수 있는 질병이다. 바리올라 바이러스는 분류학적으로 오소폭스바이러스(orthopoxvirus) 계통에 속하며, 같은 계통으로 분류되는 백시니아 바이러스와 교차면역이 가능하고, 유전적으로도 매우 유사하여 두 바이러스의 게놈은 거의 비슷하여 유전자 서열 상동성이 95%을 상회하며, 대부분의 주요 유전자의 단백질은 동일한 것으로 알려져있다. 그러나 바리올라 바이러스에 비하여 백시니아 바이러스는 사람에게 질병을 일으키지 않으므로 천연두 질병의 연구에 백시니아 바이러스가 널리 사용되고 있다. 이러한 두 바이러스의 유사한 유전적 성질을 이용하여 그동안 백시니아 바이러스로 생산된 백신을 사용하여 1980년 WHO는 지구상에서 천연두의 박멸을 선언할 수 있었다. 그러나 그동안 사용된 백시니아 바이러스를 사용한 백신은 생백신으로 제조 기술이 매우 오래된 기술이며 또한 심각한 부작용 현상을 동반하여 현대 의학적 관점에서 다시 사용하기에는 부적합한 것으로 판정되었다.

박멸 선언 후 지구상에서 더 이상의 백신 접종이 이루어지지 않고 있기 때문에, 최근 급격한 환경 변화에 의한 천연두 바이러스의 재출현 가능성에 대하여 세계 각국의 보건 관계자들은 심각한 우려를 표하고 있으며, 또한 바리올라 바이러스는 배양이 쉽고 동결건조가 가능하며, 건조한 공기 중에서도 장기간 생존할 수 있는 특징을 가져 바이오 테러용 생물 무기로 사용될 가능성이 매우 높다고 보고되었다. 이러한 이유로 천연두에 대한 새로운 예방 및 치료법의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 이중가닥 RNA에 의하여 염기서열 특이적으로 mRNA를 분해하는 현상으로 유전자 발현을 조절하는 방법으로 다양한 동물 및 식물에서 관찰되었다. 세포에서 19 ~ 23개의 뉴클레오티드(nucleotide)를 가지는 siRNA는 RISC(RNA-induced silencing complex)를 통하여 목표 RNA를 인식하고 분해를 유도하여 유전자 발현을 억제한다. 따라서 이를 이용하여 화학적으로 합성된 siRNA 또는 siRNA를 발현 할 수 있는 shRNA(short hairpin RNA) 벡터를 in vitro 또는 in vivo에 넣어 주어 특정 유전자 발현을 조절시켜 질병을 치료 할 수 있는 새로운 치료법으로의 가능성을 보여 주었다. 특히 최근에는 바이러스 증식 억제에 siRNA 기술이 매우 효과적인 것으로 밝혀져 siRNA를 이용한 항바이러스 제재 연구가 활발하게 진행되고 있다.

이에 본 발명자들은 이중가닥의 siRNA를 합성하여 이 siRNA가 효율적으로 백시니아 바이러스의 증식을 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Dave RS et al., 2006, Virology, 348:489-497 Stephen C et al., 2004, PNAS 101:11178- 11192

본 발명의 목적은 천연두 질병의 원인이 되는 바리올라 바이러스의 증식을 억제하는 방법으로 백시니아 바이러스 B1R 단백질을 암호화하는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하여 유전자의 발현을 억제 시킬 수 있는 이중가닥의 siRNA를 제공하여 인간세포에서 바이러스의 증식이 억제됨을 확인하는 것을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 갖는 siRNA를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA를 유효성분으로 포함하는, 오소폭스바이러스(orthopoxvirus)에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제작된 siRNA는 효과적으로 백시니아 바이러스의 증식을 억제하고 인간세포에서 안전한 핵산 화합물임이 밝혀져 이를 이용하여 백시니아 바이러스와 같은 계통의 바이러스인 바리올라 바이러스에 의해 발병되는 천연두의 예방과 치료에 사용 될 수 있다.

도1은 백시니아 바이러스 B1R 유전자 및 이에 상응하는 본 발명의 siRNA 구조를 나타낸 모식도이다.
도2는 본 발명에 따른 143 TK- 세포에 백시니아 바이러스를 감염시킨 뒤 플라그 형성을 보여 주는 사진으로, (A)는 바이러스에 감염되지 않은 대조군이고, (B)는 바이러스에 감염된 실험군을 나타낸다.
도3은 본 발명에 따른 다양한 농도의 siRNA를 전처리 후 백시니아 바이러스를 감염시킨 세포에서 플라그 형성을 나타낸 그래프이다.
도4는 본 발명에 따른 100 nM의 siRNA를 처리 후에 나타난 플라그 형성 억제를 보여 주는 사진이다.
도5는 본 발명에 따른 100 nM의 siRNA를 처리 후에 143 TK- 세포의 세포독성도를 측정한 결과 그래프로, 대조군(control)은 siRNA를 처리하지 않은 세포이고, 실험군은 100nM의 siRNA를 처리 한 세포를 나타낸다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명은 하기와 같은 염기서열을 갖는 siRNA를 제공한다.

5‘-GGAUAUUCUCACGGAGAUA-3’ (서열번호 1)

위 siRNA 염기서열은 B1R 유전자 염기서열 422-441 지역에 상응하는 염기서열이 선택되었다. 본 발명에서 선택된 B1R 유전자는 serine/threonine protein kinase로 DNA 합성에 반드시 필요한 단백질이다. 본 발명의 siRNA 는 19개의 염기를 갖는 이중 가닥 RNA로써 상기와 같이 선택된 염기서열에 상응하는 19개의 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)와 3-말단에 디옥시티민(deoxythymine) 2개가 첨부된 총 21개의 센스 폴리뉴클레오티드와 이에 상보적인 안티센스 폴리뉴클레오티드로 구성되었다.

상기 siRNA는 오소폭스바이러스(orthopoxvirus)의 증식을 억제할 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 siRNA는 백시니아 바이러스 또는 바리올라 바이러스(variola virus)의 증식을 억제할 수 있다.

또한, 상기 siRNA는 오소폭스바이러스의 B1R 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

상기와 같이 제작된 siRNA의 효능은 백시니아 바이러스에 감염된 인간 세포주인 143 TK- 세포를 이용하여 바이러스의 증식이 억제되는 정도를 플라그 형성 분석(plaque assay)을 통하여 확인하였다. 플라그 형성 분석 결과 상기 siRNA는 siRNA 농도 60 ~ 150 nM에서 확실한 바이러스 증식 억제 효과가 있음이 확인 되었으며, 또한 제작된 siRNA는 투여 농도에서 안전한 화합물로 세포에서 세포 독성을 유발 하지 않는 것으로 확인 되었다. 이와 같이 본 발명의 siRNA는 인간 세포에서 효과적인 바이러스 억제 효과를 가지는 동시에 안전한 화합물임을 확인 하였다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA를 유효성분으로 포함하는, 오소폭스바이러스(orthopoxvirus)에 대한 항바이러스 조성물을 제공한다. 보다 상세하게는, 상기 오소폭스바이러스(orthopoxvirus)가 백시니아 바이러스 또는 바리올라 바이러스인 항바이러스 조성물을 제공한다.

본 발명의 siRNA는 통상적인 방법에 따라 약학적 제재로 제조되어 사용될 수 있다. 필요에 따라 핵산을 세포에 주입시키는 방법에 따라 투여 할 수 있으며 최근에 개발된 리포좀(liposome), 폴리머(polymer), 펩타이드(peptide)등을 이용한 세포 전달법을 사용 할 수 있다.

투여되는 siRNA 양은 세포에서 siRNA 농도 60 ~ 150 nM인 것이 바람직하다. 그러나, 실제 투여양은 환자의 질환 정도, 나이, 체중, 투여 방법 등의 여러 상황을 고려하여 결정되어야 하며 본 발명의 투여 범위에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. siRNA 선정 및 제작

백시니아 바이러스의 유전자 정보 서열(Gene bank accession no. AY243312)을 National Center for Biotechonology Information으로 부터 얻어 목표 유전자인 B1R 유전자의 전체 염기서열을 확인하였다. B1R 유전자 중 염기서열 422 - 441 지역을 목표 지역으로 선정하여 Ambion(www.ambiob.com)과 Dharmacom(www.dharmacon.com)의 siRNA 디자인 프로그램을 이용하여 목표 지역에 해당하는 siRNA를 제작하였다. 이 후 Bioneer사에 (대전, 대한민국) 의뢰하여 dTdT 오버행(overhang)을 갖는 21-염기의 이중가닥 siRNA를 합성하여 이를 서열번호 1로 명명하였다(도 1 참조).

실시예 2. 세포 배양

인간 세포주인 143 TK- 세포를 100mm 배양 접시에서 10% 우태아혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신(1%, w/v)을 함유하는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 배양 배지로 37℃, 5% CO₂ 배양 조건의 배양기에서 배양하였다. 세포가 약 70% confluency 정도가 되었을 때 siRNA 억제 효과 실험에 사용하였다.

실시예 3. 플라그 형성 분석법

백시니아 균주인 VACV-WR을 ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입하여 이미 문헌(Vigne S et al., 2009, Antimicrob. Agents Chemother, 53:2579-2588)에 밝혀진 방법으로 플라그 형성 분석법을 실행하였다. 도 2에서는 상기 방법에 의해 (A)는 바이러스가 감염되지 않은 세포의 대조군과 (B)는 바이러스가 감염된 세포의 실험군에서 형성된 플라그를 나타내었다.

실시예 4. siRNA 에 의한 바이러스 증식 억제 효과 분석

siRNA에 의한 바이러스 증식 억제 효과를 보기 위해서 먼저 143 TK- 세포를 siRNA로 형질전환 시켰다. 형질전환 방법은 Lipofectamine2000 (Invitrogen, 미국)을 이용하여 다양한 농도의 siRNA를 세포에 첨가하였다. 이때 siRNA와 Lipofectamine2000의 복합체 형성은 제조사에서 제공된 방법을 사용하였다. siRNA로 형질전환 시킨 4시간 후 다시 세포를 200 pfu/㎖ 농도의 백시니아 바이러스로 감염시켜 주었다. 2시간 동안 세포를 바이러스에 감염시킨 후 세포를 PBS로 세척하고 새로운 배양 배지로 교환한 다음 48시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양 조건의 배양기에서 세포를 배양하였다. 48시간 배양 후 세포를 0.1%(w/v) 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 포함한 20%(v/v) 에탄올 용액으로 30분간 염색한 후, 형성된 플라그 수를 측정하여 바이러스 증식 정도를 분석하였다. 한편 대조군으로 siRNA 처리 없이 바이러스만 감염 시킨 세포 및 nonsense siRNA를 처리하고 바이러스를 감염시킨 세포를 사용하였다(도3 참조). 사용된 nonsense siRNA의 서열은 다음과 같다.

5’-CCUACGCCACCAAUUUCGUdTdT-3’(서열번호 2)

도 3은 siRNA 처리로 인한 바이러스 증식 억제 효과를 그래프로 나타낸 것으로 siRNA 농도 60 ~ 150 nM에서 플라그 형성이 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 특히 100 nM 농도의 siRNA에서 효율적인 바이러스 증식 억제 효과를 확인 할 수 있었다.

도 4는 siRNA 효과를 사진으로 보여 주는 것으로 (A)는 대조군으로 바이러스와 siRNA를 처리하지 않은 세포에서는 플라그 형성을 볼 수 없었으나, (B)는 바이러스만 처리한 세포로써 많은 플라그가 형성되었으며 (C)는 바이러스와 siRNA를 처리한 세포로 다시 플라그 형성이 감소된 것을 확인 할 수 있었다.

실시예 5. siRNA 에 의한 세포 독성 분석

핵산 화합물인 제작된 siRNA에 의한 세포독성이 발생하는지를 MTT 분석법을 이용하여 확인하였다. 143 TK- 세포를 96-well plate에 well 당 1 x 10⁶ 개의 농도로 키운 다음 siRNA를 처리하지 않은 대조군과 100 nM 농도의 siRNA를 처리한 실험군으로 나누어 48시간 배양 후 MTT 방법으로 세포 치사율을 측정하였다. 세포 치사율 측정 방법으로는 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드) 분석 방법을 사용하였다. 이 방법은 세포 내부의 미토콘드리아에 있는 효소인 디하이드로게나제(dehydrogenase)가 테트라졸리움염을 청색을 띠는 물질인 포르마잔(formazan)으로 변환시킬 수 있는 정도를 측정하는 방법이다. 즉 세포가 훼손되는 정도에 비례하여 포르마잔으로 변환시키는 디하이드로게나제의 능력도 감소된다. 이 방법은 세포 독성도를 측정하는 방법으로 가장 보편적으로 사용되고 있다.

도5는 MTT 분석 결과를 그래프로 보여주는 것으로 143 TK-세포에서 siRNA처리한 세포의 생존율은 대조군인 세포와 차이가 없는 것으로 나타났다.

<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT <120> Novel siRNA, Antiviral composition against orthopoxvirus using the same <130> PT20120804 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA for specific inhibition of vaccinia virus replication <400> 1 ggauauucuc acggagaua 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nonsense siRNA <400> 2 ccuacgccac caauuucgu 19

Claims (7)

1. 삭제
2. 서열 번호 1의 염기서열을 갖는 siRNA로, 상기 siRNA는 오소폭스바이러스(orthopoxvirus)의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, siRNA.
3. 서열 번호 1의 염기서열을 갖는 siRNA로, 상기 siRNA는 백시니아 바이러스 또는 바리올라 바이러스(variola virus)의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, siRNA.
4. 서열 번호 1의 염기서열을 갖는 siRNA로, 상기 siRNA는 오소폭스바이러스의 B1R 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, siRNA.
5. 서열 번호 1의 염기서열을 갖는 siRNA를 유효성분으로 포함하는, 오소폭스바이러스에 대한 항바이러스 조성물.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 오소폭스바이러스가 백시니아 바이러스 또는 바리올라 바이러스 인 것을 특징으로 하는, 오소폭스바이러스에 대한 항바이러스 조성물.
7. 청구항 5에 있어서, 상기 siRNA의 양은 세포에서 siRNA 농도가 60 ~ 150 nM인 것을 특징으로 하는, 오소폭스바이러스에 대한 항바이러스 조성물.

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