ES2933623T3 - Composiciones de Mycoplasma Bovis - Google Patents

Abstract

En el presente documento se describen composiciones inmunogénicas de Mycoplasma bovis útiles para generar una respuesta inmunitaria en animales contra M. bovis. También se describen aquí métodos para generar una respuesta protectora contra infecciones en mamíferos causadas por M. bovis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de Mycoplasma Bovis

Campo de la invención

La presente invención se refiere a composiciones inmunogénicas de Mycoplasma bovis. La presente invención se refiere además a composiciones inmunogénicas para su uso en el aumento de una respuesta inmunitaria en animales contra M. bovis, y a procedimientos para generar una respuesta protectora contra infecciones en mamíferos causadas por M. bovis.

Antecedentes de la invención

Mycoplasma bovis causa múltiples enfermedades en los rebaños bovinos de todo el mundo, incluyendo, por ejemplo, mastitis, neumonía, artritis, otitis, abscesos cutáneos, infertilidad, aborto o combinaciones de las mismas. En cada una de las formas de la enfermedad puede haber mortalidad. Por lo tanto, M. bovis es una preocupación importante para los productores de leche y de carne de vacuno, así como para los veterinarios de todo el mundo. Se han desarrollado y propuesto diversos antibióticos como herramientas para mitigar las pérdidas económicas y la mortalidad producida por este patógeno. La prevención de la enfermedad mediante la aplicación de una vacuna segura y eficaz ofrece importantes ventajas frente a la terapia con antibióticos, a través de la mejora el bienestar de los animales, la mejora en economía de los productores y soporte para el uso racional de los antibióticos. Se han desarrollado vacunas que contienen M. bovis inactivado (por ejemplo, muerto). Sin embargo, las vacunas muertas suelen presentar largos retrasos en el inicio de una respuesta protectora, pueden requerir más de una dosis y, en algunos casos, pueden necesitar adyuvantes que no son adecuados en determinadas aplicaciones. El documento US 2009/068231 A1 se refiere a vacunas atenuadas contra Mycoplasma, incluyendo M. bovis, bacterias que presentan una expresión reducida de ciertas proteínas y sugiere la atenuación química como procedimiento para obtenerlas.

Las vacunas vivas atenuadas, o vivas modificadas, tienen la ventaja de que pueden conducir al desarrollo de una respuesta inmunitaria más rápida, suelen ser eficaces cuando se administran en una sola dosis y, por lo general, son menos costosas de producir. Por lo tanto, es necesario mejorar las vacunas contra M. bovis, incluidas las vacunas vivas atenuadas.

Sumario de la invención

Los solicitantes han identificado sorprendentemente composiciones inmunogénicas útiles para generar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por Mycoplasma bovis en mamíferos. Además, pueden combinarse con un adyuvante. Dichas composiciones también pueden combinarse con antígenos adicionales, dando lugar a composiciones multivalentes para combatir múltiples infecciones en mamíferos.

Una realización de la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una cepa atenuada de Mycoplasma bovis, en donde dicha cepa está depositada en la American Type Culture Collection con el número de acceso PTA-122167.

Otra realización proporciona una composición inmunogénica que comprende la cepa de M. bovis atenuada de la realización anterior, en donde dicha cepa de M. bovis está inactivada.

Otra realización proporciona la composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones anteriores y, además, un adyuvante.

Otra realización proporciona la composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde comprende además al menos un antígeno adicional.

Otra realización proporciona la composición inmunogénica de la realización anterior, en donde el antígeno adicional se selecciona del grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo y un parásito.

Otra realización proporciona una composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde dicha composición está formulada para su administración por una vía seleccionada del grupo que consiste en intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal, oral y en aerosol.

Otra realización proporciona una composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en un procedimiento de prevención de enfermedades causadas por M. bovis en un animal bovino, que comprende la administración al animal de una cantidad inmunizante de la composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones anteriores.

Otra realización proporciona una composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en un procedimiento de prevención de enfermedades causadas por M. bovis y otro agente infeccioso de un animal bovino, que comprende administrar al animal una cantidad inmunizante de la composición inmunogénica de cualquiera de las realizaciones anteriores, y un antígeno adicional.

También se divulga el uso de una cepa atenuada de M. bovis, o una cepa atenuada inactivada de M. bovis, en la fabricación de un medicamento para prevenir la enfermedad causada por M. bovis en un animal bovino.

Se genera una vacuna contra Mycoplasma bovis mediante los pasos que comprenden: (A) obtener un cultivo de M. bovis depositado en el ATCC como PTA-122167; (B) pasar dicho cultivo de M. bovis al menos una vez; (C) aislar un clon de dicho cultivo pasado; y (D) formular dicho clon con un vehículo o excipiente, y opcionalmente un adyuvante. El clon obtenido a partir del cultivo pasado está más atenuado que el PTA-122167.

Otra realización proporciona un procedimiento para proporcionar una vacuna de Mycoplasma bovis, en donde dicha vacuna se genera mediante los pasos que comprenden: (A) obtener un cultivo de M. bovis depositado en el ATCC como PTA-122167; (B) pasar dicho cultivo de M. bovis al menos una vez; (C) aislar un clon de dicho cultivo pasado; y (D) formular dicho clon con un vehículo o excipiente, y opcionalmente un adyuvante.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 proporciona una comparación de las tasas de crecimiento a 33 °C y 38 °C de la cepa 3683 de Mycoplasma bovis de tipo silvestre, el mutante #22/3/12 de M. bovis sensible a la temperatura y el mutante N2805-1 de M. bovis.

Descripción detallada

A menos que se definan de otro modo en la presente memoria, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con las presentes realizaciones tendrán los significados que comúnmente entienden aquellos de destreza ordinaria en la técnica. Además, salvo que el contexto lo exija de otro modo, los términos en singular incluirán los plurales y los términos en plural incluirán el singular.

El término "adyuvante", como se utiliza en la presente memoria, significa un agente farmacológico o inmunológico que modifica el efecto de otros agentes, como un fármaco o una composición inmunogénica. Los adyuvantes se incluyen a menudo en las composiciones inmunogénicas para mejorar la respuesta inmunitaria del receptor a un antígeno suministrado. Véase más abajo una descripción más detallada de los adyuvantes.

Los términos "anticuerpo" o "anticuerpos", como se utilizan en la presente memoria, significan una molécula de inmunoglobulina capaz de unirse a un antígeno mediante el reconocimiento de un epítopo. Las inmunoglobulinas son proteínas séricas compuestas por cadenas polipeptídicas "ligeras" y "pesadas", que tienen regiones "constantes" y "variables", y se dividen en clases (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) según la composición de las regiones constantes. Un anticuerpo que es "específico" para un antígeno determinado indica que las regiones variables del anticuerpo reconocen y se unen a un antígeno concreto de forma exclusiva. Los anticuerpos pueden ser una mezcla policlonal, o monoclonales. Pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o recombinantes, o pueden ser porciones inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden existir en una variedad de formas, incluyendo Fv, Fab', F(ab')2, Fc, así como de cadena única. Un anticuerpo puede convertirse en una proteína de unión al antígeno, que incluye, pero no se limita a, fragmentos de anticuerpos. Como se utiliza en la presente memoria, los términos "proteína de unión a antígeno", "anticuerpo" y similares, que pueden utilizarse indistintamente, se refieren a un polipéptido o polipéptidos, o fragmento(s) de los mismos, que comprenden un sitio de unión a antígeno. El término "proteína de unión a antígeno" o "anticuerpo" se refiere preferentemente a los anticuerpos monoclonales y sus fragmentos, y a sus equivalentes de unión inmunológica que pueden unirse a una proteína concreta y a sus fragmentos. Como se utiliza en la presente memoria, el término abarca no sólo los anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también sus fragmentos. A efectos de la presente invención, "anticuerpo" y "proteína de unión a antígeno" también incluyen fragmentos de anticuerpos, a menos que se indique de otro modo. Los fragmentos de anticuerpos ejemplares incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, diacuerpos, sus fragmentos de reconocimiento de antígeno, nanocuerpos de inmunofármacos modulares pequeños (SMIP) y similares, todos ellos reconocidos por un experto en la técnica como una proteína de unión a antígeno o un fragmento de anticuerpo, y cualquiera de los fragmentos mencionados anteriormente y sus contrapartes manipuladas química o genéticamente, así como otros fragmentos de anticuerpos y mutantes de los mismos, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno. Los anticuerpos y las proteínas de unión a antígenos pueden fabricarse, por ejemplo, mediante técnicas tradicionales de hibridoma (Kohler et al., Nature 256:495-499 (1975)), procedimientos de ADN recombinante (Patente estadounidense No. 4.816.567), o las técnicas de visualización de fagos que utilizan bibliotecas de anticuerpos (Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597, 1991. Para otras técnicas de producción de anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 así como otras técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica.

"Antígeno", como se utiliza en la presente memoria, significa una molécula que contiene uno o más epítopos (lineales, conformacionales o ambos), que al ser expuesta a un sujeto, inducirá una respuesta inmune que es específica para ese antígeno. Un epítopo es el sitio específico del antígeno que se une a un receptor de células T o a un anticuerpo específico de células B, y suele comprender de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 residuos de aminoácidos. El término "antígeno" también puede referirse a antígenos de subunidades-antígenos separados y discretos de un organismo completo con el que el antígeno está asociado en la naturaleza- así como a bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios muertos, atenuados o inactivados. El término "antígeno" también se refiere a los anticuerpos, como los anticuerpos antiidiotipo o sus fragmentos, y a los mimotopos peptídicos sintéticos que pueden imitar un antígeno o un determinante antigénico (epítopo). El término "antígeno" también se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antígeno o un determinante antigénico in vivo, como en las aplicaciones de inmunización por ADN. Un "antígeno", como se utiliza en la presente memoria, es una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida específicamente por un anticuerpo o una proteína de unión a antígeno. En particular, un anticuerpo, o una proteína de unión al antígeno, se unirá a los epítopos del antígeno. Un epítopo, como se utiliza en la presente memoria, se refiere al determinante antigénico reconocido por la región hipervariable, o Región Determinante de la Complementariedad (CDR), de la región variable de un anticuerpo o proteína de unión a antígeno.

El término "animal", como se utiliza en la presente memoria, significa cualquier animal susceptible de ser infectado por Mycoplasma bovis, tanto doméstico como salvaje. Preferentemente, el término "animal", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un bovino.

El término "atenuado", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cepa de un microorganismo cuya patogenicidad se ha reducido para que en general inicie una respuesta inmunitaria sin producir la enfermedad. Una cepa atenuada es menos virulenta que la cepa progenitora de la que deriva. Los microorganismos atenuados pueden ser examinados in vitro o in vivo para confirmar que son menos patógenos que su cepa progenitora. Para introducir mutaciones atenuantes se utilizan medios convencionales, como el paso in vitro, así como la mutagénesis química. Un medio alternativo de atenuación comprende la realización de mutaciones predeterminadas utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, en la que se pueden introducir una o más mutaciones. El término "más atenuado", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una cepa que ha sido modificada adicionalmente más allá de la cepa atenuada de la que se derivó. Esta atenuación adicional puede lograrse mediante pasos adicionales in vitro, o rondas adicionales de mutagénesis química o dirigida al sitio. Para ser útil como vacuna viva, cualquier organismo atenuado debe, no obstante, causar que el sistema inmunitario del huésped inicie una respuesta inmunitaria eficaz, lo que puede requerir cierto crecimiento del organismo.

Los términos "bacteria", "especie bacteriana", "bacteria" y similares, como se utilizan en la presente memoria, significan un amplio dominio de microorganismos procariotas.

El término "bovino", como se utiliza en la presente memoria, significa un grupo diverso de ungulados de tamaño medio a grande, generalmente con pezuñas hendidas, y en donde al menos uno de los sexos tiene cuernos verdaderos. Los bovinos incluyen, pero no están limitados a, el ganado doméstico, el bisonte, el búfalo africano, el búfalo de agua, el yak y el antílope de cuatro cuernos o de cuernos en espiral.

El término "mutagénesis química", como se utiliza en la presente memoria, significa el uso de un compuesto que aumenta la frecuencia de algunos tipos de mutación(es) que se producen por encima del nivel de fondo natural. Los compuestos utilizados pueden variar en su potencia, ya que pueden diferir en su capacidad para entrar en una célula, en el grado de su reactividad con los ácidos nucleicos, en su toxicidad general y en la probabilidad de que el tipo de cambio químico que introducen en el ácido nucleico sea corregido por un sistema de reparación endógeno.

El término "composición inmunogénica" o "cantidad inmunizante", como se utiliza en la presente memoria, significa una composición que genera una respuesta inmune (es decir, tiene actividad inmunogénica efectiva y/o al menos parcialmente protectora) cuando se administra sola, o con un vehículo aceptable para uso farmacéutico, a un animal. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular mediada principalmente por las células T citotóxicas, o una respuesta inmunitaria humoral mediada principalmente por las células T auxiliares, que a su vez activan las células B, dando lugar a la producción de anticuerpos. Además, se pueden generar linfocitos T o anticuerpos específicos que permitan la futura protección de un huésped inmunizado.

El término "aislado", como se utiliza en la presente memoria, significa que el material de referencia se retira de alguno de los componentes del ambiente en el que se encuentra normalmente. Por lo tanto, un material biológico aislado puede estar libre de algunos componentes celulares, es decir, de componentes de las células en las que se encuentra o produce el material. En el caso de las moléculas de ácido nucleico, un ácido nucleico aislado incluye, por ejemplo, un producto de PCR, un ARNm aislado, un ADNc o un fragmento de restricción. Un ácido nucleico aislado es preferentemente extirpado del cromosoma en el que puede encontrarse, y más preferentemente ya no está unido a regiones no reguladoras, no codificantes, o a otros genes situados aguas arriba o aguas abajo de la molécula de ácido nucleico cuando se encuentra en el cromosoma. Alternativamente, el ácido nucleico aislado carece de uno o más intrones. Las moléculas de ácido nucleico aisladas incluyen secuencias insertadas en plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales y similares. Así, un ácido nucleico recombinante es un ácido nucleico aislado. Una proteína aislada puede estar asociada a otras proteínas o ácidos nucleicos, o a ambos, con los que se asocia en la célula, o a las membranas celulares si es una proteína asociada a la membrana. Un orgánulo, célula o tejido aislado se extrae del lugar anatómico en el que se encuentra en un organismo. Un material aislado puede ser, pero no es necesario, purificado. Un polipéptido o polinucleótido "aislado" o "purificado", por ejemplo, un "polipéptido aislado" o un "polinucleótido aislado", se purifica hasta un estado más allá del que existe en la naturaleza. Por ejemplo, el polipéptido o polinucleótido "aislado" o "purificado", puede estar sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente celular o tisular de la que se deriva la proteína o el polinucleótido, o sustancialmente libre de precursores químicos u otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente. Se considera que la preparación de la proteína de unión a antígeno que tiene menos del 50 % aproximadamente de proteína de no unión a antígeno (también denominada en la presente memoria como una "proteína contaminante"), o de precursores químicos, está "sustancialmente libre" 40 %, 30 %, 20 %, 10 % y más preferentemente 5 % (en peso seco), de proteína de no unión para el antígeno, o de precursores químicos, es considerado sustancialmente libre.

El término "medicamento", como se utiliza en la presente memoria, significa un agente que promueve la recuperación de una infección, lesión o dolencia; un medicamento.

El término "mutante", como se utiliza en la presente memoria, significa un individuo u organismo que surge o resulta de un caso de mutación, que es un cambio de secuencia de pares de bases dentro del ácido nucleico o del cromosoma de un organismo, y que resulta en la creación de un nuevo carácter o rasgo que no se encuentra en el individuo u organismo de tipo silvestre.

El término "progenitor" o "cepa progenitora", como se utiliza en la presente memoria, significa la entidad de la que se derivan las crías o la progenie. El término "progenie", como se utiliza en la presente memoria, significa la producida por, o derivada de, uno o más progenitores o cepas progenitoras.

Los términos "prevenir", "previniendo" o "prevención", y similares, como se utilizan en la presente memoria, significan inhibir la replicación de un microorganismo, inhibir la transmisión de un microorganismo o inhibir que un microorganismo se establezca en su huésped. Estos términos, y otros similares, también pueden significar inhibir o bloquear uno o más signos o síntomas de infección.

Los términos "ingeniería inversa" o "mutagénesis inversa", como se utilizan aquí, significan reintroducir por medios genéticos (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa, o PCR) la secuencia original de nucleótidos que se encuentra en una posición o posiciones particulares dentro del genoma de un microorganismo, en donde dicha secuencia había sido previamente modificada.

Los términos "pasos en serie" o "paso en serie", como se utilizan en la presente memoria, significan un procedimiento para purificar un organismo, preferentemente un microorganismo, para obtener una población clonalmente pura. Los términos también pueden referirse a una técnica para atenuar, o debilitar, la virulencia de un organismo, preferentemente un microorganismo.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" (o "cantidad eficaz"), como se utiliza en la presente memoria, significa una cantidad de un ingrediente activo, por ejemplo, un agente de acuerdo con la invención, con o sin un adyuvante, según sea apropiado en las circunstancias, proporcionado en una dosis única o múltiple según sea apropiado, suficiente para efectuar resultados beneficiosos o deseados, cuando se administra a un sujeto o paciente. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones. Una cantidad terapéutica eficaz de una composición de acuerdo con la invención puede ser determinada fácilmente por alguien de destreza ordinaria en la técnica, y proporciona un beneficio medible a un paciente, como la protección del animal frente a un desafío posterior con un patógeno similar.

Como se utilizan aquí, los términos "terapéutico" o "tratamiento" abarcan todo el espectro de tratamientos para una enfermedad o trastorno. A modo de ejemplo, un agente "terapéutico" de la invención puede actuar de una manera, o un tratamiento puede resultar en un efecto, que es profiláctico o preventivo, incluyendo aquellos que incorporan procedimientos diseñados para dirigirse a los animales que pueden ser identificados como de riesgo (farmacogenética); o de una manera que es de naturaleza de alivio o curativa; o puede actuar para reducir la tasa o la extensión de la progresión de al menos un síntoma de una enfermedad o trastorno que se está tratando.

El término "vehículo veterinariamente aceptable", como se utiliza en la presente memoria, se refiere a las sustancias que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los animales, sin toxicidad indebida, irritación, respuesta alérgica, y similares, proporcionales a una relación razonable entre beneficio y riesgo, y eficaces para su uso previsto.

La siguiente descripción se proporciona para ayudar a los expertos en la técnica a practicar la presente invención. Aun así, esta descripción no debe interpretarse como una limitación indebida de la presente invención, ya que aquellos de destreza ordinaria en la técnica pueden realizar modificaciones y variaciones en las realizaciones , sin apartarse del espíritu o alcance del descubrimiento de la presente invención.

Bacterias; Composiciones Inmunogénicas

En ciertas realizaciones de la presente invención, una cepa de Mycoplasma bovis procedente de un bovino ha sido atenuada, así como caracterizada. Un aislado de dicha cepa de M. bovis fue depositado en la American Type Culture Collection ("ATCC"), Manassas, VA, EE. UU., el 12 de mayo de 2015, y se le ha asignado el número de acceso, PTA-122167.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden ser atenuadas o inactivadas antes de su uso en una composición inmunogénica. Los procedimientos de atenuación e inactivación son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los procedimientos de atenuación incluyen, pero sin limitarse a, el paso en serie en cultivo celular, la irradiación ultravioleta y la mutagénesis química. Un gran número de mutágenos químicos pueden interactuar directamente con el ADN. Sin embargo, muchas sustancias químicas, como las aminas aromáticas y el benceno, no son necesariamente mutagénicas por sí mismas, pero a través de procesos metabólicos en las células, producen compuestos mutagénicos. Los mutágenos químicos también pueden incluir especies reactivas de oxígeno (ERO). Estos pueden incluir el superóxido, los radicales hidroxilo y el peróxido de hidrógeno. Un gran número de estas especies altamente reactivas se generan en los procesos celulares normales, por ejemplo, como subproductos del transporte de electrones mitocondrial o de la peroxidación de lípidos. Otros mutágenos químicos también pueden generar estas ERO. Estas ERO pueden dar lugar a la producción de diversos productos de adición de base, así como a roturas y entrecruzamientos de la hebra de ADN. Los mutágenos químicos también pueden incluir agentes desaminantes, por ejemplo el ácido nitroso, que puede causar mutaciones de transición al convertir la citosina en uracilo. El hidrocarburo aromático policíclico (HAP), también es un mutágeno químico. Cuando se activa, puede unirse al ADN y formar productos de adición. Los mutágenos químicos también pueden incluir agentes alquilantes, como la etilnitrosourea. Estos compuestos transfieren el grupo metilo o etilo a las bases o a los grupos fosfato el esqueleto. La guanina, al ser alquilada, puede confundirse con la timina. Algunos de estos agentes alquilantes pueden provocar el entrecruzamiento rupturas del ADN. Las nitrosaminas son un grupo importante de mutágenos, como los que se pueden encontrar en el tabaco. La metilnitronitrosoguanidina (MNNG, MNG o NTG) es un agente alquilante que actúa añadiendo grupos alquilo al O6 de la guanina y al O4 de la timina, lo que puede dar lugar a mutaciones de transición entre GC y AT. Estos cambios no causan una fuerte distorsión en la doble hélice del ADN, por lo que son difíciles de detectar por el sistema de reparación de desajustes del ADN. Otros agentes alquilantes también pueden ser el gas mostaza y el cloruro de vinilo.

Los procedimientos de inactivación incluyen, pero no están limitados a, el tratamiento con formol, betapropriolactona (BPL) o etilenimina binaria (BEI), u otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. La inactivación por formol puede realizarse mezclando la suspensión bacteriana con formaldehído al 37 %, hasta una concentración final de formaldehído del 0,05 %. La mezcla de bacterias y formaldehído se agita constantemente durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla bacteriana inactivada es probada respecto a bacterias vivas residuales, mediante ensayo de crecimiento en medio de cultivo. La inactivación por BEI puede realizarse mezclando la suspensión bacteriana con BEI 0,1 M (2-bromo-etilamina en NaOH 0,175 N), hasta una concentración final de BEI de 1 mM. La mezcla de bacterias-BEI se agita constantemente durante aproximadamente 48 horas a temperatura ambiente, seguida de la adición de tiosulfato de sodio 1,0 M hasta una concentración final de 0,1 mM. La mezcla continúa durante dos horas adicionales. La mezcla bacteriana inactivada se somete a una prueba de bacterias vivas residuales mediante un ensayo de crecimiento en medios de cultivo.

Las composiciones inmunogénicas eficaces (es decir, protectoras) de la presente invención pueden incluir uno o más vehículos veterinariamente aceptables, como todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la adsorción y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir el cloruro de sodio, la dextrosa, el manitol, el sorbitol y la lactosa, entre otros conocidos por los expertos en la técnica. Los estabilizadores incluyen la albúmina, entre otros conocidos por los expertos en la técnica. Los conservantes incluyen el mertiolate, entre otros conocidos por los expertos en la técnica.

Las composiciones inmunogénicas eficaces de la presente invención pueden incluir uno o más adyuvantes. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitarse a, el sistema de adyuvantes RIBⁱ (Ribi Inc.; Hamilton, MT), alumbre, gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite como, por ejemplo, adyuvantes completos e incompletos de Freund, copolímero de bloque (CytRx; Atlanta, GA), SAF-M (Chiron; Emeryville, CA), adyuvante AMPHlGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc.; Cambridge, Ma ), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc.; Birmingham, AL) u otras fracciones de saponina, monofosforil lípido A, adyuvante lipídicoamínico Avridine, enterotoxina termolábil de Escherichia coli (recombinante o no), o dipéptido de muramilo, entre muchos otros conocidos por los expertos en la técnica.

Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser fácilmente determinadas por el experto en la técnica, y las cantidades apropiadas de cada una de dichas sustancias son generalmente conocidas o pueden ser fácilmente determinadas. La presente invención contempla composiciones inmunogénicas que comprenden de aproximadamente 50 |jg a aproximadamente 2.000 |jg de adyuvante, o el adyuvante se incluye en una cantidad de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 1.500 jg , o de aproximadamente 250 jg a aproximadamente 1.000 jg , o de aproximadamente 350 jg a aproximadamente 750 jg , o el adyuvante se incluye en una cantidad de aproximadamente 500 jg /2 ml de dosis de la composición inmunogénica. Generalmente, las vacunas de la presente invención se suministran como dosis de 1-2 ml.

Varias citoquinas o linfoquinas han mostrado tener actividad moduladora de inmunidad, y así pueden usarse como adyuvantes incluyendo, pero sin limitarse a, las interleuquinas 1-a, 1-p, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12 (véase, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. No. 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 y 18 (y sus formas mutantes), los interferones-a, p y y, el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (véase, por ejemplo, la Patente de los EE. UU. No.

5.078.996 y el número de acceso ATCC 39900), el factor estimulante de colonias de macrófagos, el factor estimulante de colonias de granulocitos, el GSF y los factores de necrosis tumoral a y p. Todavía otros adyuvantes útiles en esta invención incluyen una quimioquina, incluyendo sin limitación, MCP-1, MIP-1a, MIP-1p, y RANTES. Las moléculas de adhesión, tal como una selectina, por ejemplo, la L-selectina, la P-selectina y la E-selectina también pueden ser útiles como adyuvantes. Otros adyuvantes útiles incluyen, sin limitación, una molécula similar a la mucina, por ejemplo CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1, un miembro de la familia de las integrinas como LFA-1, VLA-1, Mac-1 y p150.95, un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas como PECAM, ICAMs, por ejemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3, moléculas coestimuladoras como CD40 y CD40L, factores de crecimiento como el factor de crecimiento vascular, el factor de crecimiento nervioso, el factor de crecimiento de fibroblastos, el factor de crecimiento epidérmico, B7.2, PDGF, BL-1 y factor de crecimiento endotelial vascular, moléculas receptoras como Fas, receptor TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6. Otra molécula adyuvante es la Caspasa (ICE). Véase también la publicación internacional de patentes números WO98/17799 y WO99/43839.

Los adyuvantes adecuados utilizados para mejorar una respuesta inmunitaria también incluyen, sin limitación, MPLMR (monofosforil lípido A 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, Mt ), que se describe en la Patente estadounidense No.

4.912.094. También son adecuados para uso como adyuvantes los análogos sintéticos del lípido A o los compuestos de fosfato de aminoalquilglucosamina (AGP), o sus derivados o análogos, que están disponibles en Corixa (Hamilton, MT), Y que están descritos en la patente de Estados Unidos No. 6.113.918. Uno de estos AGP es el 2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-deseoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil]-2-[(R)-3-tetradecanoiloxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranósido, que también se conoce como 529 (antes conocido como RC529). Este adyuvante 529 está formulado en forma acuosa o como emulsión estable.

Otros adyuvantes incluyen emulsiones de aceite mineral y agua, sales de aluminio (alumbre), como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc., Amphigen, Avridine, L121/escualeno, D-lactida-polilactida/glicósido, polioles plurónicos, muramil dipéptido, Bordetella muerta, saponinas, como StimulonMR QS-21 (Antigenics, Framingham, MA.), descrito en Patente de EE. UU. No 5.057.540y las partículas generadas a partir de ellas, como los ISCOMS (complejos inmunoestimulantes), Mycobacterium tuberculosis, lipopolisacáridos bacterianos, polinucleótidos sintéticos como los oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (Patente estadounidense No. 6.207.646), una toxina pertussis (PT), o una toxina termolábil de E. coli (LT), en particular LT-K63, LT-R72, PT-K9/G129; véase, por ejemplo, la publicación internacional de patentes No. WO 93/13302 y WO 92/19265.

También son útiles como adyuvantes las toxinas del cólera (CT) y sus mutantes, incluidas las descritas en la solicitud de patente internacional publicada número WO 00/18434 (en donde el ácido glutámico en la posición del aminoácido 29 se sustituye por otro aminoácido, distinto del ácido aspártico, preferentemente una histidina). Se describen toxinas CT o mutantes similares en la solicitud de patente internacional publicada con el número WO 02/098368 (en donde la isoleucina en la posición del aminoácido 16 se sustituye por otro aminoácido, solo o en combinación con la sustitución de la serina en la posición del aminoácido 68 por otro aminoácido; y/o en donde la valina en la posición del aminoácido 72 se sustituye por otro aminoácido). Otras toxinas CT se describen en la solicitud de patente internacional publicada con el número Wo 02/098369 (en donde la arginina en la posición del aminoácido 25 se sustituye por otro aminoácido; y/o se inserta un aminoácido en la posición del aminoácido 49; y/o se insertan dos aminoácidos en las posiciones del aminoácido 35 y 36). Dichas toxinas CT o mutantes pueden incluirse en las composiciones inmunogénicas como entidades separadas, o como asociados de fusión para los péptidos neurotóxicos de la presente invención.

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden incluir sustancias tensioactivas. Las sustancias tensoactivas adecuadas incluyen, sin limitación, análogos de la quinona, hexadecilamina, octadecilamina, ésteres de aminoácidos de octadecilo, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecilamonio, metoxihexadecilglicerol y polioles plurónicos; poliaminas, p. ej, pirano, dextransulfato, poli IC, carbopol; péptidos, por ejemplo, muramil péptido y dipéptido, dimetilglicina, tuftsina; emulsiones oleosas; y geles minerales, por ejemplo, fosfato de aluminio, etc., y complejos inmunoestimulantes (ISCOMS).

Todos los adyuvantes mencionados y las sustancias adicionales pueden utilizarse en cantidades fácilmente determinables por los expertos en la técnica.

Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden incluir antibióticos. Dichos antibióticos incluyen, pero no están limitados a, los de las clases de aminoglucósidos, carbapenemos, cefalosporinas, glucopéptidos, macrólidos, penicilinas, polipéptidos, quinolonas, sulfonamidas y tetraciclinas. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender desde aproximadamente 1 pg/ml hasta aproximadamente 60 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 5 pg/ml hasta aproximadamente 55 pg/ml de antibiótico, o desde aproximadamente 10 pg/ml hasta aproximadamente 50 pg/ml de antibiótico o de aproximadamente 15 pg/ml a aproximadamente 45 pg/ml de antibiótico, o de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 40 pg/ml de antibiótico, o de aproximadamente 25 pg/ml a aproximadamente 35 pg/ml de antibiótico, o menos de aproximadamente 30 pg/ml de antibiótico.

También pueden incluirse otros aditivos en las composiciones inmunogénicas de esta invención, incluyendo conservantes, ingredientes estabilizadores y similares. Los conservantes ejemplares adecuados incluyen el clorobutanol, el sorbato de potasio, el ácido sórbico, el dióxido de azufre, el galato de propilo, los parabenos, la etilvainillina, la glicerina, el fenol y el paraclorofenol. Los ingredientes estabilizadores adecuados que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, los casaminoácidos, la sacarosa, la gelatina, el rojo de fenol, la amina N-Z, el difosfato monopotásico, la lactosa, el hidrolizado de lactoalbúmina y la leche en polvo. Las composiciones inmunogénicas también pueden incorporarse a liposomas para su uso como composición inmunogénica, y también pueden contener otros aditivos adecuados para el modo de administración seleccionado de la composición. La composición puede incluir otros excipientes farmacéuticamente aceptables para el desarrollo de formas de dosificación en polvo, líquidas o en suspensión. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, vol. 2, 19a edición (1995), por ejemplo, Capítulo 95 Aerosols y la Publicación de Patente Internacional No WO99/45966.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden incluir otros antígenos. Los antígenos pueden presentarse en forma de una preparación total o parcialmente inactivada del microorganismo, o en forma de moléculas antigénicas obtenidas por técnicas recombinantes o de síntesis química. Otros antígenos apropiados para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los derivados de bacterias patógenas, como Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Bacillus anthracis, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Mycoplasma bovis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp, Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, Chlamydia spp., Brucella spp., Vibrio spp, Salmonella enterica serovars y Leptospira spp. Los antígenos también pueden proceder de hongos patógenos, como Candida, protozoos como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giardia spp., o helmintos como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus y Fasciola. Otros antígenos pueden incluir virus patógenos, como el coronavirus bovino, el rotavirus bovino, los herpesvirus bovinos, el virus de la parainfluenza bovina, el virus de la diarrea viral bovina, el adenovirus bovino, el rinovirus bovino, el reovirus bovino, el virus respiratorio sincitial bovino, el virus de la leucosis bovina, el virus de la peste bovina, el virus de la fiebre aftosa y el virus de la rabia.

Formas, dosificaciones, vías y tiempos de administración

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden administrarse a los animales para inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra M. bovis. En consecuencia, la presente invención proporciona procedimientos para estimular una respuesta inmunitaria eficaz contra M. bovis administrando a un animal una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición inmunogénica de la presente invención descrita en la presente memoria.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención pueden hacerse en varias formas, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas pueden ser preparadas en forma de soluciones o dispersiones acuosas estériles adecuadas para uso inyectable, o ser preparadas en formas liofilizadas utilizando técnicas de liofilización. Las composiciones inmunogénicas liofilizadas se mantienen típicamente a aproximadamente 4 °C, y pueden reconstituirse en una solución estabilizadora, por ejemplo, solución salina o ^h E^p ES, con o sin adyuvante. Las composiciones inmunogénicas también pueden hacerse en forma de suspensiones o emulsiones.

Estas composiciones inmunogénicas pueden contener aditivos adecuados para su administración a través de cualquier vía de administración convencional. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden prepararse para su administración a los sujetos en forma de, por ejemplo, líquidos, polvos, aerosoles, comprimidos, cápsulas, comprimidos o cápsulas con recubrimiento entérico o supositorios. Por lo tanto, las composiciones inmunogénicas también pueden incluir, pero no se limitan a, suspensiones, soluciones, emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, pastas y formulaciones implantables de liberación sostenida o biodegradables. En una formulación para la administración parenteral, el ingrediente activo se proporciona en forma seca (es decir, en polvo o granulado) para su reconstitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos) antes de la administración parenteral de la composición reconstituida. Otras formulaciones útiles que se pueden administrar por vía parenteral incluyen las que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposomal o como componente de un sistema polimérico biodegradable. Las composiciones para liberación sostenida o implantación pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero poco soluble o una sal poco soluble.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de M. bovis. Las bacterias purificadas pueden utilizarse directamente en una composición inmunogénica, o pueden ser atenuadas o inactivadas. Típicamente, una composición inmunogénica eficaz contiene entre aproximadamente 1*102 y aproximadamente 1*1012 partículas bacterianas, o entre aproximadamente 1*103 y aproximadamente 1*1011 partículas bacterianas, o entre aproximadamente 1*104 y aproximadamente 1*101° partículas bacterianas, o entre aproximadamente 1*105 y aproximadamente 1*109 partículas bacterianas, o preferentemente entre aproximadamente 1^10® y aproximadamente 1*108 partículas bacterianas. La cantidad precisa de una bacteria en una composición inmunogénica eficaz para proporcionar un efecto protector puede ser determinada por un experto en la técnica.

Las composiciones inmunogénicas eficaces comprenden generalmente un vehículo veterinariamente aceptable en un volumen de entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 5 ml. En otra realización, el volumen del vehículo está entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 4 ml aproximadamente, o entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 3 ml aproximadamente. En otra realización, el volumen del vehículo es de aproximadamente 1 ml, o de aproximadamente 2 ml, o de aproximadamente 5 ml. Los vehículos veterinariamente aceptables adecuados para su uso en composiciones inmunogénicas pueden ser cualquiera de los descritos en la presente memoria.

Dichos vehículos incluyen, sin limitación, agua, solución salina, solución salina amortiguada, Amortiguador de fosfato, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones. Se pueden añadir otros diluyentes, adyuvantes y excipientes empleados convencionalmente, de acuerdo con las técnicas convencionales. Dichos vehículos pueden incluir el etanol, los polioles y sus mezclas adecuadas, los aceites vegetales y los ésteres orgánicos inyectables.

También pueden emplearse amortiguadores y agentes de ajuste del pH. Los amortiguadores incluyen, sin limitación, sales preparadas a partir de un ácido o una base orgánica. Los amortiguadores representativos incluyen, sin limitación, sales de ácidos orgánicos, tales como sales de ácido cítrico, por ejemplo, citratos, ácido ascórbico, ácido glucónico, histidina-Hel, ácido carbónico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido acético, ácido Itálico, Tris, clorhidrato de trimetamina o amortiguadores de fosfato. Los vehículos parenterales pueden incluir solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa, trehalosa, sacarosa, lactato de Ringer o aceites fijos. Los vehículos intravenosos pueden incluir agentes que reponen fluidos y nutrientes, agentes que reponen electrolitos, como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Los conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, los antimicrobianos, los antioxidantes, los agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), los gases inertes y similares también pueden ser suministrados en los vehículos farmacéuticos. La presente invención no está limitada por la selección del vehículo. La preparación de estas composiciones aceptables para uso farmacéutico, a partir de los componentes descritos anteriormente, con un pH apropiado, isotonicidad, estabilidad y otras características convencionales, está dentro de la habilidad de la técnica. Véanse, por ejemplo, textos como Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed, Lippincott Williams & Wilkins, pub., 2000 y The Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4a ed. sup., eds. R. C. Rowe et al., APhA Publications, 2003.

Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente si una bacteria necesita ser atenuada o inactivada antes de su administración. M. bovis puede administrarse directamente a un animal sin atenuación adicional. La cantidad de una bacteria que es terapéuticamente efectiva puede variar dependiendo de la bacteria particular utilizada, la condición del animal y/o el grado de infección, y puede ser determinada por un experto en la técnica.

Se puede administrar una sola dosis a los animales o, alternativamente, se pueden realizar dos o más inoculaciones con intervalos de entre dos y aproximadamente diez semanas. Pueden ser necesarios regímenes de refuerzo, y el régimen de dosificación puede ajustarse para proporcionar una inmunización óptima. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente el régimen de administración óptimo. Cuando se utiliza más de una dosis, no es necesario que la primera y la segunda se administren en el mismo lugar en el animal.

Las composiciones inmunogénicas eficaces pueden administrarse directamente en el torrente sanguíneo, en el músculo o en un órgano interno. Los medios adecuados para la administración parenteral incluyen la intravenosa, la intraarterial, la intraperitoneal, la intratecal, la intraventricular, la intrauretral, la intraesternal, la intracraneal, la intramuscular y la subcutánea. Los dispositivos adecuados para la administración parenteral incluyen inyectores con aguja (incluyendo microagujas), inyectores sin aguja y técnicas de infusión.

Las formulaciones parenterales son típicamente soluciones acuosas que pueden contener excipientes como sales, carbohidratos y agentes amortiguadores (preferentemente a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 7,5, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 7,5, o de aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5), pero para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una solución estéril no acuosa, o como una forma seca que se utilizará junto con un vehículo adecuado, como el agua estéril y libre de pirógenos. La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, mediante liofilización, puede realizarse fácilmente utilizando técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica.

La solubilidad de los compuestos utilizados en la preparación de soluciones parenterales puede aumentarse mediante el uso de técnicas de formulación apropiadas conocidas por el experto en la técnica, como la incorporación de agentes que mejoran la solubilidad, incluyendo amortiguadores, sales, tensioactivos, liposomas, ciclodextrinas y similares.

Las formulaciones para la administración parenteral pueden ser formuladas para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, sostenida, en pulsos, controlada, dirigida y programada. Así, los compuestos de la invención pueden formularse como un sólido, semisólido o líquido tixotrópico para su administración como depósito implantado, proporcionando una liberación modificada del compuesto activo. Algunos ejemplos de estas formulaciones son las cánulas recubiertas de fármacos y las microesferas de ácido poli('d/-láctico-coglicólico) (PLGA).

Las composiciones inmunogénicas eficaces de la presente invención también pueden administrarse por vía tópica en la piel o en las mucosas, es decir, por vía dérmica o transdérmica. Las formulaciones típicas para este fin incluyen geles, hidrogeles, lociones, soluciones, cremas, ungüentos, polvos, apósitos, espumas, películas, parches cutáneos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendas y microemulsiones; también pueden utilizarse liposomas. Los vehículos típicos son el alcohol, el agua, el aceite mineral, la vaselina líquida, la vaselina blanca, la glicerina, el polietilenglicol y el propilenglicol. Se pueden incorporar potenciadores de la penetración; véase, por ejemplo Finnin y Morgan, J. Pharm Sci, 88 (10):955-958 (1999). Otros medios de administración tópica incluyen la entrega por electroevaporación, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis y microagujas o inyección sin agujas (por ejemplo, PowderjectMR, BiojectMR, etc.). Las formulaciones para la administración tópica pueden diseñarse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, sostenida, en pulsos, controlada, dirigida y programada.

Las composiciones inmunogénicas eficaces también pueden administrarse por vía intranasal o por inhalación, típicamente en forma de polvo seco (ya sea solo o como una mezcla, por ejemplo, en una mezcla seca con lactosa, o como una partícula de componente mixto, por ejemplo, mezclada con fosfolípidos, como la fosfatidilcolina), desde un inhalador de polvo seco, o como un aerosol de un contenedor presurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferentemente un atomizador que utiliza la electrohidrodinámica) para producir una niebla fina. También puede administrarse mediante un nebulizador, con o sin el uso de un propulsor adecuado, como el 1,1,1,2-tetrafluoroetano o el 1,1,1,2,3,3-heptafluoropropano. Para uso intranasal, el polvo puede comprender un agente bioadhesivo, por ejemplo, quitosano o ciclodextrina. El recipiente presurizado, la bomba, el pulverizador, el atomizador o el nebulizador contienen una solución o una suspensión del (de los) compuesto(s) de la invención que comprende, por ejemplo, etanol, etanol acuoso o un agente alternativo adecuado para dispersar, solubilizar o prolongar la liberación del principio activo, un propelente como disolvente y un tensioactivo opcional, como trioleato de sorbitán, ácido oleico o un ácido oligoláctico.

Antes de su uso en una formulación de polvo seco o de suspensión, el producto farmacéutico se microniza generalmente hasta un tamaño adecuado para su administración por inhalación (típicamente menos de aproximadamente 5 micras). Esto puede lograrse mediante cualquier procedimiento de trituración adecuado, como la molienda por chorro en espiral, la molienda por chorro en lecho fluido, el procesamiento con fluidos supercríticos (para formar nanopartículas), la homogeneización a alta presión o el secado por aspersión.

Las cápsulas (hechas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), las ampollas y los cartuchos para uso en un inhalador o insufladores, pueden formularse para contener una mezcla en polvo del compuesto de la invención. Una base de polvo adecuada podría ser la lactosa o el almidón, y un modificador del rendimiento podría ser la l-leucina, el manitol o el estearato de magnesio. La lactosa puede ser anhidra o en forma de monohidrato. Otros excipientes adecuados incluyen el dextrano, la glucosa, la maltosa, el sorbitol, el xilitol, la fructosa, la sacarosa y la trehalosa.

Una formulación de solución adecuada para su uso en un atomizador, que utiliza la electrohidrodinámica para producir una niebla fina, puede contener desde aproximadamente 1 |jg hasta aproximadamente 20 mg del compuesto de la invención por cada actuación, y el volumen de actuación puede variar desde aproximadamente 1 j l hasta aproximadamente 100 jl. Alternativamente, la cantidad de compuesto por actuación puede variar entre aproximadamente 100 jg y aproximadamente 15 mg, o entre aproximadamente 500 jg y aproximadamente 10 mg, o entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 10 mg, o entre aproximadamente 2,5 jg y aproximadamente 5 mg. En otra realización, el volumen de actuación puede variar entre aproximadamente 5 j l y aproximadamente 75 j l , o entre aproximadamente10 j l y aproximadamente 50 jl, o entre aproximadamente 15 j l y aproximadamente 25 jl. Una formulación típica puede comprender el compuesto de la invención, propilenglicol, agua estéril, etanol y cloruro de sodio. Los disolventes alternativos que pueden utilizarse en lugar del propilenglicol incluyen el glicerol y el polietilenglicol.

Las formulaciones para la administración inhalada/intranasal pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada utilizando, por ejemplo, PLGA. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, sostenida, en pulsos, controlada, dirigida y programada.

En el caso de los inhaladores de polvo seco y los aerosoles, la unidad de dosificación está determinada generalmente por medio de una válvula que suministra una cantidad medida. Las unidades de acuerdo con la invención están típicamente dispuestas para administrar una dosis medida o "puff' que contiene desde aproximadamente 10 ng hasta aproximadamente 100 jg del compuesto de la invención. En otra realización, la cantidad de compuesto administrado en una dosis medida es de unos 50 ng a aproximadamente 75 jg , o de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 50 jg , o de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 25 jg , o de aproximadamente 750 ng a aproximadamente 10 jg , o de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 5 jg . La dosis diaria total estará típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 100 mg, que puede ser administrado en una sola dosis o, más generalmente, como dosis divididas a lo largo del día. Alternativamente, la dosis diaria total puede variar entre aproximadamente 50 jg y aproximadamente 75 mg, o entre aproximadamente 100 jg y aproximadamente 50 mg, o entre aproximadamente 500 jg y aproximadamente 25 mg, o entre aproximadamente 750 jg y aproximadamente 10 mg, o entre aproximadamente 1 mg y aproximadamente 5 mg.

Las composiciones inmunogénicas eficaces de la presente invención también pueden administrarse por vía oral o peroral, es decir, en el cuerpo de un sujeto a través de la boca o por medio de ella, e implica la deglución o el transporte a través de la mucosa oral (por ejemplo, absorción sublingual o bucal, o ambas). A las formulaciones de la invención destinadas a la administración oral o peroral pueden añadirse aromas adecuados, como el mentol y el levomentol, o edulcorantes, como la sacarina o la sacarina sódica.

Las composiciones inmunogénicas eficaces de la presente invención pueden administrarse por vía rectal o vaginal, por ejemplo, en forma de supositorio, pesario o enema. La manteca de cacao es la base tradicional de los supositorios, pero se pueden utilizar diferentes alternativas según sea apropiado. Las formulaciones para la administración rectal/vaginal pueden ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, sostenida, en pulsos, controlada, dirigida y programada.

Las composiciones inmunogénicas eficaces de la presente invención también pueden administrarse directamente en el ojo o el oído, normalmente en forma de gotas de una suspensión micronizada, o de una solución en solución salina estéril isotónica y de pH ajustado. Otras formulaciones adecuadas para la administración ocular y auditiva incluyen ungüentos, implantes biodegradables (por ejemplo, esponjas de gel absorbibles, colágeno) y no biodegradables (por ejemplo, silicona), obleas, lentes y sistemas particulados o vesiculares, como niosomas o liposomas. Un polímero como el ácido poliacrílico reticulado, el polivinilalcohol, el ácido hialurónico, un polímero celulósico, por ejemplo, la hidroxipropilmetilcelulosa, la hidroxietilcelulosa o la metilcelulosa, o un polímero heteropolisacárido, por ejemplo, la goma gelana, pueden incorporarse junto con un conservante, como el cloruro de benzalconio. Dichas formulaciones también pueden administrarse por iontoforesis. Las formulaciones para la administración ocular/aural pueden ser formuladas para que tengan liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen la liberación retardada, sostenida, en pulsos, controlada, dirigida y programada.

Las composiciones inmunogénicas de la presente invención, no están limitadas por la selección de los vehículos convencionales, fisiológicamente aceptables, adyuvantes u otros ingredientes útiles en las preparaciones farmacéuticas de los tipos descritos anteriormente. La preparación de estas composiciones aceptable para uso farmacéutico, a partir de los componentes descritos anteriormente, con un pH apropiado, isotonicidad, estabilidad y otras características convencionales, está dentro de la habilidad de la técnica.

En general, la selección de la "cantidad efectiva" o la dosificación apropiada para los componentes de las composiciones inmunogénicas de la presente invención también se basará en la identidad del antígeno en la(s) composición(es) inmunogénica(s) empleada(s), así como en la condición física del sujeto, incluyendo muy especialmente la salud general, la edad y el peso del sujeto inmunizado. El procedimiento y las vías de administración, así como la presencia de componentes adicionales en las composiciones inmunogénicas, también pueden afectar a las dosificaciones y cantidades de las composiciones. Dicha selección, y el ajuste hacia arriba o hacia abajo de la dosis efectiva, está dentro de la habilidad de la técnica. La cantidad de composición necesaria para inducir una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta protectora, o producir un efecto exógeno en el sujeto sin efectos secundarios adversos significativos, puede variar, dependiendo de estos factores. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente las dosis adecuadas.

Del mismo modo, el orden de administración de la composición inmunogénica y los períodos de tiempo entre las administraciones individuales, si es necesario más de una, pueden ser seleccionados por alguien diestro en la técnica basándose en las características físicas y las respuestas precisas del huésped a la aplicación del procedimiento. Preferentemente, la composición inmunogénica eficaz de la presente invención puede administrarse a un animal bovino de 1 día a 3 semanas de edad. Más preferentemente, puede administrarse a un animal bovino de 1 a 2 semanas de edad. Cabe señalar, de nuevo, basándose en los riesgos de exposición particulares presentes en cualquier operación de cría o ganadería particular, que los terneros pueden ser vacunados con las vacunas vivas modificadas (atenuadas) de la presente invención a cualquier edad, como de 0 a 3 semanas de edad, de 0 a 2 meses de edad y de 0 a 6 meses de edad. Para una composición inmunogénica eficaz que comprenda un M. bovis vivo modificado, generalmente sólo es necesaria una única administración, y esa administración puede llevarse a cabo en un animal bovino a una edad como se describió anteriormente. Sin embargo, pueden administrarse más de una vez, por ejemplo, dosis subsiguientes se administran a intervalos de 2 a 4 semanas tras la primera vacunación. Sin embargo, dependiendo de varios factores, incluyendo la prevalencia de la enfermedad en un rebaño, y la presencia de cepas de campo circulantes particularmente patógenas, puede ser apropiado administrar una o múltiples dosis de la vacuna viva de la presente invención a lo largo del tiempo a un animal dado, independientemente de la edad del animal vacunado. Por lo tanto, los animales más viejos también pueden ser vacunados, y vacunados repetidamente, lo que es particularmente importante con respecto a las hembras bovinas, tanto antes del inicio de la gestación como durante la misma. Así, en otro ejemplo preferido, se vacuna a una hembra bovina entre 2 y 4 meses antes del inicio de la gestación, aunque la vaca haya sido vacunada previamente, y se vacuna al ternero poco después del nacimiento. En algunas circunstancias puede ser conveniente vacunar adicionalmente a la vaca madre durante la gestación.

Para otros tipos de vacunas de M. bovis (por ejemplo, muertas o de subunidades), la administración inicial de la composición puede ser a una edad como la indicada anteriormente, con administraciones posteriores de 2 a 4 semanas después de la dosis anterior.

Kits

Dado que puede ser deseable administrar una composición inmunogénica individualmente o en combinación con compuestos adicionales, por ejemplo, con el propósito de tratar una enfermedad o condición particular, una composición inmunogénica descrita en la presente memoria puede incluirse convenientemente en, o combinarse en, la forma de un kit adecuado para la administración o coadministración de las composiciones. Los kits pueden comprender una o más composiciones farmacéuticas separadas, al menos una de las cuales es una composición inmunogénica de acuerdo con la presente invención, y un medio para retener por separado dichas composiciones, como contenedores, una botella dividida o un paquete de lámina dividido. Un ejemplo de dicho kit es una jeringa y una aguja, y similares. Un kit es particularmente adecuado para administrar diferentes formas de dosificación, por ejemplo, oral o parenteral, para administrar las composiciones separadas en diferentes intervalos de dosificación, o para valorar las composiciones separadas una contra otra. Para ayudar a la administración de una composición de la presente invención, el kit comprende típicamente instrucciones de administración.

Otro kit puede comprender uno o más reactivos útiles para la detección de M. bovis. El kit puede incluir reactivos para analizar una muestra en busca de la presencia de M. bovis entero, o de polipéptidos, epítopos o secuencias polinucleotídicas de M. bovis. Los kits pueden incluir un conjunto de instrucciones impresas o una etiqueta que indique que el kit es útil para la detección de animales infectados con M. bovis.

Técnicas de recombinación

La composición inmunogénica puede comprender una vacuna recombinante. Dichas vacunas recombinantes comprenderían generalmente un vector y un inserto heterólogo que comprende un antígeno de M. bovis. Los antígenos adecuados de M. bovis pueden incluir proteínas de membrana y asociadas a la membrana, incluyendo pero no limitándose a las proteínas de superficie variable (Vsps); citadhesinas; lipoproteínas, por ejemplo P48 y P68; así como potencialmente otras proteínas hipotéticas que quedan por investigar y caracterizar.

El inserto puede comprender opcionalmente un promotor heterólogo, como, por ejemplo, promotores sintéticos conocidos en la técnica. Alternativamente, los promotores del vector huésped pueden ejercer un control transcripcional sobre la expresión de los insertos. Ejemplos adecuados no limitantes de promotores (que pueden ser nativos o heterólogos, dependiendo de la elección del vector) son el promotor de virus vacuna H6, el promotor de virus vacuna I3L, el promotor poxviral 42K, el promotor de virus vacuna 7.5K y el promotor de virus vacuna Pi.

Los vectores adecuados se han descrito en otra parte de esta solicitud. Los vectores pueden ser vectores virales, incluyendo, sin limitaciones, vectores virales de virus vacuna y viruela, tales como parapox, viruela de mapache, viruela de cerdo y diferentes vectores de avipox (por ejemplo, cepas de viruela de canario y viruela de aves). Las cepas virales actualmente contempladas incluyen las cepas D1701, ALVAC, TROVAC, NYVAC. Generalmente, las secuencias que no son esenciales para el huésped viral son sitios de inserción adecuados para los insertos de la presente invención. Las cepas recitadas anteriormente están bien caracterizadas en la técnica y algunos sitios de inserción en estos vectores son bien conocidos. Véase, por ejemplo Pat. de EE. UU. No. 5.174.993 Pat. de EE. UU. No. 5.505.941 Pat. de EE. UU. No. 5.766.599 Pat. de EE. UU. No. 5.756.103, Pat. de EE. UU. No. 7.638.134, Pat. de EE. UU. No.

6.365.393.

Existen varios procedimientos o técnicas conocidos que pueden utilizarse para clonar y expresar las secuencias de nucleótidos descritas en la presente memoria. Por ejemplo, las secuencias pueden aislarse como fragmentos de restricción y clonarse en vectores de clonación y/o expresión. Las secuencias también pueden ser amplificadas por PCR y clonadas en vectores de clonación y/o expresión, o pueden ser clonadas por una combinación de estos dos procedimientos. Las técnicas estándar de biología molecular conocidas en la técnica, y no descritas específicamente, pueden seguirse en general como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989) Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989) Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Nueva York (1988) Watson et al., Recombinant DNA, Scientific American Books, Nueva York Birren et al (eds) Genome Analysis: A Laboratory Manual Series, vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); y la metodología expuesta en Patente de los Estados Unidos No. 4.666.828, 4.683.202, 4.801.531, 5.192.659 y 5.272.057. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se lleva a cabo generalmente como se describe en Protocolos de PCR: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Los sistemas de expresión procariota y eucariota, incluidos los vectores y las células huésped, pueden utilizarse para expresar tanto formas truncadas como de longitud completa de los polipéptidos recombinantes expresados por las secuencias de nucleótidos de la presente invención. Para expresar los polipéptidos descritos en la presente memoria, pueden utilizarse diversos sistemas de vector de expresión del huésped. Estos sistemas de expresión del huésped también representan vehículos mediante los cuales las secuencias codificantes de interés pueden ser clonadas y posteriormente purificadas. Las células huésped pueden, cuando se transforman o transfectan con el vector o la secuencia de nucleótidos adecuados, expresar el producto génico polipeptídico codificado de la invención. Dichas células huésped incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN bacteriófago recombinante, ADN plásmido o ADN cósmido que contienen secuencias codificantes; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levadura recombinante que contienen las secuencias codificantes del producto génico; sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias codificantes; sistemas celulares de plantas infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes; o sistemas de células de mamíferos (por ejemplo, COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, el promotor de la metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío del adenovirus; el promotor del virus vacuna 7.5K).

Generalmente, los vectores pueden derivarse , pero no limitarse a, plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de episomas de levadura, de elementos cromosómicos de levadura, de virus (por ejemplo, como se ha descrito anteriormente), de cromosomas de mamíferos, y de combinaciones de los mismos, como los derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, incluyendo, pero no limitándose a, cósmidos y fagémidos.

Se pueden utilizar vectores para la expresión de polipéptidos de M. bovis. Generalmente, los vectores incluyen regiones reguladoras de acción cis unidas de forma operativa al polinucleótido que codifica los polipéptidos que se van a expresar. Las regiones reguladoras pueden ser constitutivas o inducibles. Los factores de acción trans apropiados son suministrados por el huésped mediante un sistema de traducción in vitro, por un vector complementario o por el propio vector al ser introducido en el huésped.

Los vectores de la invención pueden incluir cualquier elemento típicamente incluido en un vector de expresión o visualización, incluyendo, pero sin limitarse a, origen de secuencias de replicación, uno o más promotores, genes de resistencia a los antibióticos, secuencias de péptido líder o de señal, diferentes secuencias de etiqueta, secuencias de relleno que pueden codificar un gen cuyo polipéptido confiere resistencia a los antibióticos, sitios de restricción, sitios de unión a ribosomas, potenciadores de la traducción (secuencias capaces de formar estructuras de bucle de tallo para la estabilidad del ARNm después de la transcripción), secuencias que codifican aminoácidos que carecen de un codón de parada y secuencias que codifican una proteína de cubierta bacteriana.

La presente invención se ilustra además con los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1. Generación y aislamiento de un muíante de Mycoplasma bovis.

El Mycoplasma bovis, aislado de la articulación de un bovino (Millmerran, Queensland; 1999), se pasó dos veces en caldo de Mycoplasma bovis ("Bovis") (PPLO; extracto de levadura; rojo de fenol; suero porcino inactivado por calor e irradiado con y), se clonó por filtros 4 veces en agar Bovis y se pasó de nuevo en caldo. Se preparó un cultivo de la cepa (10 ml) y se incubó a la temperatura adecuada durante 24 horas. Transcurrido ese tiempo, el cultivo se cosechó por centrifugación a 13.000 g durante 10 minutos a 4 °C. La pella resultante se lavó 3 veces con 1 ml de solución salina amortiguada con fosfato (PBS). La pella final se resuspendió en 1 ml de PBS y se dividió en dos tubos eppendorf de 1,5 ml. Se indujo mutagénesis en la cepa (designada como 3683) utilizando la sustancia química metilnitronitrosoguanidina (NTG). Los mutantes sensibles a la temperatura de M. bovis se generaron y seleccionaron de acuerdo con el protocolo descrito originalmente en Nonomura e Imada (Avian Dis. 26(4):763-775; 1982). Tras la mutagénesis y la selección fenotípica, se llevó a cabo la clonación por filtros y el paso en caldo Bovis.

Un ternero fue inoculado intranasalmente con un clon purificado de un mutante sensible a la temperatura designado 3683 # 22/3/12. El aislado de M. bovis N2805-1 fue obtenido posteriormente a partir de un hisopo recogido de la nasofaringe de ese ternero específico, de acuerdo con el siguiente procedimiento: El caldo de micoplasma que contenía material de hisopo nasal recogido 28 días después de la infección se colocó en placas de agar PPLO, que se incubaron a 38,3 °C en una atmósfera de 5 % de CO². Se recogió una colonia individual y se transfirió al caldo PPLO, y se incubó a 38,3 °C en una atmósfera de 5 % de CO² durante 48 horas. A continuación, el cultivo de caldo se pasó por un filtro estéril de 0,45 micras, se diluyó en solución salina y se sembró en agar PPLO, con el fin de obtener colonias individuales. Se realizaron un total de 8 pases, alternando entre el caldo y las placas, filtrando la fase de caldo antes de la siembra, para obtener colonias individuales. Esto dio lugar a un total de 3 pasos de filtrado/clonación. El paso final de caldo se dividió en 2 alícuotas, que se almacenaron a - 80 °C. Posteriormente se descongeló una alícuota congelada y se utilizó para inocular 60 ml de caldo PPLO. Tras 48 horas de incubación a 38,3 °C en 5 % de CO², el cultivo se dispensó en alícuotas de 1,25 ml y se congeló a -80 °C, para que sirviera de cultivo madre de trabajo. Se descongeló un vial de cultivo madre y se utilizó para inocular 200 ml de caldo PPLO, que se incubó durante 24 horas a 37 °C en 5 % de CO². A continuación, el cultivo se dispensó en alícuotas de 1,25 ml y se congeló a -80 °C. Todo el trabajo posterior se realizó con este material ("paso 10").

Dado que la cepa utilizada para vacunar al ternero del que finalmente se recuperó N2805-1 era sensible a la temperatura, se evaluaron las características fenotípicas de N2805-1 tanto a la temperatura restrictiva (38,3 °C) como a la permisiva (33 °C). El crecimiento de N2805-1 a la temperatura restrictiva fue al menos tan bueno, si no mejor, que el crecimiento a la temperatura permisiva (Tabla 1), lo que indica que N2805-1 ya no presentaba un fenotipo sensible a la temperatura.

Tabla 1.

En un estudio separado, la tasa de crecimiento de N2805-1 se comparó con la del mutante sensible a la temperatura, 3683 #22/3/12, y la cepa madre (3683) de la que se derivó. Se inoculó caldo PPLO que contenía un 10 % de suero porcino con un 1 % (v/v) de cultivo madre congelado descongelado de cada cepa. Se prepararon dos cultivos en caldo y uno se incubó a 33 °C y el otro a 38 °C, ambos con 5 % de CO². A las 42 horas después de la incubación, se extrajo una alícuota de 0,1 ml de cada cultivo y se determinaron las UFC/ml mediante dilución en serie y recuento en placa en agar PPLO. Las placas se incubaron a la misma temperatura que el cultivo de caldo correspondiente durante 5-7 días con un 5 % de CO². Los resultados de la Figura 1 demuestran que a las 42 horas de la incubación, N2805-1 ya no era tan sensible a la temperatura como 3683 #22/3/12.

Para caracterizar genotípicamente el N2805-1, se secuenció el genoma completo y se comparó con el de la cepa progenitora de tipo silvestre (WT, con inducción previa de mutagénesis) 3683, de la que se derivó. El resultado de ese esfuerzo fue que se identificaron 12 diferencias de nucleótido único diferente (polimorfismos de nucleótido único, o SNP) entre las 3683 cepas de M. bovis y las cepas derivadas N2805-1. Hasta la fecha, 5 de esos 12 SNP han sido confirmados por PCR. En la Tabla 2 se muestran los cambios ejemplares en la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de esos 5 ^s N^p (desde la cepa 3683 hasta el aislado N2805-1).

Tabla 2.

Ejemplo 2. Eficacia de una cepa de vacuna de Mycoplasma bovis modificada viva contra un desafío heterólogo de Mycoplasma bovis virulento.

Se reclutaron en el estudio terneros clínicamente sanos y privados de calostro (CD). Todos los terneros fueron serológicamente negativos (título <1:1600) para el anticuerpo de M. bovis por ELISA, y fueron negativos a la PCR para M. bovis en los hisopos nasales recogidos antes del Día 0.

Todos los terneros fueron también negativos a la infección persistente por BVDV en las pruebas de muescas en la oreja. Los animales fueron alojados en salas separadas por grupo de tratamiento, en corrales individuales, durante la fase de vacunación de este estudio. Los grupos de tratamiento se mezclaron en cuatro salas de desafío y se alojaron por bloques durante la fase de desafío. Se registraron todos los eventos adversos que se produjeron en los terneros durante el transcurso del estudio.

En el Día de Estudio 0 (SD 0), los animales de 1 a 2 semanas de edad recibieron por vía intranasal (una fosa nasal) una de las siguientes vacunas (Tabla 3): T01, solución salina; T02, vacuna de M. bovis cepa N2805-1; T03, vacuna experimental de referencia de M. bovis (viva atenuada); T04, paso anterior de la vacuna de M. bovis cepa N2805-1, sensible a la temperatura. Entre el SD 29 y el SD 31, todos los animales fueron desafiados por aerosol con la cepa 110LA-11-10 de M. bovis Kansas. Los terneros fueron desafiados utilizando una pequeña máscara facial (máscara anestésica canina) conectada a un nebulizador, a través de una cámara que contenía el desafío de M. bovis en aerosol. Se conectaron cuatro nebulizadores a cada cámara, que a su vez estaba conectada, mediante tubos individuales, a cuatro terneros. Posteriormente, se realizó necropsia a los animales el SD 56; las muestras/tejidos recogidos incluyeron: tejido pulmonar, para la PCR; hisopos pulmonares, 1 para el aislamiento de M. bovis, y 1 para otras bacterias; tejido de amígdalas; ganglios linfáticos traqueobronquiales; y tejido de lesión pulmonar.

Tabla 3.

Resultados. Los resultados de las puntuaciones de las lesiones pulmonares (LLS) con transformación inversa de los mínimos cuadrados (BTLSM) se recogen en la Tabla 4. La vacuna administrada a los grupos de tratamiento T02, T03 y T04 indujo una reducción significativa de las lesiones pulmonares en comparación con T01, controles salinos (0 %, 1 % y 1 %, frente al 17 %, respectivamente).

Tabla 4.

1. Los grupos de tratamiento con la misma letra no son significativamente diferentes a alfa =,10

La duración media de la pirexia (>103,1°F) se indica en la Tabla 5. Los tres grupos de tratamiento vacunados tuvieron significativamente menos días de pirexia en comparación con los controles.

Tabla 5.

1. Diferentes superíndices dentro de una columna representan diferencias significativas entre los grupos Después del desafío, el grupo T01 tuvo una duración de la enfermedad clínica asociada a la enfermedad respiratoria por M. bovis de 4,7 días en promedio. Esto contrasta con los 0,7, 1,2 y 2,5 días, respectivamente, de los grupos T02, T03 y T04 (Tabla 6). Los terneros T02 y T03 presentaron una reducción significativa de la duración media de al menos un signo clínico en comparación con los terneros T01 (P<0,0009 y P<0,0265).

Los grupos T02, T03 y T04 estuvieron protegidos de la enfermedad inducida por M. bovis, ya que menos animales mostraron signos clínicos de tos, cojera y esfuerzo respiratorio, y durante un periodo de tiempo más corto en comparación con el grupo T01. Ningún animal de ningún grupo presentó secreción nasal. Los vacunados presentaron una inclinación de las orejas/cabeza ligeramente más frecuente que el grupo T01 (Tabla 7).

Tabla 6.

1. Diferentes superíndices dentro de una columna representan diferencias significativas entre los grupos

Tabla 7.

Se recogieron hisopos nasales y se analizaron por PCR para M. bovis semanalmente a lo largo del estudio. La detección por PCR alcanzó su punto máximo entre el día 7 y el 21 para los grupos vacunados. Los controles T01 permanecieron negativos a la p Cr durante la fase de vacunación. El 100 % de los terneros T02 y T04, y el 93,3 % de los terneros T03 fueron positivos a la PCR durante el estudio (Tabla 8).

Todos los animales eran sero-negativos para M. bovis (títulos de ELISA de <1:1.600, o Media Geométrica <800) antes del inicio del estudio. La seroconversión se detectó el día 7 para los terneros T02 y T04, y el día 14 para el grupo T03. Las medias de los títulos fueron bajas en todos los grupos hasta después del desafío (Tabla 9).

La respuesta de anticuerpos IgA de la mucosa a la vacunación y al desafío se vigiló en las secreciones nasales utilizando un ELISA de IgA específico de M. bovis. Se utilizó un valor de corte de >1:50 para definir una respuesta positiva. Los títulos de anticuerpos IgA fueron inducidos por la vacunación, y en general aumentaron con la progresión del estudio. Los títulos de IgA fueron mayores en los terneros T02, T03 y T04 que en los animales T01 desde el día 7 hasta el día 55. La respuesta máxima fue el día 43 para los grupos T01 y T02, y el día 55 para los grupos T03 y T04 (Tabla 10).

Las muestras de pulmón, amígdalas y ganglios linfáticos traqueobronquiales fueron analizadas por PCR para M. bovis*. (* Mycoplasma agalactiae también puede ser amplificado en este ensayo de PCR) La recuperación de M. bovis fue menos frecuente en los tres grupos de tratamiento vacunados en muestras de tejido pulmonar y ganglionar, en comparación con los controles. La recuperación de las amígdalas fue alta para todos los grupos de tratamiento (Tabla 11).

Tabla 11.

La tasa de aislamiento de M. bovis a partir de los hisopos pulmonares (día de la necropsia) fue menor en los terneros T02, T03 y T04, con 31,3 %, 40,0 % y 33,3 %, en comparación con el 87,5 % de los controles T01. Los hisopos pulmonares fueron negativos para todos los demás patógenos bacterianos analizados (Tabla 12).

Tabla 12.

El ensayo ELISPOT de IFN gamma midió la inducción de la inmunidad mediada por células tras la vacunación y el desafío. Las células formadoras de manchas de IFN gamma (SFC) por millón de bTlSM (día -1 y día 42) y las medias geométricas (día 7 y día 14) se listan en la Tabla 13.

Tabla 13.

En conclusión, la vacuna candidata N2805-1 (T02) proporcionó una reducción significativa de las puntuaciones de las lesiones pulmonares. Las temperaturas rectales y los signos clínicos de la enfermedad tras el desafío se redujeron en gravedad y duración con N2805-1. Los títulos de anticuerpos en suero, los títulos de IgA y los resultados de la PCR y del cultivo también apoyan la eficacia de esta cepa. Por lo tanto, la vacuna N2805-1 es una buena candidata para evaluar su seguridad, y en posteriores estudios de eficacia.

Ejemplo 3. Caracterización genómica del muíante sensible a la temperatura, 3863 22/3/12, y del muíante no sensible a la temperatura, N2805-1.

En un esfuerzo por caracterizar las diferencias genómicas entre el mutante sensible a la temperatura de M. bovis, 3683 # 22/3/12, y el mutante no sensible a la temperatura, N2805-1, aislado de un ternero que había sido inoculado con 3683 # 22/3/12, se determinó la secuencia de los genomas de ambos utilizando la tecnología Illumina. Se prepararon bibliotecas de ADN y se determinó la secuencia de las muestras con código de barras para obtener una cobertura de 60X secuencias de extremo pareado por muestra. Se llevó a cabo un control de calidad de todas las lecturas, y se eliminaron las lecturas fallidas y de baja calidad antes del levantamiento del mapa y del análisis de polimorfismo (SNP) de un solo nucleótido. Las lecturas de secuencias se asignaron a un genoma de referencia (Hubei-1; número de acceso al banco de genes CP002513) utilizando el software CLC Genomics workbench (Qiagen; Redwood City, CA). Se utilizó el módulo de detección de variantes de CLC Genomics workbench para el descubrimiento de SNP. La identidad y la ubicación de los SNP se muestran en la Tabla 14. Entre las dos cepas mutantes, se identificaron 56 SNP, 17 de los cuales dieron lugar a cambios en los aminoácidos (incluidos 2 que dieron lugar a la introducción de un codón de parada), 6 dieron lugar a mutaciones de desplazamiento de marco y 33 se produjeron en regiones no codificantes.

Tabla 14.

(continuación

Una cepa de Mycoplasma bovis procedente de un bovino ha sido atenuada, así como caracterizada. Un aislado de dicha cepa de M. bovis fue depositado en la American Type Culture Collection ("ATCC"), Manassas, VA, EE. UU., el 12 de mayo de 2015, y se le ha asignado el número de acceso, PTA-122167.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una composición inmunogénica eficaz que comprende una cepa atenuada de Mycoplasma bovis, en donde dicha cepa está depositada en la American Type Culture Collection con el número de acceso PTA-122167.

2. Una composición inmunogénica eficaz como la definida en la reivindicación 1 para su uso en la prevención de enfermedades causadas por Mycoplasma bovis en un animal bovino, que comprende la administración al animal de una cantidad inmunizante de la composición inmunogénica.

3. Una composición inmunogénica eficaz de la reivindicación 1 o una composición inmunogénica eficaz para el uso de la reivindicación 2, en donde dicha cepa de M. bovis está inactivada.

4. La composición inmunogénica o la composición inmunogénica para uso de la reivindicación 3, en donde la composición puede comprender adicionalmente un adyuvante.

5. La composición inmunogénica o la composición inmunogénica para uso de la reivindicación 3, que comprende además al menos un antígeno adicional.

6. La composición inmunogénica o la composición inmunogénica para uso de la reivindicación 5, en donde el antígeno adicional se selecciona del grupo que consiste en un virus, una bacteria, un hongo y un parásito.

7. La composición inmunogénica o la composición inmunogénica para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde dicha composición está formulada para su administración por una vía seleccionada del grupo que consiste en intramuscular, subcutánea, intranasal, intratraqueal, oral y en aerosol.

8. Un procedimiento para proporcionar una vacuna de Mycoplasma bovis como se define en la reivindicación 1, en donde dicha vacuna se genera mediante los pasos que comprenden:

A. Obtención de un cultivo de M. bovis depositado en el ATCC como PTA-122167;

B. Paso adicional de dicho cultivo de M. bovis al menos una vez;

C. Aislar un clon de dicho cultivo pasado; y

D. Formular dicho clon con un vehículo o excipiente, y opcionalmente un adyuvante.