JP2012510285A - 改変Ｅｒｎｓタンパク質を有するウシウイルス性下痢ウイルス - Google Patents

Abstract

本発明は、免疫原性組成物およびワクチンとしての利用性を有するキメラペスチウイルスであって、その同種Ｅｒｎｓタンパク質を発現しないウシウイルス性下痢ウイルスを含み、さらに、別のペスチウイルスに由来する異種Ｅｒｎｓタンパク質、または前記異種Ｅｒｎｓタンパク質の天然の変異体、合成の変異体、もしくは遺伝的変異体を発現するキメラペスチウイルスに関する。また、本明細書において、ウシウイルス性下痢ウイルス感染の蔓延を治療または予防するための方法およびキット、ならびに、ワクチン接種された動物と野生型に感染した動物とを区別するための方法およびキットも記載する。

Description

本発明は、新規なキメラペスチウイルス、ならびに免疫原性組成物およびワクチンにおけるそれらの使用に関するものである。本発明はまた、ウシウイルス性下痢ウイルス感染の蔓延を治療または予防するための方法およびキットにも関する。本発明はさらに、ワクチン接種された動物と野生型ウイルスに感染した動物とを区別するための方法およびキットにおける、キメラペスチウイルスの使用にも関する。

ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤウイルス、またはＢＶＤＶ）を含めたペスチウイルスは、家畜動物および野生動物の両方で、いくつかの種から単離されている。同定された、ＢＶＤＶの宿主には、バッファロー、アンテロープ、トナカイ、および様々なシカ種が含まれ、一方、固有のペスチウイルス種が、キリンおよびプロングホーンアンテロープにおいて同定されている。ＢＶＤＶは、フラビウイルス科の小型のＲＮＡウイルスである。これは、ヒツジにおけるボーダー病およびブタにおける豚コレラの原因物質である、他のペスチウイルスと近縁である。最近では、Ｂｕｎｇｏｗａｎｎａｈペスチウイルスという名の分岐ペスチウイルスが、オーストラリアにおける子豚の胎内感染の病原因子として同定された。

ＢＶＤＶにより生じる疾患は、特に牛において広く蔓延しており、経済上、壊滅的であり得る。牛におけるＢＶＤＶ感染の結果、繁殖上の問題が生じ得、流産または早産が生じ得る。ＢＶＤＶは、妊娠中の牛の胎盤を通過し得、その結果、ウイルスに対して免疫寛容であり、死ぬまで持続的にウイルス血症である、持続感染した（ＰＩ）子牛が産まれ得る。感染した牛はまた、発熱、下痢、咳、および消化器粘膜の潰瘍を特徴とする「粘膜疾患」を示し得る。これらの持続感染した動物は、粘膜疾患のさらなる突発をもたらす、群内でのウイルスの拡散源をもたらし、かつ、腸疾患または肺炎の発生の原因となる微生物に非常に感染しやすい。

ＢＶＤＶは、２つのバイオタイプの１つに分類される。「ｃｐ」バイオタイプのものは、培養細胞に対する細胞変性効果を誘発し、一方、非細胞変性バイオタイプまたは「ｎｃｐ」バイオタイプのウイルスは誘発しない。さらに、２つの主要な遺伝子型（１型および２型）が認められており、これらの両方は、様々な臨床的症候群を生じさせることが示されている。

ＢＶＤＶビリオンは、４０から６０ｎｍの直径である。ＢＶＤＶのヌクレオカプシドは、ＲＮＡの単一分子およびカプシドタンパク質Ｃからなる。ヌクレオカプシドは脂質膜に囲まれており、この脂質膜内に、２つの糖タンパク質Ｅ１およびＥ２が固定されている。第３の糖タンパク質であるＥ^ｒｎｓは、エンベロープと緩やかに会合している。ＢＶＤＶのゲノムは、およそ１２．５ｋｂの長さであり、５’非翻訳領域（ＮＴＲ）と３’非翻訳領域との間に位置する単一のオープンリーディングフレームを含有する。およそ４３８ｋＤのポリタンパク質は、このオープンリーディングフレームから翻訳され、細胞プロテアーゼおよびウイルスプロテアーゼによって、少なくとも１１個のウイルス構造タンパク質および非構造（ＮＳ）タンパク質にプロセシングされる（Ｔａｕｔｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５４１５〜５４２２（１９９７）；Ｘｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５３１２〜５３２２（１９９７）；Ｅｌｂｅｒｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：４１３１〜４１３５（１９９６）；およびＷｉｓｋｅｒｃｈｅｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８４：３４１〜３５０（１９９１））。ＢＶＤＶのゲノム順序は、ｐ２０／Ｎ^ｐｒｏ、ｐ１４／Ｃ、ｇｐ４８／Ｅ^ｒｎｓ、ｇｐ２５／Ｅ１、ｇｐ５３／Ｅ２、ｐ５４／ＮＳ２、ｐ８０／ＮＳ３、ｐ１０／ＮＳ４Ａ、ｐ３２／ＮＳ４Ｂ、ｐ５８／ＮＳ５Ａ、およびｐ７５／ＮＳ５Ｂである。３つのエンベロープタンパク質ｇｐ４８／Ｅ^ｒｎｓ、ｇｐ２５／Ｅ１、およびｇｐ５３／Ｅ２が、重度にグリコシル化されている。Ｅ^ｒｎｓ（以前は、Ｅ０またはｇｐ４８と呼ばれていた）は、ジスルフィドによって共有結合しているホモ二量体を形成する。疎水性の膜アンカー領域が存在しないことは、Ｅ^ｒｎｓがエンベロープと緩やかに会合していることを示唆する。Ｅ^ｒｎｓは、感染した牛において高い抗体力価を誘発するが、抗血清は、限られたウイルス中和活性を有する。

ＢＶＤＶワクチンの中で、現在利用可能なものは、化学的に不活化された野生型ウイルスを含有するものである。これらのワクチンは、典型的には、複数回用量の投与を必要とし、短期間の免疫応答をもたらす。それらはまた、胎児のウイルス伝染は防御しない。ヒツジにおいて、精製Ｅ２タンパク質に基づくサブユニットワクチンが報告されている。このワクチンは、胎児を感染から防御すると考えられるが、防御はウイルスの同種株にのみ限定され、抗体力価と防御との間に相関はない。

改変生（ＭＬ）ＢＶＤＶワクチンは、ウシもしくはブタの細胞における反復継代によって、または温度感受性の表現型をウイルスに付与する化学的に誘発される突然変異によって弱毒化されているウイルスを用いて生産されている。単回用量のＭＬＶ ＢＶＤＶワクチンは、感染からの防御をもたらすために十分であることが証明されており、免疫性の期間は、ワクチン接種された牛において数年間延長し得る。さらに、ＭＬＶワクチンを用いた交差防御が報告されている（Ｍａｒｔｉｎら、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｗｏｒｋｅｒｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｄｉｓｅａｓｅｓ」、７５：１８３（１９９４））。しかし、既存のＭＬＶワクチンでは、ワクチン接種された動物と自然感染した動物との区別は不可能である。

したがって、ＢＶＤＶの蔓延を防止するための新規なワクチンが必要とされていることは明らかである。このようなワクチン（複数可）は、今後の全国的なまたは地域的なＢＶＤＶ撲滅プログラムにおいて貴重となり得、また、他の牛ワクチンと組み合わされて、産業におけるかなりの前進となり得る。ＢＶＤＶの蔓延を防止および監視するために、より効果的なワクチンは、「印つき（ｍａｒｋｅｄ）」ワクチンであろう。このようなワクチンは、野生型ウイルスには存在しないさらなる抗原決定基を含有するか、または野生型ウイルスに存在する抗原決定基を欠いたものであり得る。前者に関しては、ワクチン接種された動物は、「マーカー」免疫原性決定基に対する免疫応答を高めるが、ワクチン接種されていない動物は高めない。マーカー決定基に対する免疫学的アッセイの使用を介して、マーカー決定基に対する抗体の存在によって、ワクチン接種された動物を、ワクチン接種されていない、自然感染した動物から区別することができる。後者の戦略のケースでは、印つきワクチン内に該決定基が存在していないため、野生型ウイルスに感染した動物は、マーカー決定基に対する免疫応答を高め、一方、感染していない、ワクチン接種された動物は高めない。マーカー決定基に対する免疫学的アッセイの使用を介して、感染した動物を、ワクチン接種された、感染していない動物から区別することができる。両方のシナリオにおいて、感染した動物を除外することによって、群は、時間とともに、ＢＶＤＶを有さないものになり得る。ＢＶＤＶ疾患の脅威を取り除くことの利益に加え、群がＢＶＤＶを有さないことを保証することは、貿易経済上の利益における直接的な自由をもたらす。

１つの実施形態において、本発明は、その同種Ｅ^ｒｎｓタンパク質を発現しないウシウイルス性下痢ウイルスを含むキメラペスチウイルスであって、さらに、別のペスチウイルスに由来する異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質、または前記異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質の天然の変異体、合成の変異体、もしくは遺伝的変異体を発現する、キメラペスチウイルスを提供する。

別の実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスであって、前記キメラペスチウイルスの異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質、または前記異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質の天然の変異体、合成の変異体、もしくは遺伝的変異体が、トナカイペスチウイルス、キリンペスチウイルス、およびプロングホーンアンテロープペスチウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスに由来する、キメラペスチウイルスを提供する。

異なる実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスであって、前記キメラペスチウイルスの異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質が、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを有する、キメラペスチウイルスを提供する。

別個の実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスであって、前記キメラペスチウイルスの異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質が、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在する少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを欠く、キメラペスチウイルスを提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスの培養物を提供する。

別の実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスを含む細胞系または宿主細胞を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。

異なる実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスおよび獣医学的に許容できる担体を含む免疫原性組成物を提供する。

別個の実施形態において、本発明は、獣医学的に許容できる担体がアジュバントである、上記の免疫原性組成物を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、前記キメラペスチウイルスが生で弱毒化されている、上記の免疫原性組成物を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、前記キメラペスチウイルスが不活化されている、上記の免疫原性組成物を提供する。

異なる実施形態において、本発明は、動物における１つまたは複数のさらなる病原性微生物の蔓延を治療または予防するために有用な１つまたは複数のさらなる抗原をさらに含む、上記の免疫原性組成物を提供する。

別個の実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスをコードするポリヌクレオチド分子および獣医学的に許容できる担体を含む、免疫原性組成物を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスおよび獣医学的に許容できる担体を含む、ワクチンを提供する。

別の実施形態において、本発明は、獣医学的に許容できる担体がアジュバントである、上記のワクチンを提供する。

異なる実施形態において、本発明は、前記キメラペスチウイルスが生で弱毒化されている、上記のワクチンを提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、前記キメラペスチウイルスが不活化されている、上記のワクチンを提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、動物における１つまたは複数のさらなる病原性微生物の蔓延を治療または予防するために有用な１つまたは複数のさらなる抗原をさらに含む、上記のワクチンを提供する。

別個の実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスをコードするポリヌクレオチド分子および獣医学的に許容できる担体を含む、ワクチンを提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスを含むワクチンを少なくとも１つの容器内に含む、キットを提供する。

別の実施形態において、本発明は、ウシウイルス性下痢ウイルス感染の蔓延を治療または予防する方法であって、上記のキメラペスチウイルスを含むワクチンが動物に投与される方法を提供する。

異なる実施形態において、本発明は、動物にワクチン接種する方法であって、ＤＩＶＡペスチウイルスワクチンが前記動物に投与され、前記ＤＩＶＡペスチウイルスワクチンが上記のキメラペスチウイルスを含み、さらに、前記キメラペスチウイルスが、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを有する方法を提供する。

別個の実施形態において、本発明は、動物にワクチン接種する方法であって、ＤＩＶＡペスチウイルスワクチンが前記動物に投与され、前記ＤＩＶＡワクチンが上記のキメラペスチウイルスを含み、さらに、前記キメラペスチウイルスが、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在する少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを欠く方法を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスを含むワクチンでワクチン接種された動物と、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物とを区別する方法であって、前記ワクチンでワクチン接種された動物が、前記ワクチンのキメラペスチウイルスにおいて存在するが野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいては存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープに対する抗体を生成し、
ａ）動物から血清試料を得るステップ、
ｂ）抗体の存在または不存在について前記試料をアッセイするステップ、
ｃ）前記抗体を有する動物を、前記ワクチンでワクチン接種されていると同定するステップ、および
ｄ）前記抗体を欠く動物を、野生型ＢＶＤＶに感染していると同定するステップ、
を含む方法を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物と、上記のキメラペスチウイルスを含むワクチンでワクチン接種された動物とを区別する方法であって、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物が、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在するが前記ワクチンのキメラペスチウイルスにおいては存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープに対する抗体を生成し、
ａ）動物から血清試料を得るステップ、
ｂ）抗体の存在または不存在について前記試料をアッセイするステップ、
ｃ）前記抗体を有する動物を、野生型ＢＶＤＶに感染していると同定するステップ、および
ｄ）前記抗体を欠く動物を、前記ワクチンでワクチン接種されていると同定するステップ、
を含む方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスを含むワクチンでワクチン接種された動物と、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物とを区別するための診断キットであって、ワクチンのキメラペスチウイルスにおいて存在するが野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいては存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープに対する抗体を検出し得る試薬を含む診断キットを提供する。

別の実施形態において、本発明は、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物と、上記のキメラペスチウイルスを含むワクチンでワクチン接種された動物とを区別するための診断キットであって、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在するがワクチンのキメラペスチウイルスにおいては存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープに対する抗体を検出し得る試薬を含む診断キットを提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、上記のキメラペスチウイルスにおいて存在するが野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいては存在しないＥ^ｒｎｓエピトープを認識する抗体を提供する。

異なる実施形態において、本発明は、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在するが上記のキメラペスチウイルスにおいては存在しないエピトープを認識する抗体を提供する。

別の実施形態において、本明細書において記載されるキメラペスチウイルスは、ＢＶＤＶによって生じる感染の予防または治療のための薬剤の調製において用いられる。

以下の定義は、本発明の実施形態の記載において採用される用語に適用され得る。以下の定義は、参照することによって本明細書に組み込まれる個別の参考文献に含まれる、あらゆる相反する定義に優先する。

本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して用いられる科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。さらに、文脈から別段の必要性がない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。

本明細書において用いられる「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸に類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を言う。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、およびその後に修飾されているアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、α−アミノ酸およびα−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、ならびに他の従来にないアミノ酸もまた、本発明のポリペプチドに適した成分であり得る。従来にないアミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸が含まれる。

アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している炭素を有する化合物を言う。例示的なアミノ酸類似体には、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、およびメチオニンメチルスルホニウムが含まれる。このような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）、または修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同一の本質的な化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが天然アミノ酸に類似の様式で機能する化合物を言う。

アミノ酸は、本明細書において、それらの一般に知られている三文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一文字記号によって言及され得る。

本明細書において用いられる「動物」という用語は、限定はしないが、家畜および野生の両方のウシ、ヒツジ、ヤギ、およびブタの種を含む、ＢＶＤＶ感染に感受性のあるあらゆる動物を含むものである。

本明細書において用いられる「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、エピトープの認識によって抗原に結合し得る、免疫グロブリン分子を言う。抗体は、ポリクローナル混合物またはモノクローナルであり得る。抗体は、天然由来源もしくは組換え由来源からも完全な免疫グロブリンであり得るか、または、完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。抗体は、例えばＦｖ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２を含む様々な形態で、および一本鎖で存在し得る。

本明細書において用いられる「抗原」という用語は、対象に暴露されると、その抗原に特異的な免疫応答を誘発する、１つまたは複数のエピトープ（線状エピトープ、立体構造エピトープ、またはその両方）を含有する分子を言う。「抗原」という用語は、弱毒化された、不活化された、または改変された生の、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物、または他の微生物を言い得る。本明細書において用いられる「抗原」という用語はまた、自然界で抗原が随伴する生物全体から分離し、別個になっている、サブユニット抗原を言い得る。「抗原」という用語はまた、抗イディオタイプ抗体またはその断片などの抗体、および抗原または抗原決定基（エピトープ）を模倣し得る合成ペプチドミモトープを言い得る。「抗原」という用語はまたは、ＤＮＡ免疫化の用途など、インビボで、抗原または抗原決定基を発現する、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを言い得る。

本明細書において用いられる「ＢＶＤＶ」、「ＢＶＤＶ単離体」、または「ＢＶＤＶ株」という用語は、限定はしないがＩ型およびＩＩ型を含む、ウイルスゲノム、関連タンパク質、および他の化学的構成要素（脂質など）からなる、ウシウイルス性下痢ウイルスを言う。多くのＩ型およびＩＩ型のウシウイルス性下痢ウイルスが当業者に知られており、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））を介して入手可能である。ウシウイルス性下痢ウイルスは、ＲＮＡの形態のゲノムを有する。ＲＮＡは、クローニングにおける使用のために、ＤＮＡに逆転写され得る。したがって、本明細書においてなされる、核酸配列およびウシウイルス性下痢ウイルス配列への言及は、ウイルスＲＮＡ配列およびウイルスＲＮＡ配列に由来するＤＮＡ配列の両方を包含する。

本明細書において用いられる「細胞系」または「宿主細胞」という用語は、ウイルスの複製および／または維持が可能な、原核細胞または真核細胞を意味する。

本明細書において用いられる「キメラの」または「キメラ」という用語は、例えば、２つ以上の祖先に由来する遺伝的または物理的成分を含有する、例えばウイルスなどの微生物を意味する。

本明細書において用いられる「培養物」という用語は、他の種またはタイプの不存在下で成長している細胞または微生物の集団を意味する。

本明細書において用いられる「ＤＩＶＡ」という用語は、感染した動物をワクチン接種された動物から区別し得るワクチンを意味する。

「エピトープ」は、Ｔ細胞受容体または特異的抗体に結合する抗原の特異的部位であり、典型的には、約３個のアミノ酸残基から約２０個のアミノ酸残基を含む。

本明細書において用いられる「異種」という用語は、異なる種または株に由来することを意味する。

本明細書において用いられる「同種」という用語は、同一の種または株に由来することを意味する。

本明細書において用いられる「免疫原性組成物」という用語は、単独で、または薬学的に許容できる担体と共に動物に投与されると、免疫応答を生じさせる（すなわち、免疫原性活性を有する）組成物を意味する。免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞によって主に仲介される細胞性免疫応答、または、ヘルパーＴ細胞によって主に仲介され、次に自らがＢ細胞を活性化して抗体の生産を導く、液性免疫応答であり得る。

本明細書において用いられる「病原体」または「病原性微生物」という用語は、その宿主動物において疾患、疾病、または異常な状態を誘発し得るかまたは生じさせ得る、微生物、例えば、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、または寄生蠕虫を意味する。

本明細書において用いられる「ペスチウイルス」という用語は、フラビウイルス科のペスチウイルス属のＲＮＡウイルスを意味する。ペスチウイルスには、限定はしないが、ＢＶＤＶ（１型および２型）、豚コレラウイルス（ＣＳＦＶ）、およびボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）、ならびに、イノシシ、バッファロー、エランド、バイソン、アルパカ、プーズー、ボンゴ、様々なシカ種、キリン、トナカイ、シャモア、およびプロングホーンアンテロープなどの種から単離されたペスチウイルスが含まれる（ＶｉｌｃｅｋおよびＮｅｔｔｌｅｔｏｎ、Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１１６：１〜１２（２００６））。

本明細書において用いられる「ポリヌクレオチド分子」という用語は、鎖内で共有結合しているヌクレオチドモノマーからなる、有機ポリマー分子を意味する。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、独特の生物学的機能を有するポリヌクレオチドの例である。

本明細書において用いられる「予防する」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、または「予防（ｐｒｅｔｅｎｖｉｏｎ）」などの用語は、微生物の複製を阻害すること、微生物の伝染を阻害すること、またはその宿主における微生物の定着を阻害することを意味する。本明細書において用いられるこれらの用語および類似の用語はまた、感染の１つまたは複数の兆候または症状を阻害または遮断することを意味し得る。

本明細書において用いられる「治療上効果的な量」という用語は、それを投与された対象において免疫応答を引き起こすために十分な、微生物、またはサブユニット抗原、またはポリペプチド、またはポリヌクレオチド分子、およびその組み合わせの量を意味する。免疫応答は、限定はしないが、細胞性免疫および／または液性免疫の誘発を含み得る。

本明細書において用いられる「治療する」、「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、微生物による感染を低減させるかまたは除去することを意味する。本明細書において用いられるこれらの用語および類似の用語はまた、微生物の複製を低減させること、微生物の伝染を低減させること、またはその宿主における微生物の定着能力を低減させることを意味し得る。本明細書において用いられるこれらの用語および類似の用語はまた、微生物による感染の１つもしくは複数の兆候もしくは症状を低減させること、改善すること、もしくは除去すること、または微生物による感染からの回復を早めることを意味し得る。

本明細書において用いられる「ワクチン」および「ワクチン組成物」という用語は、感染を予防するかもしくは低減させる組成物、または感染の１つもしくは複数の兆候もしくは症状を予防するかもしくは低減させる組成物を意味する。病原体に対するワクチン組成物の予防効果は、通常は、対象において、細胞介在性免疫応答または液性免疫応答または両方の組み合わせである免疫応答を誘発することによって達成される。一般的に、感染の発生の廃絶もしくは低減、兆候もしくは症状の改善、または感染した対象からの微生物の除去の促進は、ワクチン組成物の防御効果の指標である。本発明のワクチン組成物は、ＢＶＤＶによって生じる感染に対する防御効果を提供する。

本明細書において用いられる「変異体」という用語は、所与のタンパク質および／または遺伝子配列の派生物を言い、派生した配列は、突然変異による違いを除いて、本質的に所与の配列と同一である。前記違いは、天然のものであり得るか、または合成によってもしくは遺伝的に生じたものであり得る。

本明細書において用いられる「獣医学的に許容できる担体」という用語は、信頼できる医学的判断の範囲内にあり、不必要な毒性、刺激、アレルギー反応などを伴うことなく動物の組織に接触させる使用に適しており、合理的なリスク対効果比に見合い、かつそれらの目的とする用途に効果的な物質を言う。

以下の記載は、当業者による本発明の実施を助けるために提供される。それでも、この記載は、本発明を不必要に制限するものと解釈されるべきではなく、それは、本明細書において論じられる実施形態における改変および変更が、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱することなく、当業者によって行われ得るためである。

ウイルス、免疫原性組成物、およびワクチン
本発明は、１つまたは複数のキメラペスチウイルスを含む免疫原性組成物およびワクチンを提供し、前記キメラペスチウイルスは、その同種Ｅ^ｒｎｓタンパク質を発現しないウシウイルス性下痢ウイルスを含むが、別のペスチウイルスに由来する異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質、または前記異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質の天然の変異体、合成の変異体、もしくは遺伝的変異体を発現する。キメラペスチウイルスは、限定はしないが、ＢＶＤＶ／トナカイペスチウイルスキメラ、ＢＶＤＶ／キリンペスチウイルスキメラ、およびＢＶＤＶ／プロングホーンアンテロープペスチウイルスキメラからなる群から選択され得る。

１つの実施形態において、ＢＶＤＶ／キリンキメラペスチウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ２０１１０−２２０９、ＵＳＡでＵＣ２５５４７として寄託されている株であり、この株には、ＰＴＡ−９９３８というＡＴＣＣ（登録商標）受託番号が付与されている。１つの実施形態において、ＢＶＤＶ／プロングホーンアンテロープキメラペスチウイルスは、ＡＴＣＣ（登録商標）でＵＣ２５５４８として寄託されている株であり、この株には、ＰＴＡ−９９３９というＡＴＣＣ（登録商標）受託番号が付与されている。１つの実施形態において、ＢＶＤＶ／トナカイキメラペスチウイルスは、ＡＴＣＣ（登録商標）でＵＣ２５５４９として寄託されている株であり、この株には、ＰＴＡ−９９４０というＡＴＣＣ（登録商標）受託番号が付与されている。

本発明のキメラペスチウイルスは、細胞、細胞系、および宿主細胞において増殖し得る。前記細胞、細胞系、または宿主細胞は、例えば、限定はしないが、昆虫細胞および植物細胞を含む、哺乳動物細胞および非哺乳動物細胞であり得る。本発明のキメラペスチウイルスが増殖し得る細胞、細胞系、および宿主細胞は、当業者が容易に知ることができ、また、入手しやすいものである。

本発明のキメラペスチウイルスは、免疫原性組成物またはワクチンにおいて用いる前に、弱毒化または不活化され得る。弱毒化および不活化の方法は、当業者に周知である。弱毒化のための方法には、限定はしないが、適切な細胞系に対する細胞培養における連続継代、紫外線照射、および化学的突然変異生成が含まれる。不活化のための方法には、限定はしないが、ホルマリン、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、もしくはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）での処理、または当業者に知られている他の方法が含まれる。

ホルマリンによる不活化は、ホルムアルデヒドの最終濃度が０．０５％となるまで、ウイルス懸濁液と３７％ホルムアルデヒドとを混合することによって行うことができる。ウイルス−ホルムアルデヒド混合物は、室温でおよそ２４時間にわたり持続的に撹拌することによって混合される。不活化ウイルス混合物は次に、適切な細胞系での成長についてアッセイすることによって、残りの生存ウイルスについて試験される。

ＢＥＩによる不活化は、ＢＥＩの最終濃度が１ｍＭとなるまで、本発明のウイルス懸濁液と０．１ＭのＢＥＩ（０．１７５ＮのＮａＯＨ内の２−ブロモエチルアミン）とを混合することによって行うことができる。ウイルス−ＢＥＩ混合物は、室温でおよそ４８時間にわたり持続的に撹拌することによって混合され、その後、最終濃度が０．１ｍＭとなるまで、１．０Ｍのチオ硫酸ナトリウムが添加される。混合は、さらに２時間にわたり続けられる。不活化ウイルス混合物は、適切な細胞系での成長についてアッセイすることによって、残りの生存ウイルスについて試験される。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、１つまたは複数の獣医学的に許容できる担体を含み得る。本明細書において用いられる場合、「獣医学的に許容できる担体」には、あらゆるおよび全ての溶媒、分散媒質、被覆剤、アジュバント、安定剤、希釈剤、保存剤、抗生物質および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などが含まれる。希釈剤には、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれ得る。等張剤には、当業者に知られているもののなかでも、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれ得る。安定剤には、当業者に知られているもののなかでも、アルブミンが含まれる。保存剤には、当業者に知られているもののなかでも、メルチオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）が含まれる。

アジュバントには、限定はしないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、水中油型エマルジョン、油中水型エマルジョン、例えば、当業者に知られている多くのもののなかでも、フロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバント、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ Ｇａ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｍａｓｓ．）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）もしくは他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から得られる易熱性エンテロトキシン（組換え、またはそれ以外のもの）、コレラ毒素、またはムラミルジペプチドが含まれる。本発明との関連で有用なアジュバントおよび添加剤の量および濃度は、当業者によって容易に決定され得る。１つの実施形態において、本発明は、約５０μｇから約２０００μｇのアジュバントを含む免疫原性組成物およびワクチンを検討する。別の実施形態において、アジュバントは、約１００μｇから約１５００μｇの量、または約２５０μｇから約１０００μｇの量、または約３５０μｇから約７５０μｇの量で含まれる。別の実施形態において、アジュバントは、２ｍｌ用量の免疫原性組成物またはワクチン当たり約５００μｇの量で含まれる。

免疫原性組成物およびワクチンはまた、抗生物質を含み得る。このような抗生物質には、限定はしないが、アミノグリコシド、カルバペネム、セファロスポリン、糖ペプチド、マクロライド、ペニシリン、ポリペプチド、キノロン、スルホンアミド、およびテトラサイクリンのクラスのものが含まれる。１つの実施形態において、本発明は、約１μｇ／ｍｌから約６０μｇ／ｍｌの抗生物質を含む免疫原性組成物およびワクチンを検討する。別の実施形態において、免疫原性組成物およびワクチンは、約５μｇ／ｍｌから約５５μｇ／ｍｌの抗生物質、または約１０μｇ／ｍｌから約５０μｇ／ｍｌの抗生物質、または約１５μｇ／ｍｌから約４５μｇ／ｍｌの抗生物質、または約２０μｇ／ｍｌから約４０μｇ／ｍｌの抗生物質、または約２５μｇ／ｍｌから約３５μｇ／ｍｌの抗生物質を含む。さらに別の実施形態において、免疫原性組成物およびワクチンは、約３０μｇ／ｍｌ未満の抗生物質を含む。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンはさらに、１つまたは複数の他の免疫調節物質、例えば、インターロイキン、インターフェロン、または他のサイトカインを含み得、その適切な量は、当業者によって決定され得る。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、キメラペスチウイルスをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド分子を含み得る。キメラペスチウイルスゲノムの全てをコードするＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、または１つもしくは複数のオープンリーディングフレームを、免疫原性組成物またはワクチンにおいて用いることができる。ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、他の作用物質の不存在下で投与され得るか、または、細胞の取り込みを促進する作用物質（例えば、リポソームまたは陽イオン性脂質）と共に投与され得る。免疫原性組成物またはワクチンにおける総ポリヌクレオチドは、通常、約０．１μｇ／ｍｌから約５．０ｍｇ／ｍｌの間である。別の実施形態において、免疫原性組成物またはワクチンにおける総ポリヌクレオチドは、約１μｇ／ｍｌから約４．０ｍｇ／ｍｌ、または約１０μｇ／ｍｌから約３．０ｍｇ／ｍｌ、または約１００μｇ／ｍｌから約２．０ｍｇ／ｍｌである。核酸（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を利用するワクチンおよびワクチン接種手順は、例えば米国特許第５，７０３，０５５号、米国特許第５，５８０，８５９号、米国特許第５，５８９，４６６号など、当技術分野において良く記載されており、前記文献の全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンはまた、さらなるＢＶＤＶ抗原、例えば、米国特許第６，０６０，４５７号、米国特許第６，０１５，７９５号、米国特許第６，００１，６１３号、および米国特許第５，５９３，８７３号において記載されているものを含み得、前記文献の全ては、参照することにより本明細書に組み込まれる。

１つまたは複数のキメラペスチウイルスに加え、免疫原性組成物およびワクチンは、他の抗原を含み得る。抗原は、微生物の不活化された全調製物もしくは部分的調製物の形態であり得るか、または、遺伝子操作技術もしくは化学的合成によって得られる抗原分子の形態であり得る。本発明に従った使用に適した他の抗原には、限定はしないが、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｕｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）、ヨーネ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、クロストリジウム種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｌ ｓｐｐ．）、乳房連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｕｂｅｒｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．）、ブルセラ種（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｐｐ．）、ビブリオ種（Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐｐ．）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ ｓｅｒｏｖａｒｓ）、およびレプトスピラ種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）などの病原性細菌に由来するものが含まれる。抗原はまた、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）などの病原性真菌、クリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、ネオスポラ・カニナム（Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ）、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、アイメリア種（Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｐ．）、バベシア種（Ｂａｂｅｓｉａ ｓｐｐ．）、ジアルジア種（Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．）などの原生動物、または、などのオステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、クーペリア（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、ヘモンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、およびカンテツ（Ｆａｓｃｉｏｌａ）などの寄生蠕虫に由来し得る。さらなる抗原には、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス−１、３、６、ウシパラインフルエンザウイルス、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシ白血病ウイルス、牛疫ウイルス、口蹄疫ウイルス、狂犬病ウイルス、およびインフルエンザウイルスなどの、病原性ウイルスが含まれる。

投与の形態、投薬量、経路
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、ＢＶＤＶに対する効果的な免疫応答を誘発するために動物に投与され得る。したがって、本発明は、治療上効果的な量の、本明細書において記載される本発明の免疫原性組成物またはワクチンを動物に投与することによる、ＢＶＤＶに対する効果的な免疫応答を刺激する方法を提供する。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、投与経路に応じて様々な形態で作製され得る。例えば、免疫原性組成物およびワクチンは、注射での使用に適した無菌の水性の溶液もしくは分散液の形態で作製され得るか、または、フリーズドライ技術を用いて凍結乾燥形態で作製され得る。凍結乾燥された免疫原性組成物およびワクチンは、典型的には約４℃で維持され、アジュバントを伴って、または伴わずに、安定化溶液、例えば生理食塩水またはＨＥＰＥＳ内で再構成され得る。免疫原性組成物およびワクチンはまた、懸濁液または乳濁液の形態で作製され得る。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、治療上効果的な量の上記のキメラペスチウイルスの１つまたは複数を含む。精製されたウイルスは、免疫原性組成物もしくはワクチンにおいて直接的に用いられ得るか、または、さらに弱毒化されるかもしくは不活化され得る。典型的には、免疫原性組成物またはワクチンは、約１×１０^２個から約１×１０^１２個の間のウイルス粒子、または約１×１０^３個から約１×１０^１１個の間のウイルス粒子、または約１×１０^４個から約１×１０^１０個の間のウイルス粒子、または約１×１０^５個から約１×１０^９個の間のウイルス粒子、または約１×１０^６個から約１×１０^８個の間のウイルス粒子を含有する。防御効果をもたらすために効果的な、免疫原性組成物またはワクチンにおけるウイルスの正確な量は、当業者によって決定され得る。

免疫原性組成物およびワクチンは通常、約０．５ｍｌから約５ｍｌの間の容積の、獣医学的に許容できる担体を含む。別の実施形態において、担体の容積は、約１ｍｌから約４ｍｌの間であるか、または約２ｍｌから約３ｍｌの間である。別の実施形態において、担体の容積は、約１ｍｌであるか、または約２ｍｌであるか、または約５ｍｌである。免疫原性組成物およびワクチンにおける使用に適した、獣医学的に許容できる担体は、本明細書において先に記載されたもののいずれかであり得る。

当業者は、投与の前にウイルスを弱毒化または不活化する必要があるかどうかを、容易に決定することができる。本発明の別の実施形態において、キメラペスチウイルスは、さらなる弱毒化を行うことなく、動物に直接投与され得る。治療上効果的なウイルスの量は、用いられる特定のウイルス、動物の状態、および／または感染の程度に応じて変化し得、当業者によって決定され得る。

本発明の方法に従うと、単回用量を動物に投与することができるか、あるいは、約２週間から約１０週間の間隔で２回以上の接種を行うことができる。追加投与レジメンが必要とされてもよく、投薬レジメンは、最適な免疫化をもたらすために調節され得る。当業者は、最適な投与レジメンを容易に決定することができる。

免疫原性組成物およびワクチンは、血流内、筋肉内、または内臓内に直接投与され得る。非経口投与のための適切な手段には、静脈内、動脈内、腹腔内、髄腔内、心室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、および皮下が含まれる。非経口投与のための適切な装置には、針（マイクロ針を含む）注入器、針を有さない注入器、および点滴技術が含まれる。

非経口製剤は、典型的には、塩、炭水化物、および緩衝剤（好ましくは約３から約９のｐＨ、または約４から約８のｐＨ、または約５から約７．５のｐＨ、または約６から約７．５のｐＨ、または約７から約７．５のｐＨにするもの）などの賦形剤を含有し得る、水性溶液であるが、いくつかの用途では、これは、無菌の非水性溶液として、または、発熱物質を有さない滅菌水などの適切な媒体と組み合わせて用いるための乾燥形態として、より適切に製剤され得る。

例えば凍結乾燥による、無菌条件下での非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な薬学的技術を用いて、容易に達成され得る。

非経口溶液の調製において用いられる化合物の溶解度は、緩衝液、塩、界面活性剤、リポソーム、シクロデキストリンなどを含む、溶解度増強剤の組み込みなどの、当業者に知られている適切な製剤技術を用いることによって増大し得る。

非経口投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出となるように製剤され得る。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、および計画放出が含まれる。したがって、本発明の化合物は、活性化合物の調節放出をもたらすインプラントデポ（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｄｅｐｏｔ）としての投与のために、固体、半固体、または揺変性液体として製剤され得る。このような製剤の例には、薬剤被覆ステント、およびポリ（ｄｌ−乳酸グリコール酸共重合体）（ＰＧＬＡ）ミクロスフェアが含まれる。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンはまた、皮膚または粘膜に、すなわち皮膚にまたは経皮的に、局所的に投与され得る。この目的のための典型的な製剤には、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、散布剤、包帯剤、フォーム、フィルム、皮膚パッチ、ウエハース、インプラント、スポンジ、ファイバー、包帯、およびマイクロエマルジョンが含まれる。リポソームもまた用いることができる。典型的な担体には、アルコール、水、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、グリセリン、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコールが含まれる。浸透増強剤もまた組み込むことができる。例えば、ＦｉｎｎｉｎおよびＭｏｒｇａｎ、Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、８８（１０）：９５５〜９５８（１９９９）を参照されたい。

局所的投与の他の手段には、エレクトロポレーション、イオントフォレーシス、フォノフォレーシス、ソノフォレーシス、および、マイクロ針注射または針を有さない（例えば、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ（商標）、Ｂｉｏｊｅｃｔ（商標）など）注射による送達が含まれる。

局所的投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出となるように製剤され得る。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、および計画放出が含まれる。

免疫原性組成物およびワクチンはまた、典型的には、乾燥粉末吸入器からの乾燥粉末の形態で（単独で、または混合物として、例えば、ラクトースとの乾燥混和物で、または、例えばホスファチジルコリンなどのリン脂質と混合された、混合成分粒子として）、または、１，１，１，２−テトラフルオロエタンもしくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパンなどの適切な噴射剤の使用を伴うかもしくは伴わない、加圧された容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは、細かな霧を生じさせるために電気流体力学を用いたアトマイザー）、もしくは噴霧器からのエアロゾルスプレーとして、鼻腔内でまたは吸入によって投与され得る。鼻腔内での使用では、粉末は、生体接着剤、例えば、キトサンまたはシクロデキストリンを含み得る。

加圧された容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、または噴霧器は、例えば、エタノール、水性エタノール、または、活性物質の分散、可溶化、もしくは放出延長のための適切な別の作用物質を含む、本発明の化合物（複数可）の溶液または懸濁液と、溶媒としての噴射剤（複数可）と、ソルビタントリオレエート、オレイン酸、またはオリゴ乳酸などの、最適な界面活性剤とを含有する。

乾燥粉末製剤または懸濁液製剤における使用の前に、薬品は通常、吸入による送達に適したサイズに微粒化される（典型的には、約５ミクロン未満）。これは、スパイラルジェット粉砕、流動床ジェット粉砕、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧均質化、またはスプレー乾燥などの、あらゆる適切な粉末化方法によって達成され得る。

吸入器または吹送器において用いるための、カプセル（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースから作製される）、ブリスター、およびカートリッジは、本発明の化合物の粉末混合物、ラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基材、および、ｌ−ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウムなどの性能調節剤を含有するように製剤され得る。ラクトースは、無水であり得るか、または、一水和物の形態であり得る。他の適切な賦形剤には、デキストラン、グルコース、マルトース、ソルビトール、キシリトール、フルクトース、スクロース、およびトレハロースが含まれる。

細かい霧を生じさせるための電気流体力学を用いたアトマイザーにおいて用いるための、適切な溶液製剤は、作動当たり約１μｇから約２０ｍｇの本発明の化合物を含有し得、作動容積は、約１μｌから約１００μｌで変動し得る。別の実施形態において、作動当たりの化合物の量は、約１００μｇから約１５ｍｇ、または約５００μｇから約１０ｍｇ、または約１ｍｇから約１０ｍｇ、または約２．５μｇから約５ｍｇの範囲であり得る。別の実施形態において、作動容積は、約５μｌから約７５μｌ、または約１０μｌから約５０μｌ、または約１５μｌから約２５μｌの範囲であり得る。典型的な製剤は、本発明の化合物、プロピレングリコール、滅菌水、エタノール、および塩化ナトリウムを含み得る。プロピレングリコールの代わりに用いることができる別の溶媒には、グリセロールおよびポリエチレングリコールが含まれる。

吸入／鼻腔内投与のための製剤は、例えばＰＧＬＡを用いて、即時放出および／または調節放出となるように製剤され得る。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、および計画放出が含まれる。

乾燥粉末吸入器およびエアロゾルのケースでは、投薬単位は通常、定量を送達するバルブによって決定される。本発明に従った単位は、典型的には、約１０ｎｇから約１００μｇの本発明の化合物を含有する定量または「一回分」を投与するように準備される。別の実施形態において、定量で投与される化合物の量は、約５０ｎｇから約７５μｇであるか、または約１００ｎｇから約５０μｇであるか、または約５００ｎｇから約２５μｇであるか、または約７５０ｎｇから約１０μｇであるか、または約１μｇから約５μｇである。全体的な１日用量は、典型的には約１μｇから約１００ｍｇの範囲であり得、これは、単回用量で投与され得るか、または、より一般には、１日を通して分割された用量として投与され得る。別の実施形態において、全体的な１日用量は、約５０μｇから約７５ｍｇ、または約１００μｇから約５０ｍｇ、または約５００μｇから約２５ｍｇ、または約７５０μｇから約１０ｍｇ、または約１ｍｇから約５ｍｇの範囲であり得る。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンはまた、口腔的または経口的に、すなわち、口を介して、または口を経由して、かつ、嚥下または口腔粘膜（例えば、舌下吸収もしくは頬吸収）を介した輸送またはその両方を伴って、対象の体内に投与され得る。メントールおよびレボメントールなどの適切な香料、または、サッカリンまたはサッカリンナトリウムなどの適切な甘味料を、口腔投与または経口投与を意図した本発明のこれらの製剤に添加することができる。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、例えば、座剤、ペッサリー、または浣腸剤の形態で、直腸または膣に投与され得る。ココアバターが従来の座剤基材であるが、様々な代替物を必要に応じて用いることができる。直腸／膣投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出となるように製剤され得る。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、および計画放出が含まれる。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンはまた、典型的には、等張の、ｐＨ調節された無菌生理食塩水内の、微粒化された懸濁液または溶液の液滴の形態で、目または耳に直接投与され得る。目および耳への投与に適した他の製剤には、軟膏、生分解性（例えば、吸収可能なゲルスポンジ、コラーゲン）および非生分解性（例えば、シリコン）のインプラント、ウエハース、レンズ、ならびに、ニオソームまたはリポソームなどの微粒子系または小胞系が含まれる。架橋ポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、もしくはメチルセルロースなどのセルロースポリマー、または、例えばゲランガムなどのヘテロ多糖ポリマーが、塩化ベンザルコニウムなどの保存剤と共に組み込まれ得る。このような製剤はまた、イオントフォレーシスによって送達され得る。

目／耳投与のための製剤は、即時放出および／または調節放出となるように製剤され得る。調節放出製剤には、遅延放出、持続放出、パルス放出、制御放出、標的化放出、および計画放出が含まれる。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、動物におけるウシウイルス性下痢ウイルス感染の蔓延を治療または予防するための薬剤の調製において用いられ得る。

本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、動物に投与するための薬剤の調製において用いられ得、該薬剤は、その同種Ｅ^ｒｎｓタンパク質を発現しないウシウイルス性下痢ウイルスを含むキメラペスチウイルスを含む、ＤＩＶＡペスチウイルスワクチンであり、前記キメラペスチウイルスは、別のペスチウイルスに由来する異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質、または前記異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質の天然の変異体、合成の変異体、もしくは遺伝的変異体を発現する。１つの実施形態において、キメラペスチウイルスは、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを有する。別の実施形態において、キメラペスチウイルスは、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在する少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを欠く。

検出方法、診断方法
本発明は、動物対象内に存在するペスチウイルスの源を決定する方法を提供する。

感染した動物をワクチン接種された動物から区別し得るワクチンであるＤＩＶＡワクチンを用いたワクチン接種は、動物対象内に存在するペスチウイルスの源を決定するための手段を提供する。この区別は、限定はしないが、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、およびＰＣＲを含む、様々な診断方法のいずれかを介して達成され得る。これらの方法および他の方法は容易に認識され、当業者に知られている。

本発明のキメラペスチウイルスは、ゲノム構成および発現されるタンパク質の両方において、野生型ＢＶＤＶ株から区別され得る。このような区別により、ワクチン接種された動物と感染した動物との間の判別が可能になる。例えば、決定は、ある研究試験においてＢＶＤＶについて陽性であると判定された動物が、野生型ＢＶＤＶ株を有するか、または、ワクチン接種を介して以前に獲得された本発明のキメラペスチウイルスを有するかに関して行うことができる。

決定を行うために、様々なアッセイを採用することができる。例えば、ウイルスは、ＢＶＤＶについて陽性であると判定された動物から単離され得、核酸に基づいたアッセイを用いて、事前のワクチン接種の指標であるキメラペスチウイルスゲノムの存在を決定することができる。核酸に基づいたアッセイには、サザンブロットアッセイまたはノーザンブロットアッセイ、ＰＣＲ、および配列決定が含まれる。あるいは、タンパク質に基づいたアッセイを採用することができる。タンパク質に基づいたアッセイにおいて、感染が疑われる細胞または組織を、ＢＶＤＶについて陽性であると判定された動物から単離することができる。細胞抽出物は、このような細胞または組織から作製され得、例えば、事前に接種されたキメラペスチウイルスまたは野生型ＢＶＤＶのいずれかの存在を区別して同定し得る、ウイルスタンパク質に対する適切な抗体を用いて、ウェスタンブロットに供され得る。

動物において誘発される免疫応答の程度および性質は、様々な技術を用いることによって評価され得る。例えば、接種された動物から血清を回収し、例えば、従来のウイルス中和アッセイにおいて、キメラウイルスに特異的な抗体の存在または不存在について試験することができる。リンパ組織における応答性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の検出は、細胞性免疫応答の誘発の指標である、Ｔ細胞増殖などのアッセイによって達成され得る。関連する技術は、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．（１９９４）など、当技術分野において良く記載されている。

キット
例えば特定の疾患または状態を治療する目的で、さらなる化合物と組み合わせた免疫原性組成物またはワクチンを投与することが望ましい場合があるが、免疫原性組成物またはワクチンが、組成物の投与または共投与に適したキットの形態で好都合に含まれるか、または組み合わされ得ることは、本発明の範囲内である。

したがって、本発明のキットは、１つまたは複数の別個の医薬組成物と、容器、分割されたボトル、または分割された箔袋などの、前記組成物を個別に保持するための手段とを含むことができ、該医薬組成物の少なくとも１つは、本発明に従った免疫原性組成物またはワクチンである。このようなキットの例は、シリンジおよび針などである。本発明のキットは、異なる投薬形態を投与するため、例えば口腔もしくは非経口で投与するため、異なる投薬間隔で別個の組成物を投与するため、または別個の組成物を互いに滴定するために、特に適している。本発明の組成物の投与を助けるために、キットは典型的には、投与のための指示書を含む。

本発明の別のキットは、ＢＶＤＶに感染した動物と、キメラペスチウイルスをワクチン接種された動物との検出および区別に有用な１つまたは複数の試薬を含み得る。キットは、ＢＶＤＶ全体、または、免疫原性組成物もしくはワクチンのキメラペスチウイルスにおいて存在しない、ＢＶＤＶのポリペプチド、エピトープ、もしくはポリヌクレオチド配列の存在について試料を分析するための試薬を含み得る。あるいは、本発明のキットは、キメラペスチウイルス、または、野生型ＢＶＤＶにおいて存在しないポリペプチド、エピトープ、もしくはポリヌクレオチド配列の存在について試料を分析するための試薬を含み得る。ウイルス、ポリペプチド、またはポリヌクレオチド配列の存在は、抗体、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、および当業者に知られている他の検出方法を用いて決定され得る。

本発明の別のキットは、特定のエピトープに対する抗体を検出するための試薬を提供し得る。エピトープは、本発明のキメラペスチウイルスにおいて存在し、野生型ＢＶＤＶにおいては存在しないか、あるいは、野生型ＢＶＤＶにおいて存在し、本発明のキメラペスチウイルスにおいては存在しない。このような試薬は、抗体の存在について試料を分析するために有用であり、当業者に容易に知られ、利用可能である。抗体の存在は、当業者に知られている標準的な検出方法を用いて決定され得る。

特定の実施形態において、キットは、印刷された指示書一式、または、キットが、ＢＶＤＶに感染した動物を、キメラペスチウイルスをワクチン接種された動物から検出および区別するために有用であることを示すラベルを含み得る。

抗体
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または組換え抗体のいずれかであり得る。好都合には、抗体は、免疫原またはその一部に対して調製され得る。例えば、免疫原のアミノ酸配列に基づいた、もしくは、クローニング技術によって組換えで調製された合成ペプチド、または、天然の遺伝子産物、および／あるいはその一部を単離し、免疫原として使用することができる。免疫原は、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、（１９８８）、ならびにＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．（１９９２）において全体的に記載されているような、当業者に周知の標準的な抗体生産技術によって抗体を生産するために用いられ得る。抗体断片はまた、当業者に知られている方法によって抗体から調製され得、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖを含む。

抗体の生産において、所望の抗体についてのスクリーニングは、当技術分野において知られている、免疫学における標準的な方法によって達成され得る。具体的に記載されていない技術は、Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、ＡｐｐｌｅｔｏｎおよびＬａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）、ならびにＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８０）などにおいて、全体的に追跡されている。通常、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロッティングが、好ましいタイプの免疫アッセイである。両アッセイは、当業者に周知である。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方をアッセイにおいて用いることができる。抗体は、当技術分野において周知であるように、固体支持体基質に結合させても、検出可能な部分とコンジュゲーションさせても、結合およびコンジュゲーションの両方を行ってもよい。（蛍光部分または酵素部分のコンジュゲーションの全体的な議論については、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ、「Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９８２）を参照されたい。）固体支持体基質への抗体の結合もまた、当技術分野において周知である。（全体的な議論については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）、ならびにＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ（１９９２）を参照されたい。）本発明における使用について検討される検出可能な部分には、限定はしないが、蛍光マーカー、金属マーカー、酵素マーカー、および放射性マーカー、例えば、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ｂ−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、^１４Ｃ、およびヨード化が含まれ得る。

本発明はさらに、限定するものではないが、以下の実施例によって例示される。

（実施例１）
キメラペスチウイルスの構築および血清学的特徴付け
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＧＭ２１６３［Ｆ−ａｒａ−１４、ｌｅｕＢ６、ｔｈｉ−１、ｆｈｕＡ３１、ｌａｃＹ１、ｔｓｘ−７８、ｇａｌＫ２、ｇａｌＴ２２、ｓｕｐＥ４４、ｈｉｓＧ４、ｒｐｓＬ１３６、（Ｓｔｒ^ｒ）、ｘｙｌ−５、ｍｔｌ−１、ｄａｍ１３：：Ｔｎ９（Ｃａｍ^ｒ）、ｄｃｍ−６、ｍｃｒＢ１、ｈｓｄＲ２（ｒｋ⁻ｍｋ⁻）、ｍｃｒＡ］は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＮｅｂｒａｓｋａのＲ．Ｄｏｎｉｓ博士から得られた、ウシウイルス性下痢ウイルス株ＮＡＤＬ（ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ）の完全長ゲノムｃＤＮＡを含有するプラスミドを有する。

ＲＤ細胞（ＳＶ４０で形質転換されたウシ精巣細胞、Ｒ．Ｄｏｎｉｓ博士から得た）を、３％ウマ血清、変法イーグル培地（ＭＥＭ）内の１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、および１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを補った、ＯｐｔｉＭＥＭにおいて維持した。ＢＫ−６細胞は、Ｐｆｉｚｅｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（ＰＧＭ）から得た。細胞を、５％ウマ血清またはドナーウシ血清（ＰＧＭ）、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、ならびに１％の抗生物質および抗真菌剤を補った、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において成長させた。指定されたものを除く全ての培地成分は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。全ての細胞は、５％ＣＯ_２環境において３７℃で維持した。

ＢＶＤＶのＥ^ｒｎｓに特異的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）１５Ｃ５を、ＩＤＥＸＸ（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）から購入した。ＢＶＤＶ ＮＳ３に対するＭＡｂ２０．１０．６は、Ｅ．Ｄｕｂｏｖｉ博士（Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供された。ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）のＥ^ｒｎｓタンパク質に対する特異性を有する、ＭＡｂ ＷＳ３６３、ＷＳ３７３、およびＷＳ３７１を、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ａｇｅｎｃｙ（Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）から得た。ウシ血清試料番号７７、８１６、１２８１、および１４３４を、Ｐｆｉｚｅｒ社内で得た。

キメラペスチウイルスは、オーバーラップＰＣＲ法を用いて、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ株のＥ^ｒｎｓ遺伝子を、キリンペスチウイルスのＥ^ｒｎｓ遺伝子（Ｇ−Ｅ^ｒｎｓ）、トナカイペスチウイルスのＥ^ｒｎｓ遺伝子（Ｒ−Ｅ^ｒｎｓ）、またはプロングホーンアンテロープペスチウイルスのＥ^ｒｎｓ遺伝子（Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ）で置き換えることによって生成させた。ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩ ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）またはＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかを用いた。オーバーラップＰＣＲおよび完全長ウイルスＤＮＡの生成のためのオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号を伴う）を、表１に列挙する。

ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬの完全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドを、ｄａｍ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２ ＧＭ２１６３から抽出した。プラスミドをインビトロでｄａｍメチルトランスフェラーゼおよびＳ−アデノシルメチオニン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）でメチル化した。Ｇ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子、Ｒ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子、およびＰ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３６７８、ＮＣ＿００３６７７、およびＡＹ７８１１５２）を合成し、クローニングベクター内にクローニングした。

キメラＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓＤＮＡの構築のために、Ｃ遺伝子の５’ＵＴＲから３’末端をコードするＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ断片を、オリゴＢ−５およびオリゴ１２７プライマーを用いて、メチル化されたプラスミドからＰＣＲによって増幅した。Ｇ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子を、オリゴ１２８およびオリゴ１２９を用いて、Ｇ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。Ｅ１から３’ＵＴＲをコードするＢＶＤＶ断片を、オリゴ１３０およびオリゴ８４を用いて、メチル化されたプラスミドからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いてゲル精製した。精製されたＰＣＲ産物を、ＤｐｎＩおよびＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ １（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理した。オリゴＢ−５およびオリゴ８４を用いたＰＣＲによって、処理されたＰＣＲ産物を組み合わせて、完全長キメラＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓゲノムを作製した。

キメラＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓＤＮＡの構築のために、Ｃ遺伝子の５’ＵＴＲから３’末端をコードするＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ断片を、オリゴＢ−５およびオリゴ１３１プライマーを用いて、メチル化されたプラスミドからＰＣＲによって増幅した。Ｒ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子を、オリゴ１３２およびオリゴ１３３を用いて、Ｒ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子を含有するプラスミドからＰＣＲによって増幅した。Ｅ１から３’ＵＴＲをコードするＢＶＤＶ断片を、オリゴ１３４およびオリゴ８４を用いて、メチル化されたプラスミドからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてゲル精製した。精製されたＰＣＲ産物を、ＤｐｎＩおよびＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ １で処理した。オリゴＢ−５およびオリゴ８４を用いたＰＣＲによって、処理されたＰＣＲ産物を組み合わせて、完全長キメラＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓゲノムを作製した。

キメラＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓＤＮＡの構築のために、Ｃ遺伝子の５’ＵＴＲから３’末端をコードするＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ断片を、オリゴＢ−５およびオリゴ１３５プライマーを用いて、メチル化されたプラスミドからＰＣＲによって増幅した。Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子を、オリゴ１３６およびオリゴ１３７を用いて、Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。Ｅ１から３’ＵＴＲをコードするＢＶＤＶ断片を、オリゴ１３８およびオリゴ８４を用いて、メチル化されたプラスミドからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いてゲル精製した。精製されたＰＣＲ産物を、ＤｐｎＩおよびＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ １で処理した。オリゴＢ−５およびオリゴ８４を用いたＰＣＲによって、処理されたＰＣＲ産物を組み合わせて、完全長キメラＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓゲノムを作製した。

キメラＥ^ｒｎｓ領域の配列確認のために、それぞれの組み合わされた完全長キメラゲノムの５’ＵＴＲからＥ１領域に対応する断片を、オリゴＢ−５およびオリゴ１７５を用いたＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を配列決定および分析した。

完全長ウイルスゲノムＲＮＡ転写産物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いて、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬの完全長ｃＤＮＡまたはキメラＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｅ^ｒｎｓＤＮＡを含有するプラスミドから生成した。各ＲＮＡ転写産物の質および量を、ＲＮＡゲルおよびＮａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）上で決定した。６ウェルプレートのウェルにおいて一晩培養したＲＤ細胞を、製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ウイルスＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を３７℃で３日間にわたりインキュベートした。上清を採取し、−８０℃で保存した。

採取した上清から得られたウイルスＲＮＡを、製造者の指示に従ってＭａｇＭａｘ（商標）ＡＩ／ＮＤ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。ＲＮＡを逆転写し、Ｎ^ｐｒｏからＥ１をコードする各キメラの領域を、オリゴ１７７およびオリゴ１７５プライマー（表１）を用いて、かつ製造者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅した。次に、ＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定した。

ウイルスＲＮＡのトランスフェクションまたはウイルス感染のいずれかから得られた細胞単層を、８０％アセトン内で固定した。ＢＶＤＶ特異的な、またはＢＤＶ特異的なモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼＡＢＣ Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）と組み合わせて用いた。ＶＩＰペルオキシダーゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて発色させた。

キメラウイルスの力価を、限界希釈法によって決定した。ウイルス試料を１０倍連続希釈し、希釈当たり４〜６反復ずつ、９６ウェルプレートに移した（ウェル当たり１００μｌ）。ＢＫ−６細胞の懸濁液１００μｌを次に各ウェルに添加し、プレートを３７℃で４〜５日間にわたりインキュベートした。ウイルス感染を、細胞変性効果（ＣＰＥ）およびＭａｂ染色の両方によって決定した。ウイルス力価を、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ法を用いて計算した。

各キメラの生物学的クローンを得るために、ウイルス試料をまず１００倍希釈し、その後、１０倍連続希釈した。希釈されたウイルス１００μｌを、希釈当たり４複製ずつ、９６ウェルプレートの各ウェルに移した。ＢＫ−６細胞１００μｌを次に各ウェルに添加し、プレートを３７℃で４日間にわたりインキュベートした。上清を採取し、新たなプレートに移し、−８０℃で保存した。細胞を固定し、染色した。単一のウイルスフォーカスを含有するウェルから得られる上清を採取し、ウイルスストックとして増殖させた。

成長速度研究を、ＢＫ−６細胞を含有するＴ−２５フラスコにおいて実施した。細胞がおよそ９０％のコンフルエンスに達すると、それらを、０．０２のＭＯＩで、各キメラに感染させた。１時間にわたり吸着させた後、接種材料を除去した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次に、３ｍｌの新鮮な成長培地を添加した。次に、力価決定のために、０から１４４時間までの様々な時点で、試料を回収した。

ウイルス中和試験のために、３つのＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｅ^ｒｎｓキメラ、親のＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ、およびＢＶＤＶ−ＣＭ５９６０（ＢＶＤＶ Ｉ型）の凍結ストックを、約４０００ＴＣＩＤ_５０／ｍｌまで、ＤＭＥＭ内に希釈した。ＢＶＤＶのＩ型およびＩＩ型の両方に対する所定の力価を有する、Ｂｏｖｉ−Ｓｈｉｅｌｄ Ｇｏｌｄ（Ｐｆｉｚｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）で免疫化された牛から得られた血清を、ＤＭＥＭで２倍連続希釈した。ウイルス５０μｌ（２００ＴＣＩＤ_５０）を、９６ウェル組織培養プレートにおいて、等容積の希釈した牛血清と混合し（４複製／希釈）、３７℃で６０分間にわたりインキュベートした。次に、ＢＫ−６細胞１００μｌを各ウェルに添加し、プレートを、３７℃で３〜６日間にわたりインキュベートした。ＢＶＤＶ抗体について陰性の血清もまた、対照として、各プレート内に含めた。血清の終点中和力価を、３日目および６日目に、ＣＰＥおよび免疫組織化学（ＩＨＣ）の両方によって決定した。

結果。ＮＡＤＬのＥ^ｒｎｓ遺伝子／タンパク質が、キリンペスチウイルスのＥ^ｒｎｓ（Ｇ−Ｅ^ｒｎｓ）、トナカイペスチウイルスのＥ^ｒｎｓ（Ｒ−Ｅ^ｒｎｓ）、またはプロングホーンアンテロープペスチウイルスのＥ^ｒｎｓ（Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ）によって置き換えられた、キメラＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｅ^ｒｎｓＤＮＡを構築した。キメラＥ^ｒｎｓ領域のそれぞれを含有するプラスミドＤＮＡを配列決定して、配列の信頼性を確認した。キメラペスチウイルスＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓ（ＰＴＡ−９９３８）、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ（ＰＴＡ−９９３９）、およびＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓ（ＰＴＡ−９９４０）は、２００９年４月２日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０、ＵＳＡに寄託され、２００９年４月２３日に、ＡＴＣＣ（登録商標）によって、生存能力のあることが確認された。

ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｅ^ｒｎｓキメラウイルスを、インビトロで転写されたウイルスＲＮＡでトランスフェクトした後に、ＲＤ細胞から取り出した。ＲＤ細胞における大きな細胞変性効果（ＣＰＥ）が、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓまたはＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓのＲＮＡ転写産物でトランスフェクションした４８〜７２時間後に観察された。しかし、ＣＰＥは、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓウイルスでは明らかではなかった。培養上清を各ウェルから採取し、残った細胞を固定し、ＢＶＤＶ ＮＳ３特異的ＭＡｂ抗体２０．１０．６で染色した。３つのキメラペスチウイルスの１つに感染させた細胞を、ＭＡｂと共にインキュベートした。ウイルスＲＮＡを、採取した上清から抽出し、配列決定して、全ての３つのキメラのＥ^ｒｎｓ遺伝子を確認した。

３つのＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｅ^ｒｎｓキメラを、ＢＶＤＶまたはＢＶＤに特異的ないくつかのＥ^ｒｎｓＭＡｂのそれぞれに対する反応性について試験した。結果を表２に示す。ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓキメラは、全ての３つのＢＤＶ Ｅ^ｒｎｓＭａｂに反応したが、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓウイルス、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓウイルス、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ親ウイルスのいずれも、ＢＤＶ Ｅ^ｒｎｓＭＡｂによって認識されなかった。ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓウイルス、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓウイルス、およびＮＡＤＬ親ウイルスは、ｐａｎ−ＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓＭＡｂ １５Ｃ５に反応した。ＢＤＶのＥ^ｒｎｓまたはＢＶＤＶのＥ^ｒｎｓのいずれかに特異的なＭＡｂは、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓキメラと反応しなかった。

ウイルスにおけるキメラＥ^ｒｎｓタンパク質が、ＢＶＤＶワクチン接種された牛から得られる抗体によるウイルス中和エピトープの認識に対して何らかの影響を有するかどうかを決定するために、３つのＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｅ^ｒｎｓキメラ、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ、およびＢＶＤＶ−ＣＭ５９６０（ＢＶＤＶ Ｉ型）を用いて、ウイルス中和アッセイを行った。０から４００００超の範囲の中和抗体力価を有する（ＢＶＤＶ−ＣＭ５９６０に対して事前に決定した）、４頭の雌牛から得られた血清を用いた。結果（表３）は、全ての３つのキメラに対する力価が、全体として、親のＢＶＤＶ−ＮＡＤＬおよびＢＶＤＶ−ＣＭ５９６０に対するものに匹敵することを示す。ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓに対する中和力価は、他の２つのキメラであるＢＶＤＶ−ＮＡＤＬおよびＢＶＤＶ−ＣＭ５９６０に対するものよりもわずかに低かった。

３つのＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｅ^ｒｎｓキメラを、限界希釈によって、２回、生物学的にクローニングした。ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓの３つのクローン、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓの４つのクローン、およびＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓの３つのクローンを得た。これらのクローンをそれぞれ、１〜３回増殖させた。滴定の結果は、増殖したＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓクローン１、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓクローン３および５、ならびにＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓクローン２が、最高の力価をもたらすことを示した。

成長速度研究を、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓクローン１、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓクローン３、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓクローン２、およびクローニングされていないＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓで行った。これらのクローンから作成された成長曲線を、親のＢＶＤＶ−ＮＡＤＬと比較した。ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓキメラおよびＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓキメラは、親のＢＶＤＶ−ＮＡＤＬに類似の成長速度を有したが、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓは、親ウイルスおよび他の２つのキメラよりも成長が遅く、各時点で低い力価を有していた。

ＮＡＤＬのＥ^ｒｎｓ遺伝子／タンパク質が、キリンペスチウイルス、トナカイペスチウイルス、またはプロングホーンアンテロープペスチウイルスのＥ^ｒｎｓによって置き換えられた、３つのＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｅ^ｒｎｓキメラウイルスを作製した。全ての３つのキメラは、ＲＤ細胞およびＢＫ−６細胞の両方において、生存能力を有し、かつ感染性であった。インビトロでのデータは、キメラＥ^ｒｎｓタンパク質が、ＢＶＤＶワクチン接種された牛から得られる抗血清によるキメラの中和に影響しないことを実証した。このことは、キメラウイルス上の中和エピトープが、その位置に関わらず、Ｅ^ｒｎｓの置換によって影響されなかったことを示唆する。

キメラウイルスは、異なる成長速度を有し、ＢＶＤＶまたはＢＤＶのＥ^ｒｎｓモノクローナル抗体に対して差次的に反応した。ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓおよびＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓは、親ウイルスと類似の成長速度を有したが、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓは、親ウイルスよりも成長が遅く、低い力価を有していた。ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｇ−Ｅ^ｒｎｓおよびＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｒ−Ｅ^ｒｎｓは両方とも、ＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓモノクローナル抗体１５Ｃ５に反応したが、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓは反応しなかった。配列比較の結果は、Ｇ−Ｅ^ｒｎｓおよびＲ−Ｅ^ｒｎｓが、Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ（５９％）よりも、ＢＶＤＶ ＮＡＤＬに対して高い配列類似性を有する（それぞれ、７５．８％および７６．２％）ことを示した。これらのデータは、ＭＡｂ反応性の結果と総合すると、Ｇ−Ｅ^ｒｎｓおよびＲ−Ｅ^ｒｎｓが、Ｐ−Ｅ^ｒｎｓよりも、親Ｅ^ｒｎｓに対して抗原的に類似している可能性があることを示唆する。

（実施例２）
キメラペスチウイルスワクチン候補の構築および血清学的特徴付けおよび効力試験
１型ＢＶＤＶ株ＣＭ５９６０および２型ＢＶＤＶ株ＣＭ５３６３７を、Ｐｆｉｚｅｒ Ｇｌｏｂａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇから得た。ウイルスＲＮＡを、製造者の指示に従ってＭａｇＭａｘ（商標）ＡＩ／ＮＤ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。ＲＮＡを逆転写し、製造者の指示に従って、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｃＤＮＡを生成した。キメラペスチウイルスを、オーバーラップＰＣＲ法を用いて、ＣＭ５９６０およびＣＭ５３６３７のＥ^ｒｎｓ遺伝子をプロングホーンアンテロープペスチウイルスのＥ^ｒｎｓ遺伝子（Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ）で置き換えることによって生成した。ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドプライマーを表１に列挙する。

キメラＣＭ５９６０／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓＤＮＡの構築のために、Ｃ遺伝子の５’ＵＴＲと３’末端との間のＣＭ５９６０のｃＤＮＡ断片を、オリゴＢ−５およびオリゴ１３５プライマーを用いて、ＣＭ５９６０のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子を、オリゴ１３６およびオリゴ１３７を用いて、Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。Ｅ１の開始点とＥ２の３’末端との間の第３の断片を、オリゴ１３８およびオリゴ２３７プライマーを用いて、ＣＭ５９６０のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。

上記の断片を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲル精製し、オリゴＢ−５およびオリゴ２３７を用いたＰＣＲによって組み合わせて、１つの断片を作製した。Ｅ１領域とＮＳ５Ｂ領域との間の断片を、オリゴＰ７およびオリゴＰ８プライマーを用いて、ＣＭ５９６０のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＮＳ５Ａ領域と３’ＵＴＲの末端との間の別の断片を、オリゴＰ３およびオリゴ８４プライマーを用いて、ＣＭ５９６０のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。次に、これらの３つの断片をゲル精製し、オリゴＢ−５およびオリゴ８４を用いたＰＣＲによって組み合わせて、完全長キメラＣＭ５９６０Ｌ／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓゲノムを作製した。

キメラＣＭ５３６３７／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓＤＮＡの構築のために、Ｃ遺伝子の５’ＵＴＲと３’末端との間のＣＭ５３６３７のｃＤＮＡ断片を、オリゴ２９６−１およびオリゴ２９７プライマーを用いて、ＣＭ５３６３７のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。Ｅ１の開始点とＥ２の３’末端との間の第２の断片を、オリゴ２９８およびオリゴ３０３プライマーを用いて、ＣＭ５３６３７のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。これらの２つの断片をゲル精製し、Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ遺伝子をコードする断片と共に（上記を参照されたい）、オリゴ２９６−１およびオリゴ３０３を用いたＰＣＲによって組み合わせて、１つの断片を作製した。

次に、Ｅ１領域とＮＳ３領域との間の断片を、オリゴ２９８およびオリゴ２９９プライマーを用いて、ＣＭ５３６３７のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。ＮＳ３領域と３’ＵＴＲの末端との間の別の断片もまた、オリゴ３００およびオリゴ９２−１プライマーを用いて、ＣＭ５３６３７のｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。これらの２つの断片および上記の１つの断片をゲル精製し、オリゴ２９６−１およびオリゴ９２−１を用いたＰＣＲによって組み合わせて、完全長キメラＣＭ５３６３７／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓゲノムを作製した。

完全長ウイルスゲノムＲＮＡ転写産物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａキット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて、キメラＣＭ５９６０Ｐ−Ｅ^ｒｎｓＤＮＡおよびキメラＣＭ５３６３７／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓＤＮＡから生成した。各ＲＮＡ転写産物の質および量を、ＲＮＡゲル上で決定した。６ウェルプレートのウェルにおいて一晩培養したＲＤ細胞を、製造者の指示に従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ウイルスＲＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの後、細胞を３７℃で３日間にわたりインキュベートした。細胞に上清を加えたものを、ＲＤ細胞および／またはＢＫ−６細胞において、１回から数回継代した。次に、上清を、ＢＫ−６細胞において連続継代した。上清を採取し、−８０℃で保存した。

取り出した組換えウイルスの同一性を確認するために、採取した上清から得られたウイルスＲＮＡを、製造者の指示に従ってＭａｇＭａｘ（商標）ＡＩ／ＮＤ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて抽出した。ＲＮＡを、製造者の指示に従ってＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写し、５’ＵＴＲとＥ２またはｐ７との間の各キメラの領域を、オリゴＢ−５およびオリゴ２３７プライマー（ＣＭ５９６０／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓキメラについて）またはオリゴ２９６−１およびオリゴ３２１プライマー（ＣＭ５３６３７／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓキメラについて）を用いたＰＣＲによって増幅した。次に、ＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定した。

ウイルスＲＮＡのトランスフェクションまたはウイルス感染のいずれかから得られた細胞単層を、８０％アセトン内で固定した。ＢＶＤＶ特異的なＭａｂを、免疫組織化学のために、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼＡＢＣ Ｅｌｉｔｅキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と組み合わせて用いた。ＶＩＰペルオキシダーゼ基質（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて発色させた。

結果。キメラＣＭ５９６０／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓウイルスおよびＣＭ５３６３７／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓウイルスを構築し、取り出した。キメラプロングホーンＥ^ｒｎｓ領域を含む、５’ＵＴＲからＥ２の領域を、配列決定によって確認した。両方のキメラは、ＲＤ細胞およびＢＫ−６細胞の両方において、生存能力を有し、かつ感染性であった。免疫組織化学的染色において、両方のキメラは、ＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓ特異的ＭＡｂ １５Ｃ５に対して反応性ではなかったが、ＢＶＤＶ ＮＳ３特異的ＭＡｂ２０．１０．６に対して反応性であった。

キメラペスチウイルス（ＢＶＤＶ−ＣＭ５９６０（ＢＶＤＶ Ｉ型）／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ）についての配列は、配列表において配列番号３１として表される。キメラペスチウイルス（ＢＶＤＶ−ＣＭ５３６３７（ＢＶＤＶ ＩＩ型）／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓ）についての配列は、配列表において配列番号３２として表される。

ＣＭ５９６０／Ｐ−Ｅ^ｒｎｓキメラを、限界希釈によって、生物学的にクローニングした（方法論については、上記の実施例１を参照されたい）。

（実施例３）
牛呼吸器疾患モデルにおけるキメラペスチウイルスワクチン候補の効力試験
ＢＶＤＶ陰性の健康な牛を得、研究群にランダムに割り当て、担当獣医の管理化で維持する。試験ワクチンを無菌アジュバントと組み合わせ、筋肉内（ＩＭ）注射もしくは皮下（ＳＣ）注射または鼻腔内（ＩＮ）接種のいずれかによって投与する。ワクチンは、単回用量または２回用量のいずれかで与える。２回用量のワクチンは、２１から２８日間あけて投与する。その後、ＢＶＤＶの１型または２型株での最終ワクチン接種の後、２１日目から２８日目に、動物をチャレンジする。チャレンジ接種材料は、４ｍｌの分割された用量で、鼻孔当たり２ｍｌで、鼻腔内に与える。ワクチン接種されておらずチャレンジされていない動物、および／またはワクチン接種されておらずチャレンジされた動物からなる対照群もまた、研究を通して維持する。

直腸体温、うつ、食欲不振、および下痢を含む、臨床的パラメータを、毎日監視する。血清中和力価を、ＢＶＤＶ１型または２型株を組み合わせた血清の連続希釈物を用いて、ウシ細胞培養物において、ウイルスは一定で血清を減少させるアッセイによって決定する。ウシ細胞培養物におけるＢＶＤＶのチャレンジ後の単離を、末梢血から試みる。ＢＶＤＶ陽性の細胞培養物を、間接的な免疫蛍光によって決定する。チャレンジ後の防御を実証するために、感染の発生の低減を、ワクチン接種された群と対照群との比較で実証する。

（実施例４）
妊娠した雌牛−子牛モデルにおけるキメラペスチウイルスワクチンの効力試験
ＢＶＤＶ陰性の雌牛および繁殖年齢の未経産牛を得、ワクチン接種試験群またはプラセボ（対照）群にランダムに割り当てる。雌牛に、筋肉内（ＩＭ）注射または皮下（ＳＣ）注射によって、２１日から２８日あけて、ワクチンまたはプラセボのいずれかを２回接種する。２回目のワクチン接種の後、全ての雌牛にＩＭプロスタグランジン注射を行い、発情期を同期させる。発情を示す雌牛を、認定されたＢＶＤＶ陰性精子を用いて、人工授精によって繁殖させる。妊娠期間のおよそ６０日目に、雌牛の妊娠状態を、直腸検査によって決定する。

およそ６週間後、妊娠が確認された雌牛を、各試験群からランダムに選択する。これらの雌牛のそれぞれを、ＢＶＤＶ１型または２型の鼻腔内接種によってチャレンジする。血液試料を、ＢＶＤＶの単離の目的で、チャレンジの日に、およびチャレンジ後、複数の間隔をあけて、回収する。

チャレンジの２８日後、左脇腹の開腹を行い、羊水を各雌牛から抽出する。手術の直前に、血清中和アッセイのために、血液試料を各雌牛から回収する。帝王切開による分娩の後、血液試料を各胎児から回収する。次に胎児を安楽死させ、ＢＶＤＶの単離の目的で、組織を無菌状態で回収する。自然流産が生じるケースでは、血液試料は、流産が検出されたときおよびその２週間後に、母牛から採取する。血液試料と流産した胎児の組を、血清学的試験およびウイルスの単離に供する。ワクチンの効力を、胎児の感染および後期流産の不存在または減少によって実証する。

（実施例５）
ワクチン接種された牛と自然感染した牛とを区別するための診断アッセイ
本発明のワクチンでワクチン接種された牛を、野生型ＢＶＤＶに自然感染した牛と比較することができる。様々な年齢の牛を、与えられた指示に従って、生のまたは不活化されたキメラペスチウイルスワクチンのいずれかでワクチン接種する。血清試料を、ワクチン接種の２〜３週間以降に回収する。キメラペスチウイルスワクチンを与えられた牛とＢＶＤＶの野外（野生型）株に感染した牛とを区別するために、血清試料を、差次的な診断アッセイを介して試験する。キメラペスチウイルスは、キメラペスチウイルスのＥ^ｒｎｓタンパク質に結合するが野生型ＢＶＤＶ上に存在するＥ^ｒｎｓタンパク質には結合しない、特異的抗体の生産を引き起こす。野生型ＢＶＤＶのコンテクストにおいて、その逆が成り立つ。野生型ＢＶＤＶ上に存在するＥ^ｒｎｓタンパク質を認識するがキメラペスチウイルス上に存在するＥ^ｒｎｓタンパク質は認識しない、特異的抗体が生成される。抗体の結合特異性および結合親和性をアッセイする方法は、当技術分野において周知であり、これには、限定はしないが、競合ＥＬＩＳＡ、直接ペプチドＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、間接免疫蛍光アッセイなどの、免疫アッセイ形式が含まれる。

競合ＥＬＩＳＡでは、Ｅ^ｒｎｓタンパク質（天然に、合成に、または組換えに由来する）を含む、全てまたは部分的な野生型ペスチウイルス抗原またはキメラペスチウイルス抗原を、抗原由来源として用いる。アルカリ性条件化でＥＬＩＳＡプレートを抗原で被覆した後、牛血清試料および希釈液を、野生型ＢＶＤＶのＥ^ｒｎｓタンパク質またはキメラペスチウイルスのＥ^ｒｎｓタンパク質のいずれかに特異的なＭＡｂの、最適な希釈液と共に添加し、３０〜９０分間にわたりインキュベートする。ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのいずれかをＭＡｂと共役させて、比色分析による結合の検出を可能にする。プレートを洗浄した後、酵素特異的な発色基質を添加し、最終インキュベーションステップの後、各ウェルの光学密度を、用いる基質に適した波長で測定する。標識されたｍＡｂの結合の阻害の程度は、プレートを被覆しているタンパク質を特異的に認識する、牛血清における抗体のレベルに依存する。

キメラペスチウイルス上に存在するキメラＥ^ｒｎｓタンパク質（例えば、プロングホーンＥ^ｒｎｓ）が試験抗原であるケースでは、キメラペスチウイルスＥ^ｒｎｓ特異的ｍＡｂによる結合の不存在は、ワクチン接種の指標である、キメラペスチウイルス特異的エピトープを認識する牛血清における抗体の存在を示す。逆に、免疫化されていないが自然感染している牛から得られる血清は、プレートを被覆しているキメラペスチウイルスＥ^ｒｎｓタンパク質に結合する抗体を含有しない。したがって、キメラペスチウイルスＥ^ｒｎｓ特異的ｍＡｂは、結合したタンパク質に結合し、その後の発色をもたらす。

野生型ＢＶＤＶ上に存在するＥ^ｒｎｓタンパク質が試験抗原であるケースでは、野生型ＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓ特異的ｍＡｂによる結合の不存在は、自然（野生型）感染の指標である、野生型ＢＶＤＶ特異的エピトープを認識する牛血清における抗体の存在を示す。逆に、キメラペスチウイルスワクチンで免疫化された牛から得られる血清は、プレートを被覆している野生型ＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓタンパク質に結合する抗体を含有しない。したがって、野生型ＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓ特異的ｍＡｂは、結合したタンパク質に結合し、その後の発色をもたらす。このようなアッセイの開発のために、以下の方法を実施した。

まず、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ Ｅ^ｒｎｓを発現する組換えバキュロウイルスを構築した。ＢＶＤＶのＣタンパク質の一部と、完全長Ｅ^ｒｎｓ遺伝子とを、オリゴ２５０プライマー（配列番号２９、５’−ＣＡＣＣＡＴＧＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＴＣ−３’）およびオリゴ２５２プライマー（配列番号３０、５’−ＴＴＡＡＧＣＧＴＡＴＧＣＴＣＣＡＡＡＣＣＡＣＧＴＣ−３’）を用いて、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬの完全長ｃＤＮＡを含有するプラスミドからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、ｐＥＮＴＲ（商標）／Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングし、製造者の指示に従って、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に形質転換した。組換えプラスミドを抽出し、インサートを配列決定によって確認した。このプラスミドはｐＥＮＴＲ−Ｅ^ｒｎｓと名付けた。製造者の指示に従って、ｐＥＮＴＲ−Ｅ^ｒｎｓおよびＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ Ｅ^ｒｎｓを発現する組換えバキュロウイルスを構築した。ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ Ｅ^ｒｎｓを発現する組換えバキュロウイルスを生成し、プラーク精製し、増殖させ、４℃および−８０℃の両方で保存した。組換えバキュロウイルスにおけるＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ Ｅ^ｒｎｓの発現を、従来のウェスタンブロット法の後に、免疫蛍光染色、およびＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓ特異的ＭＡｂ １５Ｃ５に対するウェスタンブロッティングによって確認した。

ＥＬＩＳＡ抗原の生産のために、１００ｍｌの懸濁培養物におけるＳＦ２１細胞を、０．５ｍｌの組換えバキュロウイルスストックに感染させた。２７℃で４日間インキュベートした後、細胞を採取した。細胞を低速（約８００ｇ）で１０分間にわたり遠心分離し、細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。細胞を１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０の５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、および１％ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０ですすいだ。混合物をまず、氷上で１０分間にわたりインキュベートし、次に−８０℃で１時間にわたりインキュベートした。解凍した後、混合物を、１０００ｇで１５分間にわたり遠心分離することによって澄明化した。上清を、４℃で、８０００ｇで２０分間にわたり遠心分離することによって、さらに澄明化した。Ｂａｃｕｌｏ−Ｅ^ｒｎｓ溶解物と呼ばれる最終上清を、アリコートにし、−８０℃で保存した。

アッセイの実施において、ＥＬＩＳＡプレートは、１００μｌ／ウェルのＭＡｂ ＷＢ２１０（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｇｅｎｃｙ、１型ＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓ特異的）を用いて、４℃で一晩被覆し、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．０）内で１：１０００に希釈した。翌日、プレートを３回洗浄し、ブロック緩衝液（１％カゼインナトリウム塩および０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０を含有するＰＢＳ）を用いて、３７℃で１時間にわたりブロックした。次に、プレートをブロック緩衝液で３回洗浄し、１００μｌのＢａｃｕｌｏ−Ｅ^ｒｎｓ溶解物（ＰＢＳ内で１：３２００に希釈したもの）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間にわたりインキュベートした。ブロック緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌの希釈されていない牛血清試料を、ウェルの１つのカラムを除いて（非競合１５Ｃ５−ＨＲＰ対照として利用するため）、ウェルに添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。ブロック緩衝液でさらに３回洗浄した後、１００μｌのＭＡｂ １５Ｃ５−ＨＲＰ複合体（ＢＶＤＶ Ｅ^ｒｎｓ特異的、ブロック緩衝液内で１：２００００に希釈したもの）を各ウェルに添加し、３７℃で１時間にわたりインキュベートした。ブロック緩衝液で３回洗浄した後、１００μｌのＡＢＴＳ基質（ペルオキシダーゼ基質溶液Ａ＋Ｂ、ＫＰＬ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加し、発色のために、室温で２０〜６０分間にわたりインキュベートした。光学密度（ＯＤ）を４０５ｎｍの波長で測定した。各血清試料についてのＯＤの低減のパーセンテージを、以下の式によって計算する。
［１−（試料のＯＤ÷１５Ｃ５−ＨＲＰ対照の平均ＯＤ）］×１００％

結果：
ウイルス中和（ＶＮ）試験によって陽性であると判定された血清試料の全ては、試料ＩＤ番号１３８５１を除いて、８２％を超えるＯ．Ｄ．の低減を有していた（表４）。ウイルス中和試験によって陰性であると判定された血清試料の全ては、試料ＩＤ番号５１５０を除いて、１７％未満のＯ．Ｄ．の低減を有していた（表４）。アッセイは異なる抗体を測定しており、特異的抗体の割合は動物間で変化するため、この相違は、アッセイの実施様式における差によって説明することができる。

本発明を、その特定の形態を参照して非常に詳細に記載してきたが、他の形態も可能である。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書に含まれる形態の記載に限定されるべきではない。

ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９９３８
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９９３９
ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９９４０

Claims (29)

1. その同種Ｅ^ｒｎｓタンパク質を発現しないウシウイルス性下痢ウイルスを含むキメラペスチウイルスであって、さらに、別のペスチウイルスに由来する異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質、または前記異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質の天然の変異体、合成の変異体、もしくは遺伝的変異体を発現する、キメラペスチウイルス。
2. 前記キメラペスチウイルスの異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質、または前記異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質の天然の変異体、合成の変異体、もしくは遺伝的変異体が、トナカイペスチウイルス、キリンペスチウイルス、およびプロングホーンアンテロープペスチウイルスからなる群から選択されるペスチウイルスに由来する、請求項１に記載のキメラペスチウイルス。
3. 前記キメラペスチウイルスの異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質が、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを有する、請求項１に記載のキメラペスチウイルス。
4. 前記キメラペスチウイルスの異種Ｅ^ｒｎｓタンパク質が、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在する少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを欠く、請求項１に記載のキメラペスチウイルス。
5. 請求項１に記載のキメラペスチウイルスの培養物。
6. 請求項１に記載のキメラペスチウイルスを含む細胞系または宿主細胞。
7. 請求項１に記載のキメラペスチウイルスをコードするポリヌクレオチド分子。
8. 請求項１のキメラペスチウイルスおよび獣医学的に許容できる担体を含む免疫原性組成物。
9. 獣医学的に許容できる担体がアジュバントである、請求項８に記載の免疫原性組成物。
10. 前記キメラペスチウイルスが生で弱毒化されている、請求項８に記載の免疫原性組成物。
11. 前記キメラペスチウイルスが不活化されている、請求項８に記載の免疫原性組成物。
12. ウシにおける１つまたは複数のさらなる病原性微生物の蔓延を治療または予防するために有用な１つまたは複数のさらなる抗原をさらに含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
13. 請求項７に記載のポリヌクレオチド分子および獣医学的に許容できる担体を含む、免疫原性組成物。
14. 請求項１に記載のキメラペスチウイルスおよび獣医学的に許容できる担体を含む、ワクチン。
15. 獣医学的に許容できる担体がアジュバントである、請求項１４に記載のワクチン。
16. 前記キメラペスチウイルスが生で弱毒化されている、請求項１４に記載のワクチン。
17. 前記キメラペスチウイルスが不活化されている、請求項１４に記載のワクチン。
18. 請求項７に記載のポリヌクレオチド分子および獣医学的に許容できる担体を含む、ワクチン。
19. ウシにおける１つまたは複数のさらなる病原性微生物の蔓延を治療または予防するために有用な１つまたは複数のさらなる抗原をさらに含む、請求項１４に記載のワクチン。
20. 請求項１４に記載のワクチンを少なくとも１つの容器内に含む、キット。
21. ウシウイルス性下痢ウイルス感染の蔓延を治療または予防する方法であって、請求項１４に記載のワクチンが動物に投与される方法。
22. 動物にワクチン接種する方法であって、ＤＩＶＡペスチウイルスワクチンが前記動物に投与され、前記ＤＩＶＡペスチウイルスワクチンが請求項１に記載のキメラペスチウイルスを含み、さらに、前記キメラペスチウイルスが、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを有する方法。
23. 動物にワクチン接種する方法であって、ＤＩＶＡペスチウイルスワクチンが前記動物に投与され、前記ＤＩＶＡワクチンが請求項１に記載のキメラペスチウイルスを含み、さらに、前記キメラペスチウイルスが、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在する少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープを欠く方法。
24. 請求項１４に記載のワクチンでワクチン接種された動物と、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物とを区別する方法であって、前記ワクチンでワクチン接種された動物が、前記ワクチンのキメラペスチウイルスにおいて存在するが野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいては存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープに対する抗体を生成し、
    ａ）動物から血清試料を得るステップ、
    ｂ）抗体の存在または不存在について前記試料をアッセイするステップ、
    ｃ）前記抗体を有する動物を、前記ワクチンでワクチン接種されていると同定するステップ、および
    ｄ）前記抗体を欠く動物を、野生型ＢＶＤＶに感染していると同定するステップ、
    を含む方法。
25. 野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物と、請求項１４に記載のワクチンでワクチン接種された動物とを区別する方法であって、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物が、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在するが前記ワクチンのキメラペスチウイルスにおいては存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープに対する抗体を生成し、
    ａ）動物から血清試料を得るステップ、
    ｂ）抗体の存在または不存在について前記試料をアッセイするステップ、
    ｃ）前記抗体を有する動物を、野生型ＢＶＤＶに感染していると同定するステップ、および
    ｄ）前記抗体を欠く動物を、前記ワクチンでワクチン接種されていると同定するステップ、
    を含む方法。
26. 請求項１に記載のキメラペスチウイルスを含むワクチンでワクチン接種された動物と、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物とを区別するための診断キットであって、ワクチンのキメラペスチウイルスにおいて存在するが野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいては存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープに対する抗体を検出し得る試薬を含む診断キット。
27. 野生型ウシウイルス性下痢ウイルスに感染した動物と、請求項１に記載のキメラペスチウイルスを含むワクチンでワクチン接種された動物とを区別するための診断キットであって、野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在するがワクチンのキメラペスチウイルスにおいては存在しない少なくとも１つのＥ^ｒｎｓエピトープに対する抗体を検出し得る試薬を含む診断キット。
28. 請求項１に記載のキメラペスチウイルスにおいて存在するが野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいては存在しないＥ^ｒｎｓエピトープを認識する抗体。
29. 野生型ウシウイルス性下痢ウイルスにおいて存在するが請求項１に記載のキメラペスチウイルスにおいては存在しないエピトープを認識する抗体。