ES2681685T3 - Virus de la diarrea vírica bovina con una proteína Erns modificada - Google Patents

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Abstract

Un virus de la diarrea viral bovina (BVDV) quimérico adecuado para su uso en una vacuna contra el BVDV y que permite la diferenciación entre el ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y el ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre, en el que el gen Erns de longitud completa se reemplaza por el gen Erns de longitud completa del pestivirus del antílope americano (P-Erns) de tal manera que el BVDV quimérico expresa la proteína Erns del pestivirus del antílope americano y no expresa la proteína Erns de BVDV.

Description

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DESCRIPCION
Virus de la diarrea vírica bovina con una proteína Erns modificada Campo de la invención
La presente invención se refiere a virus de la diarrea bovina vírica (BVDV) quiméricos novedosos y a su uso en composiciones inmunogénicas y vacunas. Se refiere también a procedimientos y kits para tratar o evitar la dispersión de la infección por el virus de la diarrea viral bovina, la presente invención se refiere adicionalmente al uso de BVDV quiméricos en procedimientos y kits para diferenciar entre animales vacunados y animales infectados con un virus de tipo silvestre.
Antecedentes
Los pestivirus, incluyendo el virus de la diarrea viral bovina (virus BVD, o BVDV), se han aislado de varias especies de animales, tanto domésticos como salvajes. Los huéspedes identificados para BVDV incluyen búfalo, antílope, reno y diversas especies de ciervo, mientras que se han identificado especies de pestivirus únicas en jirafas y en antílope americano. BVDV es un virus de ARN pequeño de la familia Flaviviridae. Está cercanamente relacionado con otros pestivirus que son los agentes causantes de la enfermedad de Border en ovejas y de la peste porcina clásica en cerdos. Recientemente un pestivirus divergente llamado pestivirus Bungowannah se ha identificado como un agente etiológico de la infección fetal de cochinillos en Australia.
La enfermedad causada por BVDV particularmente en ganado vacuno está extendida, y puede ser económicamente devastadora. La infección de BVDV en ganado vacuno puede dar como resultado problemas de cría, y puede causar abortos o nacimientos prematuros. BVDV es capaz de cruzar la placenta del ganado vacuno preñado, y puede dar como resultado el nacimiento de partos infectados de forma persistente (Pl) que son inmunotolerantes para el virus y persistentemente virémicos para el resto de sus vidas. El ganado vacuno infectado puede presentar también "enfermedad mucosal", caracterizada por temperatura elevada, diarrea, tos y ulceración de la mucosa alimentaria. Estos animales persistentemente infectados proporcionan una fuente para diseminación de virus dentro del rebaño por estallidos adicionales de enfermedad mucosal y están altamente predispuestos a infección con microorganismos responsables de causar enfermedades del intestino o neumonía.
BVDV está clasificado en uno de dos biotipos. Aquellos del biotipo "cp" inducen un efecto citopático en células cultivadas, mientras que los virus de biotipo no citopático, o "ncp", no. Además, se reconocen dos genotipos principales (tipo 1 y 2), se ha mostrado que ambos de los cuales causan una diversidad de síndromes clínicos.
Los viriones de BVDV son de 40 a 60 nm en diámetro. La nucleocápside de BVDV consta de una molécula individual de ARN y de la proteína C de la cápside. La nucleocápside está rodeada por una membrana lipídica con dos glicoproteínas unidas a ella, E1 y E2. Una tercera glicoproteína, Ems, está asociada débilmente a la envoltura. El genoma de BVDV es aproximadamente de 12,5 kb de longitud, y contienen un marco de lectura abierta individual localizada entre las regiones no traducidas de 5' y 3' (NTRs). Una poliproteína de aproximadamente 438 kD se traduce a partir de este marco de lectura abierta, y se procesa por proteasas celulares y virales en al menos once proteínas virales estructurales y no estructurales (NS) (Tautz, y col., J. Virol. 71: 5415-5422 (1997); Xu, y col., J. Virol. 71: 5312-5322 (1997); Elbers, y col., J. Virol. 70: 4131-4135 (1996); y Wiskerchen, y col., Virology 184: 341350 (1991)). El orden genómico de BVDV es p20/Npr°, p14/C, gp48/Ems, gp25/E1, gp53/E2, p54/NS2, p80/NS3, p10/NS4A, p32/NS4B, p58/NS5A y p75/NS5B. Las tres proteínas de la envoltura, gp48/Ems, gp25/E1 y gp53/E2, están muy glicosiladas. Ems (antes referida como E0 o gp48) forma homodímeros, covalentemente unidos por disulfuros. La ausencia de una región de unión a membrana hidrófoba sugiere que Ems está débilmente asociada con la envoltura. Ems induce valoraciones de anticuerpo altas en ganado vacuno infectado, pero los antisueros tienen actividad neutralizadora de virus limitada.
Entre las vacunas de BVDV actualmente disponibles están aquellas que contienen virus de tipo silvestre químicamente inactivado. Estas vacunas requieren típicamente la administración de dosis múltiples, y dan como resultado una respuesta inmune de vida corta; ellas no protegen contra la transmisión fetal del virus. En ovejas, se ha comunicado una subunidad de vacuna basada en una proteína E2 purificada. Aunque esta vacuna parezca proteger a los fetos de llegar a infectarse, la protección está limitada a solo la cepa homóloga de virus, y no hay correlación entre valoraciones de anticuerpos y protección.
Las vacunas de BVDV modificadas vivas (ML) se han producido usando virus adecuados que se han atenuado pasando repetidamente en células bovinas o porcinas, o por mutaciones químicamente inducidas que confieren un fenotipo sensible a temperatura en el virus. Una dosis de una vacuna de MLV BVDV se ha demostrado suficiente para proporcionar protección de la infección, y la duración de la inmunidad puede prolongarse años en ganado vacuno vacunado. Además, se ha comunicado protección cruzada usando vacunas MLV (Martin, y col., In “Proceedings of the Conference of Research Workers in Animal Diseases”, 75:183 (1994)). Sin embargo, las vacunas de MLV existentes permiten la diferenciación entre animales vacunados y animales infectados de forma natural.
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Así, está claro que existe una necesidad de vacunas nuevas para controlar la dispersión de BVDV. Tal vacuna/tales vacunas pueden ser inapreciables en los futuros programas nacionales o regionales de erradicación de BVDV, y podrían combinarse también con otras vacunas de ganado vacuno, que representan un avance sustancial en la industria. Una vacuna más efectiva para controlar y realizar seguimientos de la dispersión de BVDV debería ser una vacuna "marcada". Una vacuna tal podría contener un determinante antigénico adicional que no esté presente en virus de tipo silvestre, o carecer de un determinante antigénico que esté presente en virus de tipo silvestre. Con respecto a lo anterior, los animales vacunados montan una respuesta inmune para el determinante inmunogénico "marcador", mientras que los animales no vacunados no. A través del uso de un ensayo inmunológico dirigido contra el determinante marcador, los animales vacunados se diferenciarían de animales no vacunados, infectados de forma natural por la presencia de anticuerpos para el determinante marcador. En el caso de la última estrategia, los animales infectados con el virus de tipo silvestre montan una respuesta inmune para el determinante marcador, mientras que los animales vacunados, no infectados, no, como un resultado del determinante que no está presente en la vacuna marcada. Por el uso de un ensayo inmunológico dirigido contra el determinante marcador, los animales infectados se diferenciarían de animales vacunados, no infectados. En ambos escenarios, sacrificando de forma selectiva a los animales infectados, el rebaño podría, a lo largo del tiempo, llegar a estar libre de BVDV. Además del beneficio de eliminar la amenaza de la enfermedad de BVDV, la certificación de un rebaño como libre de BVDV ha conducido a liberación de beneficios económicos comerciales. La solicitud US-A-6 001 613 aborda el problema de proporcionar un virus DIVA quimérico para el desarrollo de una vacuna contra la infección de BVDV permitiendo la discriminación entre animales vacunados e infectados por ensayos serológicos retrospectivos, desvela un BVDV quimérico que expresa una GP de superficie E2 heteróloga derivada de una cepa de BVDV diferente en reemplazamiento de la proteína E2 BVDV de tipo silvestre y es capaz de diferenciar entre ganado vacuno vacunado con dicho BVDV quimérico y animales infectados con BVDV de tipo silvestre, que expresa una GP de superficie E2 heteróloga derivada de una cepa BVDV diferente en reemplazamiento de la proteína E2 de BVDV de tipo silvestre endógena. VAN GENNIP y col. VACCINE 2010, 19 (4-5) 447-459, desvela un pestivirus quimérico derivado de un virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) (que expresa una proteína Erns BVDv para el fin de la vacunación de animales eficientemente contra la estructura del pestivirus y permitiendo el uso de Erns heteróloga como marcador determinante para discriminar entre animales vacunados e infectados de forma natural.
Sumario
La invención en su sentido más amplio es como se define en las reivindicaciones independientes. En una realización, la presente invención proporciona un pestivirus quimérico, en el que dicho pestivirus quimérico es un virus de la diarrea viral bovina quimérico (BVDV) capaz de diferenciar entre ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre, que no expresa su proteína Erns homóloga, adicionalmente en el que dicho BVDV quimérico comprende un BVDV en el que el gen Erns de longitud completa se reemplaza por el gen Erns de longitud completa del pestivirus del antílope americano y que expresa una proteína Erns heteróloga derivada de derivada de un pestivirus del antílope americano (P - Erns). En una realización, la presente invención proporciona un BVDV de la invención que comprende la cepa CM5960/P-Erns generada reemplazando el gen Erns del BVDV de la cepa CM5690 con el gen Erns del pestivirus del antílope americano (P- Erns) adecuado para su uso para diferenciar entre ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre.
En una realización separada, la presente invención proporciona un BVDV quimérico de la invención que comprende la cepa CM53637/P-Erns generada reemplazando el gen Erns del BVDV de la cepa CM53637 con el gen Erns del pestivirus del antílope americano (P-Erns) adecuado para su uso para diferenciar entre ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre.
En una realización separada, la presente invención proporciona un BVDV de la invención que comprende la cepa depositada como ATCc PTA-9939 con ATCCR adecuada para su uso para diferenciar entre ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre. Alternativamente como se describe en el presente documento, la proteína Erns heteróloga de dicho BVDV quimérico, deriva de un pestivirus de reno o un pestivirus de jirafa. La presente divulgación proporciona además el BVDV quimérico como se describe anteriormente, en el que la proteína Erns heteróloga de dicho BVDV quimérico tiene al menos un epitope de Erns que no está presente en el virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre. La presente divulgación proporciona el BVDV quimérico que se describe anteriormente, en el que la proteína heteróloga Erns de dicho BVDV quimérico carece de al menos un epitope de Erns que está presente en el virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre.
Se desvela en el presente documento un cultivo del BVDV quimérico como se describe anteriormente.
En otra realización, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende el BVDV quimérico de la invención. En aún otra realización, la presente invención proporciona una molécula polinucleotídica que codifica para el BVDV quimérico de la invención. En un aspecto diferente la presente divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende un BVDV quimérico como se describe anteriormente y un vehículo veterinariamente aceptable. En una realización, la presente invención proporciona una composición inmunogénica para su uso en la prevención o el tratamiento de infecciones provocadas por BVDV que comprende el pestivirus quimérico de la invención y un vehículo veterinariamente aceptable.
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En una realización separada, la presente invención proporciona un kit que comprende, en al menos un recipiente, la composición para su uso como una vacuna de la invención y un conjunto de instrucciones impresas para la diferenciación entre ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre. En un aspecto separado, la presente divulgación proporciona la composición inmunogénica como se describe anteriormente, en la que el vehículo veterinariamente aceptable es un coadyuvante.
En aún otro aspecto, la presente divulgación proporciona la composición inmunogénica como se describe anteriormente, en la que dicho BVDV quimérico está atenuado vivo.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación proporciona la composición inmunogénica como se describe anteriormente, en la que dicho BVDV quimérico está inactivado.
En un aspecto diferente, la presente divulgación proporciona la composición inmunogénica como se describe anteriormente, que comprende adicionalmente uno o más antígenos adicionales útiles para tratar o evitar la dispersión de uno o más microorganismos patógenos adicionales en un animal.
En una realización separada, la presente invención proporciona una composición inmunogénica que comprende la molécula polinucleotídica que codifica para el BVDv quimérico como se describe anteriormente y un vehículo veterinariamente aceptable.
En una realización, la presente invención proporciona una vacuna que comprende el BVDV quimérico de la invención para la diferenciación entre ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre y un vehículo veterinariamente aceptable.
En un aspecto la presente divulgación proporciona una vacuna que comprende el BVDV quimérico como se describe anteriormente y un vehículo veterinariamente aceptable.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona la vacuna como se describe anteriormente, en la que el vehículo veterinariamente aceptable es un coadyuvante.
En un aspecto diferente la presente divulgación proporciona la vacuna como se describe anteriormente, en la que dicho BVDV quimérico está atenuado vivo.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación proporciona la vacuna como se describe anteriormente, en la que dicho BVDV quimérico está inactivado.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación proporciona la vacuna como se describe anteriormente, que comprende adicionalmente uno o más antígenos adicionales útiles para tratar o evitar la dispersión de uno o más microorganismos patógenos adicionales en un animal.
En un aspecto separado, la presente divulgación proporciona una vacuna que comprende una molécula polinucleotídica que codifica para el BVDV quimérico como se describe anteriormente y un vehículo veterinariamente aceptable.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un kit que comprende, en al menos un recipiente, una vacuna que comprende el BVDV quimérico como se describe anteriormente.
En otra realización, la presente invención proporciona una vacuna para su uso en tratar o evitar la dispersión de infección de virus de la diarrea viral bovina, en el que una vacuna que comprende el BVDV quimérico de la invención se administra a un animal.
También se desvela en el presente documento un procedimiento de vacunar un animal, en el que se administra una vacuna de pestivirus DIVA a dicho animal, y en el que dicha vacuna de pestivirus DIVA comprende el BVDV quimérico como se describe anteriormente, adicionalmente en el que dicho BVDV quimérico tiene al menos un epitope de Ems que no está presente en virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre.
Se desvela además en el presente documento un procedimiento de vacunar un animal, en el que se administra una vacuna de pestivirus DIVA a dicho animal, y en el que dicha vacuna DIVA comprende el BVDV quimérico como se describe anteriormente, adicionalmente en el que dicho BVDV quimérico carece de al menos un epitope de Ems que está presente en virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre.
En aún otra realización, la presente invención proporciona procedimiento de diferenciación entre un animal vacunado con una vacuna que comprende el BVDV quimérico de la invención y un animal infectado con virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre, en el que el animal vacunado con dicha vacuna genera anticuerpos para al menos un epitope de Ems que está presente en el BVDV quimérico de dicha vacuna, pero que no está presente en virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a) ensayar muestras séricas obtenidas de dichos animales para la presencia o ausencia de los anticuerpos; c) identificar al animal que tiene dichos anticuerpos como que ha sido vacunado con dicha vacuna; y
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d) identificar al animal que carece de dichos anticuerpos como que se ha infectado con el BVDV de tipo silvestre.
En aún otra realización, la presente invención proporciona procedimiento de diferenciar entre un animal infectado con virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre y un animal vacunado con una vacuna que comprende el BVDV quimérico de la invención, en el que el animal infectado con virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre genera anticuerpos para al menos un epitope de Ems que está presente en virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre, pero que no está presente en el BVDV quimérico de dicha vacuna, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a) ensayar muestras séricas obtenidas de dichos animales para la presencia o ausencia de los anticuerpos;
c) identificar al animal que tiene dichos anticuerpos como que se ha infectado con el BVDV de tipo silvestre; y
d) identificar al animal que carece de dichos anticuerpos como que ha sido vacunado con dicha vacuna.
También se desvela en el presente documento un kit diagnóstico para diferenciar entre un animal vacunado con una vacuna que comprende el BVDV quimérico como se describe anteriormente y un animal infectado con virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre, comprendiendo dicho kit reactivos capaces de detectar anticuerpos para al menos un epitope de Ems que está presente en el BVDV quimérico de la vacuna, pero que no está presente en virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre.
Se desvela además en el presente documento un kit diagnóstico para diferenciar entre un animal infectado con virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre y un animal vacunado con una vacuna que comprende el BVDV quimérico como se describe anteriormente, comprendiendo dicho kit reactivos capaces de detectar anticuerpos para al menos un epitope de Ems que está presente en virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre, pero que no está presente en el BVDV quimérico de la vacuna.
En aún otro aspecto, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que reconoce un epitope de Ems que está presente en el BVDV quimérico como se describe anteriormente, pero el cual epitope no está presente en virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre.
En un aspecto diferente, la presente divulgación proporciona un anticuerpo que reconoce un epitope presente en virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre, pero el cual epitope no está presente en el BVDV quimérico como se describe anteriormente.
En otro aspecto de la divulgación, un BVDV quimérico como se describe en el presente documento se usa en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de infecciones causadas por BVDV.
Descripción detallada
Las siguientes definiciones se pueden aplicar a términos empleados en la descripción de realizaciones de la invención.
A no ser que se defina de otro modo en la presente memoria, los términos científicos y técnicos que se usan relacionados con la presente invención tendrán los significados que se entienden habitualmente por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Adicionalmente, a no ser que el contexto requiera algo diferente, los términos singulares incluirán el plural y los términos en plural y los términos en plural incluirán el singular.
El término "aminoácido", como se usa en el presente documento, hace referencia a aminoácidos que se dan en la naturaleza y a aminoácidos sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y a imitadores de aminoácidos que funcionan en una manera similar a los aminoácidos que se dan en la naturaleza. Los aminoácidos que se dan en la naturaleza son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican más tarde, por ejemplo, hidroxiprolina, carboxiglutamato, y O-fosfoserina. Los estereoisómeros (por ejemplo, aminoácidos D) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como a-aminoácidos y a-aminoácidos disustituidos, N-alquilaminoácidos, ácido láctico, y otros aminoácidos no convencionales pueden ser también componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, £-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N- formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, a-N-metilarginina, y otros aminoácidos e iminoácidos similares.
Los análogos de aminoácidos se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se da en la naturaleza, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R. Los análogos de aminoácidos ejemplares incluyen, por ejemplo, homoserina, norleucina, metionina sulfóxido, y metionina metilsulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o armazones peptídicos modificados, pero mantienen la misma estructura química esencial como un aminoácido que se da en la naturaleza. Los miméticos de aminoácidos hacen referencia a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido que se da en la naturaleza.
Los aminoácidos se pueden referir para el presente documento bien por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o bien por los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature
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Commission.
El término "animal” como se usa en el presente documento, se pretende que incluya cualquier animal que sea susceptible de infecciones con BVDV, incluyendo pero no limitado a especies bovinas, ovinas, caprinas y porcinas, tanto domésticas como salvajes.
El término “anticuerpo” o “anticuerpos”, como se usa en el presente documento, hace referencia a una molécula de inmunoglobulina capaz de unir un antígeno por medio de reconocimientos de un epitope. Los anticuerpos pueden ser una mezcla policlonal o monoclonales. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes, o pueden ser partes inmunorreactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos pueden existir en una diversidad de formas que incluyen, por ejemplo, como, Fv, Fab', F(ab')2, así como en cadenas individuales.
El término “antígeno” como se usa en el presente documento se refiere a una molécula que contiene uno o más epitopes (lineales, conformacionales o ambos) que tras exposición a un sujeto inducirán una respuesta inmune que es específica para ese antígeno. El término “antígeno” se puede referir a bacterias, virus, hongos, parásitos u otros microbios vivos atenuados, inactivados o modificados. El término “antígeno” como se usa en el presente documento se puede referir también a un antígeno subunidad, que está separado y diferenciado a partir de un organismo entero con el que el antígeno está asociado en la naturaleza. El término “antígeno” se puede referir también a anticuerpos, tales como anticuerpos antiidiotípicos o fragmentos de los mismos, y a mimotopos peptídicos sintéticos que pueden imitar un antígeno o un determinante antigénico (epitope). El término “antígeno” se puede referir también a un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antígeno o determinante antigénico in vivo, tal como en aplicaciones de inmunización de ADN.
Los términos “BVDV”, "aislados de BVDV" o "cepas de BVDV" como se usan en el presente documento hacen referencia a virus de la diarrea viral bovina, incluyendo pero no limitados a tipo I y tipo II, que constan de genoma viral, proteínas asociadas, y otros constituyentes químicos (tales como lípidos). Se conocen un número de virus de la diarrea viral bovina de tipo I y tipo II por aquellos expertos en la técnica y están disponibles a través de, por ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC®). El virus de la diarrea viral bovina tiene un genoma en forma de aRn. El ARN se puede transcribir de forma reversa a ADN para usar en clonación. Así, las referencias hechas en el presente documento a ácido nucleico y virus de la diarrea viral bovina comprenden tanto secuencias de ARN virales como secuencias de ADN derivadas de las secuencias de ARN virales.
El término “línea celular” o “célula huésped”, como se usa en el presente documento quiere decir una célula procariota o eucariota en la que un virus puede replicarse y/o mantenerse.
El término “quimérico” o “quimera” como se usa en el presente documento quiere decir un microorganismo, por ejemplo un virus, que contienen componentes genéticos o físicos derivados de más de un progenitor.
El término “cultivo” como se usa en el presente documento quiere decir una población de células o microorganismos que crecen en la ausencia de otras especies o tipos.
El término “DIVA” como se usa en el presente documento quiere decir una vacuna que es capaz de diferenciar animales infectados de animales vacunados.
Un “epitope” es el sitio específico del antígeno que se une a un receptor de linfocitos T o a anticuerpos específicos, y comprende típicamente de aproximadamente 3 residuos de aminoácidos a aproximadamente 20 residuos de aminoácidos.
El término “heterólogo”, como se usa en el presente documento, significa derivado de una especie o cepa diferente.
El término “homólogo”, como se usa en el presente documento, significa derivado de la misma especie o cepa.
El término “composición inmunogénica”, como se usa en el presente documento, quiere decir una composición que genera una respuesta inmune (es decir, tiene actividad inmunogénica) cuando se administra sola o con un vehículo farmacéuticamente aceptable, a un animal. La respuesta inmune puede ser una respuesta inmune celular mediada principalmente por linfocitos T citotóxicos, o por una respuesta inmune humoral mediada principalmente por linfocitos T coadyuvantes, que a su vez activan linfocitos B conduciendo a producción de anticuerpos.
El término “patógeno” o “microorganismo patógeno” como se usa en el presente documento quiere decir un microorganismo -por ejemplo un virus, bacteria, hongo, protozoo, o helminto- que es capaz de causar o inducir una enfermedad, síndrome, o estado anormal en su animal huésped.
El término “pestivirus” como se usa en el presente documento quiere decir un virus ARN del género Pestivirus, de la familia Flaviviridae. Los pestivirus incluyen, pero no se limitan a, BVDV (tipo 1 y tipo 2), Virus de la Peste Porcina Clásica (CSFV), y Virus de la Enfermedad de Border (BDV), así como pestivirus aislados de especies tales como jabalí salvaje, búfalo, eland, bisonte, alpaca, pudú, bongo, diversas especies de ciervo, jirafa, reno, gamuza y antílope americano (Vilcek y Nettleton; Vet Microbiol. 116:1-12 (2006)).
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El término “molécula polinucleotídica” como se usa en el presente documento quiere decir una molécula polimérica orgánica compuesta de monómeros nucleotídicos unidos covalentemente en una cadena. ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) son ejemplos de polinucleótidos con distinta función biológica.
Los términos “evitar”, “evitando” o “prevención”, y similares, como se usan en el presente documento, quieren decir inhibir la replicación de un microorganismo, inhibir transmisión de un microorganismo, o inhibir a un microorganismo de establecerse a sí mismo en un huésped. Estos términos y similares como se usan en el presente documento pueden también inhibir o bloquear uno o más signos o síntomas de infección.
El término “cantidad terapéuticamente efectiva” como se usa en el presente documento quiere decir una cantidad de un microorganismo, o de una subunidad de antígeno, o de polipéptidos, o de moléculas de polinucleótidos, y combinaciones de los mismos, suficientes para facilitar una respuesta inmune en el sujeto al que ello se administra. La respuesta inmune puede comprender, sin limitación, la inducción de inmunidad celular y/o de inmunidad humoral.
Los términos “tratar”, "tratando" o “tratamiento”, y similares, como se usan en el presente documento quieren decir reducir o eliminar una infección por un microorganismo. Estos términos y similares como se usan en el presente documento pueden querer decir también reducir la replicación de un microorganismo, reducir la transmisión de un microorganismo, o reducir la capacidad de un microorganismo para establecerse a sí mismo en su huésped. Estos términos y similares como se usan en el presente documento pueden también querer decir también reducir, mejorar, o eliminar uno o más signos o síntomas de infección por un microorganismo, o acelerar la recuperación de infección por un microorganismo.
Los términos "vacuna" y “composición de vacuna”, como se usan en el presente documento, quieren decir una composición que evita o reduce una infección, o que evita o reduce uno o más signos o síntomas de infección. Los efectos protectores de una composición de vacuna frente a un patógeno se logran normalmente induciendo en el sujeto una respuesta inmune, bien una respuesta inmune mediada por células o bien una respuesta inmune humoral o una combinación de ambas. Hablando generalmente, las incidencias de infección abolidas o reducidas, la mejora de los signos o síntomas, o la eliminación acelerada del microorganismo de los sujetos infectados son indicativas de los efectos protectores de una composición de vacuna. Las composiciones de vacuna de la presente invención proporcionan efectos protectores contra infecciones causadas por BVDV.
El término "variante", como se usa en el presente documento, hace referencia a una derivación de una proteína dada y/o de una secuencia de genes, en la que la secuencia derivada es esencialmente la misma que la secuencia dada, pero para diferencias mutacionales. Dichas diferencias pueden darse en la naturaleza, o pueden generarse sintética o genéticamente.
El término “vehículo veterinariamente aceptable” como se usa en el presente documento hace referencia a sustancias, que están dentro del alcance del juicio médico sólido, adecuadas para usar en contacto con los tejidos de animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica indebidas, y similares, proporcionales con una relación beneficio frente a riesgo razonable, y efectivas para su uso deseado.
La siguiente descripción se proporciona para ayudar a aquellos expertos en la técnica en practicar la presente invención. Aún así, esta descripción no debería interpretarse para limitar indebidamente la presente invención ya que se pueden hacer modificaciones y variaciones en las realizaciones discutidas en el presente documento por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica sin apartarse del espíritu o del alcance del presente descubrimiento de la invención.
VIRUS, COMPOSICIONES INMUNOGÉNICAS, Y VACUNAS
La presente invención proporciona composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden uno o más pestivirus quiméricos, en las que dicho pestivirus quimérico son virus de la diarrea viral bovina (BVDV) quiméricos capaces de diferenciar entre ganado vacuno vacunado con dicho BVDV quimérico y ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre, que no expresa su proteína Erns homóloga, pero en las que dicho BVDV quimérico comprende un BVDV en el que el gen Erns de longitud completa se reemplaza por el gen Erns de longitud completa del pestivirus del antílope americano y que expresa una proteína Erns heteróloga derivada de derivada de un pestivirus del antílope americano (P - Erns). El BVDV es una quimera BVDV/pestivirus de antílope americano. Alternativamente, también se desvela en el presente documento que la quimera puede ser BVDV/pestivirus de reno o BVDV/pestivirus de jirafa.
El pestivirus quimérico de BVDV/pestivirus de jirafa es la cepa depositada como UC 25547 con American Type Culture Collection (ATCC®), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, EE.UU., y se le da la designación de depósito ATCC® de PTA-9938. En una realización, el pestivirus quimérico de BVDV/pestivirus de antílope americano es la cepa depositada como UC 25548 con ATCC® y se le da la designación de depósito ATCC® de PTA-9939. El pestivirus quimérico de BVDV/pestivirus de reno es la cepa depositada como UC 25549 con ATCC® y se le da la designación de depósito ATCC® de PTA-9940.
Se pueden propagar los BVDV quiméricos de la presente invención en células, líneas celulares y células huésped. Dichas células, líneas celulares o células huésped pueden ser por ejemplo, pero no se limitan a, células de mamífero y células no de mamífero, incluyendo células de insecto y células vegetales. Las células, las líneas celulares y las
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células huésped en las que se puede propagar los BVDV quiméricos de la presente invención se conocen fácilmente y son fácilmente accesibles para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica.
El BVDV quimérico de la presente invención puede atenuarse e inactivarse antes de usar en una composición inmunogénica o vacuna. Los procedimientos de atenuación e inactivación se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Los procedimientos para atenuación incluyen, pero no se limitan a, pasos en serie en cultivo celular en una línea celular adecuada, irradiación ultravioleta, y mutagénesis química. Los procedimientos para inactivación incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con formalina, betapropiolactona (BPL) o etilenoimina binaria (BEI), u otros procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica.
La inactivación por formalina se puede llevar a cabo mezclando la suspensión de virus con formaldehído al 37% a una concentración de formaldehído final del 0,05%. La mezcla de virus-formaldehído se mezcla por agitación continua durante aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de virus inactivada se pone a prueba después para virus vivos residuales realizando ensayo por crecimiento en una línea celular adecuada.
La inactivación por BEI se puede llevar a cabo mezclando la suspensión de virus de la presente invención con BEI (2-bromo-etilamina en NaOH 0,175 N) 0,1 M a una concentración de BEI final de 1 mM. La mezcla de virus-BEI se mezcla por agitación constante durante aproximadamente 48 horas a temperatura ambiente, seguida por la adición de tiosulfato de sodio 1,0 M a una concentración final de 0,1 mM. La mezcla se continúa durante dos horas adicionales. La mezcla de virus inactivada se pone a prueba después para virus vivos residuales realizando ensayo por crecimiento en una línea celular adecuada.
Las composiciones inmunogénicas y las vacunas para su uso en la presente invención pueden incluir uno o más vehículos veterinariamente aceptables. Como se usa en el presente documento, un "vehículo veterinariamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, coadyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardadores de la absorción, y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol, y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol, y lactosa, entre otros conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los estabilizadores incluyen albúmina, entre otros conocidos por el trabajador experto. Los conservantes incluyen mertiolato, entre otros conocidos por el trabajador experto.
Los coadyuvantes incluyen, pero no se limitan a, el sistema coadyuvante RIBI (Ribi Inc.), alumbre, gel de hidróxido de aluminio, emulsiones de aceite en agua, emulsiones de agua en aceite tales como, por ejemplo, coadyuvantes completo e incompleto de Freund, copolímero Block (CytRx, Atlanta Ga.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif ), coadyuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL) u otras fracciones de saponina, monofosforil-lípido A, coadyuvante amina lipoidal Avridina, enterotoxina lábil al calor de E. coli (recombinante o lo contrario), toxina colérica, o péptido muramilo, entre otros muchos conocidos por aquellos expertos en la técnica. Las cantidades y concentraciones de coadyuvantes y aditivos útiles en el compuesto de la presente invención pueden determinarse fácilmente por el trabajador experto. En una realización, la presente invención contempla composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden de aproximadamente 50 |jg a aproximadamente 2000 |jg de coadyuvante. En otra realización está incluido el coadyuvante en una cantidad de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 1500 jg, o de aproximadamente 250 jg a aproximadamente 1000 jg, o de aproximadamente 350 jg a aproximadamente 750 jg. En otra realización, el coadyuvante está incluido en una cantidad de aproximadamente 500 jg/2 ml de dosis de la composición inmunogénica o vacuna.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden incluir también antibióticos. Tales antibióticos incluyen, pero no están limitados a, aquellos de las clases de aminoglicósidos, carbapenems, cefalosporinas, glicopéptidos, macrólidos, penicilinas, polipéptidos, quinolonas, sulfonamidas, y tetraciclinas. En una realización, la presente invención contempla composiciones inmunogénicas y vacunas que comprenden de aproximadamente 1 jg/ml a aproximadamente 60 jg/ml de antibiótico. En otra realización, las composiciones inmunogénicas y vacunas comprenden de aproximadamente 5 jg/ml a aproximadamente 55 jg/ml de antibiótico, o de aproximadamente 10 jg/ml a aproximadamente 50 jg/ml de antibiótico, o de aproximadamente 15 jg/ml a aproximadamente 45 jg/ml de antibiótico, o de aproximadamente 20 jg/ml a aproximadamente 40 jg/ml de antibiótico, o de aproximadamente 25 jg/ml a aproximadamente 35 jg/ml de antibiótico. En aún otra realización, las composiciones inmunogénicas y vacunas comprenden menos de aproximadamente 30 jg/ml de antibiótico.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden incluir adicionalmente uno o más agentes inmunomoduladores distintos, tales como, por ejemplo, interleucinas, interferones, u otras citoquinas, cantidades adecuadas de las que se pueden determinar por el trabajador experto.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden incluir moléculas polinucleotídicas adicionales que codifican para un pestivirus quimérico.
Se pueden usar bien moléculas de ADN o bien moléculas de ARN que codifiquen todo el genoma del pestivirus quimérico, o uno o más marcos de lectura abiertos, en composiciones inmunógenas o vacunas. La molécula de ADN o de ARN se puede administrar ausentes otros agentes, o se puede administrar conjuntamente con un agente que
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facilita captación celular (por ejemplo, liposomas o lípidos catiónicos). El polinucleótido total en la composición inmunogénica o en la vacuna estará generalmente entre aproximadamente 0,1 pg/ml y aproximadamente 5,0 mg/ml. En otra realización, el polinucleótido total en la composición inmunogénica o en la vacuna será de aproximadamente 1 pg/ml y de aproximadamente 4,0 mg/ml, o de aproximadamente 10 pg/ml y de aproximadamente 3,0 mg/ml, o de aproximadamente 100 pg/ml y de aproximadamente 2,0 mg/ml. Las vacunas y los procedimientos de vacunación que utilizan ácidos nucleicos (ADN o mARN) se han descrito bien en la técnica, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 5.703.055, la Patente de los Estados Unidos N.° 5,580,859, la Patente de los Estados Unidos N.° 5.589.466.
Las composiciones inmunogénicas y las vacunas pueden incluir también antígenos de BVDV adicionales, por ejemplo, aquellos descritos en la patente de Estados Unidos N.° 6.060.457, la patente de Estados Unidos N.° 6.015.795, la patente de Estados Unidos N.° 6.001.613, y la patente de Estados Unidos N.° 5.593.873.
Además de uno o más pestivirus quimérico(s), las composiciones inmunogénicas y las vacunas pueden incluir otros antígenos. Los antígenos pueden estar en forma de una preparación total o parcial inactivada del microorganismo, o en la forma de moléculas antigénicas obtenidas por técnicas de ingeniería genética o de síntesis química. Otros antígenos apropiados para usar de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de bacterias patógenas tales como Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Bacillus anthracis, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Mannhemia haemolytica, Mycoplasma bovis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp., Streptococcus uberis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, Chlamydia spp., Brucella spp., Vibrio spp., serotipos de Salmonella enterica y Leptospira spp. Los antígenos pueden estar derivados también de hongos patógenos tales como Candida, protozoos tales como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp., Babesia spp., Giardia spp., o helmintos tales como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, y Fasciola. Los antígenos adicionales incluyen virus patógenos tales como coronavirus bovinos, herpesvirus-1,3,6 bovinos, virus parainfluenza bovino, virus sincitial respiratorio bovino, virus de la leucosis bovina, virus de la peste bovina, virus de enfermedades de las patas y la boca, virus de la rabia, y virus influenza.
FORMAS, DOSIFICACIONES, VÍAS DE ADMINISTRACIÓN
Las composiciones inmunogénicas y vacunas se pueden administrar a animales para inducir una respuesta inmune efectiva contra BVDV. Por consiguiente, se describen en el presente documento procedimientos de estimular una respuesta inmune efectiva contra BVDV, administrando a un animal una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición inmunógena o vacuna de la presente invención.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas se pueden fabricar de diversas formas dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden fabricarse en forma de soluciones o dispersiones estériles acuosas adecuadas para uso inyectable, o pueden fabricarse en formas liofilizadas usando técnicas de secado por congelación. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas liofilizadas se mantienen típicamente a aproximadamente 4°C, y pueden reconstituirse en una solución estabilizante, por ejemplo, solución salina o y HEPES, con o sin coadyuvante. Las composiciones inmunogénicas y las vacunas se pueden fabricar también en forma de suspensiones o emulsiones.
Las composiciones inmunogénicas y las vacunas incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de los BVDV quiméricos descritos anteriormente. Los virus purificados se pueden usar directamente en una composición inmunogénica o vacuna, o pueden atenuarse adicionalmente, o inactivarse. Típicamente, una composición inmunogénica o vacuna contiene entre aproximadamente 1*102 y aproximadamente 1*1012 partículas virales, o entre aproximadamente 1*103 y aproximadamente 1*1011 partículas virales, o entre aproximadamente 1*104 y aproximadamente 1*101° partículas virales, o entre aproximadamente 1*105 y aproximadamente 1*109 partículas virales, o entre aproximadamente 1*106 y aproximadamente 1*108 partículas virales. La cantidad precisa de un virus en una composición inmunogénica o vacuna efectiva para proporcionar un efecto protector se puede determinar por un trabajador experto.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas comprenden generalmente un vehículo veterinariamente aceptable en un volumen de entre aproximadamente 0,5 ml y aproximadamente 5 ml. En otra realización el volumen del vehículo está entre aproximadamente 1 ml y aproximadamente 4 ml, o entre aproximadamente 2 ml y aproximadamente 3 ml. En otra realización, el volumen del vehículo es aproximadamente 1 ml, o es aproximadamente 2 ml, o es aproximadamente 5 ml. Los vehículos veterinariamente aceptables adecuados para usar en composiciones inmunogénicas y vacunas pueden ser cualquiera de aquellos descritos anteriormente en el presente documento.
Aquellos expertos en la técnica determinan fácilmente si un virus necesita atenuarse o inactivarse antes de su administración. Se puede administrar un BVDV quimérico directamente a un animal sin atenuación adicional. La cantidad de un virus que es terapéuticamente efectivo puede variar dependiendo del virus particular usado, la afección del animal y/o el grado de infección, y puede determinarse por un trabajador experto. Se puede administrar una dosis individual a animales, o, alternativamente, pueden tener lugar dos o más inoculaciones con intervalos desde aproximadamente dos hasta aproximadamente diez semanas. Los regímenes de refuerzo se pueden requerir y el régimen de dosificación se puede ajustar para proporcionar inmunización óptima. Aquellos expertos en la
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técnica pueden determinar el régimen de administración óptima.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas se pueden administrar directamente dentro del torrente sanguíneo, dentro del músculo, o dentro de un órgano interno. Los medios adecuados para administración parenteral incluyen intravenoso, intraarterial, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrauretral, intraesternal, intracraneal, intramuscular y subcutáneo. Los dispositivos adecuados para administración parenteral incluyen inyectoras de aguja (incluyendo de microaguja), inyectoras libres de aguja y técnicas de infusión.
Las formulaciones parenterales son típicamente soluciones acuosas que pueden contener excipientes como sales, carbohidratos y agentes tamponantes (preferentemente a un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 9, o de aproximadamente 4 a aproximadamente 8, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 7,5, o de aproximadamente 6 a aproximadamente 7,5, o aproximadamente 7 a aproximadamente 7,5), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una solución no acuosa estéril o como una forma secada para usarse en conjunción con un vehículo adecuado tal como agua libre de pirógeno, estéril.
La preparación de formulaciones parenterales según condiciones estériles, por ejemplo, mediante liofilización, se pueden llevar a cabo fácilmente usando técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por aquellos expertos en la técnica.
La solubilidad de compuestos usados en la preparación de soluciones parenterales se puede incrementar por el uso de técnicas de formulación apropiadas conocidas por el trabajador experto, tales como la incorporación de agentes potenciadores de solubilidad que incluyen tampones, sales, tensioactivos, liposomas, ciclodextrinas, y similares.
Las formulaciones para administración parenteral pueden formularse para liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, marcada y programada. Así los compuestos de la invención se pueden formular como un sólido, semisólido, o líquido tixotrópico para administración como un dispositivo implantado que proporciona liberación modificada del compuesto activo. Ejemplos de tales formulaciones incluyen endoprótesis vasculares y microsferas de ácido poli(d/-lactico-coglicólico) (PGLA).
Se pueden administrar también las composiciones inmunogénicas y vacunas a la piel o mucosa, es decir, dérmicamente o transdérmicamente. Las formulaciones típicas para este propósito incluyen geles, hidrogeles, lociones, soluciones, cremas, pomadas, polvos espolvoreables, apósitos, espumas, películas, parches cutáneos, obleas, implantes, esponjas, fibras, vendajes y microemulsiones. Se pueden usar también liposomas. Los vehículos incluyen alcohol, agua, aceite mineral, parafina líquida, parafina blanca, glicerina, polietilenoglicol y propilenoglicol. Se pueden incorporar potenciadores de penetración. Véase, por ejemplo, Finnin y Morgan, J. Pharm Sci, 88 (10): 955-958 (1999).
Otros medios de administración tópica incluyen administración por electroporación, iontoforesis, fonoforesis, sonoforesis e inyección por microagujas o libre de agujas (porejemp/o Powderject™, Bioject™, etc.).
Las formulaciones para administración tópica pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, marcada y programada.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas se pueden administrar también intranasalmente o por inhalación, típicamente en forma de un polvo seco (bien solo o bien como una mezcla, por ejemplo, en una mezcla seca con lactosa, o como una partícula de componente mezclado, por ejemplo, mezclado con fosfolípidos, tales como fosfatidilcolina) a partir de un inhalador de polvo seco o como un pulverizador de aerosol a partir de un contenedor presurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferentemente un atomizador usando medios
electrohidrodinámicos para producir una niebla fina), o nebulizador, con o sin el uso de un propulsor adecuado, tal como 1,1,1,2-tetrafluoroetano o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano. Para uso intranasal, el polvo puede comprender un agente bioadhesivo, por ejemplo, chitosano o ciclodextrina.
El contenedor presurizado, bomba, pulverizador, atomizador, o nebulizador contiene una solución del/de los compuesto(s) de la invención que comprende, por ejemplo, etanol, etanol acuoso, o un agente alternativo adecuado para dispersar, solubilizar, o prolongar la liberación del producto activo, un(os) propulsor(es) como disolvente y un tensioactivo opcional, tal como trioleato de sorbitán, ácido oleico, o un ácido oligoláctico.
Antes de usar en un polvo seco o formulación de suspensión, el producto de fármaco generalmente se micronizó a un tamaño adecuado para administrar mediante inhalación (típicamente menos de 5 micrómetros). Esto se puede lograr mediante cualquier procedimiento de pulverización apropiado, tal como molienda por chorro en espiral, molienda por chorro en lecho fluido, procesamiento en fluido supercrítico para formar nanopartículas, homogeneización por alta presión, o secado por pulverización.
Se pueden formular cápsulas (hechas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), blister y cartuchos para usar en un inhalador o insuflador para contener una mezcla en polvo del compuesto de la invención, una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón y un modificador de actuación tal como /-leucina, manitol, o estearato de
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magnesio. La lactosa puede ser anhidra o estar en forma del monohidrato. Otros excipientes adecuados incluyen dextrano, glucosa, maltosa, sorbitol, xilitol, fructosa, sacarosa y trehalosa.
Una formulación de solución adecuada para usar en un atomizador usando medios electrohidrodinámicos para producir una niebla fina puede contener de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 20 mg del compuesto de la invención por actuación y el volumen de actuación pueden variar de aproximadamente 1 jl a aproximadamente 100 jl. En otra realización, la cantidad de compuesto por actuación puede variar de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 15 mg, o de aproximadamente 500 jg a aproximadamente 10 mg, o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, o de aproximadamente 2,5 jg a aproximadamente 5 mg. En otra realización, el volumen de actuación puede variar de aproximadamente 5 jl a aproximadamente 75 jl, o de aproximadamente 10 jl a aproximadamente 50 jl, o de aproximadamente 15 jl a aproximadamente 25 jl. Una formulación típica puede comprender el compuesto de la invención, propilenoglicol, agua estéril, etanol y cloruro de sodio. Disolventes alternativos que se pueden usar en vez de propilenoglicol incluyen glicerol y polietilenoglicol.
Las formulaciones para administración inhalada/intranasal pueden formularse para liberarse de forma inmediata y/o modificada usando, por ejemplo, PGLA. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, marcada y programada.
En el caso de inhaladores y aerosoles de polvo seco, la unidad de dosificación se determina generalmente por medio de una válvula que administra una cantidad medida. Las unidades de acuerdo con la invención están típicamente dispuestas para administrar una dosis medida o “soplo” conteniendo de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 jg del compuesto de la invención. En otra realización, la cantidad de compuesto administrado en una dosis medida es de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 75 jg, o de aproximadamente 100 ng a aproximadamente 50 jg, o de aproximadamente 500 ng a aproximadamente 25 jg, o de aproximadamente 750 ng a aproximadamente 10 jg, o de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 5 jg. La dosis diaria general estará típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 jg a aproximadamente 100 mg que pueden administrarse en una dosis individual o, más usualmente, como dosis divididas a lo largo de todo el día. En otra realización, la dosis diaria general puede variar de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 75 mg, o de aproximadamente 100 jg a aproximadamente 50 mg, o de aproximadamente 500 jg a aproximadamente 25 mg, o de aproximadamente 750 jg a aproximadamente 10 mg, o de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 5 mg.
Se pueden administrar también las composiciones inmunogénicas y vacunas oralmente o peroralmente, es decir dentro del cuerpo del sujeto a través o por medio de la boca e implica tragar o transportar a través de la mucosa oral (por ejemplo, absorción sublingual o bucal) o ambas cosas. Se pueden añadir aromas adecuados, tales como mentol y levomentol, o edulcorantes, tales como sacarina o sacarina sódica, a aquellas formulaciones de la invención que se pretenden administrar de forma oral o peroral.
Se pueden administrar las composiciones inmunogénicas y vacunas rectalmente o vaginalmente, por ejemplo, en forma de un supositorio, pesario, o enema. La manteca de cacao es una base de supositorios tradicional, pero se pueden usar diversas alternativas según sea apropiado. Las formulaciones para administración rectal/vaginal pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, marcada y programada.
Se pueden administrar también las composiciones inmunogénicas y vacunas directamente al ojo o al oído, típicamente en forma de gotas de una suspensión micronizada o de una solución en medio salino estéril, isotónico, de pH ajustado. Otras formulaciones adecuadas para administración oral y auditiva incluyen pomadas, implantes biodegradables (por ejemplo esponjas de geles absorbibles, colágeno) y no biodegradables (por ejemplo silicona), obleas, lentes y sistemas particulados o vesiculares, tales como niosomas o liposomas. Se puede incorporar un polímero tal como ácido poliacrílico reticulado, alcohol polivinílico reticulado, ácido hialurónico reticulado, un polímero celulósico, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, o metilcelulosa, o un polímero heteropolisacarídico, por ejemplo, goma gelán, conjuntamente con un conservante, tal como cloruro de benzalconio. Tales formulaciones pueden administrarse también por iontoforesis.
Las formulaciones para administración ocular/auditiva pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retardada, mantenida, por pulsos, controlada, marcada y programada.
Las composiciones inmunogénicas y vacunas se pueden usar en la preparación de un medicamento para tratar o evitar la dispersión de infección con virus de la diarrea viral bovina en un animal.
Se pueden usar las composiciones inmunogénicas y vacunas en la preparación de un medicamento para administrar a un animal, en el que el medicamento es una vacuna de pestivirus DIVA.
DETECCIÓN, PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO
La presente invención proporciona procedimientos para determinar el origen de un pestivirus presente en un sujeto animal.
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La vacunación que emplea una vacuna de DIVA -una que es capaz de diferenciar los animales infectados de los vacunados- proporciona un medio para determinar el origen de un pestivirus presente en un sujeto animal. Esta diferenciación puede lograrse por medio de cualquiera de diversos procedimientos diagnósticos, incluyendo pero no limitados a ELISA, prueba de transferencia de Western y PCR. Estos y otros procedimientos se reconocen fácilmente por alguien de experiencia ordinaria en la técnica.
El BVDV quimérico de la presente invención se puede distinguir de las cepas de BVDV de tipo silvestre tanto en su composición genómica como en las proteínas expresadas. Tal distinción permite discriminación entre animales vacunados y animales infectados. Por ejemplo, se puede hacer una determinación respecto al caso en que si un animal da resultados positivos en una prueba para BVDV en ciertas pruebas de laboratorio lleva una cepa de BVDV de tipo silvestre, o lleva un BVDV quimérico de la presente invención obtenido previamente por vacunación.
Se puede emplear una diversidad de ensayos para hacer la determinación. Por ejemplo, los virus se pueden aislar del animal que da positivo para BVDV, y se pueden usar ensayos basados en ácidos nucleicos para determinar la presencia de un genoma de BVDV quimérico, indicador de vacunación anterior. Los ensayos basados en ácidos nucleicos incluyen análisis de prueba de transferencia de Southern o de Northern, PCR, y secuenciación. Alternativamente, se pueden emplear ensayos basados en proteínas. En ensayos basados en proteínas, las células o tejidos sospechosos de una infección se pueden aislar del animal que da resultados positivos para BVDV. Se pueden hacer extractos celulares a partir de tales células o tejidos y pueden someterse a, por ejemplo, prueba de transferencia de Western, usando anticuerpos apropiados contra proteínas virales que pueden identificar la presencia de bien el BVDV quimérico previamente inoculado, o bien del BVDV de tipo silvestre.
La extensión y naturaleza de las respuestas inmunes inducidas en el animal se puede valorar usando una diversidad de técnicas. Por ejemplo, los sueros se pueden recoger a partir de animales inoculados y se pueden probar para la presencia o ausencia de anticuerpos específicos para el virus quimérico, por ejemplo, en un ensayo de neutralización de virus convencional. Se puede lograr la detección de linfocitos T-citotóxicos (CTL) que dan respuesta en tejidos linfoides por ensayos tales como proliferación de linfocitos T, como indicadora de la inducción de una respuesta inmune celular. Las técnicas relevantes se describen bien en la técnica, por ejemplo, Coligan y col. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994).
KITS
Ya que puede ser deseable administrar una composición inmunogénica o vacuna en combinación con compuestos adicionales, por ejemplo, para el propósito de tratar una enfermedad o afección particular, está dentro del ámbito de la presente invención que una composición inmunogénica o vacuna pueda estar convenientemente incluida en, o combinada en, la forma de un kit adecuado para administración o coadministración de las composiciones.
Así, los kits pueden comprender una o más composiciones farmacéuticas separadas, al menos una de los cuales es una composición inmunogénica o vacuna de acuerdo con la presente invención, y un medio para retener por separado dichas composiciones, tal como un recipiente, una botella dividida, o un paquete de láminas dividido. Un ejemplo de un kit tal es una jeringuilla y una aguja, y similares. Un kit de la presente invención es particularmente adecuado para administrar diferentes formas de dosificación, por ejemplo, oral o parenteral, para administrar las composiciones separadas a intervalos de dosificación diferentes, o para valorar las composiciones separadas una frente a la otra. Para ayudar a una administración de una composición de la presente invención, el kit comprende típicamente las direcciones para administración.
Otro kit puede comprender uno o más reactivos útiles para la detección de y para la diferenciación entre un animal infectado por BVDV y un animal vacunado con BVDV quimérico. El kit puede incluir reactivos para analizar una muestra para la presencia de BVDV completo, o de polipéptidos de BVDV, epitopes o secuencias de polinucleótido que no están presentes en el BVDV quimérico de la composición inmunogénica o vacuna. Alternativamente, los kits de la presente divulgación pueden incluir reactivos para analizar una muestra para la presencia de un BVDV quimérico, o polipéptidos, epitopes o secuencias polinucleotídicas que no están presentes en el BVDV de tipo silvestre. La presencia de virus, polipéptidos, o secuencias de polinucleótidos se puede determinar usando anticuerpos, PCR, hibridación, y otros procedimientos de detección conocidos por aquellos de experiencia en la técnica.
Otro kit puede proporcionar reactivos para la detección de anticuerpos contra epitopes particulares. Los epitopes bien están presentes en el BVDV quimérico de la presente invención y no están presentes en el BVDV de tipo silvestre, o bien alternativamente, están presentes en el BVDV de tipo silvestre y no están presentes en el BVDV quimérico de la presente divulgación. Tales reactivos son útiles para analizar una muestra para la presencia de anticuerpos, y se conocen fácilmente y están fácilmente disponibles para alguien de experiencia ordinaria en la técnica. La presencia de anticuerpos se puede determinar usando procedimientos de detección estándar conocidos por aquellos de experiencia en la técnica.
En ciertas realizaciones, los kits pueden incluir un juego de instrucciones impresas o una etiqueta indicando que el kit es útil para la detección y diferenciación de animales infectados por BVDV de animales vacunados con BVDV quimérico.
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ANTICUERPO, ANTICUERPOS
Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales, o recombinantes. Convenientemente, los anticuerpos se pueden preparar contra el inmunógeno o contra una parte del mismo. Por ejemplo, un péptido sintético basado en la secuencia de aminoácidos del inmunógeno, o preparado recombinantemente por técnicas de clonación o el producto del gen natural y/o partes del mismo se puede aislar y usar como el inmunógeno. Los inmunógenos se pueden usar para producir anticuerpos por tecnología de producción de anticuerpos estándar bien conocida por aquellos expertos en la técnica, tal como se describe generalmente en Harlow y Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988) y Borrebaeck, “Antibody Engineering -A Practical Guide”, W.H. Freeman y Co. (1992). Los fragmentos de anticuerpo pueden prepararse también a partir de los anticuerpos, e incluyen Fab, F(ab')2, y Fv, por procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica.
En la producción de anticuerpos, se puede llevar a cabo búsqueda del anticuerpo deseado por procedimientos estándar en inmunología conocidos en la técnica. Se siguen generalmente técnicas no específicamente descritas como en Stites, y col. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a Edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994) y Mishell y Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W.H. Freeman y Co., Nueva York (1980). En general, los tipos preferidos de inmunoensayos son ELISA y prueba de transferencia de Western. Ambos ensayos se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Se pueden usar tanto los anticuerpos policlonales como los monoclonales en los ensayos. El anticuerpo puede estar unido a un sustrato de soporte sólido o puede estar conjugado con un resto detectable o puede estar unido y conjugado según se sabe bien en la técnica. (Para una discusión general de conjugación de restos fluorescentes o enzimáticos, véase Johnstone y Thorpe, “Immunochemistry in Practice”, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1982)). La unión de anticuerpos a un sustrato de soporte sólido también se conoce bien en la técnica. (Para una discusión general, véanse Harlow y Lane (1988) y Borrebaeck (1992)). Los restos detectables para usar en la presente invención pueden incluir, pero no se limitan a, marcadores fluorescentes, metálicos, enzimáticos y radiactivos tales como biotina, oro, ferritina, fosfatasa
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alcalina, b-galactosidasa, peroxidasa, ureasa, fluoresceína, rodamina, tritio, C y yodinación.
La presente invención está ilustrada adicionalmente por, pero de ninguna manera está limitada por, los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1. Construcción y Caracterización Serológica de Pestivirus Quiméricos
E. coli K12 GM2163 [F- ara-14, leuB6, thi-1, fhuA31, lacY1, tsx-78, galK2, galT22, supE44, hisG4, rpsL136, (Strr), xyl-5, mtl-1, dam13::Tn9(Camr), dcm-6, mcrB1, hsdR2(rk'mk'),mcrA] alberga un plásmido que contiene el ADNc genómico de longitud total de la cepa NADL del virus de la diarrea viral bovina (BVDV-NADL), obtenido del Dr. R. Donis, Universidad de Nebraska.
Se mantuvieron células RD (células testiculares bovinas transformadas con SV40; obtenidas del Dr. R. Donis) en OptiMEM suplementado con suero de caballo al 3%, aminoácidos no esenciales al 1% (NEAA) en medio de Eagle modificado (MEM), Glutamax 2 mM y 10 pg/ml de Gentamicina. Las células BK-6 se obtuvieron a partir de Pfizer Global Manufacturing (PGM). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementando con suero de caballo al 5% o con suero de ternero donante (PGM), Glutamax 2 mM, y Antibiótico y Antimicótico al 1%. Todos los componentes del medio salvo donde se indica se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA). Todas las células se mantuvieron a 37oC en un ambiente de CO2 al 5%.
Se adquirió anticuerpo monoclonal (MAb) 15C5 específico para Ems de BVDV a partir de IDEXX (Westbrook, ME). Se proporcionó MAb 20.10.6 contra BVDV NS3 por el Dr. E. Dubovi (Universidad de Cornell). Se obtuvieron MAb WS 363, WS 373 y WS 371, que tienen especificidad para la proteína Ems del virus de la Enfermedad de Border (BDV), de Veterinary Laboratories Agency (Surrey, Reino Unido). Las muestras de suero bovino n.° 77, n.° 816, n.° 1281, y n.° 1434 se obtuvieron internamente en Pfizer.
Se generaron pestivirus quiméricos reemplazando el gen Ems de la cepa BVDV-NADL con el gen Ems de pestivirus de jirafa (G-Ems), de reno (R-Ems), o de antílope americano (P-Ems) usando un procedimiento de PCR solapante. Se usó bien ADN polimerasa HS de fusión PfuUltra™ II (Stratagene; La Jolla, CA) o bien ADN polimerasa Taq de Platinum® de Alta Fidelidad (Invitrogen). Se enumeran en la Tabla 1 los cebadores de oligonucleótidos (con SEQ ID N.°s acompañantes) para PCR solapantes y para generar un ADN viral de longitud total en la Tabla 1.
Tabla 1. Cebadores oligonucleotídicos usados para amplificación por PCR
SEQ ID Nombre Origen
N.°
1 Oligo B-5 T7 + NADL
Secuencias (5'-3') Sitio de Unión del
Cebador
(secuencia subrayada)
GTGTTAATACGACTCACTATAG promotor T7
TATACGAGAATTAGAAAAGGC
2
Oligo 84 NADL
SEQ ID
Nombre Origen
N.°
3
Oligo 127 G-Ems+ NADL
4
Oligo 128 G-Ems
5
Oligo 129 G-Ems
6
Oligo 130 G-Ems + NADL
7
Oligo 131 R-Ems + NADL
8
Oligo 132 R-Erns
9
Oligo 133 R-Erns
10
Oligo 134 R-Ems + NADL
11
Oligo 135 P-Ems + NADL
12
Oligo 136 p-Erns
13
Oligo 137 p-Erns
14
Oligo 138 P-Ems + NADL
15
Oligo 175 NADL
16
Oligo 177 NADL
17
Oligo 237 CM5960
18
Oligo P7 CM5960
19
Oligo P8 CM5960
20
Oligo P3 CM5960
21
Oligo 296-1 T7 + CM53637
22
Oligo 297 P- Erns+CM53637
GGGGGCTGTTAGAGGTCTTCC
(continuación) Secuencias (5'-3')
Sitio de Unión del Cebador
(secuencia subrayada)
AATTCCACTGGGTGATGTTCTCTC CC ATTGT AACTTG AAAC A A AACT GAGAACATCACCCAGTGGAA TGCGTGGGCTCCAAACCATGT
AACATGGTTTGGAGCCCACGCA GCTTCCCCTTACTGTGATGTCG GGTTCC ACTGTGTT ATATTCTCTC CC ATTGT AACTTGAA ACAA AACT GAGAATATAACACAGTGGAACC TGCATTAGCTCCGAACCACGTT
AACGTGGTTCGGAGCTAATGCA GCTTCCCCTTACTGTGATGTCG GGTTCCACTGAGTTATATTCAC TCCC ATTGT AACTTGAA ACA
GTGAATATAACTCAGTGGAACC
TGCCTGTGCCCCAAACCATGT
AACATGGTTTGGGGCACAGGCA
GCTTCCCCTTACTGTGATGTCG
G-E extremo N- terminal
G-E extremo terminal
R-Ems extremo
terminal
P-E extremo terminal
C-
R-Erns extremo N-
terminal
C-
P-Erns extremo N-
terminal
C
GTTATCAATAGTAGCCACAGAAT
TCCACCCTCAATCGACGCTAAA
CCCTGAGGCCTTCTGTTCTGAT
CACTTGTCGGAGGTACTACTACT
CTTGTCTATCTTATCTCTTATTGC
ACTATCTGAACAGTTGGACAGG
GTGTTAATACGACTCACTATA promotor T7 GTATACGAGATTAGCTAAAG
CCAGGTTCCACTGAGTTATATTCAC P-Erns extremo
terminal
TCCTGTTACCAGCTGAAGCAGAA
N-
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(continuación)
SEQ ID
Nombre Origen
N.°
23
Oligo 298 P- Ems+CM53637
24
Oligo 299 CM53637
25
Oligo 300 CM53637
26
Oligo 303 CM53637
27
Oligo 92-1 CM53637
28
Oligo 321 CM53637
29
Oligo 250 NADL
30
Oligo 252 NADL
Secuencias (5'-3') Sitio de Unión del
Cebador
(secuencia subrayada)
AACATGGTTTGGGGCACAGGCA P-Erns extremo C-
terminal
GCAAGTCCATACTGTAAAGTG
TTAATGCCCTCCCTGTCTCTACCACCT
AGGATGAGGATCTAGCAGTGGATCT
CCATAGCCATCTGCTCAGACAGTA
GGGGCTGTCAGAGGCATCCTCTAGTC
AGCCACTACACCTGTCACGAGAAG
CACCATGAAAATAGTGCCCAAAGAATC NADL-C extremo C-
terminal
TTAAGCGTATGCTCCAAACCACGTC NADL-Erns extremo C-
terminal
Se extrajo el plásmido que contiene el ADNc de longitud total de BVDV-NADL de dam- E. coli K12 GM2163. El plásmido se metiló in vitro con dam-metiltransferasa y S-adenosilmetionina (New England Biolabs; Ipswich, MA). Se sintetizaron y clonaron dentro de un vector de clonación genes G-Ems, R-Ems, y P-Ems (números de acceso de GenBank NC_003678, NC_003677, y AY781152, respectivamente).
Para la construcción de ADN quimérico BVDV-NADL/G-Ems, se amplificó un fragmento de BVDV-NADL que codifica para 5'UTR al extremo 3' del gen C mediante PCR a partir de plásmido metilado con cebadores Oligo B-5 y Oligo 127. El gen G-Erns se amplificó por PCR a partir del ADN plasmídico que contiene el gen G-Erns con Oligo 128 y Oligo 129. Se amplificó un fragmento de BVDV que codifica para E1 al 3'UTR por PCR de plásmido metilado con Oligo 130 y Oligo 84. Los productos de PCR se purificaron de gel usando Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen; Valencia, CA). Los productos de PCR purificados se trataron con Dpn I y Exonucleasa 1 (New England Biolabs). Los productos de pCr tratados se ensamblaron creando un genoma de BVDV-NADL/G-Erns quimérico de longitud total por PCR usando Oligo B-5 y Oligo 84.
Para la construcción de ADN quimérico BVDV-NADL/G-Erns, se amplificó un fragmento de BVDV-NADL que codifica para 5'UTR al extremo 3' del gen C mediante PCR a partir de plásmido metilado con cebadores Oligo B-5 y Oligo 131. El gen R-Erns se amplificó por PCR a partir del plásmido que contiene gen R-Erns con Oligo 132 y Oligo 133. Se amplificó un fragmento de BVDV que codifica para E1 al 3'UTR por PCR de plásmido metilado con Oligo 134 y Oligo 84. Los productos de PCR se purificaron de gel con Kit de Extracción de Gel QIAquick. Los productos de PCR purificados se trataron con Dpn I y Exonucleasa 1. Los productos de PCR tratados se ensamblaron creando un genoma de BVDV-NADL/R-Erns quimérico de longitud total por PCR con Oligo B-5 y Oligo 84.
Para la construcción de ADN quimérico BVDV-NADL/G-Erns, se amplificó un fragmento de BVDV-NADL que codifica para 5'UTR al extremo 3' del gen C mediante PCR a partir de plásmido metilado con cebadores Oligo B-5 y Oligo 135. El gen P-Ems se amplificó por PCR a partir del ADN plasmídico que contiene el gen P-Ems con Oligo 136 y Oligo 137. Se amplificó un fragmento de BVDV que codifica para E1 al 3'UTR por PCR de plásmido metilado con Oligo 138 y Oligo 84. Los productos de PCR se purificaron del gel con Kit de Extracción de Gel QIAquick. Los productos de PCR purificados se trataron con Dpn I y Exonucleasa 1. Los productos de PCR tratados se ensamblaron creando un genoma de BVDV-NADL/P-Ems quimérico de longitud total por PCR con Oligo B-5 y Oligo 84.
Para la confirmación de secuencia de las regiones quiméricas de Ems, se amplificó un fragmento que corresponde al 5' UTR para la región E1 de cada genoma quimérico de longitud total ensamblado por PCR usando Oligo B-5 y Oligo 175, y se secuenciaron y analizaron los productos de PCR.
Se generaron transcritos de ARN genómico viral de longitud total a partir de plásmidos que contienen el ADNc de longitud total de BVDV-NADL o el ADN de BVDV-NADL/Ems quimérico usando kit mMessage mMachine T7 Ultra (Ambion; Austin, TX). La calidad y la cantidad de cada trascrito de ARN se determinó en un gel de ARN y en un espectrofotómetro de Nanodrop (Nanodrop; Wilmington, DE). Se transfectaron cultivos de toda una noche de células rD en pocillos de placas de 6 pocillos con ARN viral usando reactivo Lipofectina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras la transfección, las células se incubaron a 37oC durante 3 días. Los sobrenadantes
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se recogieron y almacenaron a -80oC.
Los ARN virales de sobrenadantes recogidos se extrajeron usando Kit de Aislamiento de ARN Viral MagMax™ AI/ND (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN se transcribieron inversamente y la región de cada quimera que codifica Npra a E1 se amplificó usando cebadores Oligo 177 y Oligo 175 (Tabla 1), y el Sistema RT-PCR ThermoScript™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos de RT-PCR se secuenciaron después.
Las monocapas de células de bien una transfección de ARN viral o bien una infección con virus se fijaron en acetona al 80%. Se usaron anticuerpos monoclonales específicos de BVDV o de BDV (Mab) en conjunción con el kit ABC Elite de IgG antirratón peroxidasa (Vector Laboratories; Burlingame, CA). El color se produjo usando sustrato de peroxidasa VIP (Vector Laboratories).
Las valoraciones de virus quiméricos se determinaron por un procedimiento de dilución limitante. Las muestras virales se diluyeron 10 veces en serie y se transfirieron a placas de 96 pocillos (100 pl por pocillo), con 4-6 replicados por dilución. Se añadieron después 100 pl de una suspensión de células BK-6 a cada pocillo y las placas se incubaron a 37oC durante 4-5 días. La infección viral se determinó tanto por efecto citopático (CPE) como por tinción con MAb. Las valoraciones de los virus se calcularon usando el procedimiento de Spearman-Karbe.
Para obtener los clones biológicos de cada quimera, las muestras de virus se diluyeron primero 100 veces y se continuó por serie de diluciones de 10 veces. Se transfirieron 100 pl de los virus diluidos a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, 4 replicados por dilución. Se añadieron después 100 pl de células BK-6 a cada pocillo y las placas se incubaron a 37oC durante 4 días. Los sobrenadantes se recogieron y transfirieron a nuevas placas y se almacenaron a -80oC. Las células se fijaron y se tiñeron. Los sobrenadantes de los pocillos que contenían focos de virus individuales se recogieron y se expandieron como reservas de virus.
Los estudios de cinéticas de crecimiento se llevaron a cabo en matraces T-25 que contienen células BK-6. Cuando las células alcanzaron aproximadamente confluencia al 90%, se infectaron con cada quimera a MOI de 0,02. Después de absorción durante 1 hora, el inóculo se retiró. Las células se lavaron 3x con PBS, y se añadieron 3 ml de medio de crecimiento recién preparado. Las muestras se recogieron después en diversos puntos temporales de 0 a 144 horas para determinaciones de valoraciones.
Para la prueba de neutralización de virus, se diluyeron reservas congeladas de tres quimeras de BVDV-NADL/Ems, BVDV-NADL parental y BVDV-CM5960 (BVDV de tipo I) en DMEM a aproximadamente 4.000 TCID50/ml. Se diluyeron dos veces en serie sueros de ganado vacuno inmunizado con Bovi-Shield Gold (Pfizer; Nueva York, NY), con valoraciones predeterminadas tanto contra BVDV de tipo I como contra BVDV de tipo II. Se mezclaron 50 pl de virus (200 TCID50) con un volumen igual de suero de ganado vacuno diluido en placas de cultivos de tejido de 96 pocillos (4 replicados/dilución) y se incubaron a 37oC durante 60 min. Se añadieron después 100 pl de células BK-6 a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37oC durante 3-6 días. El suero negativo para anticuerpos contra BVDV se incluyó también en cada placa como un control. Las valoraciones de neutralización de punto final de los sueros se determinaron tanto por CPE como por inmunohistoquímica (IHC) en el día 3 y en el día 6.
Resultados. Se construyeron ADN de BVDV-NADL/Ems quiméricos en los que el gen/la proteína NADL Ems se reemplazó por Ems de pestivirus de jirafa (G-Ems), de reno (R-Ems) o de antílope americano (P-Ems). Se secuenció ADN plasmídico que contenía cada una de las regiones Ems quiméricas para confirmar la autenticidad de secuencia. Se depositaron los siguientes pestivirus quiméricos con la American Type Culture Collection (ATCC®), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, EE.U.U. en el 2 de abril de 2009, y se confirmó que era viable por ATCC® en el 23 de abril de 2009: BVDV-NADL/G-Ems (PTA-9938), BVDV-NADL/P-Ems (PTA-9939), y BVDV-NADL/R-Ems (PTA-9940).
Los virus quiméricos BVDV-NADL/Ems se recuperaron de las células RD después de transfección con ARN viral transcrito in vitro. Se observó efecto citopático de consideración (CPE) en células RD 48-72 horas después de transfección con transcritos de ARN BVDV-NADL/G-Ems o BVDV-NADL/R-Ems. CPE no fue obvio con el virus BVDV- NADL/P-Ems, sin embargo. Se recogieron sobrenadantes de cultivo de cada pocillo, y las células que quedaron se fijaron y se tiñeron con anticuerpo MAb 20.10.6. específico de NS3 de BVDV. Las células infectadas con uno de los tres pestivirus quiméricos se incubaron con el MAb. Los ARN virales se extrajeron de los sobrenadantes recogidos, y se secuenciaron para confirmar los genes Ems de todas las tres quimeras.
Las tres quimeras BVDV-NADL/Ems se probaron por su reactividad para cada uno de los MAb de Ems específicos para BVDV o BDV. Los resultados se muestran en Tabla 2. La quimera BVDV-NADL/R-Ems se hizo reaccionar con todos los tres MAb de Ems de BVD, mientras que no se reconocieron ni BVDV-NADL/G-Ems, ni BVDV-NADL/P-Ems ni el virus parental BVDV-NADL por los MAb de Ems de BVD. Se hicieron reaccionar BVDV-NADL/G-Ems, BVDV- NADL/R-Ems, y virus parental nAdL con un MAb 15C5 de pan-BVDV Ems MAb 15C5. Los MAb específicos bien para Ems de BDV o bien para BVDV no reaccionaron con la quimera de BVDV-NADL/P-Ems.
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Tabla 2. Reactividad de quimeras BVDV-NADL/Erns frente a los MAb
MAb
Especificidad Reactividad de quimera
WS 371 WS 373 WS363
BDV Ems BDV Ems BDV Ems BVDV-NADL/G-E1 rns BVDV-NADL/R-Erns BVDV-NADL/P-Erns +++ - +++ - +++ - BVDV- NADL
(continuación)
MAb
Especificidad Reactividad de quimera
15C5 20.10.6
BVDV Ems Pestivirus NS3 BVDV-NADL/G-E' +++ +++ rns BVDV-NADL/R-Erns BVDV-NADL/P-Erns +++ - +++ ++ BVDV- NADL +++ +++
Con el fin de determinar si las proteínas Ems quiméricas en los virus tuvieron algún impacto en el reconocimiento de epitopes virales neutralizantes por anticuerpos de ganado vacuno vacunado contra BVDV, se llevó a cabo un ensayo de neutralización viral con las tres quimeras de BVDV-NADL/Ems, BVDV-NADL, y BVDV-CM5960 (BVDV de tipo I). Se utilizaron los sueros de 4 vacas con valoraciones de anticuerpos neutralizantes que variaban desde 0 hasta mayores de 40.000 (previamente determinadas contra BVDV-CM5960). Los resultados (Tabla 3) indican que las valoraciones frente a todas las tres quimeras fueron generalmente comparables a aquellas para BVDV-NADL parental y BVDV-CM5960. Las valoraciones de neutralización contra BVDV-NADL/P-Ems fueron ligeramente menores que aquellas contra las otras dos quimeras, BVDV-NADL y BVDV-CM5960.
Tabla 3. Valoraciones de neutralización de antisueros bovinos contra quimeras de BVDV-NADL/Erns
Ganado vacuno
Valoraciones de neutralización
N.° de Sueros CM5960
BVDV-NADL/G-Ems BVDV-NADL/R-Ems BVDV-NADL/P-Ems BVDV-NADL
816
< 10 < 10 < 10 < 10
< 10
77
320 320 320 160 320
1281
6400 12800 3200 3200
256000
1434
51200 25600 6400 25600
51200
Las tres quimeras BVDV-NADL/Ems se clonaron biológicamente dos veces por dilución limitante. Se obtuvieron tres clones de BVDV-NADL/G-Ems, cuatro de BVDV-NADL/R-Ems, y tres de BVDV-NADL/P-Ems. Estos clones se expandieron cada uno entre 1-3 veces. Los resultados de valoración indicaron que el clon 1 de BVDV-NADL/G-Ems expandido, los clones 3 y 5 de BVDV-NADL/R-Ems, y el clon 2 de BVDV-NADL/P-Ems 2 produjeron las valoraciones más altas.
Los estudios de cinéticas del crecimiento se llevaron a cabo con clon 1 de BVDV-NADL/G-Ems, clon 3 de BVDV- NADL/R-Ems, clon 2 de BVDV-NADL/P-Ems, y BVDV-NADL/P-Ems no clonado. Las curvas de crecimiento generadas a partir de estos clones se compararon con el BVDV-NADL parental. Las quimeras BVDV-NADL/G-Ems y BVDV- NADL/R-Ems tuvieron cinéticas de crecimiento similares al BVDV-NADL parental, mientras que BVDV-NADL/P-Ems crecieron más lentamente y tuvieron valoraciones menores en cada punto temporal que el virus parental y las otras dos quimeras.
Se crearon tres virus quiméricos BVDV-NADL/Ems, en los que el gen/la proteína NADL Ems se reemplazó por Ems de un pestivirus de jirafa, de reno o de antílope americano. Todas las tres quimeras fueron viables e infecciosas tanto en células RD como en células BK-6. Los datos in vitro demostraron que las proteínas Ems quiméricas no afectaron la neutralización de las quimeras por antisueros de ganado vacuno vacunado contra BVDV. Esto sugiere que los epitopes neutralizantes en los virus quiméricos, sin importar donde estén localizados, no estaban afectados por las sustituciones de Ems.
Los virus quiméricos tuvieron cinéticas de crecimiento diferentes y reaccionaron de forma diferente a anticuerpos monoclonales de Ems de BVDV o de BDV. BVDV-NADL/G-Ems y BVDV-NADL/R-Ems tuvieron cinéticas de crecimientos similares al virus parental, mientras que BVDV-NADL/P-Ems creció lentamente y a una valoración más
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baja que el virus parental. Tanto BVDV-NADL/G-Ems como BVDV-NADL/R-Ems reaccionaron frente a anticuerpo monoclonal 15C5 de BVDV Erns, mientras que BVDV-NADL/P-Ems no lo hizo. Los resultados de comparación de secuencias mostraron que G-Ems y R-Ems tuvieron similaridades de secuencia más altas a BVDV NADL (el 75,8% y el 76,2%, respectivamente) que P-Ems (el 59%). Estos datos, tomados conjuntamente con los resultados de reactividad de MAb, sugieren que G-Ems y R-Ems pueden ser antigénicamente más similares al Ems parental que al
p-Erns
Ejemplo 2. Construcción y Caracterización Serológica y Realización de Pruebas de Eficacia de Candidatos a Vacunas de Pestivirus Quiméricos
Se obtuvieron la cepa de BVDV de tipo 1 CM5960 y la cepa de BVDV de tipo 2 CM53637 de Pfizer Global Manufacturing. Los ARN virales se extrajeron usando Kit de Aislamiento de ARN Viral MagMax™ AI/ND (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN se transcribieron de forma reversa generando ADNc usando Sistema de RT-PCR ThermoScript™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se generaron pestivirus quiméricos reemplazando el gen Ems de CM5960 y de CM53637 con el gen Ems de pestivirus de antílope americano (P-Ems) usando un procedimiento de PCR solapante. Los cebadores oligonucleotídicos usados para las PCR se enumeran en la Tabla 1.
Para construcción de ADN de CM5960/P-Ems quimérico, se amplificó un fragmento de ADNc de CM5960 entre el 5'UTR y el extremo 3' del gen C por PCR a partir de ADNc de cM5960 con cebadores Oligo B-5 y Oligo 135. El gen P-Ems se amplificó por PCR a partir del ADN plasmídico que contiene el gen P-Ems con Oligo 136 y Oligo 137. Se amplificó un tercer fragmento entre el comienzo de E1 y el extremo 3' de E2 por PCR a partir de ADNc de CM5960 con cebadores Oligo 138 y Oligo 237.
Los fragmentos anteriormente descritos se purificaron de gel usando un Kit de Extracción de Gel QIAquick (Qiagen), y se ensamblaron por PCR creando un fragmento con Oligo B-5 y Oligo 237. Se amplificó un fragmento entre la región E1 y la región NS5B por PCR a partir de los ADNc de cM5960 con cebadores Oligo P7 y Oligo P8. Se amplificó otro fragmento entre la región NS5A y el extremo de 3'UTR por PCR a partir de los ADNc de CM5960 con cebadores Oligo P3 y Oligo 84. Estos tres fragmentos se purificaron en gel después, y se ensamblaron por PCR con Oligo B-5 y Oligo 84 creando un genoma de CM5960L/P-Erns quimérico de longitud total.
Para construcción de ADN de CM53637/P-Erns quimérico, se amplificó un fragmento de ADNc de CM53637 entre el 5'UTR y el extremo 3' del gen C por PCR a partir de ADNc de cM53637 con cebadores Oligo 296-1 y Oligo 297. Se amplificó un segundo fragmento entre el comienzo de E1 y el extremo 3' de E2 por PCR a partir de ADNc de CM53637 con cebadores Oligo 298 y Oligo 303. Estos dos fragmentos se purificaron en gel, y se ensamblaron conjuntamente con un fragmento que codifica para el gen P-Erns (véase anteriormente), por PCR creando un fragmento usando Oligo 296-1 y Oligo 303.
Se amplificó después un fragmento entre la región E1 y la región NS3 por PCR a partir de ADNc de CM53637 con cebadores Oligo 298 y Oligo 299. Se amplificó además otro fragmento entre la región NS3 y el extremo de 3'UTR por PCR a partir de ADNc de CM53637 con cebadores Oligo 300 y Oligo 92-1. Estos dos fragmentos y el anterior se purificaron en gel, y se ensamblaron por PCR con Oligo 296-1 y Oligo 92-1 creando un genoma de CM53637/P-Ems quimérico de longitud total.
Se generaron transcritos de ARN genómico viral de longitud total a partir de los ADN de CM5960/P-Ems quimérico y de CM53637/P-Ems quimérico usando kit de mMessage mMachine T7 Ultra (Ambion). La calidad y la cantidad de cada transcrito de ARN se determinó en un gel de ARN. Se transfectaron cultivos de toda una noche de células RD en pocillos de placas de 6 pocillos con ARN viral usando reactivo Lipofectina (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras la transfección, las células se incubaron a 37oC durante 3 días. Las células más los sobrenadantes se hicieron pasar una a varias veces en células RD y/o BK-6. Los sobrenadantes se hicieron pasar en serie en células BK-6. Los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -80oC.
Para confirmar la identidad del virus recombinante recuperado, los ARN virales de sobrenadantes recogidos se extrajeron usando Kit de Aislamiento de ARN Viral MagMax™ AI/ND (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los ARN se transcribieron de forma reversa usando Sistema de RT-PCR ThermoScript™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se amplificó la región de cada quimera entre 5' UTR y E2 o p7 por PCR usando cebadores Oligo B-5 y Oligo 237 (para quimera CM5960/P-Ems) u Oligo 296-1 y Oligo 321 (para quimera CM53637/P-Ems) (Tabla 1). Los productos de RT-PCR se secuenciaron después.
Las monocapas de células de bien una transfección de ARN viral o bien una infección con virus se fijaron en acetona al 80%. Se usaron MAb específicos para BVDV en conjunción con el kit ABC Elite de IgG antirratón peroxidasa (Vector Laboratories) para inmunohistoquímica. El color se produjo usando sustrato de peroxidasa VIP (Vector Laboratories).
Resultados. Se construyeron y recuperaron virus CM5960/P-Ems y CM53637/P-Ems quiméricos. Se confirmaron mediante secuenciación las regiones 5'UTR a E2, incluyendo las regiones de Ems de antílope americano quiméricas. Ambas quimeras fueron viables e infecciosas tanto en células RD como en células BK-6. Ambas quimeras fueron no reactivas para MAb 15C5 específico de Ems de BVDV, pero fueron reactivas para MAb 20.10.6 específico de NS3 de
BVDV en tinción inmunohistoquímica.
La secuencia para el pestivirus quimérico (BVDV-CM5960 (BVDV de tipo I)/P-Ems) se presenta en el listado de secuencias como SEQ ID N.°: 31. La secuencia para el pestivirus quimérico (BVDV-CM53637 (BVDV de tipo II)/P- Ems) se presenta en el listado de secuencias como SEQ ID NO: 32.
5 La quimera CM5960/P-Ems se clonó biológicamente por dilución limitada (véase anteriormente ejemplo 1 para metodología).
Ejemplo 3. Realización de Pruebas de Eficacia de Candidatas a Vacuna de Pestivirus Quimérico en un Modelo de Enfermedad Respiratoria de Ternero
Se obtienen partos saludables negativos en BVDV, se asignan al azar a grupos de estudio, y se mantienen bajo 10 supervisión de un veterinario al cargo. La vacuna de prueba se combina con un coadyuvante estéril y se administra bien por inoculación intramuscular (IM) o bien por inyección subcutánea (SC), o bien por inoculación intranasal (IN). La vacuna se da bien como una o bien como dos dosis. Se administran dos dosis de la vacuna, separadas 21 a 28 días. Los animales se ponen a prueba subsiguientemente a 21 a 28 días tras la vacunación final con una cepa de Tipo 1 o de Tipo 2 de BVDV. Los inóculos de prueba se dan intranasalmente en una dosis dividida de 4 ml, 2 ml por 15 narina. Se mantienen también durante todo el estudio grupos control constituidos por animales no vacunados, no puestos a prueba y/o animales no vacunados, puestos a prueba.
Se someten a seguimiento los parámetros clínicos diariamente, incluyendo temperatura rectal, depresión, anorexia, y diarrea. Las valoraciones de neutralización sérica se determinan por un ensayo de virus constante, suero decreciente en cultivos de células bovinas, usando diluciones seriadas de sueros combinadas con una cepa de 20 BVDV de tipo 1 o de tipo 2. Se intenta aislamiento tras la prueba de BVDV en cultivo de células bovinas a partir de sangre periférica. Un cultivo celular positivo en BVDV se determina por inmunofluorescencia indirecta. Para demostrar protección tras la prueba, se demuestra una reducción en la incidencia de infección en grupos vacunados frente a los grupos control.
Ejemplo 4. Pruebas de Eficacia de la Vacuna de Pestivirus Quimérico en un Modelo de Vaca Preñada-Ternero
25 Se obtienen vacas y vaquillas en edad de crecimiento negativas en BVDV y se asignan al azar a un grupo de prueba de vacunación o a un grupo de placebo (control). Las vacas se inoculan dos veces por inyección intramuscular (IM) o subcutánea (SC), bien con vacuna o bien con placebo, separadas 21 a 28 días. Tras la segunda vacunación, todas las vacas reciben una inyección de prostaglandinas IM sincronizando el estro. Las vacas que presentan estro se fecundaron mediante inseminación artificial con semen negativo en BVDV certificado. A aproximadamente 60 días 30 de la gestación, el estado de preñez de las vacas se determina por palpación rectal.
Aproximadamente 6 semanas más tarde, las vacas con embarazos confirmados se seleccionan al azar de cada grupo de prueba. Cada una de estas vacas se pone a prueba por inoculación intranasal de BVDV de tipo 1 ó 2. Las muestras de sangre se recogen en el día de la prueba y a múltiples intervalos posteriores a la prueba para propósitos de aislamiento de BVDV.
35 Veintiocho días tras la prueba, se llevan a cabo laparotomías del flanco izquierdo y se extrae fluido amniótico de cada vaca. Inmediatamente antes de la cirugía, se recoge una muestra de sangre de cada vaca para ensayos de neutralización de suero. Tras alumbramiento por cesárea, se recoge una muestra de sangre de cada feto. Los fetos se someten después a eutanasia, y los tejidos se recogen asépticamente para propósitos de aislamiento de BVDV. En casos donde tienen lugar abortos espontáneos, las muestras de sangre se toman de la madre cuando se detecta 40 aborto y dos semanas después. Las muestras de sangre emparejadas y los fetos abortados se someten a realización de pruebas serológicas y a aislamiento vírico. La eficacia de la vacuna está demostrada por una carencia o disminución de infección fetal y por aborto tardío.
Ejemplo 5. Ensayos Diagnósticos para Diferenciación entre Ganado Vacuno Vacunado y Ganado Vacuno Infectado de forma Natural
45 El ganado vacuno vacunado con una vacuna de la presente invención puede compararse con ganado vacuno infectado de forma natural con un BVDV de tipo silvestre. Se vacuna ganado vacuno de diversas edades bien con una vacuna de pestivirus quimérico vivo o bien con una vacuna de pestivirus quimérico inactivado de acuerdo con las instrucciones proporcionadas. Se recogen muestras de suero 2-3 semanas o más tarde tras vacunación. Para diferenciar entre el ganado vacuno que recibió la vacuna de pestivirus quimérica frente a aquellos infectados por una 50 cepa de campo (tipo silvestre) de BVDV, se prueban las muestras de suero por medio de un ensayo de diagnóstico diferencial. El pestivirus quimérico provoca la producción de anticuerpos específicos que se unen a la proteína Ems del pestivirus quimérico, pero no a la proteína Ems presente en BVDV de tipo silvestre. En el contexto de BVDV de tipo silvestre, lo contrario es cierto. Se generan anticuerpos específicos que reconocen la proteína Ems presente en BVDV de tipo silvestre, pero no la proteína Ems presente en el pestivirus quimérico. Se conocen bien en la técnica los 55 procedimientos de realización de un ensayo para especificidad y afinidad de unión de anticuerpos, e incluyen pero no se limitan a formatos de inmunoensayo tales como ELISA competitivo, ELISA de péptidos directos, pruebas de bandas de Western, ensayos de inmunofluorescencia indirecta, y similares.
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Para un ELISA competitivo, se usan antígenos virales de pestivirus de tipo silvestre o quiméricos completos o parciales, incluyendo la proteína Ems (derivada de forma natural, sintéticamente o recombinantemente), como una fuente de antígenos. Tras revestimiento de la placa de ELISA con antígeno en condiciones básicas, se añaden las muestras y diluciones de suero de ganado vacuno conjuntamente con una dilución optimizada de un MAb específico bien para proteína Ems del BVDV de tipo silvestre o bien para la proteína Ems del pestivirus quimérico, y se incuban durante 30 -90 min. Bien la peroxidasa de rábano picante o bien la fosfatasa alcalina está conjugada al MAb para permitir la detección colorimétrica de la unión. Tras el lavado de las placas, se añade un sustrato cromogénico específico de enzima, y después de una etapa e incubación final, la densidad óptica de cada pocillo se mide a una longitud de onda apropiada para el sustrato usado. El grado de inhibición de unión del mAb marcado es dependiente del nivel de anticuerpos en el suero de ganado vacuno que reconoce específicamente la proteína que reviste la placa.
En el caso de que la proteína Ems quimérica (por ejemplo Ems de antílope americano) presente en el pestivirus quimérico sea el antígeno de prueba, una falta de unión por el mAb específico de Ems del pestivirus quimérico indica la presencia de anticuerpos en el suero de ganado vacuno que reconocen el pestivirus quimérico -epitope específico, indicativo de vacunación. En contraste, el suero de ganado vacuno no inmunizado, pero infectado de forma natural, no contendrá anticuerpos que se unan a la proteína Ems de pestivirus quimérico que recubre la placa. Por lo tanto, el mAb específico de Ems de pestivirus quimérico se unirá a la proteína unida, y dará como resultado formación de color subsiguiente.
En el caso de que la proteína Ems presente en el BVDV de tipo silvestre sea el antígeno de prueba, una falta de unión por el mAb específico de Ems de BVDV de tipo silvestre indica la presencia de anticuerpos en el suero de ganado vacuno que reconocen el epitope específico de BVDV de tipo silvestre, indicador de una infección natural (tipo silvestre). En contraste, el suero de ganado vacuno inmunizado con la vacuna de pestivirus quimérico no contendrá anticuerpos que se unan a la proteína Ems de BVDV de tipo silvestre que recubre la placa. Por lo tanto, el mAb específico de Ems de BVDV de tipo silvestre se unirá a la proteína unida, y dará como resultado formación de color subsiguiente.
Para el funcionamiento de un ensayo tal, se llevaron a cabo los siguientes procedimientos.
Primero, se construyó un baculovirus recombinante que expresa BVDV-NADL Ems. Se amplificaron una parte de la proteína C de BVDV, más el gen Erns de longitud total, por PCR a partir de un plásmido que contiene ADNc de BVDV-NADL de longitud total con cebadores Oligo 250 (SEQ ID N.°: 29;
5'-CACCATGAAAATAGTGCCCAAAGAATC-3') y Oligo 252 (SEQ ID N.°: 30;
5'-TTAAGCGTATGCTCCAAACCACGTC-3'). El producto de PCR se clonó en pENTR™ /D-TOPO (Invitrogen) y se transformó en E. coli Competente One Shot® (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se extrajo el plásmido recombinante y el inserto se confirmó por secuenciación. Este plásmido se designó pENTR-Erns. Se usaron pENTR-Erns y Sistema de Expresión de Baculovirus BaculoDirect™ (Invitrogen) construyendo el baculovirus recombinante que expresa BVDV-NADL Erns de acuerdo con las instrucciones de fabricante. Se generó el baculovirus recombinante que expresa BVDV-NADL Erns, se purificó en placa, se expandió, y se almacenó tanto a 4oC como a -80oC. La expresión de BVDV-NADL Erns en el baculovirus recombinante se confirmó por tinción inmunofluorescente y por prueba de bandas de Western frente a MAb 15C5 específico de Erns de BVDV tras procedimientos de prueba de bandas de Western convencionales.
Para la producción del antígeno de ELISA, las células SF21 en cultivo de suspensión de 100 ml se infectaron con 0,5 ml de la reserva de baculovirus recombinantes. Las células se recogieron después de incubación de 4 días a 27oC. Las células se centrifugaron a velocidad lenta (aproximadamente 800 g) durante 10 min para recoger las células y para lavarlas una vez con PBS. Las células se lisaron con NaCl 150 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0, e IGEPAL CA-630 al 1%. La mezcla se incubó primero en hielo durante 10 minutos y después a -80oC durante 1 hora. Después de descongelar, la mezcla se aclaró por centrifugación a 1000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se aclaró adicionalmente por centrífuga a 8000 g durante 20 minutos a 4oC. El sobrenadante final, designado lisado Baculo- Erns, se alicuotó y se almacenó a -80oC.
Llevando a cabo el ensayo, las placas de ELISA se recubrieron durante toda una noche a 4oC con 100 pl/pocillo de MAb WB210 (Veterinary Laboratory Agency; específico de Erns de BVDV de tipo 1), diluido 1:1000 en tampón carbonato/bicarbonato (pH 9,0). El día siguiente, las palcas se lavaron tres veces y se bloquearon con tampón de bloqueo (PBS que contiene sal sódica de caseína al 1% y Tween 20 al 0,05%) a 37oC durante 1 hora. Las placas se lavaron subsiguientemente tres veces con tampón de bloqueo, y se añadieron 100 pl de lisado de Baculo-Erns (diluido 1:3200 en PBS) a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37oC durante 1 hora. Tras tres lavados con tampón de bloqueo, se añadieron 100 pl de muestras de sueros de ganado vacuno no diluidas a los pocillos, salvo para una columna de pocillos (para servir como controles de 15C5-HRP no competitivos), y se incubaron a 37oC durante 1 hora. Tras tres lavados más con tampón de bloqueo, se añadieron a cada pocillo 100 pl de conjugado MAb 15C5-HRP (específico de Erns de BVDV, diluido 1:20.000 en tampón de bloqueo), y se incubaron a 37oC durante 1 hora. Tras tres lavados con tampón de bloqueo, se añadieron a cada pocillo 100 pl de sustrato ABTS (soluciones de sustrato de Peroxidasa A + B; KPL, EE.U.U.), y se incubaron a temperatura ambiente durante 20-60 minutos para formación de color. La densidad óptica (D.O.) se midió a la longitud de onda de 405 nm. El porcentaje de reducción de D.O. para cada muestra de suero se calcula por la siguiente fórmula:
[ 1 - (D.O. de Muestra D.O. Promedio de Controles de 15C5-HRP) ] x 100%.
Resultados:
Todas las muestras de suero que dieron resultados positivos para la prueba de neutralización de virus (VN) tuvieron reducción de D.O. por encima del 82% , salvo la muestra de N.° de ID 13851 (Tabla 4). Todas las muestras de suero 5 que dieron resultados negativos por la prueba de neutralización de virus tuvieron reducción de D.O. de menos del 17% , salvo la muestra de N.° de ID 5150 (Tabla 4). La discrepancia puede explicarse por las diferencias en como se han llevado a cabo los ensayos, ya que están midiendo anticuerpos diferentes y la proporción de anticuerpos específicos varía entre animales.
Tabla 4. Muestras de suero positivas y negativas en BVDV en un ELISA competitivo de MAb15C5.
Número de Fila
ID de la Muestra D.O. de la Muestra D.O. Promedio de Columna Sin Suero % de Reducción
1
40021 0,0615 0,907013 93,21950182
2
40014 0,0965 0,907013 89,36068171
3
40422 0,0639 0,907013 92,95489701
4
40372 0,0754 0,907013 91,68699897
5
40222 0,0634 0,907013 93,01002301
6
40152 0,0894 0,907013 90,14347093
7
13461 0,0663 0,907013 92,6902922
8
13851 0,641 0,907013 29,32846607
9
13801 0,1599 0,907013 82,37070472
10
13904 0,073 0,907013 91,95160378
11
40504 0,0625 0,907013 93,10924981
12
40471 0,0914 0,907013 89,92296693
13
35037 0,0639 0,907013 92,95489701
14
13690 0,159 0,907013 82,46993152
15
13797 0,0859 0,907013 90,52935294
16
6127 0,0886 0,907013 90,23167253
17
5138 0,7434 0,907013 18,03866097
18
5139 0,8423 0,907013 7,13473787
19
5141 0,7732 0,907013 14,75315128
20
5142 0,7475 0,907013 17,58662776
21
5144 0,8293 0,907013 8,568013909
22
5145 0,9488 0,907013 -4,607100449
23
5146 0,9451 0,907013 -4,199168038
24
5147 1,0138 0,907013 -11,77348064
25
5148 0,9322 0,907013 -2,7769172
26
5149 0,9794 0,907013 -7,980811741
27
5150 0,1157 0,907013 87,24384325
Filas 1-16: Muestras de suero de ganado vacuno positivas Filas 17-27: Muestras de suero de ganado vacuno negativas - Todas las muestras de suero se usan sin diluir en el ELISA
10
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Luo, Yugang Welch, Siao-Kun Wan 15 Yuan, Ying
Ankenbauer, Robert Gerard
<120> PESTIVIRUS QUIMÉRICOS
20 <130> PC33857A
<150> US 61/119.594 <151>
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<150> US 61/173.363 <151>
<160> 32
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211> 43 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> T7 + NADL <220>
<221> misc_feature <223> Oligo B-5
<400> 1
gtgttaatac gactcactat agtatacgag aattagaaaa ggc 43
<210> 2 <211> 21 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> NADL
<220>
<221> gen <222> (1)..(21)
<223> Oligo 84
<400>2
gggggctgtt agaggtcttc c 21
<210> 3 <211> 47 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> G-Erns+NADL <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 127
<400>3
aattccactg ggtgatgttc tctcccattg taacttgaaa caaaact 47
<210> 4 <211> 20 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> G-Erns
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<221> gen <222> (1)..(20)
<223> Oligo 128
<400>4
gagaacatca cccagtggaa 20
<210>5 <211> 21 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> G-Erns
<220>
<221> gen <222> (1)..(21)
<223> Oligo 129
<400>5
tgcgtgggct ccaaaccatg t 21
<210> 6 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> G-Erns+NADL <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 130
<400>6
aacatggttt ggagcccacg cagcttcccc ttactgtgat gtcg 44
<210>7 <211> 47 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> R-Erns+NADL <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 131
<400>7
ggttccactg tgttatattc tctcccattg taacttgaaa caaaact 47
<210> 8 <211> 22 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> G-Erns
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<222> (1)..(22)
<223> Oligo 132
<400>8
gagaatataa cacagtggaa cc 22
<210>9 <211> 22 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> G-Erns
<220>
<221> gen <222> (1)..(22)
<223> Oligo 133
<400>9
tgcattagct ccgaaccacg tt 22
<210> 10 <211> 44 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> G-Erns+NADL <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 134
<400> 10
aacgtggttc ggagctaatg cagcttcccc ttactgtgat gtcg 44
<210> 11 <211> 42 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> P-Erns+NADL <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 135
<400> 11
ggttccactg agttatattc actcccattg taacttgaaa ca 42
<210> 12 <211> 22 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> P-Erns
<220>
<221> gen <222> (1)..(22)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<223> Oligo 136 <400> 12
gtgaatataa ctcagtggaa cc 22
<210> 13 <211> 21 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> P-Erns
<220>
<221> gen <222> (1)..(21)
<223> Oligo 137
<400> 13
tg cctg tg cc cea a a ccat g t 21
<210> 14 <211> 44 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> P-Erns+NADL <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 138
<400> 14
aacatggtttggggcacaggcagcttccccttactgtgatgtcg 44
<210> 15 <211> 23 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> NADL
<220>
<221> gen <222> (1)..(23)
<223> Oligo 175
<400> 15
gttatcaata gtagccacag aat 23
<210> 16 <211> 22 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> NADL
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<222> (1)..(22)
<223> Oligo 177
<400> 16
tccaccctca atcgacgcta aa 22
<210> 17 <211> 22 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> CM5960
<220>
<221> gen <222> (1)..(22)
<223> Oligo 237
<400> 17
ccctgaggcc ttctgttctg at 22
<210> 18 <211> 23 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> CM5960
<220>
<221> gen <222> (1)..(23)
<223> Oligo P7
<400> 18
cacttgtcggaggtactactact 23
<210> 19 <211> 24 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> CM5960
<220>
<221> gen <222> (1)..(24)
<223> Oligo P8
<400> 19
cttgtctatc ttatctctta ttgc 24
<210> 20 <211> 22 <212>ADN <213> Pestivirus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<223> CM5960
<220>
<221> gen <222> (1)..(22)
<223> Oligo P3
<400> 20
actatctgaa cagttggaca gg 22
<210> 21 <211> 41 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> T7+CM53637 <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 296-1
<400> 21
gtgttaatac gactcactat agtatacgag attagctaaa g 41
<210> 22 <211> 48 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> P-Erns+CM53637 <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 297
<400> 22
ccaggttcca ctgagttata ttcactcctg ttaccagctg aagcagaa 48
<210> 23 <211> 43 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> P-Erns+CM53637 <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 298
<400> 23
aacatggttt ggggcacagg cagcaagtcc atactgtaaa gtg 43
<210> 24 <211> 27 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> CM53637
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
<220>
<221> gen <222> (1)..(27)
<223> Oligo 299
<400> 24
ttaatgccct ccctgtctct accacct 27
<210> 25 <211> 25 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> CM53637
<220>
<221> gen <222> (1)..(25)
<223> Oligo 300
<400> 25
aggatgagga tctagcagtg gatct 25
<210> 26 <211> 24 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> CM53637
<220>
<221> gen <222> (1)..(24)
<223> Oligo 303
<400> 26
ccatagccat ctgctcagac agta 24
<210> 27 <211> 26 <212>ADN <213> Pestivirus
<220>
<221> misc_feature <223> CM53637
<220>
<221> gen <222> (1)..(26)
<223> oligo 92-1
<400> 27
ggggctgtca gaggcatcct ctagtc 26
<210> 28 <211> 24 <212>ADN <213> Pestivirus
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220>
<221> misc_feature <223> CM53637
<220>
<221> gen <222> (1)..(24)
<223> oligo 321
<400> 28
agccactaca cctgtcacga gaag 24
<210> 29 <211> 27 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> NADL <220>
<221> misc_feature <223> Oligo 250
<400> 29
caccatgaaa atagtgccca aagaatc 27
<210> 30 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> NADL <220>
<221> misc_feature <223> oligo 252
<400> 30
ttaagcgtat gctccaaacc acgtc 25
<210> 31 <211> 12307 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Virus quimérico Erns <220>
<221> misc_feature <223> BVDV Tipo 1
<400> 31

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un virus de la diarrea viral bovina (BVDV) quimérico adecuado para su uso en una vacuna contra el BVDV y que permite la diferenciación entre el ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y el ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre, en el que el gen Erns de longitud completa se reemplaza por el gen Erns de longitud completa del pestivirus del antílope americano (P-Erns) de tal manera que el BVDV quimérico expresa la proteína Erns del pestivirus del antílope americano y no expresa la proteína Erns de BVDV.
  2. 2. El BVDV quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que consiste en la cepa CM5960/P-Ems generada reemplazando el gen Erns de la cepa CM5690 de BVDV por el gen Erns del pestivirus del antílope americano (P-
    Erns).
  3. 3. El BVDV quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que consiste en la cepa CM53637/P-Ems generada reemplazando el gen Erns de la cepa CM53637 de BVDV por el gen Erns del pestivirus del antílope americano (P-
    Erns).
  4. 4. El BVDV quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 que consiste en la cepa depositada como ATCC PTA-9939 con ATCCr.
  5. 5. Una célula hospedadora que comprende el virus quimérico de la reivindicación 1, siendo dicha célula adecuada para la replicación de dicho virus.
  6. 6. Una molécula polinucleotídica que codifica para el BVDV quimérico de la reivindicación 1.
  7. 7. Una composición inmunogénica para su uso en la prevención o el tratamiento de infecciones provocadas por el BVDV, que comprende el BVDV quimérico de la reivindicación 1 y un vehículo veterinariamente aceptable.
  8. 8. Una composición inmunogénica para su uso en la prevención o el tratamiento de infecciones provocadas por el BVDV, que comprende la molécula polinucleotídica de la reivindicación 6 y un vehículo veterinariamente aceptable.
  9. 9. Una vacuna que comprende el BVDV quimérico de la reivindicación 1 y un vehículo veterinariamente aceptable adecuado para la diferenciación entre el ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y el ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre.
  10. 10. Un kit que comprende, en al menos un envase, la vacuna de la reivindicación 9 y un conjunto de instrucciones impresas para diferenciar entre el ganado vacuno vacunado con dicho virus quimérico y el ganado vacuno infectado con un BVDV de tipo silvestre.
  11. 11. La vacuna de la reivindicación 9 para su uso en el tratamiento o la prevención de la infección por el virus de la diarrea bovina.
  12. 12. Un procedimiento de diferenciación entre un animal vacunado con la vacuna de la reivindicación 9 y un animal infectado con el virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre, en el que el animal vacunado con dicha vacuna genera anticuerpos para al menos un epítopo de la proteína Erns del pestivirus del antílope americano (P-Erns), comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
    (a) ensayar muestras séricas obtenidas de dichos animales para la presencia o ausencia de los anticuerpos contra P-Erns;
    (b) identificar al animal que tiene dichos anticuerpos como que ha sido vacunado con dicha vacuna; y
    (c) identificar al animal que carece de dichos anticuerpos como que se ha infectado con el BVDV de tipo silvestre.
  13. 13. Un procedimiento de diferenciación entre un animal infectado con virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre y un animal vacunado con la vacuna de la reivindicación 9, en el que el animal infectado con virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre genera anticuerpos para al menos un epítopo de Ems del virus de la diarrea viral bovina de tipo silvestre, pero que no está presente en el pestivirus quimérico de dicha vacuna, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
    (a) ensayar muestras séricas obtenidas de dichos animales para la presencia o ausencia de los anticuerpos contra Ems de tipo silvestre;
    (b) identificar al animal que tiene dichos anticuerpos como que se ha infectado con el BVDV de tipo silvestre; y
    (c) identificar al animal que carece de dichos anticuerpos como que ha sido vacunado con dicha vacuna.
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