CN108430504A - 瘟病毒标记疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包含嵌合Erns基因的突变瘟病毒，其提供具有逃避血清学检测的能力的突变瘟病毒，但保持良好的疫苗特性和病毒复制。

Description

瘟病毒标记疫苗

本发明涉及兽医病毒学和疫苗学的领域。更具体地，本发明涉及具有突变Erns基因的突变瘟病毒，该突变瘟病毒的疫苗和医学用途，突变瘟病毒和疫苗的制备方法，以及使用突变瘟病毒或其突变Erns基因的诊断方法。

黄病毒科的瘟病毒属含有许多与农业产业大大经济相关的动物致病性病毒。瘟病毒在全世界发生，并且可以感染在偶蹄目内不同种的动物。主要病毒成员是感染反刍动物和猪的牛病毒性腹泻病毒型(BVDV)，感染猪的经典猪瘟病毒(CSFV)和感染反刍动物和猪的边界病病毒。不同瘟病毒之间存在可变程度的血清学交叉反应，这在其血清诊断方面引起很大困难。

瘟病毒病毒粒子有包膜并包含具有约12kb的单链、线性、正义RNA基因组的核衣壳。该基因组编码4个结构蛋白和8个非结构蛋白，并被翻译成约3900个氨基酸的一个大多蛋白，其然后被病毒蛋白酶和宿主蛋白酶切割。瘟病毒特征的广泛综述在Fields Virology(第4版 2001, Lippincott Williams & Wilkins, ISBN-10: 0781718325)中关于黄病毒的章节中给出。瘟病毒分子生物学综述于Tautz等人 (2015, Adv. in Virus Res., Vol.93, 章节2, p. 47- 160)中。

瘟病毒糖蛋白的特征的综述在Wang等人(2015, Viruses, vol. 7, p. 3506-3529)中给出。免疫显性蛋白是包膜糖蛋白Erns和E2，以及非结构蛋白NS3；这些中，E2诱导病毒中和抗体。Erns包膜糖蛋白对瘟病毒属的病毒是独特的，并且具有许多功能：在其N端和C端，存在切割信号用于从多蛋白释放它。Erns蛋白的中心区域与RNA酶活性相关，所述RNA酶活性可干扰双链RNA，并且以该方式影响被感染的宿主细胞的干扰素应答。Erns蛋白的C端侧具有膜缔合信号。目前已知的Erns基因长度在666和681个核苷酸之间，编码222和227个氨基酸之间的Erns蛋白。在文献中，Erns蛋白也被称为E0(E零)、gp48或gp44-48。

在瘟病毒属内，存在血清学和遗传上密切相关的核心病毒组。该核心组由四种官方病毒种组成：BVDV-1、BVDV-2、CSFV和边界病病毒。关于基于Erns蛋白的相关性，一些非官方种也落入该组：来自驯鹿和长颈鹿的分离株，以及HoBi瘟病毒(也称为HoBi样，或BVDV-3)。参见：Hause等人 (2015, J. of Gen. Virol., vol. 96, p. 2994-2998)，其呈现目前已知的瘟病毒'种'的相关性的概述；Erns蛋白的相关性在该参考文献的第2997页的图1，小图C中呈现。

几种分离株或(部分)基因组已知为血清学和/或遗传上与该核心组关系更远的瘟病毒的，并且更加继续待发现。为了增加相对于基于Erns蛋白的核心组的距离，这些是：羚羊瘟病毒(也称为：叉角羚)；Bungowannah病毒；挪威大鼠瘟病毒(NRPV)；且最远的是非典型猪瘟病毒(APPV)和中菊头蝠瘟病毒(RaPV)。

Bungowannah瘟病毒于2003年在澳大利亚被鉴定为猪的心肌炎、死胎和死亡的原因。Bungowannah病毒的表征在Kirkland等人(2015, Vet. Microbial., vol. 178, p.252-259)中给出。Bungowannah病毒也是WO 2007/121.522的主题。

挪威大鼠瘟病毒由Firth等人(2014, Mbio, vol. 5, e01933-14)描述；APPV在Hause等人, 2015 (同上)中描述；且RaPV由Wu等人(2012, J. of Virology, vol. 86, p.10999-11012)描述。

CSFV引起经典猪瘟或猪霍乱，这是严重的出血性疾病，其对猪动物来说通常是致命的。该严重的临床疾病引起大量动物患病，和依赖于商业猪养殖及其产品的部门的巨大经济损失。CSFV的垂直传播通过胎儿的胎盘感染是可能的。此外，猪可变成慢性感染，引起病毒的持续水平传播。

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是牛中最普遍的病毒病之一的病原体。该病毒在全世界大多数牛群中流行，并引起各种症状，其中生殖和呼吸疾病最突出。

BVDV在具有不同的基因型和生物型方面是生物多样的。基因型：BVDV-1和-2现在被认为是分开的种，并且在结构糖蛋白E1和E2中具有遗传差异。在两个种BVDV-1和-2内，已经描述了高毒力或低毒力的毒株。已经发展了几种亚基因型并且在野外被发现，它们的流行率不同；目前相关的是1b、1f、2a和2c。

BVDV生物型(细胞病变(cp)或非细胞病变(ncp))的差异由非结构基因NS2和NS3中的遗传差异决定。尽管两种生物型都可以穿过胎盘并感染胎儿，但只有ncp形式可以引起持续感染(PI)小牛。PI小牛的出生是BVDV流行病学的基石，因为这些动物通常持续一段时间无症状，但长期传播感染性BVDV病毒，污染其牛群和周围环境。这些PI动物还通常在一年内发展致命的BVDV疾病，即所谓的‘粘膜疾病’。通过NS2基因的突变，认为cp型BVDV在PI动物中进化。尽管cp生物型引起更急性症状，但其对于宿主动物比ncp生物型更容易清楚。

对于BVDV相关疾病(流产、死胎、出血综合征和粘膜疾病)的概述，参见"The Merckveterinary manual" (第10版, 2010, C.M. Kahn编, ISBN: 091191093X)。

针对瘟病毒感染和/或其诱发疾病的疫苗接种是常见的实践，并且许多类型的疫苗是市售的。此类疫苗可以基于活的(即复制的)或灭活的瘟病毒，或甚至基于病毒亚单位。

在几个国家中，存在政府控制瘟病毒的计划，诸如紧急疫苗接种和/或扑杀感染的动物。对于BVDV，PI动物的检测和消除连同通过疫苗接种的胎儿保护是重要的。然而，野生动物库的再次感染使根除复杂化。此外，对于针对瘟病毒的抗体血清阳性的动物，跨境运输可能受到限制；这干扰了一般疫苗接种方案的应用。

因此，努力已集中于开发允许血清学“区分感染的动物与接种疫苗的动物”或：DIVA的疫苗。此类型的区分测试背后的基本原理是，用具有阳性(额外特征)或阴性(丢失特征)‘标记’功能的疫苗对靶动物接种疫苗，其可以与野生型微生物感染动物在血清学上区分开。例如，该标记疫苗可以是野生型微生物中存在的一种或多种抗原缺陷的。受感染的宿主然后将变为该抗原血清阳性的，而接种疫苗者在合适的测定系统中仍然是该抗原血清阴性的。

在使用诊断测试来监测根除和防治计划中，关键的是具有测试的足够水平的灵敏度和特异性，因为在这方面的错误可具有任一方式的严重后果：假阳性可引起动物的不必要的检疫或扑杀，且假阴性可引起通过未检测到的载体动物跨境运输传播病原体。如有疑问，可以在几周后重新测试负评分的动物。

尽管疫苗和野外病毒之间的区分通常使用分子生物学技术(例如使用PCR)是可能的，但通常优选经由某种免疫诊断测定来应用DIVA原理。此类测定甚至可以在感染后相当长的时间以大规模应用，并且相对便宜。

常用的诊断测试是酶免疫测定，诸如ELISA。针对瘟病毒的商业ELISA测试通常基于免疫显性蛋白(Erns、E2或NS3)之一，并将检测抗原或针对其的抗体。实例为：

对于BVDV：PrioCHECK® BVDV抗体ELISA试剂盒(Thermo Fisher)，BVDV NS3的抑制ELISA；和IDEXX BVDV PI X2测试，用于BVDV Erns抗原检测的ELISA。

对于CSFV：CSFV E2抗体测试试剂盒(Biocheck)，用于检测针对CSFV E2的抗体的间接ELISA；CSFV Ab测试(IDEXX); )；PrioCHECK® CSFV Erns ELISA，检测CSFV Erns特异性抗体；和PrioCHECK® CSFV抗原ELISA试剂盒® (Thermo Fisher)，针对CSFV抗原的双抗体夹心直接Elisa。

迄今已经描述了几种活减毒瘟病毒疫苗。尽管这些疫苗病毒可以通过基因检测与野外病毒区分，但它们具有不足的血清学标记能力。例如，对于BVDV，活减毒疫苗毒株已经描述于：WO 2005/111.201，其描述了在Npro和Erns基因中具有突变的瘟病毒突变体(优选ncp生物型的BVDV)和：WO 2008/034.857，其描述了cp生物型的瘟病毒突变体，其中Npro基因的一部分已缺失。还参见：Zemke等人 (2010, Vet. Microbiol., vol. 142, p. 69-80)。

WO 2014/033.149描述了一种瘟病毒，其在来自NS3蛋白的解旋酶结构域2的表位中具有突变。

类似地，van Gennip等人(2001, Vaccine, vol. 19, p. 447-459)描述了携带BVDV Erns或E2基因以逃避抗CSFV抗体的识别的活嵌合CSFV。然而，与抗Erns抗血清的残余血清学交叉反应仍然引起假阳性反应。

最后，CSFV标记疫苗在欧洲得到许可，所述CSFV标记疫苗由表达CSFV E2-蛋白的BVDV骨架组成(Suvaxyn™ CSF标记物, Zoetis)。

作为结果，对于活减毒瘟病毒标记疫苗存在非常少的选择。原因之一是在平衡具有良好病毒复制和提供有效免疫保护的疫苗病毒的特性和与野生型病毒具有清楚和可检测的血清学差异的方面遇到问题。

一个实例是Luo等人 (2012, Vaccine, vol. 30, p. 3843-3848和WO 2010/064.164)。这些作者通过来自瘟病毒的Erns基因(诸如来自驯鹿、长颈鹿或叉角羚)交换了完整的BVDV Erns基因。作者报告，使用来自其最远的供体瘟病毒(叉角羚)的Erns基因后，血清学交叉反应性最低。然而，BVDV-叉角羚Erns嵌合病毒也复制了测试的所有候选者中最差者。

因此，本发明的一个目标是克服现有技术中的缺点，并且通过提供改进的瘟病毒标记疫苗病毒来适应本领域的需要，所述瘟病毒标记疫苗病毒缺乏与其他瘟病毒的特异性血清学交叉反应性，但仍具有良好的病毒复制，并诱导针对瘟病毒感染和/或疾病的有效免疫保护。

令人惊讶地发现，通过提供具有嵌合Erns基因的突变瘟病毒，可以满足该目标，并且因此可以克服现有技术的一个或多个缺点，所述嵌合Erns基因，对于5’侧的大部分，基于来自远缘相关的瘟病毒的Erns基因，且位于3’侧的嵌合Erns基因的另一部分基于来自紧密相关的瘟病毒的Erns基因。

本发明人发现，通过来自与接受瘟病毒远缘相关的瘟病毒的异源Erns基因在瘟病毒中完全替代其原始Erns基因，严重降低或甚至停止所得突变瘟病毒的复制。

这完全符合来自现有技术的教导，参见例如Luo等人(同上)。Richter等人(2011,Virology, vol. 418, p. 113-122)用具有来自Bungowannah病毒的Erns基因的突变BVDV也具有相同的经历。Richter等人试图克服这种对复制的影响，并且对插入的异源Erns基因的信号肽酶切割位点进行修饰(制备双顺反子构建体或在切割位点缺失一个核苷酸)。然而，这些修饰无一可以恢复突变BVDV的活力。无论如何也不清楚为什么出现这种影响，以及是否或如何克服这种影响。

本发明人令人惊讶地发现这样的方式，其通过向远缘相关的Erns基因提供来自与突变瘟病毒遗传密切相关的瘟病毒的Erns基因的3’侧来恢复包含来自遗传远离突变瘟病毒的瘟病毒的Erns基因的突变瘟病毒的复制能力。

来自遗传远离突变瘟病毒的瘟病毒的Erns基因的5’侧的嵌合Erns基因的5’部分使得突变瘟病毒当使用针对来自遗传远离突变瘟病毒的瘟病毒的Erns基因的抗血清时几乎血清学检测不到。这提供了优异的血清学标记功能，具有非常低的误导性交叉反应性的风险，例如，当针对用野生型瘟病毒感染筛选接种疫苗的动物时。

此外，来自与突变瘟病毒遗传接近的瘟病毒的Erns基因的3'侧的嵌合Erns基因的3'部分，使得突变瘟病毒能够几乎在其没有其Erns基因的突变的水平上复制。这对于当扩增病毒用于生产目的时允许突变瘟病毒复制到足够高的滴度是重要的，以及对于当用作活疫苗时在动物中复制是重要的。

高度相关的还有这样的发现：这种通过在突变的Erns基因的3’侧交换来恢复复制能力不会干扰或逆转Erns蛋白上的血清学交叉反应的强烈降低，其通过在突变的Erns基因的5’部分交换来获得。

因此，本发明允许制备和使用突变瘟病毒，其具有意想不到的和有利的特征组合：非常有效的免疫保护性和血清学标记能力，复制能力几乎没有降低。

目前还不知道为什么这种来自与突变瘟病毒遗传接近的瘟病毒的Erns基因的3’侧的替代恢复了突变瘟病毒的复制。尽管本发明人不想受任何可能解释这些观察的理论或模型所束缚，但他们推测显然'远缘相关的'Erns基因本身不提供或诱导或至少不足以提供或诱导对突变瘟病毒的活力和复制重要的某些功能或效应。只有通过提供来自与突变瘟病毒遗传接近的瘟病毒的Erns基因的3’侧才能恢复缺失的功能。

因此，在一个方面，本发明涉及具有其中Erns基因突变的基因组的突变瘟病毒，其特征在于突变的Erns基因是嵌合Erns基因，且嵌合Erns基因由5’部分和3’部分组成，其中所述5’部分占所述嵌合Erns基因的60-95％，且所述3’部分占所述嵌合Erns基因的剩余部分，且其中所述5’部分由来自遗传远离突变瘟病毒的瘟病毒的Erns基因的相应部分组成，且其中所述3’部分由来自与突变瘟病毒遗传接近的瘟病毒的Erns基因的相应部分组成。

用于本发明的“突变”病毒是以一种或多种方式与其亲代病毒遗传不同的病毒。同样适用于“突变”基因。通常已经经由基因操作在体外构建突变病毒或突变基因。

原则上可以通过任何合适的技术进行突变。病毒基因组上突变的净结果可以是插入、缺失和/或取代。

例如通过用异源Erns基因替代原始Erns基因来突变瘟病毒的方法是本领域中众所周知的。这些将通常涉及使用瘟病毒基因组的全长cDNA拷贝；对于BVDV，这是例如如G.Meyers等人(1996, J. of Virol., vol. 70, p. 8606-8613)所述的pA/BVDV，并且对于CSFV: 如G. Meyers等人(1989, Virology, vol. 171, p. 555-567)所述的pA/CSFV。

cDNA拷贝允许通过涉及克隆、转染、重组、选择和扩增的众所周知的分子生物学技术进行操作。随后从所得突变瘟病毒构建体体外转录RNA，然后可将其转染入合适的宿主细胞中以生成突变瘟病毒的第一代复制型病毒。

这些和其他技术非常详细地解释于标准教科书，如：Sambrook & Russell: "Molecular cloning: a laboratory manual" (2001, Cold Spring Harbour LaboratoryPress; ISBN: 0879695773); Ausubel等人, 于: Current Protocols in MolecularBiology (J. Wiley and Sons lnc., NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach& G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (CSHL Press, ISBN0879696540); 和"PCR protocols", : J. Bartlett和D. Stirling (Humana press,ISBN: 0896036421)。本文还描述和例举用于构建突变瘟病毒的详细方法。

因此，本领域技术人员将能够容易地仅仅使用常规的方法和材料应用这些技术。

对于本发明，“瘟病毒”作为属于瘟病毒属的病毒是众所周知的。这种病毒表现出其分类学组-成员的特征性特征，诸如形态学、基因组和生物化学特征，以及生理学特征，诸如生理学、免疫学或病理学行为。如本领域所知，微生物的分类基于此类特征的组合。本发明因此还包括以任何方式由其细分，例如细分为亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型或亚组等的瘟病毒。

用于本发明中的瘟病毒的样品当然可以从感染动物中分离，但是更方便地，它们可以从大学或(保藏)机构公开获得。

对于技术人员显而易见的是，尽管用于本发明的特定瘟病毒当前可以被分类于特定的物种和属中，但这种分类学分类可以随时间改变，因为新的见解可以导致重新分类至新的或不同的分类学组中。然而，这不改变微生物本身，其遗传或抗原库，或与其他病毒的遗传相关性水平，但只是其科学名称或分类。因此，这种重新分类的微生物仍然在本发明的范围内。

对于本发明，词语“基因”用于表示编码特定蛋白的核酸或基因组区域。在瘟病毒的情况下，基因组编码一个大开放阅读框(ORF)，其被翻译成多蛋白。在这种情况下，该多蛋白的一种特定蛋白的基因因此不等于ORF，并且不具有其自身的启动子、起始密码子和终止密码子。

“Erns基因”可容易地通过其生物学特性鉴定。例如，其位于瘟病毒基因组的前四分之一(5' 25%)中；直接位于核心蛋白的基因的下游(至3’侧)，并直接位于E1蛋白基因的上游(至5’侧)。Erns蛋白存在于瘟病毒病毒粒子中并具有RNA酶活性。Erns蛋白的大部分分泌至环境中，且因此可以在病毒培养基或动物宿主的血清中检测到。

瘟病毒多蛋白中编码的Erns蛋白在两侧都侧接特征性信号肽和切割位点，并且(在目前已知的物种中)长度在210和227个氨基酸之间。

通过比较比对，容易识别Erns基因或蛋白，特别是因为瘟病毒Erns基因和蛋白的许多核苷酸和氨基酸序列可得自公共数据库。例如，用于本发明中的特定瘟病毒属或非典型分离株的Erns基因可以是GenBank中该瘟病毒的公开基因组序列中的Erns基因：BVDV-1：U63479；BVDV-2：U18059；CSFV：X87939；边界病病毒：AF037405；HoBi：AB871953；长颈鹿：NC003678；驯鹿：AF144618；羚羊：NC024018；Bungowannah：NC023176；NrPV：NC025677；APPV：KR011347；和RaPV：JQ814854 (部分基因组，来自E1-NS3的部分)。

为了说明：用于本发明中的BVDV Erns基因可以是来自BVDV-1毒株CP7的Erns基因，其中病毒基因组序列可得自GenBank登录号U63479，从核苷酸1179直至并包括1859，其长度为681个核苷酸。这在SEQ ID NO:1中表示。该基因编码227个氨基酸的BVDV-1 CP7Erns蛋白，其在SEQ ID NO:2中表示。

类似地：因为可以使用Bungowannah Erns基因，如来自GenBank登录号NC023176的核苷酸1228-1893表示的Erns基因长度为666个核苷酸，并且在SEQ ID NO:3中表示。编码的Bungowannah Erns蛋白呈现于SEQ ID NO:4中。

NB: 本文的SEQ ID NO 3和4分别与WO2007/121.522的SEQ ID NO 6和18相同。

在此呈现的序列标识符中，核苷酸以DNA的标准IUPAC-IUB代码表示。然而，如技术人员将理解，自然界中的瘟病毒基因组序列是RNA形式，其中T将是U。

如果基因是最初没有连接的部分的组装体，则其为“嵌合的”。例如来自不同病毒分离株或物种的相同基因的部分的组装体。嵌合基因编码嵌合蛋白，其有效地是融合蛋白。

术语“5’部分”和“3’部分”用于表示共同构成如本文定义的嵌合Erns基因的两个部分。显然，5’部分位于嵌合Erns基因的5’ (上游)侧，并且始于嵌合Erns基因的第一个核苷酸；3'部分位于嵌合Erns基因的3'(下游)侧，并结束于该基因的最后一个核苷酸。

如本文所用的术语“部分”本身并不意味着特定尺寸或尺寸的部分。相反：对于本发明，“5’部分”覆盖比“3’部分”更大的嵌合Erns基因的部分，如本文所定义：

- “所述5’部分占所述嵌合Erns基因的60-95％”，且

- “所述3’部分占所述嵌合Erns基因的剩余部分”

两者都是在嵌合Erns基因的全长上简单计算的，由此对于技术人员显而易见的是，“剩余部分”意指：不在5’部分中的嵌合Erns基因的剩余部分。实际上，3’部分因此在其3’侧占嵌合Erns基因的5-40％，并且取决于5’部分的大小。

如技术人员将理解，嵌合Erns基因的总核苷酸长度需要使得其为3的倍数，以便不引入所得突变瘟病毒的阅读框中的偏移。

技术人员完全能够根据情况仅仅使用常规方法和材料计算和优化嵌合Erns基因的5’或3’部分的长度，以适应该要求，并且仍然在本发明的范围内进行操作。

如所述，一起形成如本文所定义的嵌合Erns基因的两个部分具有不同的起源，这导致它们不同的功能。在该方面的核心是这些部分来源的瘟病毒和本发明的突变瘟病毒的遗传相关性水平。这种遗传相关性评估的基础是Erns基因。比较的是：一方面，来自嵌合Erns基因的5’-和3’部分的供体瘟病毒的Erns基因，而另一方面，在突变瘟病毒中在其针对本发明突变之前(即在用于产生根据本发明的突变瘟病毒的亲代瘟病毒中)的Erns基因。

因此，基于嵌合Erns基因的5’-和3’部分的供体Erns基因和根据本发明的突变瘟病毒的原始Erns之间的核苷酸序列同一性水平来确定瘟病毒是否与根据本发明的突变瘟病毒“遗传远离”或“遗传接近”。

为了易于进行这些比较，不同瘟病毒的原始Erns基因是如GenBank中公开的Erns基因，其登录号如上文中描述。

例如，当根据本发明的突变瘟病毒是CSFV时，则通过比较GenBank登录号X87939的CSFV Erns基因与来自另一种瘟病毒的供体Erns基因来确定与另一种瘟病毒的遗传相关性水平。

本发明的遗传相关性通过核苷酸序列比对确定。此类比对可以用许多可用的计算机程序之一方便地进行，例如：比对2个序列，或者针对数据库比对查询序列，可以使用NCBI因特网网站http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上公开可用的程序套件BLAST™使用默认参数完成。或者，可以使用MEGA (Tamura等人, 2013, Mol. Biol. and Evol.,vol. 30, p. 2725-2729)方便地进行多个序列的多重比对。

因为核苷酸序列比对的评分是长度依赖性的并且嵌合Erns基因的部分的长度可以变化，因此通过简单地将整个嵌合Erns基因针对如上面定义的整个原始Erns基因比对，且然后鉴定嵌合Erns基因的哪一部分来自瘟病毒的哪些物种或分离株，和鉴定该部分的长度，来进行比对。

因此，在已鉴定嵌合Erns基因的部分源自哪种瘟病毒和已鉴定该部分的长度之后，则当使用具有默认参数的程序‘Bl2seq’，如嵌合Erns基因中使用的该Erns基因的部分和突变瘟病毒的相应原始Erns基因之间的核苷酸序列同一性小于70％时，对于本发明确定Erns基因来自遗传远离根据本发明的突变瘟病毒的瘟病毒。

相反，对于本发明，当使用具有默认参数的程序‘Bl2seq’，Erns基因的该部分和突变瘟病毒的相应原始Erns基因之间的核苷酸序列同一性为70％或更高时，Erns基因来自与根据本发明的突变瘟病毒的原始Erns基因“遗传接近”的瘟病毒。

在实践中，这意味着瘟病毒BVDV-1、BVDV-2、CSFV、边界病病毒、驯鹿、长颈鹿和HoBi瘟病毒彼此‘遗传接近’，并且这些各自‘遗传远离’来自羚羊、Bungowannah、NRPV、APPV和RaPV的瘟病毒的Erns基因。

Hause等人(同上)的第2997页的图1，小图C的树形图也说明了这一点。

“相应部分”意指嵌合Erns基因的5’或3’部分由来源Erns基因中的相似大小和位置的部分形成。例如：当在如本文定义的嵌合Erns基因的实施方案中，5’部分占嵌合Erns基因的85％时，则相应部分是来自遗传远离根据本发明的突变瘟病毒的瘟病毒的Erns基因的5’侧的85％。

类似的推理适用于嵌合Erns基因的3’部分：当5’部分是例如85％时，则3’部分占嵌合Erns基因的‘剩余’ 15％，并且‘相应部分’是来自与根据本发明的突变瘟病毒遗传接近的瘟病毒的Erns基因的3’侧的15％。

在一个实施方案中，当使用具有默认参数的程序‘Bl2seq’，如嵌合Erns基因中使用的该Erns基因的部分和突变瘟病毒的相应原始Erns基因之间的核苷酸序列同一性小于65％时，Erns基因来自遗传远离根据本发明的突变瘟病毒的瘟病毒。

优选地，遗传远离意指使用具有默认参数的程序‘Bl2seq’，该Erns基因的部分和突变瘟病毒的相应原始Erns基因之间的核苷酸序列同一性小于60％、55％或甚至50％，按照该优先顺序。

相反，在一个实施方案中，当使用具有默认参数的程序‘Bl2seq’比对后，如嵌合Erns基因中使用的该Erns的部分和突变瘟病毒的相应原始Erns基因之间的核苷酸序列同一性大于75 %时，Erns基因来自与根据本发明的突变瘟病毒遗传远离的瘟病毒。

优选地，遗传接近意指使用具有默认参数的程序‘Bl2seq’，嵌合Erns基因中的该Erns基因的部分和突变瘟病毒的相应原始Erns基因之间的核苷酸序列同一性超过80％、85％或甚至超过90％，按照该优先顺序。

在一个实施方案中，嵌合Erns基因的5’部分为嵌合Erns基因的约65％和约93％之间，优选在嵌合Erns基因的约70％和约93％之间；约75％和约91％之间；或甚至约80％和约90％之间，按照该优先顺序。

对于本发明，用术语“约”表示的数字意指数字可以在指示值附近的±25％之间变化；优选地约意指指示值附近的±20％，更优选约意指指示值附近±15、12、10、8、6、5、4、3、2 %，或甚至约意指指示值附近±1％，按照该优先顺序。

在目前已知的瘟病毒属的成员内，BVDV、CSFV和边界病病毒对农业部门具有最大的经济影响。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的突变瘟病毒是选自以下的瘟病毒：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；经典猪瘟病毒(CSFV)；和边界病病毒。

当根据本发明的突变瘟病毒基于BVDV、CSFV或边界病病毒时，则来自遗传远离的瘟病毒的Erns基因是来自羚羊瘟病毒、Bungowannah病毒、挪威大鼠瘟病毒、APPV或中菊头蝠瘟病毒的Erns基因。

因此，在根据本发明的突变瘟病毒的一个实施方案中，来自遗传远离的瘟病毒的Erns基因是来自选自以下的瘟病毒的Erns基因：羚羊瘟病毒、Bungowannah病毒；挪威大鼠瘟病毒；非典型猪瘟病毒(APPV)；和中菊头蝠瘟病毒(RaPV)。

此外，当根据本发明的突变瘟病毒基于BVDV、CSFV或边界病病毒时，则来自遗传接近的瘟病毒的Erns基因是来自BVDV-1、BVDV-2、CSFV、边界病病毒、驯鹿瘟病毒、长颈鹿瘟病毒或HoBi瘟病毒的Erns基因。

因此，在根据本发明的突变瘟病毒的一个实施方案中，来自遗传接近的瘟病毒的Erns基因是来自选自以下的瘟病毒的Erns基因：BVDV-1；BVDV-2；CSFV；边界病病毒；驯鹿瘟病毒；长颈鹿瘟病毒；和HoBi瘟病毒。

根据本发明的突变瘟病毒的有利用途是作为标记疫苗。当该标记疫苗作为活疫苗应用时，突变瘟病毒需要具有降低的毒力，以便足够安全地施用于动物。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的突变瘟病毒是减毒瘟病毒。

对于本发明，如果病毒与相同物种或分离株(诸如野生型分离株)的另一种病毒相比具有降低的毒力，则瘟病毒是“减毒的”。事实上，减毒的意味着表现出通过感染的靶动物的身体的传染减少，例如，胎儿感染；诱导较少的病理学，诸如疾病(的体征)；和/或表现出向环境中的传播减少。

无论瘟病毒是否实际减毒，并且该减毒水平是否足以用作根据本发明的突变瘟病毒的亲代病毒，例如，关于其在活疫苗中的用途，可以使用标准程序在体外或体内方便地确定。例如，通过逐一比较两种瘟病毒变体，一种具有该突变，且一种没有该突变。例如，通过比较突变对细胞培养物或实验感染动物中的病毒复制率的影响：检查不同组织或器官中的病毒存在，和监测动物或胎儿中疾病的临床、宏观或微观体征。

获得该减毒的一种方式是通过向突变瘟病毒提供进一步突变，将其毒力减毒至可接受的水平以用作活减毒疫苗。

可以减毒根据本发明的突变瘟病毒的进一步突变的实例是Npro-或NS3基因中的突变。

NS3中的突变优选是如WO 2014/033.149中所述的突变，其中瘟病毒具有位于NS3蛋白的解旋酶结构域中的表位的突变，使得该表位不再与针对野生型瘟病毒中的该表位的单克隆抗体反应。

可替代地，或另外，进一步突变位于Npro基因中。这种突变可以提供与根据本发明的突变瘟病毒中的其他修饰良好组合的减毒水平。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的突变瘟病毒具有其中Npro基因突变的基因组。

在一个优选实施方案中，对Npro基因的突变是如WO 2008/034.857中所述的突变，其中Npro基因缺失，除了编码Npro的N端12个氨基酸的Npro基因的5’部分。

当用作活减毒标记疫苗时，可进行进一步突变或减毒以增加突变瘟病毒的安全性或效力。

WO 2012/038.454中描述了一种特别有用的调整。本发明防止当在一种疫苗中组合不同基因型的BVDV病毒时发生的干扰。如WO 2012/038.454中所述，将一种基因型的BVDV瘟病毒突变以包含另一种基因型的BVDV的E2基因，而不是其自身的E2基因。其效果是这种E2-嵌合BVDV然后可以与具有相同病毒骨架、但具有其原始E2基因的BVDV组合于一种疫苗中。这两种病毒现在将不再干扰发展针对每种病毒的免疫应答。

因此，在根据本发明的突变瘟病毒的一个实施方案中，突变瘟病毒基于BVDV，并且所述BVDV是一种基因型的，但包含来自另一种基因型的BVDV的E2基因，而不是其原始E2基因。

在一个优选实施方案中，根据本发明的突变瘟病毒基于BVDV-1，并且包含BVDV-2的E2基因，而不是其原始E2基因。

这种调整也可以包含在根据本发明的突变瘟病毒中，例如，当突变瘟病毒基于BVDV-1病毒且包含BVDV-1E2基因时。反向组合当然也是可能的，其中根据本发明的突变瘟病毒的骨架基于BVDV-2并且包含BVDV-2 E2基因。

在一个实施方案中，根据本发明的突变瘟病毒是BVDV，并且所述BVDV是细胞病变生物型的。

在根据本发明的突变瘟病毒的一个实施方案中，嵌合Erns基因包含来自Bungowannah病毒的Erns基因作为来自遗传远离的瘟病毒的Erns基因。

发现这种突变瘟病毒具有优异的标记功能性，因为发现编码的嵌合Erns蛋白仅使用抗Bungowannah病毒抗血清可检测到，但当使用针对其他瘟病毒或针对它们的Erns蛋白的抗血清时不能检测到。

在一个优选实施方案中，根据本发明的突变瘟病毒基于BVDV，并且包含嵌合Erns基因，所述嵌合Erns基因包含Bungowannah Erns基因作为来自遗传远离的瘟病毒的Erns基因，并且嵌合Erns基因的3’部分是嵌合Erns的约10％和约20％，并且源自BVDV。

在根据本发明的突变瘟病毒的一个优选实施方案中，突变瘟病毒基于BVDV-1并且包含如SEQ ID NO:5中所述的嵌合Erns基因。

SEQ ID NO:5的嵌合Erns基因长687个核苷酸，并具有正确的阅读框。在这种情况下，嵌合Erns基因的该3’部分和突变瘟病毒(此处为BVDV-1)之间的相关性水平因此是100％，其符合遗传接近的要求。

关于如本文定义的该嵌合Erns基因的该3’部分的长度百分比，其为距离BVDV-1毒株CP7的Erns基因的(对应) 3’侧108个核苷酸(原始Erns基因长681 nt)；因此在该嵌合Erns基因中，如本文定义的3’部分是该嵌合Erns基因的(108/687)= 15.7％。

SEQ ID NO:6呈现由SEQ ID NO:5编码的嵌合Erns基因的氨基酸序列。

在SEQ ID NO:5中的Bungowannah Erns基因(SEQ ID NO:3)的5’部分与原始Erns基因(此处为：登录号U63479的BVDV-1 Erns基因)的对应长度(579个核苷酸)具有65％核苷酸序列同一性。这符合遗传远离的要求。

在下文的实施例部分中详细描述了这种突变瘟病毒的构建和使用。

在一个进一步方面，本发明涉及如本发明中所定义的嵌合Erns基因。

嵌合Erns基因可用于构建根据本发明的突变瘟病毒。该基因可以包含在PCR扩增物中，或者包含在质粒或其他载体中以促进修饰和克隆。可以使用标准分子生物学技术通过PCR或在细菌培养物中扩增基因或质粒。

在一个优选实施方案中，所述嵌合Erns基因如SEQ ID NO:5中所示。

根据本发明的突变瘟病毒的进一步或另外的调整或突变是可想到的。这些也可以以一种或多种组合应用。因此，在根据本发明的突变瘟病毒的一个实施方案中，应用一种、多种或全部选自以下的条件：

- 突变瘟病毒包含另一突变，其位于Npro基因中，并且其将突变瘟病毒减毒，

- 突变瘟病毒基于一种基因型的BVDV，但包含来自另一种基因型的BVDV的E2基因，而不是其原始E2基因，

- 来自遗传远离的瘟病毒的Erns基因是来自Bungowannah病毒的Erns基因，

- 来自遗传接近的瘟病毒的Erns基因是来自BVDV-1或BVDV-2的Erns基因，

- 突变瘟病毒基于cp生物型BVDV-1或cp生物型BVDV-2，且

- 所述嵌合Erns基因如SEQ ID NO:5中所示。

在构建根据本发明的突变瘟病毒中，存在可以引入各个实施方案的不同方式。例如，根据本发明的突变瘟病毒可以通过引入如本文所定义的嵌合Erns基因来产生。接下来，可以将另外的突变和变异添加至突变瘟病毒中。

然而，更有利的方法可以是将如本文所定义的嵌合Erns基因引入已经具有其他实施方案中的一个或多个的瘟病毒中，并且以该方式生成根据本发明的具有几个额外特征的突变瘟病毒。例如，这可以应用于作为确立的疫苗毒株的瘟病毒。以这种方式，可以为建立的疫苗提供有效的标记特性，同时保持其复制和免疫保护。

因此，在一个进一步方面，本发明提供了用于构建根据本发明的突变瘟病毒的方法，所述方法包括将瘟病毒基因组中的Erns基因突变为如本文所定义的嵌合Erns基因。

应用根据本发明的方法所需的方法和材料完全在技术人员的常规能力之内，在本文中详细描述，并且是本领域众所周知的。

在一个实施方案中，将根据本发明的方法应用于用作建立的疫苗毒株的瘟病毒。例如：在灭活疫苗中，诸如：对于BVDV：Bovilis® BVD (MSD Animal Health)，Bovidec®(Novartis)，Pregsure® BVD (Zoetis)；对于边界病和BVDV：Mucobovin® (Merial)。

或者优选地，在建立的活减毒瘟病毒疫苗毒株中，诸如：对于BVDV：Mucosiffa®(Merial)；且对于CSFV: Porcilis CSF Live (MSD AH); Suvaxyn CSF (Zoetis)；或Riemser Schweinepest vakzine [Riems的猪瘟疫苗] (IDT Dessau)。

在根据本发明的方法中，且为了扩增根据本发明的突变瘟病毒，病毒在合适的宿主细胞中产生。当突变病毒尚未处于复制形式时，这可以借助将核酸转染至这种宿主细胞中来实现。或者，当处于复制形式时，将突变瘟病毒接种至此类宿主细胞上并通过天然复制进行扩增。

宿主细胞可以是原代细胞，诸如从动物组织制备。然而，优选地，宿主细胞来自建立的连续生长的细胞系。

在病毒复制周期的某些点，此类宿主细胞将含有根据本发明的突变瘟病毒。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及包含根据本发明或可通过根据本发明的方法获得的的突变瘟病毒的宿主细胞。

用于复制瘟病毒的合适宿主细胞是本领域中众所周知的，并且通常是公共可获得的，例如，来自大学或(保藏)机构。用于制备和培养根据本发明的宿主细胞的方法、培养基和材料是本领域中众所周知的。

合适的宿主细胞的实例是细胞系，诸如：牛细胞系，诸如：MDBK (Madin Darby牛肾)；猪细胞系诸如：PK15(猪肾)或STE(猪睾丸类上皮细胞)；或通用目的细胞系诸如：Vero(非洲绿猴肾细胞)、MDCK(Madin Darby犬肾)或PT细胞(绵羊上皮肾细胞)。

如上所讨论，根据本发明的突变瘟病毒的有利用途是作为标记疫苗。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及包含根据本发明的突变瘟病毒的动物疫苗，或根据本发明的宿主细胞，或其任何组合，以及药学上可接受的载体。

“疫苗”众所周知是具有先天性医疗效果的组合物。疫苗包含免疫活性组分和药学上可接受的载体。“免疫活性组分”是被靶标的免疫系统识别的一种或多种抗原性分子，在此：根据本发明的突变瘟病毒，并且其诱导保护性免疫应答。应答可以源自靶标的先天性和/或获得性免疫系统，并且可以是细胞类型和/或体液类型的。

疫苗通常在降低感染水平或程度方面是有效的，例如通过减少病毒载量或缩短宿主动物中病毒复制的持续时间。

另外，或可能作为其结果，疫苗通常有效减少或改善可以由这种病毒感染或复制引起或作为其结果的疾病症状或由动物对该感染的应答引起的疾病症状。

根据本发明的疫苗的效果是通过诱导免疫应答、诸如诱导病毒中和抗体和/或诱导细胞免疫应答来预防或减少动物的瘟病毒感染和/或与这种病毒感染或复制相关的疾病体征。

这种疫苗可以被通俗地称为‘针对’瘟病毒的疫苗，或者称为‘瘟病毒疫苗’。

可以例如通过监测接种疫苗后或攻击感染后的免疫应答，例如通过监测靶标的疾病的体征，临床评分，血清学参数，或通过病原体的重新分离，且将这些结果与模拟接种疫苗的动物中看到的接种疫苗-攻击应答进行比较来进行测定疫苗针对瘟病毒的有效性。

或者，在已知高于某些水平的病毒中和抗体与保护相关的情况下，血清学可足以证明疫苗效力。

根据本发明的疫苗意欲针对的“动物”是易于被瘟病毒感染的动物。这些主要是哺乳动物(非人类)动物，并且是偶蹄目的成员。根据本发明的疫苗的优选靶动物是反刍动物和猪；更优选的是：牛、绵羊和猪。

根据本发明的疫苗可以包含均根据本发明的突变瘟病毒和宿主细胞的任何“组合”。这是指可以制备疫苗的各种方式，如下所述。一个实例是收获根据本发明的突变瘟病毒的完整培养物，包括病毒和(感染的)宿主细胞。

根据本发明的疫苗可以是活、灭活或亚单位疫苗或其任何组合。

‘灭活的’疫苗是包含已经通过某种灭活方法赋予非复制性的微生物的疫苗。常用的灭活方法是通过应用例如热、辐射或化学品诸如福尔马林、β-丙内酯、二元乙撑亚胺或β-乙醇胺。

待灭活的突变瘟病毒最初是可以源自病毒培养物(诸如来自细胞沉淀、培养物上清液或整个培养物)的整个病毒颗粒。由于灭活方法影响病毒颗粒的蛋白、脂质和/或核酸，这可以在一定程度上被破坏。尽管如此，这种类型的疫苗通常被称为全病毒灭活疫苗。

选择合适的灭活方法完全在本领域技术人员的常规能力之内。

或者，根据本发明的疫苗或其部分可以是亚单位疫苗。这可以通过应用一个或多个(额外的)用于分级或分离病毒颗粒的一个或多个部分的步骤来从活病毒或灭活病毒制备。这包括例如制备本领域中都众所周知的提取物、级分、匀浆或超声波。

然而，根据本发明的疫苗的优选形式是活疫苗。尽管术语‘活’在病毒剂的方面在生物学上是不正确的，但它通常用于该领域中。因此，对于本发明，术语‘活’是指根据本发明的突变瘟病毒，其能够复制非灭活病毒，即是可复制的。

由于根据本发明的突变瘟病毒的特性，以及经由适当的测试进行筛选，根据本发明的疫苗可以有利地用作瘟病毒Erns蛋白的标记疫苗。

在一个优选实施方案中，根据本发明的疫苗是活减毒标记疫苗。

活减毒疫苗通常以冻干形式制备。这允许在高于冷冻的温度下延长储存。用于冻干的程序是本领域技术人员已知的，且用于以各种规模冻干的设备是市售的。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的疫苗呈冻干形式。

冻干形式可以是饼，或者可以是冻干球，或者两者均如EP 799.613中所述。

为了重构冻干的疫苗，将其悬浮于生理上可接受的稀释剂中。这通常在临施用前进行，以验证疫苗的最佳质量。稀释剂通常是含水的，并且可以例如是无菌水或生理盐溶液。待用于重构疫苗的稀释剂本身可以含有额外化合物，诸如佐剂。

在冻干的根据本发明的疫苗的一个进一步实施方案中，用于疫苗的稀释剂与包含活疫苗组合物的冻干形式分开供应。在该情况下，冻干的疫苗和稀释剂组合物形成一起体现根据本发明的疫苗的部件试剂盒。

因此，在冻干的根据本发明的疫苗的一个优选实施方案中，疫苗是具有至少两个容器的部件试剂盒，一个容器包含冻干的疫苗，而一个容器包含水性稀释剂。

“药学上可接受的载体”是例如液体诸如水、生理盐溶液或磷酸盐缓冲盐水溶液。以更复杂的形式，载体可以例如缓冲液，其包含进一步添加剂，诸如稳定剂或防腐剂。

根据本发明的疫苗还可以包含佐剂。当疫苗是灭活疫苗或亚单位疫苗时，这是特别有用的。然而，活疫苗也可以包含佐剂，尽管应该仔细选择该佐剂以便不减少疫苗病毒的活力，甚至在长期储存后。

“佐剂”是众所周知的疫苗成分，其通常是以非特异方式刺激靶标的免疫应答的物质。本领域已知许多不同的佐剂。用于灭活/亚单位疫苗的佐剂的实例是：弗氏完全或不完全佐剂、维生素E、铝组合物(诸如磷酸铝或氢氧化铝)、Polygen™、非离子嵌段聚合物和聚胺诸如硫酸葡聚糖、Carbopol™、吡喃、皂苷(诸如Quil A™或Q-vac™)。皂苷和疫苗组分可以在ISCOM™中组合。

而且，肽例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、促吞噬素经常用作佐剂，和油-乳液，其使用矿物油例如Bayol™或Markol™、Montanide™或轻质矿物(石蜡)油；或非矿物油诸如角鲨烯、角鲨烷或植物油，例如油酸乙酯。此外，可以有利地使用组合产物诸如ISA™(来自Seppic)或DiluvacForte™。

疫苗-乳液可以是油包水(w/o)、水包油(o/w)、水包油包水(w/o/w)或双油乳液(DOE)等的形式。

或者，并且更适合与活疫苗使用：可以将其他免疫刺激组分添加至根据本发明的疫苗中，诸如细胞因子或免疫刺激性寡脱氧核苷酸。

免疫刺激性寡脱氧核苷酸优选为免疫刺激性的含非甲基化CpG的寡脱氧核苷酸(INO)。优选的INO是Toll样受体(TLR) 9激动剂，诸如WO 2012/089.800 (X4家族)、WO2012/160.183 (X43家族)或WO 2012/160.184 (X23家族)中所述。

根据本发明的疫苗应当以关于其剂量、体积、途径或制剂的最佳方式以及关于靶动物的年龄、性别或健康状况的最佳方式施用于靶动物。技术人员完全能够确定疫苗施用的此类最佳条件。对于灭活疫苗或亚单位瘟病毒疫苗，施用通常通过肌肉内、皮下或皮内注射。对于根据本发明的活减毒疫苗，‘粘膜’途径也可以是适当的，诸如鼻内或眼部。

因此，在一个实施方案中，通过胃肠外途径，优选地通过肌肉内、皮下或皮内途径，施用根据本发明的疫苗。

根据本发明的活疫苗也可以通过注射施用。或者，并且根据所采用的突变瘟病毒的特定特性，其可以经由粘膜、口服或呼吸途径应用。

在一个实施方案中，通过粘膜途径，优选地通过鼻内或眼部途径，施用根据本发明的疫苗。

优选地，经由大规模应用的方法，诸如通过喷雾，或经由饲料或饮用水，应用活疫苗。

根据本发明的疫苗可以有利地与另一种抗原、微生物或疫苗组分组合成为组合疫苗。根据本发明的疫苗的特定形式的特征，需要仔细选择制备该组合的方式。此类选择在技术人员的常规能力之内。

因此，在一个实施方案中，根据本发明的疫苗的特征在于其包含至少一种额外免疫活性组分。

“额外免疫活性组分”可以是抗原、免疫增强物质、和/或疫苗，其任一者都可以包含佐剂。当其是抗原的形式时，额外免疫活性组分可以由在兽医上重要的任何抗原性组分组成。优选地，额外免疫活性组分基于，或源自对靶动物致病的其他微生物。例如其可以包含生物或合成分子诸如蛋白、碳水化合物、脂多糖、编码蛋白性抗原的核酸。包含这种核酸的宿主细胞、含有这种核酸的活的重组载体微生物也可以作为递送或表达核酸或额外免疫活性组分的途径。或者，额外免疫活性组分可以包含分级或灭活的微生物，诸如寄生虫、细菌或病毒。

额外免疫活性组分还可以是免疫增强物质，例如趋化因子、或免疫刺激性核酸，如上所述。或者，可以将根据本发明的疫苗本身加入疫苗中。

用于本发明的组合疫苗的一个有利的效用是它不仅诱导针对瘟病毒的免疫应答，而且还诱导针对靶动物的其他病原体的免疫应答，而仅需要对动物进行单次疫苗接种处理，由此减少了动物的不适，以及减少时间和劳动力成本。

此类额外免疫活性组分的实例原则上都是适合于给动物接种疫苗的所有病毒、细菌和寄生虫病原体或其部分，所述动物也是根据本发明的瘟病毒疫苗的靶标。

此类靶动物相关的病原体的实例是：

对于猪：猪圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪瘟病毒、猪肺炎支原体、胞内劳森氏菌、大肠杆菌、链球菌属种、沙门氏菌属种、梭状芽孢杆菌属种、胸膜肺炎放线杆菌、巴斯德氏菌属种、嗜血杆菌属种、丹毒丝菌属种和博德特氏菌属种。

对于牛群：新孢子虫属种、网尾线虫属种、隐孢子虫属种、奥斯特线虫属种、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、感染性牛鼻气管炎病毒(牛疱疹病毒)、牛副粘病毒、牛副流感病毒、牛呼吸道合胞病毒、狂犬病病毒、蓝舌病病毒、溶血巴斯德氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌属种、葡萄球菌属种、分枝杆菌属种、布鲁氏菌属种、梭状芽孢杆菌属种、曼氏杆菌属种、嗜血杆菌属种和梭菌属种。

对于绵羊：刚地弓形虫、小反刍动物病毒、蓝舌病病毒、施马伦贝格病毒、分枝杆菌属种、布鲁氏菌属种、梭状芽孢杆菌属种、柯克斯氏体属种、大肠杆菌、衣原体属种、梭状芽孢杆菌属种、巴斯德氏菌属种、曼氏杆菌属种。

额外的免疫活性组分因此也可以是另外的瘟病毒和/或瘟病毒疫苗，其中的任一种或两种可以是活的、灭活或亚单位疫苗。

技术人员不仅能够进行此类组合，同时能够保护根据本发明的疫苗的效力、安全性和稳定性。

根据本发明的疫苗的制备是本领域中众所周知的，并且在技术人员的常规能力之内。此类制备方法将通常包括根据待制备的疫苗的类型例如在体外细胞培养物中繁殖根据本发明的突变瘟病毒、收获和配制的步骤。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于制备根据本发明的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

- 用根据本发明的突变瘟病毒感染宿主细胞的培养物，

- 孵育感染的宿主细胞培养物，

- 收获培养物或其部分，和

- 将培养物或其部分与药学上可接受的载体混合。

在该方法的不同点，可以添加额外的步骤，例如用于额外的处理，诸如用于纯化或储存。

接下来，制备方法可以涉及与其他药学上可接受的赋形剂诸如稳定剂、载体、佐剂、稀释剂、乳剂等混合。然后将制备的疫苗分配至合适大小的容器中。制备过程的各个阶段通过足够测试来监测，例如通过针对抗原的质量和数量的免疫学测试；通过针对外来剂的灭活(如果适用)、无菌和不存在的微生物测试；且最终通过体外或体内实验来确定疫苗效力和安全性。所有这些是技术人员众所周知的，并且规定于政府法规诸如药典和手册诸如“Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA,ISBN: 683306472)和：“Veterinary vaccinology” (P. Pastoret等人编, 1997,Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)。

将本发明的疫苗制备为适于施用于家禽靶标且与期望的应用途径和期望效果匹配的形式。

疫苗可被配制成可注射液体，诸如：悬浮液、溶液、分散液或乳液。或者，疫苗可以以冻干形式配制。通常疫苗被制备为无菌。

取决于根据本发明的疫苗的应用途径，可能有必要调整疫苗的组成。这完全在技术人员的能力之内，并且通常涉及微调疫苗的效力、稳定性或安全性。这可以通过以下进行：调整疫苗剂量、数量、频率、途径，使用另一种形式或制剂的疫苗，或调整疫苗的其他成分(例如稳定剂或佐剂)。

待每动物剂量的根据本发明的疫苗使用的根据本发明的突变瘟病毒的确切量取决于疫苗的类型和治疗的靶动物。对于活疫苗，这通常低于灭活疫苗，因为活病毒可以复制。根据适应症，根据本发明的活疫苗的剂量将含有约1x10^1至约1x10^7组织培养感染剂量50 % (TCID50)/动物的根据本发明的突变瘟病毒。根据本发明的灭活疫苗的剂量将含有约1x10^2至约1x10^9 TCID50/动物的灭活形式的根据本发明的突变瘟病毒。

计数和定量根据本发明的突变瘟病毒的病毒颗粒的方法是众所周知的。

根据本发明的疫苗的每个动物剂量的体积可以根据意欲治疗的靶动物和意欲应用途径来优化。通常，灭活疫苗以0.1至5 ml/动物的剂量给予。根据应用的途径，活疫苗的剂量是甚至更可变的。

何者为根据本发明的疫苗的免疫有效量的确定或每剂量的疫苗的体积的优化两者完全在技术人员的能力之内。

在一个进一步方面，本发明涉及根据本发明的突变瘟病毒，或根据本发明的宿主细胞，或其任何组合，其用于动物疫苗中。

在一个进一步方面，本发明涉及根据本发明的突变瘟病毒或根据本发明的宿主细胞或其任何组合用于制备动物疫苗的用途。

在一个进一步方面，本发明涉及根据本发明的疫苗用于预防或减少动物中的瘟病毒感染或相关疾病体征的用途。

在一个进一步方面，本发明涉及用于预防或减少动物中的瘟病毒感染或相关疾病体征的方法，所述方法包括将根据本发明的疫苗施用于所述动物。

在一个进一步方面，本发明涉及对动物接种疫苗的方法，其包括向所述动物施用根据本发明的疫苗的步骤。

因此，根据本发明的疫苗可以用作预防性或治疗性治疗或两者，因为其均干扰瘟病毒的感染的建立和进展。

在该方面，通过根据本发明的疫苗降低病毒载量的进一步有利的效果是预防或减少病毒的脱落，从而预防或减少病毒垂直地扩散至后代以及水平地在畜群或群体内和在地理区域内扩散。因此，使用根据本发明的疫苗导致瘟病毒的流行率降低。

因此，本发明的进一步方面是：

- 根据本发明的疫苗用于减少群体或地理区域内瘟病毒的流行率的用途，和

- 根据本发明的疫苗，其用于减少群体或地理区域内瘟病毒的流行率。

将根据本发明的疫苗应用于靶生物体的施用方案可以在单剂量或多剂量中，其方式与疫苗制剂相容，与动物饲养的实际方面相容，且其量将是免疫学有效的。

优选地，将施用根据本发明的疫苗的方案整合至靶动物可需要的其他疫苗的现有疫苗接种时间表中，以减少对动物的应激并降低劳动力成本。这些其他疫苗可以以与其注册用途相容的方式以同时、并发或依次方式施用。

有利的是，尽可能在靶动物中建立有效的免疫保护早地应用根据本发明的疫苗。这也将并入母体衍生的抗体在靶标中的相关性和水平。

如上所讨论，均根据本发明的突变瘟病毒和疫苗特别适用于应用DIVA原理的方案中。这是因为突变瘟病毒为疫苗提供了强大的标记疫苗特性。这适用于当疫苗是活疫苗时以及当其为灭活疫苗或亚单位疫苗时。

根据本发明的疫苗在接种疫苗的靶动物中诱导针对Erns蛋白的抗体，所述抗体不容易能够与不同于疫苗病毒的瘟病毒的Erns蛋白特异性结合。这允许设计筛选测定的几种方式：

一方面可以设计测定法来特异性检测根据本发明的突变瘟病毒作为阳性标记物，筛选有效的疫苗接种。这种测定法将使用针对根据本发明的突变瘟病毒表达的Erns蛋白的抗体，或将使用突变瘟病毒或其Erns蛋白作为检测抗原。

另一方面，可以设计测定法以阳性检测与在根据本发明的疫苗中包含的突变瘟病毒相比不同的瘟病毒作为阴性标志物筛选。由于根据本发明的疫苗的有利的标记特性，这种非疫苗病毒的检测因此允许筛选任何致病性野生型野外病毒的感染，甚至在瘟病毒疫苗接种的动物中。这种测定法将使用针对Erns的抗体，其不识别如根据本发明的突变瘟病毒表达的Erns，或使用致病性病毒或其Erns蛋白用于检测。

因此，本发明的一个进一步方面是用于区分用根据本发明的疫苗接种疫苗的动物与用除了疫苗中包含的突变瘟病毒以外的瘟病毒感染的动物的方法，所述方法包括使用针对Erns蛋白的抗体，所述抗体不与由疫苗中包含的突变瘟病毒表达的嵌合Erns蛋白特异性结合。

对于本发明，“抗体”是可以特异性结合表位的免疫球蛋白或其部分。对于血清诊断，抗体通常是IgG或IgM类型。所述抗体可以是完整或部分抗体，例如单链抗体，或免疫球蛋白的含有抗原结合区的部分。它们可以是不同的形式：此类部分的(合成)构建体，条件是抗体-部分仍然含有抗原结合位点。免疫球蛋白的众所周知的子片段为：Fab、Fv、scFv、dAb或Fd片段、Vh结构域或此类片段或结构域的多聚体。所述抗体可以也用一种或多种方式标记以促进或扩增检测。

用作诊断测定中的试剂的抗体通常通过用靶抗原(过度)免疫供体动物、并收获从动物的血清产生的抗体而产生。众所周知的供体是兔和山羊。另一个实例是可以在蛋黄中产生高水平的抗体(所谓的IgY)的鸡。或者，抗体可以在体外产生，例如经由众所周知的来自永生化B淋巴细胞培养物(杂交瘤细胞)的单克隆抗体技术，并且其工业规模生产系统是已知的。抗体或其片段也可以在重组表达系统中通过表达克隆的Ig重链和/或轻链基因来表达。所有这些都是技术人员众所周知的。

如本领域中所众所周知，“针对”特定靶标的抗体是对于该靶标上的表位特异性的抗体，其中所述靶标是特定分子或实体。如果抗体(或其片段)能够选择性结合该表位，则它对于表位是特异性的。

对于本发明，抗体将基于它们针对的靶标进行指称；例如：针对CSFV的抗体被称为‘CSFV抗体’，并且‘Erns抗体’是针对Erns蛋白的抗体，也称为抗-Erns抗体等。

抗体是否可以“特异性结合”表位，可以由技术人员容易地进行评价。例如，可以通过证明抑制与测定中使用的抗原或抗体的浓度相关来确定基于抑制的免疫测定法的结果的特异性。使用例如竞争结合测定，可以确定需要多少抗原来使抗体与包被抗原的结合抑制50％(Bruderer等人, 1990, J. of Imm. Meth., vol. 133, p. 263)。

不识别根据本发明的突变瘟病毒的Erns蛋白的针对Erns蛋白的抗体是本领域已知的，或者可以使用常规程序获得。描述的瘟病毒Erns蛋白的ELISA测试采用针对例如CSFV或BVDV-1产生的抗Erns抗体，参见例如Grego等人 (2007, J. of Vet. Diagn. Invest.,vol. 19, p. 21 - 27)。这些将不与根据本发明的突变瘟病毒的Erns特异性结合。

因此，本发明的另一个有利用途是可以在根据本发明的方法中采用基于瘟病毒Erns抗体的现有测试。

根据本发明的区分动物的方法与具有最大农业-经济相关性的瘟病毒尤其相关。

因此，在根据本发明的用于区分动物的方法的一个实施方案中，所述抗体与来自瘟病毒的Erns蛋白特异性结合，所述瘟病毒选自：BVDV-1；BVDV-2；CSFV；和边界病病毒。

根据本发明的用于区分的方法可以使用任何合适的免疫诊断测定方法进行。

经常，此类免疫诊断测定将具有用于扩增信号强度的步骤，和一个或多个用于洗去未结合的、非特异性的或不需要的组分的步骤。阳性信号的检测可以多种方式进行，诸如光学上通过检测颜色变化、荧光或颗粒大小的变化，或者另外通过检测免疫复合物中的放射标记的抗原或抗体。类似地，测试的物理形式可以广泛变化，并且可以例如采用微量滴定板、膜、试纸、生物传感器芯片、凝胶基质或包含(微)载体颗粒诸如胶乳、金属或聚苯乙烯(polystyreen)等的溶液。

这种免疫诊断测定的特定设置的选择通常通过输入样品的类型、所需测试灵敏度(正确鉴定阳性样品)和测试特异性(正确地区分真阳性和真阴性样品)来确定。此类特性取决于免疫应答的强度和时机，或微生物的存在。进一步，测试经济诸如大规模适用性和成本的要求对于具体格式的选择可以是决定性的。

众所周知的免疫诊断测试是：放射免疫测定法、免疫扩散、免疫荧光、免疫沉淀、凝集、溶血、中和和“酶联免疫吸附测定法”或ELISA。尤其是对于大规模测试，可要求液体处理和/或结果读取和处理的自动化。这还可需要用更加现代化和小型化的形式诸如AlphaLISA^TM (Perkin Elmer)中代替传统的测定。

ELISA是容易放大的，并且可以是非常灵敏的。其他优点是其结果的动态范围，因为可以在稀释范围内测试样品。结果以吸光度的任意单位表示，一般为0.1和2.5光密度(OD)单位之间，或者作为“阻断%”，这取决于用于读出的技术设备的测试性能和设置。包括常规合适的阳性和阴性对照样品，并且多次测试倍数最高的样品。通过包括定义参考样品(的稀释范围)而获得标准化，其也允许将特定评分匹配至用于确定阳性或阴性的预设值，并且允许与生物学意义关联，例如：抗原的量与效力的关联，或抗体的量与免疫保护水平的关联。

ELISA设置的许多变体是已知的，但通常这些采用将抗原或抗体固定化至固相，例如固定化至微量滴定板的孔。当固定化抗体时，测试被称为‘捕获’或‘夹心’ELISA。接着添加测试样品，允许配体(例如待检测的抗原或抗体)结合。然后加入检测剂(抗体、抗原或其他结合组分)，其经常缀合至标记物，例如缀合至可诱导颜色反应的酶，所述颜色反应可以分光光度读取。其他类型的标记物可以使用发光、荧光或放射性。标记的检测剂的使用意在提供信号强度的扩增以增强测试灵敏度，但是，它也可引入背景信号，降低信噪比。

在ELISA方案的变体中，通过引入竞争性结合来改善测试特异性，在该情况下，测试被称为‘竞争-’、‘抑制-’、‘干扰-’、双重识别或‘阻断ELISA’。在此类测定中，测试样品中的因子(抗体或抗原)与标记的检测抗体/抗原竞争结合固定化至固相的分子(抗原或抗体)。这导致最大标记信号的下降，它是测量竞争因子的存在或量的灵敏方式。结果可以表示为最大ELISA信号的抑制百分比。

酶免疫测定的一般参考文献存在于各种出版物中，尤其是标准实验室教科书，诸如：‘The Immunoassay Handbook (第4版:Theory and applications of ligandbinding, ELISA and related techniques’; D. G. Wild编, 2013, ISBN-10:0080970370);和：‘The ELISA Guidebook’ (Methods in Molecular Biology, vol. 149,J. R. Crowther, Humana Press, 2000, ISBN-10:0896037282)。替代品是供应商的手册，诸如：“Technical guide for ELISA”, KPL Inc., Gaithersburg, MD, USA, 2013;和：Eli Lilly &Co.的“Assay guidance manual”，章节：Immunoassay methods, K.Cox等人，2012年5月。

关于检测和控制BVDV的一般概述是：OIE, Manual of Diagnostic Tests andVaccines for Terrestrial Animals 2015 (NN, 章节2.4.8)。

在一个实施方案中，根据本发明的用于区分动物的方法应用ELISA。这可以是任何类型，诸如阻断或夹心ELISA。可以将此类测试针对所需的特定区分类型进行优化和微调。这也可以取决于待检测的瘟病毒的类型或待检测的抗体的类型以及待筛选的动物测试样品的类型。技术人员完全能够应用这些技术并进行优化，以获得足够特异性和选择性的测试结果，对动物进行所需的区分。

这些方法现在能够实现DIVA原则的有效应用，以及大规模筛选和根除计划的组织和执行。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于诊断已经用根据本发明的疫苗接种疫苗的动物的用除了疫苗中包含的突变瘟病毒以外的瘟病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：

- 从所述接种疫苗的动物获得样品，和

- 通过在适当的免疫测定中使用所述疫苗中包含的突变瘟病毒或疫苗中包含的突变瘟病毒表达的嵌合Erns蛋白，测试所述样品中存在针对除了疫苗中包含的突变瘟病毒以外的瘟病毒的抗体。

显然，反过来也适用：

因此，在一个实施方案中，根据本发明的用于诊断感染的方法包括以下步骤：用针对Erns蛋白的抗体测试样品中存在除了疫苗中包含的突变瘟病毒以外的瘟病毒，所述抗体不与由所述疫苗中包含的突变瘟病毒表达的嵌合Erns蛋白特异性结合。

用于收集和制备样品的方法是本领域中众所周知的。此类样品可以是其中存在足够量的待检测的病毒或抗体的任何类型的生物样品。通常，这些样品可以是：血液、血清、乳、精液、尿液、粪便或组织样品，诸如耳朵穿刺物。

什么构成“适当的免疫测定”，例如用于检测非疫苗瘟病毒可以取决于样品、病毒的细节或待执行的测试的其他参数。选择和优化这种测试完全在技术人员的常规能力之内。通常，根据本发明的突变瘟病毒或由突变瘟病毒表达的嵌合Erns蛋白可以用作检测抗原。该病毒将被灭活，并且可以例如将病毒或嵌合Erns包被至用于这种免疫测定中的支持基质上。

在一个优选实施方案中，这种免疫测定是ELISA。

为了促进均根据本发明的区分方法和诊断方法，本发明还提供了用于实施这些方法的诊断测试试剂盒的组装和使用。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及包含根据本发明的突变瘟病毒或由突变瘟病毒表达的嵌合Erns蛋白的诊断测试试剂盒。

在根据本发明的诊断测试试剂盒的一个优选实施方案中，突变瘟病毒以灭活形式包含。

“诊断测试试剂盒”涉及用于执行均根据本发明的区分方法或诊断方法的部件试剂盒。所述试剂盒包含用于应用所述方法的一种或多种组分，具体地：根据本发明的突变瘟病毒或如对于本发明所述的嵌合Erns蛋白。所述突变瘟病毒或嵌合Erns蛋白应该在方便形式和容器中出现，任选具有用于样品稀释和孵育、封闭或洗涤的缓冲液，并且任选地具有如何执行所述方法和如何阅读和解释结果的说明书。

在一个实施方案中，所述试剂盒可以包含具有多个孔的容器，诸如微量滴定板。容器的孔可以经处理以含有用于根据本发明的方法中使用的一种或多种组分。

在根据本发明的诊断测试试剂盒的一个优选实施方案中，将根据本发明的突变瘟病毒或嵌合Erns蛋白固定化至微量滴定板的孔。

根据本发明的诊断测试试剂盒任选包含的说明书，例如可以写在含有试剂盒的成分的盒上；可以存在于该盒中的小册子上；或者可以是在试剂盒的经销商等的因特网网站上可见或可下载。

对于本发明，诊断测试试剂盒也可以是所述部件的提供(涉及商业销售)，例如在因特网网站上，用于在包含根据本发明的方法的测定法中组合使用。

诊断试剂盒诸如根据本发明的诊断试剂盒也被称为‘伴侣诊断剂’，因为其特别适合与标记疫苗、诸如根据本发明的疫苗组合使用。通过它们的组合使用，现在可以应用有效的控制程序来减少野生型瘟病毒在动物群体中的流行。

因此，在一个进一步方面，本发明涉及通过组合使用均根据本发明的疫苗和诊断测试试剂盒来控制来自偶蹄目的动物群体中的野生型瘟病毒的感染的方法。

本发明现在将通过以下非限制性实施例进一步描述。

实施例

实施例1：嵌合Erns基因的构建

构建嵌合Erns基因用于插入BVDV疫苗病毒的现有cDNA克隆。嵌合Erns基因由来自Bungowannah病毒的Erns基因组装，但嵌合Erns基因的3’部分基于BVDV-1毒株CP7病毒。

应用的方法和材料基本上基于Zemke等人(2010, Vet. Microbiol., vol. 142,p. 69-80)和Richter等人(2011, Virology, vol. 418, p. 113-122)描述的先前工作。Richter等人描述了Bungowannah病毒的cDNA克隆。

Zemke等人描述了具有Npro缺失的BVDV-1 CP7病毒的cDNA克隆的构建。从该cDNA拯救的病毒用于牛的疫苗接种，并显示为安全减毒的，并且能够提供针对BVDV-2病毒的异源攻击的有效免疫保护。

在本文使用的克隆质粒中，当适当时，cDNA侧接启动子、起始密码子和终止密码子和/或有用的限制酶位点。

基于完全合成的感染性cDNA克隆pBVDV-!b_synth_ΔNpro，用Bungowannah病毒Erns蛋白取代BVDV-1 CP7 Erns蛋白。为了Bungowannah病毒Erns蛋白和位于E1蛋白上游的多蛋白的正确加工，携带膜锚区和转运肽的CP7 Erns的C端得到保留。

使用引物Bungo_Erns_Ph_F (5‘-CTTTCAAGTCACAATGGGAACCAACGTGACACAATGGAAC-3‘) (SEQ ID NO:7)和Bungo_Erns_oTP_R (5‘-CGCGGTCCCTTGCCTGGCACTCTCTACTACCTCGGTGTAACCGTCAAC -3‘) (SEQ ID NO:8)以及作为模板DNA的合成质粒Bungo_C-E2mod_pMK_RQ (Geneart)扩增Bungowannah病毒Erns编码区。

通过PCR使用以下两种引物从Bungowannah cDNA构建体(Richter，同上)分离Bungowannah Erns基因：Bungowannah Erns基因的5'侧的正义引物，从衣壳基因的末端开始：Bungo_Erns_Ph_F: 5‘-CTTTCAAGTCACAATGGGAACCAACGTGACACAATGGAAC -3‘ (SEQ IDNO:7)，以及区域Erns CP7/Erns Bungowannah病毒的负义引物：BungoErns_oTP_R：5‘-CGCGGTCCCTTGCCTGGCACTCTCTACTACCTCGGTGTAACCGTCAAC -3‘, (SEQ ID NO:8)。

通过无限制靶向克隆使用Phusion聚合酶(New England Biolabs)将619 bp PCR片段插入质粒pBVDV-Ib_synth_ ΔN^pro中。所得cDNA构建体被称为：pBVDV-1CP7_ΔNpro_Erns-Bungo/CP7 (SEQ ID NO:9)。

或者，也可以使用适当的PCR或rtPCR引物从SEQ ID NO:3的DNA拷贝或Bungowannah病毒基因组分离株开始获得Bungowannah Erns基因。

所有应用的方法和材料均为标准技术，并且根据制造商的说明使用商业试剂盒和工具，简而言之：克隆质粒在大肠杆菌DH10B™细胞(Invitrogen)中扩增。通过使用QiagenPlasmid Mini™或Midi试剂盒纯化质粒DNA。使用Big Dye™终止子v1.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems)进行测序。核苷酸序列用自动测序仪(3130 Genetic Analyzer™,Applied Biosystems)读取并使用Genetics Computer Group软件版本11.1 (AccelrysInc.)和Genious™软件(Biomatters Ltd)分析。

实施例2：突变瘟病毒的回收和扩增：

新形成的cDNA构建体pBVDV-1CP7_ΔNpro_Erns-Bungo/CP7用于SmaI线性化cDNA构建体的体外RNA转录，其通过T7 RiboMax™大规模RNA生产系统(Promega)根据制造商的说明进行。在琼脂糖凝胶电泳后通过溴化乙锭染色估计RNA的量。对于转染，将1x10^7个KOP-R或MDBK细胞或另一种合适的反刍动物细胞系使用胰蛋白酶溶液分离，用PBS洗涤，与1-5μg体外合成的RNA混合，并使用Gene Pulser™ Xcell电穿孔系统(Bio-Rad)电穿孔(在850V、25μF、156ω下两次脉冲)。为了病毒回收，将转染细胞的上清液在转染后72小时收获并接种至合适的反刍动物细胞系中。对于病毒储备物以及生长动力学实验测定感染性滴度。重组病毒的身份通过测序证实。

在孵育转染的细胞后，可以获得突变的BVDV瘟病毒。挑取几个克隆，并将这些在KOP-R或MDBK细胞中扩增数代，以选择复制克隆并扩增它们的滴度。

将来自超过20个克隆的重组病毒传代，并且在几代后，在通过离心澄清的细胞培养上清液中或者在澄清的整个培养物的冻融样品中检查病毒滴度。上清液中的滴度通常稍高于冻融样品中的滴度。选择两种重组病毒(编号1和10)用于进一步研究；在第20代时，这两种均生长至1x10^5 PFU/ml的滴度。

实施例3：扩增的突变瘟病毒的测序

两种选择的重组病毒BVDV-Ib_synth_dNpro_Erns_Bungowannah (克隆编号1和10)进行其全基因组的核苷酸测序，以检测是否已发生任何相关突变。使用'新一代测序'方法，在传代水平13和19+1进行测序，并且与亲代病毒BVDV-Ib_synth_dNpro相比仅可以观察到非常有限数量的突变：克隆1没有引起氨基酸交换的突变，仅在P13时在E1中在C 1531A处具有一个沉默突变；P19+1具有Bungowannah Erns基因中的一个沉默突变C1156T，以及在NS5B基因中在nt G10723A处的一个突变。克隆10：具有一些引起氨基酸交换的点突变：P13在G/C741的衣壳基因和E2基因C/A 2431中含有混合群体，而P19具有两个点突变，两者都引起NS2基因中在G3417C和G3968C处的氨基酸交换，以及4个沉默突变，NS3基因中的一个G6748A，NS4B基因中在A7240C和A7348G处的两个，以及NS5A基因中在A8908G处的一个。

考虑到这些是RNA病毒，并且看到相对高的代数，这些是非常好的结果。因此，所研究的重组病毒的遗传稳定性已被充分证明，并且均用于进一步研究。

实施例4：多步病毒生长动力学

为了进一步表征BVDV-Ib_synth_ΔN^pro_E^rns_Bungowannah克隆1和10，研究了多步生长动力学。

在P23时，KOP-R细胞用BVDV-Ib (Cp7)、BVDV-Ib_synth_ΔN^pro (Cp7_ΔNpro)、BVDV-Ib_synth_ΔN^pro_E^rns_Bungowannah (Cp7_ΔNpro_Erns Bungo)克隆1和10以0.1的m.o.i.接种2小时。将应用的病毒接种物反滴定以测定实验中实际使用的滴度。孵育后，将细胞洗涤两次，添加新鲜培养基并在接种后0、24、48、72和96小时冷冻细胞。解冻后，在MDBK-细胞上滴定澄清的细胞培养上清液以测定每个时间点的病毒滴度。用BVDV NS3蛋白特异性的抗体(单克隆抗体WB103/105(可得自APHA Scientific, New Haw, Addlestone,Surrey, UK))通过免疫荧光染色检测病毒，并且计算滴度并以TCID50/ml表示。该实验进行两次，并且一次代表性实验的结果呈现于图1中。

Erns BVDV_synCp7_ΔNpro_Erns Bungo克隆1和10病毒表明当与野生型病毒BVDV-1 CP7相比时减少的生长，但与重组BVDV疫苗病毒BVDV1 CP7_ΔNpro相比，它们的复制仅轻微受损。

实施例5：牛中突变瘟病毒疫苗–灭活疫苗的血清学检测

进一步扩增克隆10病毒，直至第21代。收获培养物上清液并储存，直至使用。克隆10病毒(构建体：BVDV-Ib_synth_ΔNpro_Erns_Bungowannah)的滴度则已经改善至4.6 x 10^5PFU/ml。通过基因组测序再次验证病毒基因组身份。该病毒材料用于测试其在牛中诱导血清应答的能力。

比较以下病毒构建体：

- BVDV-Ib_synth_ΔNpro (dNpro): BVDV疫苗毒株，其具有Npro的减毒缺失(除了12个N端氨基酸)

- BVDV-Ib_Erns_Bungowannah (Erns-Bungo): 根据本发明的突变瘟病毒，其包含根据SEQ ID NO:5的嵌合基因

- 克隆10病毒(简称：dNpro_Erns Bungo)，也是根据本发明的突变瘟病毒，其邻接于根据SEQ ID NO:5的嵌合基因包含Npro的缺失(除了N端12 aa)

- 野生型Bungowannah病毒(BungoV)。

5.1 病毒抗原制备

获得来自所有四种病毒的病毒培养物上清液并使用BEI灭活。在细胞上在两代中验证灭活，并通过免疫荧光使用针对BVDV NS3和Bungowannah Erns的抗血清进行测试。没有检测到病毒生长，证实完全灭活。

5.2 疫苗接种：

对于每种病毒，将4 ml BEI灭活的病毒抗原与1 ml Polygen™佐剂混合，至最终浓度为12 % v/v。该混合物以1 ml/剂量通过肌肉内注射施用于小牛；每种抗原一头小牛。灭活疫苗抗原含量为10^7和10^8 TCID50/ml之间，除了克隆10病毒抗原，其具有10^5 - 10^6TCID50/ml之间的较低抗原含量，用于三次疫苗接种。

疫苗接种时间表为：第0天：第1次疫苗接种；第21天：第1次加强疫苗接种；第42天：第2次加强疫苗接种。在第0、21、28、35、42和49天收集血液样品。然后在不同的测定中测试来自这些样品的血清。

5.3 血清学测试

5.3.1 病毒中和测定

进行血清中和测定以确定针对BVDV-1b和/或Bungowannah病毒诱导的中和抗体的强度。

将牛血清在96孔微量滴定板中以Log2步骤稀释，并与30 - 300 TCID50/ml的活病毒BVDV或Bungowannah在37℃下孵育1小时。随后，每孔添加1x10^5个MDBK细胞。在孵育后3天，通过使用针对瘟病毒NS3蛋白的单克隆抗体(其识别BVDV和Bungowannah病毒两者：WB112 (APHA Scientific))将细胞免疫荧光染色来测定每ml的中和剂量50％ (ND50)。

结果呈现于图2中，并且证明两种突变瘟病毒都可以诱导良好的BVDV中和滴度，接近由BVDV疫苗毒株(dNpro)诱导的那些。尽管来自克隆10疫苗的滴度最初低，因为抗原含量较低。这在第一次加强后快速改善。Bungowannah病毒不能诱导抗BVDV抗体。

关于抗Bungowannah抗体，这些仅由Bungowannah病毒疫苗诱导；表明甚至在突变瘟病毒Erns-Bungo和克隆10中的大部分Bungowannah Erns基因的表达也不诱导Bungowannah中和抗体。

5.3.2 免疫荧光抑制测定

开发免疫荧光抑制(IFI)测定以允许流式细胞术实验。

基本上如Beer等人 (2000, Vet. Microbiol., vol. 77, p. 195 - 208)中所述进行IFI。简而言之: 用BVDV毒株NCP7感染MDBK-细胞。接种后三天，将细胞收获，用4％多聚甲醛在室温下固定15分钟。随后，将细胞在室温下用0.01％洋地黄皂苷透化5分钟，并用FACS缓冲液洗涤三次。将1x10^5个这些细胞与100μl来自灭活疫苗接种的牛血清(在FACS缓冲液中1:2稀释或仅在FACS缓冲液中)孵育1小时。接下来，将BVDV Erns蛋白特异性的单克隆抗体WB210 (APHA Scientific) 1:100稀释，并添加并孵育10分钟。其后，将细胞洗涤三次，并添加100μl商业的与ALEXA488标记物缀合的山羊抗小鼠抗体并孵育5分钟。在三个洗涤步骤后，使用FACSscan™细胞荧光计和软件CellQuest (两者：Becton Dickinson)进行流式细胞术分析。

感染细胞的数量通过抗NS3染色(WB112)测定，并且发现为100％。通过测量WB210特异性结合的中值荧光强度(MFI)来测定IFI-值。Bungo_Erns未感染的对照细胞的染色的中值荧光强度被设定为100％抑制(不存在Bungo_Erns，检测的荧光强度被设定为背景)；BungoV感染细胞的Bungo_Erns特异性抗体染色的MFI被设定为0％抑制(Bungo_Erns对于检测抗体是完全可接近的；针对对照均一化)。％抑制被测定为 = (MFI NCP7 WB210-MFI样品)/MFI NCP7*100并针对对照WB210均一化。

测试的对照样品是：用BVDV-Id免疫的牛血清(PC)和BVDV特异性抗体阴性的血清(NC)。

IFI测定的结果呈现于图3中，并且显示仅阳性对照血清：WB210和PC以及针对BVDV疫苗(dNpro)的血清从第49天起显示高于截止值的IFI信号(BVDV-Erns WB210的80％抑制)。测试的其他血清是阴性的，或者低于截止值。

这证明抗BVDV-Erns抗体没有被任何突变瘟病毒(Erns-Bungo或克隆10)的疫苗诱导，仅被BVDV疫苗本身(dNpro)诱导。

5.3.3 竞争性ELISA

为了能够确定诱导的BVDV Erns特异性抗体的水平，基于市售抗BVDV Erns单克隆抗体WB210建立BVDV Erns的竞争性ELISA。这与商业的总抗BVDV抗体测试进行比较。

试剂和板取自市售BVDV总Ab™试剂盒(Idexx)。该测定中使用的抗体是WB210和山羊抗小鼠POD (Dianova)。将100μl样品稀释液应用至每个孔中，并将商业抗体在PBS-WB210中1:400稀释。将这些抗体和来自灭活疫苗试验的牛血清在单独管中混合，添加至板中并在室温下孵育90分钟。将板用PBS+0.1% Tween™20洗涤5次。将二抗-缀合物山羊抗小鼠POD在TBS+2%脱脂奶粉+ 2％鱼明胶中1:1000稀释。每孔添加100μl并在37℃下孵育60分钟。该第二次孵育后，将板用PBS再次洗涤5次，并适当干燥。每孔应用100μl TMB底物并孵育。3分钟后添加终止溶液。测量在450 nm处的吸光度。％抑制值如下计算：(OD 纯Ab – OD样品) /OD 纯Ab*100。

根据制造商的说明进行市售的BVDV总Ab™间接ELISA (Idexx)。

测试来自首次采血和第一次免疫后49天(dpi)的牛血清中BVDV Erns-和总BVDV特异性抗体的存在。

对照血清为：来自先前动物试验的牛血清：抗BVDV (PC)，抗Bungowannah (PCBungo)和抗BVDV阴性(NC)。

结果呈现于图4中，并且表明 –如预期- 仅用BVDV疫苗(dNpro)免疫的动物的血清抑制了BVDV Erns特异性抗体WB210的结合。然而，在用BVDV疫苗以及突变瘟病毒Erns-Bungo或克隆10(但不是Bungowannah病毒)免疫的动物的血清中发现了一般BVDV特异性抗体。

5.4 结论

用根据本发明的突变瘟病毒(克隆10和Erns-Bungo)的BEI灭活病毒抗原免疫都诱导了强大水平的抗BVDV特异性中和抗体。因为已知BVDV中和抗体在这些水平与针对BVDV感染和疾病的保护相关，因此这些结果证明了这些突变瘟病毒作为针对BVDV感染和疾病的有效灭活疫苗表现的能力。

另外，在进行的不同测定中未发现BVDV Erns特异性抗体，表明这些突变瘟病毒在其在BVDV疫苗中使用后能够基于BVDV Erns蛋白进行非常独特的标记物筛选。

实施例6：牛中突变瘟病毒疫苗–活疫苗的血清学检测

根据本发明的突变瘟病毒(克隆1和10)的疫苗和标记能力的进一步研究在牛中进行，这次作为活病毒疫苗。

6.1 病毒抗原的制备

BVDV-Ib_synth_ΔNpro_Erns_Bungowannah克隆1和10在IFN抑制剂A存在的情况下在KOP-R细胞上生长。接种后3天收获澄清的培养上清液，并在MDBK细胞上滴定。通过用针对NS3的单克隆抗体WB103/105免疫荧光染色来测定滴度。第19+1代的滴度对于克隆1和10病毒非常相当：分别为2.2和4.6 x10^6 TCID50/ml。先前已证明了它们的遗传稳定性。

6.2 疫苗接种

免疫四头约6个月龄的小牛：2只用克隆1病毒免疫且两只用克隆10病毒免疫。三个疫苗接种日期的接种剂量为：对于克隆10病毒，约1x10^7，且对于克隆1病毒，约3x10^6。

接种时间表为：第0天：第1次疫苗接种；第21天：第1次加强疫苗接种；第42天：第2次加强疫苗接种。在第0、21、28、43和49天收集血液样品。然后在不同的测定中测试来自这些样品的血清。

6.3 血清学测试

6.3.1 中和抗体

如上所述在病毒特异性血清中和测定中测定BVDV或Bungowannah病毒特异性的中和抗体的产生；结果呈现于图5中。

第一次免疫诱导针对BVDV的低中和抗体滴度(1.5 - 16 ND50/ml)，而在第一次加强疫苗接种后看到强烈的加强效应，将抗BVDV滴度增加直至256至1024 ND50/ml。第二次加强疫苗接种没有进一步显著增加滴度。

随着时间没有检测到Bungowannah病毒特异性的显著中和抗体。

6.3.2 BVDV NS3特异性抗体

通常在针对BVDV接种疫苗的牛中，中和抗体主要针对病毒蛋白E2。也产生针对NS3(p80)和Erns的非中和抗体。然而，仅在复制病毒存在后才诱导显著水平的抗NS3抗体，灭活的病毒抗原则不诱导。为了测定在这些试验中诱导的NS3特异性抗体的水平，使用活疫苗。遵循制造商的说明，使用BVDV p80抗体™竞争性ELISA试剂盒(IDvet, France)。

结果呈现于图6中，表明在第一次加强疫苗接种后3周(第一次免疫后第42天)时，发现所有四头动物都是NS3特异性抗体明显阳性的。

6.3.3 竞争性ELISA

为了测定BVDV Erns特异性抗体的水平，作为DIVA方法的适用性的证据，使用WB210单克隆抗体进行BVDV Erns的竞争性ELISA。测试设置和性能如上所述。

结果呈现于图7中。最重要的是：在用活BVDV-Ib_synth_ΔNpro_Erns_Bungowannah克隆1或10免疫的牛的血清中未发现BVDV Erns特异性抗体。尽管如此，总BVDV特异性抗体的存在使用BVDV总Ab™间接ELISA (Idexx)证实。作为指标，动物2克隆10的S/P值为0.27，仅恰好在截止值以下。

6.4 结论

就像用根据本发明的突变瘟病毒制成的灭活疫苗接种疫苗的结果一样，用来自这些突变瘟病毒的活疫苗的疫苗接种也证明了有效的疫苗接种和优异的标记功能性。

这是因为当用活BVDV-Ib_synth_ΔNpro_Erns_Bungowannah病毒克隆1或克隆10免疫牛时，诱导了稳健的BVDV特异性抗体应答。使用抗体证明了这一点，所述抗体为：NS3特异性、BVDV中和性和总BVDV特异性的。这证实了作为针对BVDV的疫苗(既作为活病毒也作为灭活病毒)的适合性。

重要的是，在这些血清中使用具有BVDV Erns-抗体的竞争性ELISA没有检测到BVDV Erns特异性的抗体，这清楚地证实了DIVA标记原理的可行性。

实施例7：进行中的进一步实验

正在计划实验动物中的进一步测试。目前正在进行的是在6个月龄年幼小牛的组中的试验，每组有5头动物。该实验将测试根据本发明的活减毒突变瘟病毒的不同疫苗接种方案：通过单次或双次疫苗接种。为了比较，将一起测试BVDV的活减毒疫苗毒株，以便在单次疫苗接种时间表中比较减毒Npro缺失本身的减毒效果。Npro缺失突变体仍然具有Npro的N端12个氨基酸，就像这里测试的突变瘟病毒的情况一样。

组合的不同组如下分配：

1. 未接种疫苗的对照

2. BVDV-Ib_synth_Δnpro，单次疫苗接种

3. BVDV-Ib_synth_ΔNpro_Erns_Bungo，克隆1，单次疫苗接种

4. BVDV-Ib_synth_ΔNpro_Erns_Bungo，克隆1，引发和加强疫苗接种。

实验的时间表为：第1天：第一次疫苗接种；第21天：第二次疫苗接种(第4组)；第42天：BVDV-1b攻击；和第70天：试验结束。

以每周间隔进行血清采样。通过肌肉内途径的疫苗接种剂量将为1x10^6TCID50。攻击将通过鼻内途径，其使用2x10^6TCID50BVDV-Ib SE5508的剂量。

采用疫苗和攻击将通过病毒血症进行检查：在第一次接种疫苗后和攻击后，通过监测纯化的白细胞，和测试疫苗或攻击病毒的鼻脱落(通过血清学和/或PCR区分)最多达连续14天。

附图说明

图1：

BVDV-Ib_synth_ΔN^pro_E^rns_Bungowannah (Cp7_ΔNpro_Erns Bungo)克隆1和10在P23处与重组亲代病毒BVDV-Ib (Cp7)和BVDV-Ib_synth_ΔN^pro (Cp7_ΔNpro)相比的多步生长曲线动力学。以0.1的m.o.i.感染KOP-R细胞。

图2：

灭活疫苗接种后的血清中和测定的结果。数字(352、353、365和321)是小牛耳标数字。宽箭头表示接种疫苗/加强的日期。

图3：

免疫荧光抑制(IFI)测定。将中值荧光强度值针对未感染细胞的对照染色(对照WB210)均一化。显示了两次实验的平均值和标准偏差。PC是用BVDV-Id免疫的牛血清且NC是BVDV特异性抗体阴性的血清。

图4：

来自灭活抗原疫苗接种试验的牛血清中的BVDV特异性抗体的ELISA测定的结果。

小图A：BVDV Erns抗体的竞争性ELISA：在牛血清中存在BVDV_Erns特异性抗体的情况下，在竞争性ELISA中抑制和检测WB210 (BVDV Erns特异性抗体)与固定化BVDV的结合。来自用携带Bungo-Erns的构建体免疫的牛的血清不能阻断BVDV Erns-抗体WB210的结合。

小图B：总抗BVDV抗体：BVDV总Ab间接ELISA (Idexx)用于检测牛血清中的总BVDV特异性抗体。如果S/P值大于0.3，则样品被认为是阳性的。

0d = 首次免疫前的初次采血；49dpi = 首次免疫后49天。

图5：

血清中和测定的结果，所述血清中和测定确定用根据本发明的活突变瘟病毒(克隆1、克隆10)接种疫苗的牛的血清中针对BVDV和针对Bungowannah病毒的中和抗体。宽箭头指示免疫日期。

图6：

通过根据本发明的活突变瘟病毒(克隆1和克隆10)的活病毒疫苗接种诱导的NS3特异性抗体的检测。通过随时间使用BVDV p80抗体™竞争性ELISA试剂盒(IDvet)进行检测。宽箭头指示免疫日期。如果S/N %值低于40％，则样品被认为是阳性的。

图7：

用根据本发明的活突变瘟病毒(克隆1和克隆10)的疫苗接种后49天时牛血清中的BVDV特异性抗体的检测的结果。

小图A：在牛血清中存在BVDV Erns特异性抗体的情况下，单克隆抗体WB210 (BVDVErns特异性)与固定化BVDV的结合被抑制，如竞争性ELISA中所检测。使用单克隆抗体WB210作为检测剂，克隆1和10两者都不诱导可检测的BVDV Erns特异性抗体。

小图B：检测牛血清中的总抗BVDV特异性抗体的BVDV总Ab™ ELISA的结果。如果S/P值大于0.3，则样品被认为是阳性的。对照牛血清：BVDV阳性(PC)，Bungowannah阳性(PCBungo)和BVDV阴性(NC)。

Claims (21)

1.具有其中Erns基因突变的基因组的突变瘟病毒，其特征在于突变的Erns基因是嵌合Erns基因，且所述嵌合Erns基因由5’部分和3’部分组成，其中所述5’部分占所述嵌合Erns基因的60-95％，且所述3’部分占所述嵌合Erns基因的剩余部分，且其中所述5’部分由来自遗传远离所述突变瘟病毒的瘟病毒的Erns基因的相应部分组成，且其中所述3’部分由来自与所述突变瘟病毒遗传接近的瘟病毒的Erns基因的相应部分组成。

2.根据权利要求1所述的突变瘟病毒，其特征在于所述突变瘟病毒是选自以下的瘟病毒：牛病毒性腹泻病毒(BVDV)；经典猪瘟病毒(CSFV)；和边界病病毒。

3.根据权利要求2所述的突变瘟病毒，其特征在于来自遗传远离的瘟病毒的Erns基因是来自选自以下的瘟病毒的Erns基因：羚羊瘟病毒、Bungowannah病毒；挪威大鼠瘟病毒；非典型猪瘟病毒(APPV)；和中菊头蝠瘟病毒。

4.根据权利要求2或3所述的突变瘟病毒，其特征在于来自遗传接近的瘟病毒的Erns基因是来自选自以下的瘟病毒的Erns基因：BVDV-1；BVDV-2；CSFV；边界病病毒；驯鹿瘟病毒；长颈鹿瘟病毒；和HoBi瘟病毒。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的突变瘟病毒，其特征在于所述突变瘟病毒是减毒瘟病毒。

6.根据权利要求5所述的突变瘟病毒，其特征在于所述突变瘟病毒具有其中Npro基因突变的基因组。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的突变瘟病毒，其特征在于所述突变瘟病毒是BVDV，且所述BVDV是细胞病变生物型的。

8.用于构建根据权利要求1-7中任一项所述的突变瘟病毒的方法，所述方法包括将瘟病毒基因组中的Erns基因突变为如权利要求1中所定义的嵌合Erns基因。

9.宿主细胞，其包含根据权利要求1-7中任一项所述或可通过权利要求8的方法获得的突变瘟病毒。

10.动物疫苗，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的突变瘟病毒或根据权利要求9所述的宿主细胞，或其任何组合，以及药学上可接受的载体。

11.用于制备根据权利要求10所述的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：

- 用根据权利要求1-7中任一项所述的突变瘟病毒感染宿主细胞的培养物，

- 孵育感染的宿主细胞培养物，

- 收获培养物或其部分，和

- 将培养物或其部分与药学上可接受的载体混合。

12.根据权利要求1-7中任一项所述的突变瘟病毒或根据权利要求9所述的宿主细胞，或其任何组合，其用于动物疫苗中。

13.根据权利要求1-7中任一项所述的突变瘟病毒或根据权利要求9所述的宿主细胞或其任何组合用于制备动物疫苗的用途。

14.根据权利要求10所述的疫苗用于预防或减少动物中的瘟病毒感染或相关疾病体征的用途。

15.用于预防或减少动物中的瘟病毒感染或相关疾病体征的方法，所述方法包括将根据权利要求10所述的疫苗施用于所述动物。

16.将动物接种疫苗用于预防或减少瘟病毒感染或相关疾病体征的方法，其包括向所述动物施用根据权利要求10所述的疫苗的步骤。

17.用于区分用根据权利要求10所述的疫苗接种疫苗的动物与用除了疫苗中包含的突变瘟病毒以外的瘟病毒感染的动物的方法，所述方法包括使用针对Erns蛋白的抗体，所述抗体不与由疫苗中包含的突变瘟病毒表达的嵌合Erns蛋白特异性结合。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述抗体与来自瘟病毒的Erns蛋白特异性结合，所述瘟病毒选自：BVDV-1；BVDV-2；CSFV；和边界病病毒。

19.用于诊断用根据本发明的疫苗接种疫苗的动物的除了疫苗中包含的突变瘟病毒以外的瘟病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：

- 从所述接种疫苗的动物获得样品，和

- 通过在免疫测定中使用所述疫苗中包含的突变瘟病毒或疫苗中包含的突变瘟病毒表达的嵌合Erns蛋白，测试所述样品中存在针对除了疫苗中包含的突变瘟病毒以外的瘟病毒的抗体。

20.诊断测试试剂盒，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的突变瘟病毒或由突变瘟病毒表达的嵌合Erns蛋白。

21.通过组合使用根据权利要求10所述的疫苗和根据权利要求20所述的诊断测试试剂盒来控制来自偶蹄目的动物群体中的瘟病毒的感染的方法。