RS56579B1 - Poboljšano dijagnostikovanje vakcina - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na poboljšanje dijagnostičkih metoda i opreme za obavljanje metode za razlikovanje između (a) životinja kojima je dat himerni pestivirus i (b) životinja koje su inficirane virusom goveđe virusne dijareje (eng. VGVD) ili su vakcinisane standardnom VGVD vakcinom.

OBJAŠNJENJE PRONALASKA

[0002] Pestivirusi, uključujući i virus goveđe virusne dijareje (VGD virus, ili VGVD), izolovani su kod nekoliko vrsta životinja, kako domaćih tako i divljih. Identifikovani domaćini za VGVD obuhvataju bivole, antilope, losove i druge vrste jelena, a posebni sojevi pestvirusa otkriveni su kod žirafa i pronghorn antilope. VGVD je mali RNK virus iz familije Flaviviridae. U bliskoj je vezi sa pestivirusima koji izazivaju graničnu bolest kod ovaca i klasičan svinjski grip kod svinja.

[0003] Bolest koju izaziva VGVD širi se brzo kod goveda i može da izazove ekonomsko opustošenje. VGVD infekcija kod goveda može da dovede do problema u razmnožavanju i može da izazove abortuse ili prevremeno rođenje. VGVD može da prolazi kroz placentu steonih krava i da dovede do rođenja uporno inficirane (UI) teladi koja je imunotolerantna na virus i uporno viremična tokom čitavog života. Inficirana goveda takođe pokazuju znake "bolesti sluzokože", za koju je karakteristična povišena telesna temperature, dijareja, kašalj i ulceracije sluzokože digestivnog trakta. Ove uporno inficirane životinje predstavljaju izvor rasejanja virusa unutar stada kao i za izbijanje bolesti sluzokože i imaju velike predispozicije mikroorganizmima odgovornih za izazivanje bolesti creva ili pneumonije.

[0004] Među trenutno dostupnim VGVD vakcinama su i one koje sadrže hemijski inaktivirane divlje tipove virusa ili one koje sadrže modifikovane žive (MŽ) VGVD. VGVD može se oslabiti ponavljanim prolaskom kroz ćelije goveda ili svinja ili hemijski indukovanim mutacijama koje virusima dodaju fenotip osetljiv na tepmperaturu. Međutim, postojeće inaktivirane i ML vakcine ne omogućavaju razlikovanje između vakcinisanih i prirodno inficiranih životinja.

[0005] "Obeležena" vakcina, koja može da sadrži dodatnu antigensku depojamant koja ne postoji u divljem tipu virusa, ili pak da ne sadrži antigensku depojamantu koja je prisutna u divljem tipu virusa, mogu predstavljati efikasan alat za kontrolu VGVD infekcije u ovoj oblasti. Publikacija za patente SAD-a (US Patent Publication) br. 2010/136055 (Luo et al.,) opisuje poslednju vakcinu zasnovanu na himernoj pestivirus vakcini u kojoj je E<rns>protein u VGVD zamenjen E<rns>proteinom iz pronghorn pestivirusa. Ovaj himerni pestivirus deponovan je kao UC 25548 sa ATCC<®>i dodeljena mu je ATCC<®>oznaka depozita PTA-9939. U pratnji odgovarajućeg dijagnostičkog testa, upotreba ovog himernog pestivirusa omogućila bi diferencijaciju između životinja kojima je data vakcina, u odnosu na životinje inficirane divljim tipom VGVD ili imunizirane standardnom VGVD vakcinom.

SAŽETAK PRONALASKA

[0006] Prema predmetnom pronalasku obezbeđen je postupak za određivanje prisustva ili odsustva antitela koji se specifično vezuje za protein E<rns>virusa goveđe virusne dijareje (VGVD) u kompetitivnom ELISA testu, navedeni metod sastoji se od sledećih koraka: a) inkubiranja uzorka goveđeg seruma u prisustvu E<rns>proteina pronghorn pestivirusa, na čija antitela, koja unakrsno reaguju na E<rns>protein divljeg VGVD, mogu da se vezuju, pri čemu se navedeni uzorak inkubira bilo ranije ili istovremeno sa korakom b);

b) dodavanje navedenog inkubiranog uzorka na test pločicu sa nanetim VGVD E<rns>proteinom, na koji se specifično vezuje navedeno antitelo koje će se detektovati; i

c) naknadno detektovanje prisustva ili odsustva navedenog antitela u navedenom uzorku.

[0007] Ovaj metod određuje da li je životinja bila izložena VGVD ili je bila vakcinisana VGVD vakcinom, pri čemu životinja inficirana sa VGVD ili vakcinisana standardnom VGVD vakcinom, poseduje antitelo koje se specifično vezuje za barem jedan E<rns>epitop koji je pristupan u VGVD, ali koji nije prisutan u himernom pestivirusu koji više ne pokazuje ekspresiju E<rns>proteina iz VGVD, ali pokazuje ekspresiju E<rns>proteina iz pronghorn pestivirusa u VGVD.

[0008] Dijagnostička oprema koja se koristi da se sprovede ova metoda iz pronalaska za određivanje da li je životinja bila izložena VGVD virusu ili je vakcinisana standardnom VGVD vakcinom, navedena oprema sastoji se od reagenasa sposobnih da detektuju antitela na barem jedan E<rns>epitop koji je prisutan u VGVD, ali koji nije prisutan i u himernim pestivirusima koji više nemaju ekspresiju E<rns>proteina iz VGVD, ali imaju ekspresiju E<rns>proteina iz pronghorn pestivirusa u VGVD.

[0009] U skladu s tim, ovde je obezbedjena i upotreba kompleta za kompetitivni ELISA test ovog pronalaska, gde se navedeni komplet sastoji od test pločice obložene VGVD E<rns>proteinom i reagensom koji olakšava otkrivanje prisustva ili odsustva antitela na barem jedan VGVD E<rns>epitop koji nije prisutan u E<rns>proteinu pronghorn pestivirusa, gde je jedan od navedenih reagenasa E<rns>protein pronghorn pestivirusa na koja se vezuju antitela koja unakrsno reaguju VGVD E<rns>.

[0010] Takođe je ovde opisan a upotreba antitela koja se vezuju na epitop prisutan u VGVD ili standardni VGVD vakcine, ali koji epitop e nije prisutan na himernom pestivirusu koji više ne pokazuje ekspresiju E<rns>proteina iz VGVD, ali pokazuje ekspresiju E<rns>proteina iz pronghorn pestivirusa u VGVD.

[0011] Metod ovog pronalaska može se takođe koristiti za određivanje da li životinja ima antitela koja se specifično vezuju za E<rns>protein u VGVD.

[0012] U metodu ovog pronalaska, korak inkubacije navedenog uzorka goveđeg seruma sa E<rns>proteinom pronghorn pestivirusa ili njegovim fragmentom, dešava se pre koraka detekcije prisustva ili odsustva navedenog antitela u dotičnom uzorku.

[0013] U sledećoj varijanti, metoda ovog pronalaska omogućava određivanje prisustva ili odsustva antitela koje se specifično vezuje za E<rns>protein u VGVD, pri čemu se navedeno antitelo specifično vezuje za najmanje jedan epitop e prisutan u E<rns>proteinu VGVD ali nije prisutan u E<rns>proteinu pronghorn pestivirusa.

[0014] U sledećoj varijanti, metoda ovog pronalaska omogućava određivanje prisustva ili odsustva antitela koje se specifično vezuje za E<rns>protein u VGVD, pri čemu prisustvo antitela ukazuje da je životinja bila ili inficirana sa VGVD ili vakcinisana standardnom VGVD vakcinom.

[0015] U sledećoj varijanti, metoda ovog pronalaska omogućava određivanje prisustva ili odsustva antitela koje se specifično vezuje za a VGVD E<rns>protein, gde odsustvo navedenog antitela ukazuje da: a) životinja nije bila 1) inficirana sa VGVD, ili 2) vakcinisana standardnom VGVD vakcinom; ili b) vakcinisana himernim pestivirusom koji pokazuje ekspresiju E<rns>proteina pronghorn pestivirusa.

[0016] Ovde opisana metoda takođe se može koristiti za određivanje prisustva ili odsustva u uzorku antitela koje se specifično vezuje za E<rns>protein u VGVD, kada je uzorak seruma dobijen od životinje koja je prijemčiva na VGVD infekciju, kao što su goveda, ovce, koze ili vrste svinja, poželjno goveda.

[0017] U sledećoj varijanti, upotreba kompleta je obezbeđena za sprovođenje kompetitivnog ELISA testa prema postupku iz ovog pronalaska, pri čemu pomenuti komplet sadrži test pločicu sa nanetim E<rns>proteinom VGVD E<rns>i reagensima koji olakšavaju otkrivanje prisustva ili odsustva antitela na najmanje jedan VGVD E<rns>epitop koji nije prisutan u E<rns>proteinu pronghorn pestivirusa, pri čemu je jedan od navedenih reagensa E<rns>proteina pronghorn pestivirusa na koji unakrsno reaguju antitela sa E<rns>vezivanjem za VGVD.

[0018] U sledećoj varijanti, upotreba kompleta za određivanje prisustva ili odsustva antitela prema postupku iz ovog pronalaska sadrži kao jedan od reagensa kompleta, antitelo koje se specifično vezuje za epitop prisutan u VGVD ili standardnoj VGVD vakcini, ali koji epitop nije prisutan u E<rns>proteinu pronghorn pestivirusa.

[0019] U sledećoj varijanti, ovaj pronalazak obezbeđuje metod određivanja da li životinja poseduje antitelo koje se specifično vezuje za VGVD E<rns>protein, pri čemu se navedeno antitelo specifično vezuje za epitop prisutan u VGVD E<rns>proteinu, ali koji epitop nije prisutan u E<rns>proteinu pronghorn pestivirusa.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0020] Sledeće definicije mogu se primeniti na pojame koji se koriste u opisu izvođenja pronalaska.

[0021] Ukoliko ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički pojmovi koji se koriste u vezi sa ovim pronalaskom imaju značenja koja uobičajeno razumeju stručnjaci u ovoj oblasti. Dalje, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, pojmovi u jedniniu podrazumevaju množinu a pojmovi u množini podrazumevaju jedninu.

[0022] "O" ili "približno", kada se koristi u vezi sa merljivom numeričkom varijablom, odnosi se na indikovanu vrednost varijable i na sve vrednosti varijable koje su unutar eksperimentalne greške navedene vrednosti (npr. u okviru 95% intervala poverenja za aritmetičku sredinu) ili unutar 10% navedene vrednosti, u zavisnosti od toga šta je veće.

[0023] Pojam "životinja", kako se ovde koristi, podrazumeva svaku životinju koja je podložna VGVD infekcijama, uključujući, između ostalog, goveda, ovce, koze i svinje, kako domaće tako i divlje.

[0024] Pojam "antitelo" ili "antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul imunoglobulina koji se može vezati za antigen pomoću prepoznavanja epitop a. Imunoglobulini su serumski proteini sastavljeni od "lakih" i "teških" polipeptidnih lanaca koji imaju regione "konstantne" i "varijabilne" i podeljeni su na klase (npr. IgA, IgD, IgE, IgG i IgM) na osnovu sastava konstante regije. Antitelo koje je "specifično" za dati antigen pokazuje da varijabilni regioni antitela prepoznaju i vezuju specifični antigen isključivo. Antitela mogu biti poliklonalna, mešana ili monoklonalna. Antitela mogu biti intaktni imunoglobulini koji se dobijaju iz prirodnih izvora ili iz rekombinantnih izvora, ili mogu biti imunoreaktivni delovi intaktnih imunoglobulina. Antitela mogu postojati u različitim oblicima, uključujući,na primer, kao, Fv, Fab', F (ab')2, kao i u pojedinačnim lancima. Antitelo može biti konvertovano u protein koji vezuje antigen, koji uključuje, između ostalog, fragmente antitela.

[0025] Pojam "antigen", kako se ovde koristi, odnosi se na molekul koji sadrži jedan ili više epitop a (linearni, konformacioni ili oba) koji će nakon izlaganja subjektu izazvati imunski odgovor koji je specifičan za taj antigen. Pojam "antigen" može se odnositi na atenuirane, inaktivirane ili modifikovane žive bakterije, viruse, gljivice, parazite ili druge mikrobe. Pojam "antigen" koji se ovde koristi može takođe da se odnosi na pojedinačni antigen, koji je odvojen i diskretan od celog organizma sa kojim je antigen prirodno povezan. Pojam "antigen" takođe može da se odnosi na antitela, kao što su antitela na anti-idiotip ili njihove fragmente, i na sintetičke peptidne mimotope koji mogu da imitiraju antigen ili antigenu depojamantu (epitop ). Pojam "antigen" može takođe da se odnosi na oligonukleotid ili polinukleotid koji eksprimira antigen ili antigensku depojamantu in vivo, kao što je u DNK aplikacije za imunizaciju.

[0026] "Pufer" označava hemijski sistem koji sprečava promenu koncentracije druge hemijske supstance. Na primer, protonski donorski i akceptorski sistemi služe kao odbojnici koji sprečavaju značajne promene koncentracije vodoničnih jona (pH). Drugi primer pufera je rastvor koji sadrži smešu slabe kiseline i njene soli (konjugatne baze) ili slabe baze i njene soli (konjugatne kiseline).

[0027] Pojmovi "VGVD", "VGVD izolati" ili "VGVD sojevi", kako se ovde koriste, odnose se na virus izazivač virusne dijareje goveda, uključujući, između ostalog tip I i tip II koji se sastoje od virusnog gena, pridruženih proteina i drugih hemijski preparat a (kao što su lipidi). Nekoliko vrsta virusa dijareje tipa I i tipa II poznat je stručnjacima i dostupnim kroz, na primer, American Type Kultura Collection (ATCC®; Manassas, VA 20108 USA). Virusni virus dijareje goveda ima genome u obliku RNK. RNK se može pretvoriti u DNK za upotrebu u kloniranju. Prema tome, referencije napravljene ovde u sekvencama nukleinske kiseline virusne dijareje goveda obuhvataju oba virusa RNK sekvence i DNK sekvence izvedene iz virusnih RNK sekvenci. Pojam "NADL" koji se ovde koristi odnosi se na 20 referentnih sojeva VGVD, deponovanih u ATCC kao VR-534.

[0028] Pojam "ćelijska linija" ili "ćelija domaćin", kao što je ovde upotrebljeno, znači prokariotska ili eukariotska ćelija u kojoj virus može da se replicira ili da se održava.

[0029] "Ćelijski imuni odgovor" ili "ćelijski posredovan imuni odgovor" je onaj posredovan T-limfocitima ili drugim belim krvnim ćelijama ili oboma, i uključuje proizvodnju citokina, hemokina i sličnih molekula proizvedenih od strane aktiviranih T-ćelija, bijelih krvnih zrnaca ili oboje.

[0030] Pojam "himerni" ili "himera", koji se ovde koristi, znači mikroorganizam, na primer virus, koji sadrži genetsku ili fizičku komponentu izvedenu iz više od jednog progenitora.

[0031] Pojam "standardna VGVD vakcina", koji se ovde koristi, znači vakcina zasnovana na divljem tipu VGVD. Virus može biti oslabljen ili inaktiviran. Međutim, virus nije genetski modifikovan.

[0032] Pojam "kultura", koji se ovde koristi, znači populacija ćelija ili mikroorganizama koji rastu u odsustvu drugih sojeva ili tipova.

[0033] Pojam "DIVA", koji se ovde koristi, znači razlikovati inficiranu od vakcinisane životinje.

[0034] "Doza" se odnosi na vakcinu ili imunogeni preparat koji se daje ispitan iku. "Prva doza" ili "prvi sloj vakcine" odnosi se na dozu datu nultog dana. "Druga doza" "treća doza" ili "godišnja doza" odnosi se na količinu takvog

sastojka koji se daje nakon prve doze, koja može ali ne mora biti ista vakcina, ili imunogeni preparat, kao prva doza.

[0035] Pojam "epitop", koji se ovde koristi, znači specifično mesto antigena koje se vezuje za receptor T-ćelija ili specifično antitelo, i obično se sastoji od oko 3 amino kiselinska ostatka do oko 20 amino kiselinskih ostataka, i mogu biti kontinuirani ili diskontinuirani.

[0036] "Fragment" odnosi se na skraćeni deo proteina ili gena. "Funkcionalni fragment" i "biološki aktivni fragment" odnose se na fragment koji zadržava biološka svojstva proteina ili gena pune dužine. "Imunogeno aktivni fragment" odnosi se na fragment koji izaziva imunološki odgovor.

[0037] Pojam "heterologni", koji se ovde koristi, znači izveden iz različitih vrsta ili sojeva.

[0038] Pojam "homologni", koji se ovde koristi, znači izveden iz istih vrsta ili sojeva.

[0039] "Humoralni imuni odgovor" odnosi se na onu koja je barem delom posredovana antitelima.

[0040] "Imuni odgovor" u subjektu se odnosi na razvoj humoralnog imunog odgovora, ćelijskog imunog odgovora ili humoralnog i ćelijskog imunog odgovora na antigen. Imunogeni odgovor može biti dovoljan za dijagnostičke svrhe ili drugo testiranje ili može biti adekvatan za sprečavanje znakova ili simptoma bolesti, uključujući i štetne zdravstvene efekte ili njihove komplikacije uzrokovane infektivnim agensom za oboljenje.

[0041] "Imunogenost" ili "Imunogenost", koji se ovde koristi, odnosi se na sposobnost izazivanja imunog odgovora usmerenog specifično protiv antigena.

[0042] Pojam "imunogeni preparat ", koji se ovde koristi, znači preparat koji je sposoban da bude prepoznat od strane imunog sistema, što rezultira stvaranjem specifičnog imunološkog odgovora (tj. ima imunogenu aktivnost) kada se daje životinji samostalno ili sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.

[0043] Pojam "imunološki efikasna količina", koji se ovde koristi, odnosi se na količinu antigena koja efikasno izaziva imunogeni ili imunološki odgovor kod životinje. Imuni odgovor može da se sastoji od indukcije ćelijskog i/ili humoralnog imuniteta.

[0044] "Izolovan", koji se ovde koristi, znači izmešten iz svog prirodnog okruženja. Kada se odnosi na mikroorganizam,

on može biti ili samostalan ili u heterologoj ćeliji domaćina, ili hromozom ili vektor (na primer plazmid, faga i td.). "Izolovana bakterija," "izolovana anaerobna bakterija," "izolovani bakterijski soj," izolovani virus" "izolovani soj virusa" i slično odnose se na preparat u kome su bakterije ili virusi sadržani u znatnom broju bez drugih mikroorganizama, npr. u kulturi, kao kada se odvoji od prirodnog okruženja. "Izolovan", kad se koristi da opiše bilo koju posebno definisanu supstancu, na primer polipeptid ili polinukleotid, odnosi se na supstancu koja se razlikuje od originalnog ćelijskog okruženja u kome se supstanca – na primer polipeptid ili nukleinska kiselina, normalno nalaze. Ovde se koristi dakle, samo kao primer, u rekombinantnoj ćelijskoj liniji sagrađenoj od polinukleotida u ovom pronalasku koristi se "izolovana" nukleinska kiselina. Ili pak, ukoliko se određeni protein ili specifičan imunogeni fragment koristi kao vakcina ili drugi sastav, spatraće se da je isti izolovan jer je identifikova, odvojen i u izvesnom stepenu prečišćen u poređenju sa oblikom u kome se javlja u prirodi. Ukoliko je protein ili njegov imunogeni fragment proizveden rekombinantnom ekspresijom vektora bakterije ili eukariote koji proizvodi antigen, smatra se da on postoji kao izolovani protein ili nukleinska kiselina. Na primer, rekombinantna ćelijska linija sazgrađena sa polinukleotidom koristi "izolovanu" nukleinsku kiselinu.

[0045] Pojam "mnogostruke infekcije" (MI), koji se ovde koristi, podrazumeva odnos broja mikroorganizama po ćeliji, što daje podataka o tome koliko inokuluma će se koristiti u dotičnoj infekciji.

[0046] Pojam "patogen" ili "patogeni mikroorganizam", koji se ovde koristi, znači mikroorganizam – na primer virus, bakterija, gljivica, protozoa, ili parazit – koji je sposoban da izazove bolest, ili nenormalno stanje životinje domaćina.

[0047] Pojam "pestivirus", koji se ovde koristi, znači RNK virus iz roda Pestivirus, familije Flaviviride. Pestivirusi obuhvataju, između ostalog, VGVD (tip 1 i tip 2), klasični virus svinjskog gripa (KVSG), i virus granične bolesti (VGB), kao i pestiviruse izolovane iz vrsta kako što su divlje svinje, bivoli, eland, bizon, alpaka, pudu, bongo, razne vrste jelena, žirafa, divokoza i pronghorn antelope (Vilcek and Nettleton; Vet Microbiol. 116:1-12 (2006)).

[0048] "Farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na supstance, koje su prema naučnom medicinskom stavu pogodne za upotrebu u kontaktu sa tkivima ispitan ika bez nepoželjne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, i slično, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika i koji su efikasni za njihovu namenu.

[0049] Pojami "sprečiti", "sprečavanje" ili "sprečeno", i slično, koji se ovde koristi, znači sprečavanje replikacije mikroorganizama, da sprečava prenošenje mikroorganizma, da sprečava da se mikroorganizam naseli u domaćinu. Ovi i slični pojami koji se ovde koriste mogu takođe značiti da oni inhibiraju ili blokiraju jedan ili više znakova ili simptoma infekcije.

[0050] "Zaštita", "zaštititi", i slično, koji se ovde koriste u odnosu na vakcinu ili drugi preparati, znači da vakcina ili preparat sprečava ili redukuje simptome bolesti koji izaziva organizam iz kojeg je dobijen antigen korišćen u vakcini ili preparatu. Pojam "zaštita” ili "zaštititi" i slično, takođe znači da vakcina ili preparat može biti korišćen u terapiji za lečenje bolesti ili jednog ili više simptoma bolesti koje već postoje kod ispitan ika.

[0051] Pojam "specifično vezivanje," "specifično vezuje," i slično, koji se ovde koristi, definisani su kao dva ili više molekula koji stvaraju kompleks koji je merljiv u fiziološkim uslovima ili u uslovima testa, i koji je selektivan. Za antitelo ili drugi inhibitor kaže se da se "specifično vezuje" za protein ako, pod odgovarajuće izabranim uslovima, to vezivanje nije značajno inhibirano, dok je istovremeno nespecifično vezivanje inhibirano. Osobina specifičnog vezivanja je visok afinitet i ono je selektivno za jedinjenje ili protein.

Nespecifično vezivanje obično ima nizak afinitet. Vezivanje u IgG antitelima, na primer, uglavnom karakteriše afinitet od barem 10<-7>M ili više, kao što je najmanje 10<-8>M ili više, ili barem 10<-9>M ili više, ili barem oko 10<-10>ili više, ili barem 10<-11>M ili više, ili barem 10<-12>M ili više. Pojam se takođe primenjuje, na primere, kada je domen na koji se vezuje antigen specifičan za određeni epitop koji ne nosi veliki broj antigena, u kom slučaju se antitelo, koje nosi domen koji vezuje antigen, neće vezati za druge antigene.

[0052] Pojam "terapijski efikasna količina", koji se ovde koristi, znači količina mikroorganizma, podjedinica antigena, ili molekula polipeptida, ili polinikleotida, i njihove kombinacije, ili vakcina ili preparat, potrebna za lečenje bolesti kod ispitan ika kod koga je primenjena.

[0053] Pojami "lečiti", "lečenje", i slično, koji se ovde koristi, znači smanjiti ili eliminisati infekciju izazvanu mikroorganizmom. Ovi i slični pojami koji se ovde koriste, mogu takođe značiti smanjenje replikacije mikroorganizma, smanjenje prenosa mikroorganizma, ili smanjenje sposobnosti mikrooranizma da se nastani u domaćinu. Ovi i slični pojmovi koji se ovde koriste, mogu takođe značiti smanjenje, ublažavanje ili eliminaciju jednog ili više znakova ili simptoma infekcije izazvane mikroorganizmom, ili ubrzanje oporavka od infekcije mikroorganizmom.

[0054] Pojami "vakcinisati" ili "vakcinacija" i slični, koji se ovde koriste, znače primena vakcine ili imunogenog preparata kod životinje.

[0055] Pojami "vakcina" i "vakcinacioni preparat," koji se ovde koriste, znače preparat koji sprečava ili redukuje jedan ili više znakova ili simptoma infekcije. Zaštitini efekati vakcinalnog preparata protiv patogena postižu se normalno indukcijom imunog odogovora kod subjekta, bilo da je posredovan ćelijskim ili humoralnim imunim odgovorom ili njihovom kombinacijom. Uopšteno govoreći, ukinuta ili smanjena incidence infekcije, ublažavanje znakova ili simptoma, ili ubrzana eliminacija mikroorganizama iz inficiranog subjekta su indikativni za zaštitino dejstvo vakcinalnog preparata. Vakcinalni preparati ovog pronalaska obezbeđuju zaštitno dejstvo protiv infekcija koje izaziva VGVD.

[0056] Pojam "nosač prihvatljiv u veterinarskoj medicini", koji se ovde koristi, odnosi se na supstance, koje su prema naučno zasnovanoj medicinskoj odluci, pogoden za upotrebu u kontaktu sa tkivima životinja bez neželjene toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, i slično, srazmerno razumnom odnosu prema riziku i efikasnom za njihovu namenu.

[0057] Sledeći opis je dostavljen je da bi pomogao stručnjacima iz oblasti da primenjuju ovaj pronalazak.

Detekcija, dijagnostičke metode, oprema

[0058] Ovaj pronalazak obezbeđuje način određivanja da li je životinja bila izložena određenim pestivirusima, bilo putem ivakcinacije ili infekcijom.

[0059] Vakcinacija u kojoj se koristi DIVA vakcina – ona koja omogućava razlikovanje između inficiranih i vakcinisanih životinja – obezbeđuje sredstvo za procenu istorije izloženosti životinje. Ovo razgraničenje može se postići različitim različitim dijagnostičkim metodama koje nisu ograničene na enzimski imunosorbent test (ELISA), koji mogu biti kompetitivni, direktni ili indirektni, test lateralnog protoka, Western blotting, PCR, radioimunoesej, radioimunoesej čvrstog stanja (SPRIA), elektrohemiluminescentni (EHL) esej, imunobloting, imunoprecipitacija, i imuno bojenje. Ove i druge metode su već priznate i poznate osobama koje se uobičajeno bave ovom oblašću.

[0060] Himerni pestivirusi koji su ovde opisani, mogu se razlikovati od divljih tipova VGVD soja i prema genetskom sastavu i po ekspresiji protein. Ovakvo razlikovanje može omogućiti razgraničenje između vakcinisanih i zaraženih životinja. Na primer, može se odrediti da li životinja sa pozitivnim testom na VGVD u određenim laboratorijskim testovima nosi VGVD soj divljeg tipa ili je vakcinisana standardnom VGVD vakcinom, ili da li je primenjen himerni pestivirus ili je neinficiran .

[0061] Moguće je koristiti različite metode za određivanje. Na primer, virus može biti izolovan kod životinja sa pozitivnim testom na infekciju. Analize zasnovane na nukleinskoj kiselini mogu uključivati, između ostalog, južnu ili severnu blotan alizu, PCR i sekvenciranje. Alternativno, mogu se koristiti testovi zasnovani na proteinima. U testovima zasnovanim na proteinu, ćelije ili tkiva sumnjive na infekciju mogu se izolovati kod životinje sa pozitivnim testom za VGVD. Ekstrakti ćelija mogu se napraviti od takvih ćelija i tkiva i mogu biti predmet na primer, Western Blot analize, koristeći odgovarajuća antitela protiv virusnih proteina koji mogu jasno da identifikuju prisustvo bilo prethodno primenjenje vakcine himernog pestivirusa bilo divljeg tipa VGVD.

[0062] Stepen i priroda imunog odgovora izazavanog kod životinja može se proceniti upotrebom različitim tehnikama. Na primer, serumi mogu da se prikupe od inokulisanih životinja i ispituje prisustvo ili odsustvo antitela specifičnih himernih virusa.

[0063] Pri pravljeni takve procene, važno je da antitela koja su stvorena kod životinje, su specifična za testirani antigen u eseju, i ne reaguju unakrsno sa istim antigenom iz drugih pestivirusa. NIje se očekivalo da bi se antitela koja prepoznaju E<rns>protein pronghorn pestivirusa i vezuju se za njega, takođe vezivala za E<rns>protein prisutan u divljem tipu VGVD. Međutim, ponovljena primena himernog pestivirusa kod goveda dovela je do povremenog stvaranja antitela koja pokazuju unakrsnu reaktivnost divljeg tipa VGVD koji se nalazi na pločici (odnosno test antigen), što daje rezultate koji ukazuju na lažno pozitivan rezultat pre infekcije divljim tipom VGVD ili vakcinacije standardnom VGVD vakcinom. Dakle, postoji potreba za poboljšanjem preciznosti i specifičnosti testa. Ovo se može postići inkubiranjem seruma životinja u prisustvu pronghorn E<rns>proteina. Protein može biti nativan - odnosno, prečišćen iz pronghorn pestivirusa – ili rekombinantno izražen. Dodavanje pronghorn E<rns>proteina može se uraditi pre dodavanja seruma na test pločicu, ili istovremeno sa dodavanjem seruma na test pločicu. Ovo je efikasno za uklanjanje E<rns>unakrsno reaktivnih antitela, a rezultat je precizniji i pouzdaniji test.

[0064] Komplet koji se koristi za izvođenje postupka prema predmetnom pronalasku može da sadrži jedan ili više reagenasa koji su korisni za otkrivanje i diferenciranje između (1) životinje zaražene VGVD virusom ili one vakcinisane standardnom VGVD vakcinom, i (2) životinje koja je dobila himerni pestivirus. Komplet može uključivati reagense za analizu uzorka za prisustvo celog VGVD, ili VGVD polipeptida, epitop a ili sekvenci polinukleotida koje nisu prisutne u himernom pestivirusu. Alternativno, kompleti ovog pronalaska mogu uključivati reagense za analizu uzorka za prisustvo himernog pestivirusa ili polipeptida, epitop a ili polinukleotidnih sekvenci koji nisu prisutni kod VGVD divljeg tipa. Prisustvo virusa, polipeptida ili polinukleotidnih sekvenci može se odrediti pomoću antitela, PCR, hibridizacije i drugih metoda detekcije poznatih onima koji su u struci.

[0065] Drugi komplet za upotrebu u izvođenju postupka iz ovog pronalaska može da obezbedi reagense za detekciju antitela protiv određenih epitopa. Epitopi su ili prisutni u himernom pestivirusu i nisu prisutni kod divljeg tipa VGVD, ili su alternativno prisutni u VGVD divljeg tipa i nisu prisutni u himernom pestivirusu. Takvi reagensi su korisni za analizu uzorka za prisustvo antitela i lako su poznati i dostupni osobama u struci. Prisustvo antitela može se odrediti korišćenjem standardnih metoda detekcije koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti.

[0066] Kompleti mogu da sadrže set štampanih uputstava ili etiketu koja ukazuje na to da se komplet koristi za otkrivanje i diferenciranje VGVD-inficiranih ili VGVD-vakcinisanih životinja od životinja koje su dobile himerni pestivirus.

Antitelo, antitela

[0067] Antitela mogu biti monoklonalna, poliklonalna, ili rekombinantna. Antitela mogu biti pripremljena protiv imunogena ili njegovog dela. Na primer, sintetički peptid zasnovan na aminokiselinskoj sekvenci imunogena, ili je pripremljen rekombinantnom tehnikom kloniranja ili prirodnim genskim proizvodom i / ili njegovim delovima, može se izolovati i koristiti kao imunogen. Imunogeni se mogu koristiti za proizvodnju antitela standardnom tehnologijom za proizvodnju antitela koja je poznata stručnjacima u ovoj oblasti, kao što je opisano kod Harlow and Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1988). Frakcije antitela mogu se takođe pripremiti iz antitela i uključuju Fab, F (ab')2 i Fv, postupcima poznatim stručnjacima iz ove oblasti.

[0068] U proizvodnji antitela, skrining za željeno antitelo može se postići standardnim metodama u imunologiji poznatim u struci. Uopšteno gledano, i ELISA i Western blotting su vrste imunoanalize koje se mogu koristiti, i obe su dobro poznate stručnjacima. U analizama se mogu koristiti i poliklonalna i monoklonska antitela. Antitelo koje se koristi za vezivanje VGVD Erns proteina može biti vezano za čvrstu podlogu supstrata. Antitelo može biti konjugovano sa detektabilnim delom ili obeleženim. Detektabilne grupe koje se mogu razmatrati za upotrebu u ovom pronalasku mogu obuhvatiti, između ostalog, fluorescentne, metalni, enzimski, i radioaktivni markeri uključujući, između otalog, biotin, zlato, feritin, alkalna fosfataza, bgalaktozidaza, peroksidaza, ureaza, fluorescein, rodamin, tricium,<14>C, i jodizacija. Antitela konjugovana sa detektabilnim delom, mogu se vezati za VGVD E<rns>protein, kao u kompetitivnom ELISA testu, ili se može vezati za antitela životinja koja se vezuju za VGVD E<rns>protein, kao što je u indirektnom ELISA testu.

[0069] U standardnim obeleženim konjugatima specifičnim za tehniku testa vezivanja, analizira se uzorak tečnog medijuma kombinovan sa reagensima različitog sastava. Takvi preparati obuhvataju obeležene konjugate koji sadrže vezujuću komponentu ugrađenu u obeleživač.

Vezujuća komponenta u konjugatu učestvuje sa drugim sastojcima, ako ih ima, reagensa i liganda u mediju pod testom da bi se formirao sistem za vezivanje koji proizvodi dve vrste ili oblike konjugata, npr. vezane vrste (konjugatni kompleks) i slobodne vrste. U vezanoj vrsti, vezujuća komponenta konjugata vezuje odgovarajući partner za vezivanje, dok u slobodnoj vrsti, vezujuća komponenta nije tako vezana. Količina analizata je proporcionalna količini vezanog u odnosu na rečeni konjugat.

Opšti opis razvoja testa

[0070] Goveda koja su primila himerni pestivirus, u kome se E<rns>protein VGVD zamjenjuje sa E<rns>proteinom iz pronghorn pestivirusa, može se razlikovati od goveda prirodno inficiranih sa divljim VGVD ili imunizirano konvencionalnom VGVD vakcinom kroz upotrebom pronalaska koji je ovde opisan. Goveda raznih starosnih dobi ili se ne tretiraju ili se primenjuju tri doze bilo živog ili inaktiviranog himernog pestivirusa, ili živog ili inaktiviranog VGVD, sa oko tri nedelje između svake doze. Uzorci seruma se sakupljaju 2-3 nedelje ili kasnije nakon svake primene, ali pre sledeće primene. Da bi razlikovali između goveda koji su primali himerni pestivirus ili one koji ne primaju lečenje, u poređenju sa onima zaraženim virusom divljih vrsta VGVD ili imuniziranim sa konvencionalnom VGVD vakcinom, uzorci seruma se testiraju pomoću diferencijalnog dijagnostičkog testa.

[0071] Za kompetitivan ELISA, VGVD divlji tip ili himerni pestivirus E<rns>protein (prirodno, sintetički ili rekombinantno izvedeni) mogu se koristiti kao izvor antigena u testu. Ako se koristi E<rns>protein na divljim VGVD, koristi se kao testni antigen, nedostatak vezivanja sa označenim VGVD specifičnim mravima bakterije VGVD E<rns>ukazuje na prisustvo antitela u serumu stoke koji se vezuje za epidopu specifičnog VGVD specifičnog tipa, što ukazuje na prirodnu (divljeg) infekciju ili imunost sa konvencionalnom VGVD vakcinom. Za razliku od toga, serum od goveda koji daje himerni pestivirus neće sadržati antitela koja se vezuju za protein divljeg tipa VGVD E<rns>koji premazuje ploču. Zbog toga se oznaceni divlji tip VGVD E<rns>-specifičan mAb vezuje za vezani protein i rezultira u naknadnom razvoju boje.

[0072] U prethodno opisanom testu, bilo je iznenađujuće što bi se antitela koja prepoznaje i vezuju za E<rns>proteinu pronghorn pestivirus E<rns>takođe vezivati za protein prisutan na divljim VGVD. Pošto je ponovljeno davanje himernog pestivirusa na stoku povremeno dovelo do stvaranja antitela koja je pokazala ograničenu transverzalnost na E<rns>protein VGVD divljeg tipa, što je dovelo do rezultata koji ukazuju na prethodnu infekciju sa VGVD ili vakcinaciju sa konvencionalnom VGVD vakcinom postoje da bi se poboljšala tačnost i specifičnost testa.

[0073] Za poboljšanu kompetitivnost ELISA testa, uzorci seruma se inkubiraju sa rekombinantno ekspresionim E<rns>proteinom pronghorn pestivirusa bilo pre ili istovremeno sa dodavanjem seruma goveda na testne pločice. Ovo efikasno uklanja antitela koja se mogu vezati za E<rns>protein pronghorn pestivirusa, ali su takođe razvila unakrsnu reaktivnost sa E<rns>proteinom iz VGVD divljeg tipa. Stoga, razvoj boje u testu ukazuje da životinja nije bila izložena VGVD ili je vakcinisan himernim pestivirusom, dok nerazvijanje boje ukazuje na to da je životinja bila izložena divljim VGVD ili vakcinisana standardnom VGVD vakcinom

[0074] Ovaj pronalazak ilustrovan je sledećim primerima:

PRIMER 1

[0075] Kreiran je rekombinantni bakulovirus sa ekspresijom VGVD-NADL E<rns>. DNK molekul koji kodira genetsku fuziju 3’ dela C gena VGVD i cela dužina E<rns>gena bila je pojačana PCR-om iz plazmida koji sadrži celu dužinu VGVD-NADL cDNA sa prajmerima Oligo 250 (SEQ ID NO: 1; 5’-CACCATGAAAATAGTGCCCAAAGAATC-3’) i Oligo 252 (SEQ ID NO: 2; 5’-TTAAGCGTATGCTCCAAACCACGTC-3’). PCR proizvod bio je kloniran u pENTR™/D-TOPO (Invitrogen; Carlsbad, CA) i transformian u One Shot<®>Competent E. coli (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Recombinantni plazmid ekstrahovan je a umetak je potvrđen sekvencioniranjem. Ovaj plazmid bio je označen kao pENTR-E<rns>. pENTR-E<rns>i BaculoDirect™ Baculovirus Expression System (Invitrogen) korišćeni su za konstruisanje rekombinantnog bakulovirusa sa ekspresijom VGVD-NADL E<rns>protein, prema uputstvima proizvođača. Rekombinantni bakulovirus sa ekspresijom VGVD-NADL E<rns>proteina je generisan, pročišćeno od plaka, prošireno i skladišten na temperaturi od 4 ° C do -80 ° C. Ekspresija VGVD-NADL E<rns>proteina u rekombinantnom bakulovirusu bila je potvrđena imunofluorescentnim bojenjem Western blotom upotrebom VGVD E<rns>specifičnog MAb 15C5 (Idexx Laboratories Inc.; Westbrook, ME).

[0076] Ekspresija pronghorn pestivirus E<rns>protein postignuta je bakulovirusu pomoću slične strategije. Ekspresija pronghorn E<rns>proteina bila je potvrđena imunofluorescentnim bojenjem i Western blotom pomoću anti-His (C-term) MAb (Invitrogen).

[0077] Za proizvodnju ELISA antigena, Sf21 ili Sf9 ćelije u 100 ml suspenzije kulture bile su inficirane reckombinantnim bakulovirusom na MI sa 0.2 do 5. Ćelije su sakupljene nakon 2 do 4 dana inkubacije na 27 ° C. Ćelije su centrifugirale pri maloj brzini (oko 800 g) tokom 10 min da bi sakupljale ćelije. Ćelije su lizirane sa nativnim lizom / puferom za vezivanje (pH 8,050 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazola i 1% IGEPAL CA-630). Smeša je pipetovana gore i dole kako bi se razbili ćelijski grudvice, a zatim zamrznuti na -80°C tokom ≥ 1 sat. Posle otapanja, smeša se razblaži centrifugom na 8000 g tokom 20 minuta na 4 °C. Konačni supernatant, obeležen kao lizat Baculo-Pronghorn E<rns>, je alokvotiran i skladišten na -80°C.

[0078] Pri obavljanju eseja, ELISA pločice su preko noći obložene na 4°C sa 100 ml/well MAb WB210 (Veterinary Laboratory Agency, Surrey, UK), koji se specifično vezuje za E<rns>protein Type 1 iz VGVD, razlažen do 1 ug/ml u karbonatno/bikarbonatnom puferu (pH 9.0). Sledećeg dana ploče su isprane tri puta PBP puferom za pranje (PBS sa 0,05% Tween 20) i inkubirane sa blokirajućim puferom (PBST plus 1% kazein natrijumovom solju) na 37°C tokom 1 časa. Ploče su nakon toga isprane tri puta PBST-om, i dodato je 100 ml Baculo-VGVD E<rns>lizata (razblaženo 1: 1600 u PBS), a ploče su inkubirane na 37 ° C tokom 1 sata. Tokom ovog perioda inkubacije, 60 ml uzorka seruma goveda dodato je u 60 ml uzorka za razblaživanje uzorka koji sadrži blokirni pufer i unapred određenu koncentraciju Baculo-Pronghorn E<rns>lizata. Mešavine serum-razblaživača su inkubirane na sobnoj temperaturi najmanje 30 minuta. Posle tri pranja sa PBST-om, smeše serum-razblaživača prenose se na bunare ELISA ploča. Višestruki bunari su ostavljeni prazni na svakoj pločici, da služe kao nekonkurentne 15C5-HRP kontrole. Pločice su inkubirane na 37 ° C tokom 1 sata. Posle još tri pranja sa PBST, 100 ml konjugata MAb 15C5-HRP (specifičnog na VGVD Erns, razblaženo u blokirajućim puferu) dodato je u svaku vrelu na 37 ° C tokom 1 sata. Posle tri pranja, dodato je 100 ml supstrata ABTS (KPL, Gaithersburg, MD) u svaku šupljinu i inkubirano na sobnoj temperaturi 20-60 minuta za razvoj boje. Optička gustina (OG) je merena na talasnoj dužini od 405/490 nm. Procenat inhibicije OG od kontrolnog konjugata za svaki uzorak seruma izračunava se prema sledećoj formuli

% inhibicije = (OG uzorka)/ (aritmetička sredina OG od 15C5-HRP kontrola) x 100%

[0079] Šest VGVD serognegativnih goveda po terapijskoj grupi vakcinisana su inaktiviranim VGVD (NADL soj), himernim pestivirusom ili bez vakcine (NTKS). Vakcinacija je obavljana u razmacima od tri nedelje. Uzorci seruma su sakupljeni svaki put, pre davanja vakcine. Uzorci su zatim testirani u gore opisanom testu.

Rezultati

[0080] Podaci prikazani u Tabeli 1 predstavljaju upoređivanje seroloških odgovora stoke koja je primila eksperimentalne antigene i netretiranih kontrola. Prikazani podaci su generisani pomoću originalnog dijagnostičkog testa i poboljšanog dijagnostičkog testa, koji je predmetni pronalazak.

Uzorci seruma su sakupljeni nakon primene dve doze inaktivirane VGVD vakcine ili dve doze inaktiviranog himernog pestivirusa. Na osnovu nekoliko poznatih VGVD pozitivnih i negativnih uzoraka, granične vrednosti za pozitivne ("Pos"), negativne ("Neg") ili nesigurne ("+/-") definisane su dole:

<40% = Pos

40% - 50% = /-> 50% = Neg

Tabela 1.

[0081] Podaci prikazani u tabeli 2 predstavljaju nastavak eksperimenta opisanog u tabeli 1 gore. Ovde su uzorci sruma prikupljeni posle primene treće doze bile inaktivirane VGVD ili inaktiviranog himernog pestivirusa.

Tabela 2.

(nastavak)

[0082] Podaci prikazani u tabeli 3, generisani su korišćenjem originalnog E<rns>DIVA testa i poboljšanog E<rns>DIVA testa, predstavljaju poređenje serološkog odgovora kod goveda koja su primila tri doze bilo žive atenuisane VGVD živi himerni pestivirus.

Tabela 3.

[0083] Podaci prikazuju dodatni korak inkubacije goveđeg seruma recombinantno-izraženom E<rns>proteinu pronghorn pestivirusa, pre nego što je isti dodat na test pločicu, i efikasan je u uklanjanju unakrsno reaktivnih antitela sposobnih da vezuju E<rns>protein i u VGVD u pronghornu. Dakle, serološki status životinjakoje su dobile himerni pestivirus pokazale su se VGVD-negativna u poboljšanom DIVA testu, i ne lažno VGVD-pozitivnim (odnosno inficirani sa VGVD ili vakcinisani standardnom VGVD vakcinom).

PRIMER 2

[0084] DIVA test opisan u Primeru 1 je kombinovan u tandemu sa drugim testom za detekciju antigena za određivanje VGVD ili antitelom, kako bi se utvrdilo da li je negativan uzorak detektovan DIVA testom iz Primera 1 (tj. onaj koji potiče od životinje koja je vakcinisana himernim pestivirusom ili neizložena neinficirana životinja) je zaista neizložena ili umesto toga potiče od životinje koja je vakcinisana himernim pestivirusom.

[0085] Negativni uzorak DIVA testa iz Primera 1 ispitan je na prisustvo drugog antigena ili antitela na VGVD koje će biti prisutno čak kod životinja koje su bile vakcinisane himernim pestivirus. U ovom testu, uzorak od životinje za koji je pomoću DIVA testa iz Primera 1, određeno da je "negativan" za VGVD, dalje se analizira na prisustvo ili odsustvodrugog antigena ili antitela pecifičnog na VGVD. Na primer, DIVA test iz Primera 1 kombinuje se sa testom za hvatanje antigena ili testom za detekciju antitela koje se specifično vezuje sa drugim antigenom za VGVD, na primer VGVD E2 proteinom. Ili pak, uzorak od životinje za koju je pomoću DIVA testa iz Primera 1 određeno da je "negativna" na VGVD, analizira se na antitela specifična na VGVD p80/125 (na pr. NS 2/3) ne-strukturalni protein. Test radi otkrivanja ovih proteina of postoji na tržištu i opisan je, na pr. SERELISA® VGVD p80 Ab Mono Blocking kit (Synbiotics Corporation; Kansas City, MO.)

[0086] Na primer iz očitavanja iz kombinacije DIVA testa iz Primera 1 sa testom za antitelo koje specifično vezuje drugi VGVD antigen, kao što je p80, dobiće se rezultati kao što je prikazano u Tabeli 4.

Tabela 4:

SPISAK SEKVENCI [0087]

<110> Ankenbauer, Robert G

Nelson, Lynn

D Oien,

Nancee L

Welch, Siao-Kun W

<120> POBOLJŠANA DIJAGNOSTIKA VAKCINE <130> PC71766

<160> 2

<170> PatentIn verzija 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> primer Oligo 250

<400> 1

caccatgaaa atagtgccca aagaatc 27

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Veštačka sekvenca

<220>

<223> primer Oligo 252

<400> 2

ttaagcgtat gctccaaacc acgtc 25

Claims (6)

Patentni zahtevi

1. Metod za određivanje prisustva ili odsustva antitela koje se specifično vezuje za E<rns>protein virusa goveđe virusne dijareje (VGVD) u kompetitivnom ELISA testu, navedeni metod sastoji se od:

<a)>inkubiranja uzorka goveđeg seruma u prisustvu E<rns>proteina pronghorn pestivirusa na koji se antitela unakrsno vezuju sa E<rns>proteinom divljeg tipa VGVD, gde se navedeni uzorak inkubira bilo pre ili istovremeno sa korakom b);

<b)>dodavanja navedenog inkubiranog uzorka na test pločicu sa nanetim E<rns>proteinom VGVD za koji se specifično vezuje navedeno antitelo koje treba detektovati; i

<c)>naknadno detektovanje prisustva ili odsustva navedenog antitela u navedenom uzorku.

2. Metod naveden u u skladu sa zahtevom 1, u kome se navedeno antitelo specifično vezuje za barem jedan epitop e prisutan u Erns proteinu VGVD, ali nije prisutno u Erns proteinu pronghorn pestivirusa.

3. Metod u skladu sa zahtevima 1 i 2 u kome prisustvo navedenog antitela ukazuje da je životinja bila ili inficirana divljim tipom VGVD ili vakcinisana standardom VGVD vakcinom.

4. Metod u skladu sa zahtevima 1 i 2, gde odsustvo navedenog anitela ukazuje da životinja nije bila 1) inficirana divljim wiltipom VGVD, ni 2) vakcinisana standardnom VGVD vakcinom, ili je bila vakcinisana himernim pestivirusom sa ekspresijom Erns proteina pronghorn pestivirusa.

5. Upotreba kompleta u kompetitivnom ELISA testu kao što je definisano zahtevima 1 ili 2, gde navedeni komplet sadrži test pločicu sa nanetim Erns proteinom VGVD-a, i reagensom koji olakšava detekciju prisustva ili odsustva najmanje jednog Erns epitopa VGVD-a koji nije prisutan u Erns proteinu pronghorn pestivirusa, gde je jedan od navedenih reagenasa Erns protein pronghorn pestivirusa za koji se vezuju antitela koja pokazuju unakrsnu reakciju sa VGVD Erns.

6. Upotreba kompleta iz tačke 5 ove izjave, gde je jedan od navedenih reagenasa antitelo koje se specifično vezuje za epitop prisutan u divljem tipu VGVD-a ili standardne VGVD vakcine, ali koji epitop nije prisutan u Erns proteinu pronghorn pestivirusa.