JP2003166992A - ネオスポラ・カニヌムの血清学的分析方法 - Google Patents
ネオスポラ・カニヌムの血清学的分析方法Info
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- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
Abstract
(57)【要約】
【課題】 ネオスポラ・カニヌムに対して自然にセロポ
ジティブを示す動物とネオスポラ・ワクチンを接種した
動物とを識別する方法を提供する。 【解決手段】 識別方法は、動物から血清サンプルを取
得し、トキソプラスマ・ゴンディイ・タンパク質と前記
血清とを接触させ、そして結合抗体の存在に関して前記
血清を検査することを含み、ネオスポラ・カニヌムに対
して自然にセロポジティブを示す動物とネオスポラ・ワ
クチンを接種した動物とを識別する。
ジティブを示す動物とネオスポラ・ワクチンを接種した
動物とを識別する方法を提供する。 【解決手段】 識別方法は、動物から血清サンプルを取
得し、トキソプラスマ・ゴンディイ・タンパク質と前記
血清とを接触させ、そして結合抗体の存在に関して前記
血清を検査することを含み、ネオスポラ・カニヌムに対
して自然にセロポジティブを示す動物とネオスポラ・ワ
クチンを接種した動物とを識別する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は ネオスポラ・カニ
ヌム（Neospora caninum）に反応性のタンパク質と対象
血清との反応による、ネオスポラ・カニヌム感染の血清
学的検出に関する。
ヌム（Neospora caninum）に反応性のタンパク質と対象
血清との反応による、ネオスポラ・カニヌム感染の血清
学的検出に関する。
【０００２】
【従来の技術】ネオスポラ・カニヌム及びトキソプラス
マ・ゴンディイ（Toxoplasma gondii）は、原生動物亜
門に属し、密接に関連した寄生虫であり、多数の動物の
病気の原因となる。ネオスポラ・カニヌムは、牛や他の
動物における流産、神経関連四肢欠陥、及び新生児死亡
の原因として認識されてきた。トキソプラスマ・ゴンデ
ィイは、ヒツジの流産の一般的原因である。ネオスポラ
症及びトキソプラスマ病の有効なマネージメントには早
急な診断が必要である。従って、ネオスポラ・カニヌム
の有効な診断テストの開発は、重要である。
マ・ゴンディイ（Toxoplasma gondii）は、原生動物亜
門に属し、密接に関連した寄生虫であり、多数の動物の
病気の原因となる。ネオスポラ・カニヌムは、牛や他の
動物における流産、神経関連四肢欠陥、及び新生児死亡
の原因として認識されてきた。トキソプラスマ・ゴンデ
ィイは、ヒツジの流産の一般的原因である。ネオスポラ
症及びトキソプラスマ病の有効なマネージメントには早
急な診断が必要である。従って、ネオスポラ・カニヌム
の有効な診断テストの開発は、重要である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】動物がネオスポラ・カ
ニヌムに暴露されたことがあるか否かの決定に利用可能
で、当業界で承認されたテストが数種類存在する。しか
しながら、ネオスポラ・カニヌムに対して自然にセロポ
ジティブ（seropositive）を示す動物と、ネオスポラ・
ワクチンを接種した動物及び/又はネオスポラ・カニヌ
ムに対してセロネガティブ（seronegative）〔非接種〕
を示す動物とを識別する診断テスト及び方法は、従来開
発されていなかった。
ニヌムに暴露されたことがあるか否かの決定に利用可能
で、当業界で承認されたテストが数種類存在する。しか
しながら、ネオスポラ・カニヌムに対して自然にセロポ
ジティブ（seropositive）を示す動物と、ネオスポラ・
ワクチンを接種した動物及び/又はネオスポラ・カニヌ
ムに対してセロネガティブ（seronegative）〔非接種〕
を示す動物とを識別する診断テスト及び方法は、従来開
発されていなかった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、ネオスポラ・
カニヌムに対して自然にセロポジティブを示す動物とネ
オスポラ・ワクチンを接種した動物とを識別する方法
を、初めて提供するものである。また、本発明は、血清
学的分析方法を用いて、ネオスポラ・カニヌムに動物が
感染されたことがあるか否かを決定する方法を提供す
る。本発明は、その一つの観点によれば、トキソプラス
マ・ゴンディイ・タンパク質と血清とを接触させ、そし
て結合抗体の存在に関して前記血清を検査することによ
り、血清サンプル中における、ネオスポラ・カニヌムに
対する抗体を検出する方法を提供する。
カニヌムに対して自然にセロポジティブを示す動物とネ
オスポラ・ワクチンを接種した動物とを識別する方法
を、初めて提供するものである。また、本発明は、血清
学的分析方法を用いて、ネオスポラ・カニヌムに動物が
感染されたことがあるか否かを決定する方法を提供す
る。本発明は、その一つの観点によれば、トキソプラス
マ・ゴンディイ・タンパク質と血清とを接触させ、そし
て結合抗体の存在に関して前記血清を検査することによ
り、血清サンプル中における、ネオスポラ・カニヌムに
対する抗体を検出する方法を提供する。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、ワクチン接種によるネ
オスポラ・セロポジティブの動物と、自然に暴露された
ネオスポラ・セロポジティブの動物とを識別することの
できる分析系を提供する。本発明によれば、トキソプラ
スマ・ゴンディイ及びネオスポラ・カニヌム由来のタン
パク質は、自然のセロポジティブ動物のみに存在するこ
とが見出された。本発明方法によって提供される分析結
果に基づいて、ネオスポラ・カニヌム・セロネガティブ
の動物と、ネオスポラ系ワクチンを先に接種されていた
動物（米国特許出願第０９／２６０，４１４号明細書
「Attenuated Live Neospora Vaccine」及び米国特許出
願第０９／１３８，９８５号明細書「Neospora Vaccin
e」参照）との信頼性を有する同定が今や可能になり、
そしてそれらをセロポジティブな（すなわち、自然に暴
露された）動物から隔離することができる。
オスポラ・セロポジティブの動物と、自然に暴露された
ネオスポラ・セロポジティブの動物とを識別することの
できる分析系を提供する。本発明によれば、トキソプラ
スマ・ゴンディイ及びネオスポラ・カニヌム由来のタン
パク質は、自然のセロポジティブ動物のみに存在するこ
とが見出された。本発明方法によって提供される分析結
果に基づいて、ネオスポラ・カニヌム・セロネガティブ
の動物と、ネオスポラ系ワクチンを先に接種されていた
動物（米国特許出願第０９／２６０，４１４号明細書
「Attenuated Live Neospora Vaccine」及び米国特許出
願第０９／１３８，９８５号明細書「Neospora Vaccin
e」参照）との信頼性を有する同定が今や可能になり、
そしてそれらをセロポジティブな（すなわち、自然に暴
露された）動物から隔離することができる。
【０００６】ネオスポラ・カニヌムに暴露された動物か
らの血清は、トキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポ
ラ・カニヌムのタンパク質、並びにそれらの断片と反応
する。ここで「反応」とは、検出可能な抗原−抗体複合体
が形成されることを意味する。抗原−抗体複合体の形成
は、ネオスポラ・カニヌムに自然に感染した動物である
ことを示している。ネオスポラ・カニヌムのワクチン接
種を予め行った動物からの血清及びネオスポラ・カニヌ
ムに対して自然にセロネガティブな動物からの血清は、
トキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポラ・カニヌム
のタンパク質、並びにそれらの断片と反応しない。従っ
て、本発明は、ワクチン接種（セロネガティブ）の動物
と、自然暴露のネオスポラ・カニヌム・セロポジティブ
の動物とを識別する方法を提供する。更に、本発明によ
れば、本発明の分析結果に基づき、所望により、ネオス
ポラ・カニヌムセロポジティブな動物に、ワクチン接種
を行うことができる。本発明において意図される動物と
しては、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）、子牛（ｃａｌｆ）、非
去勢雄牛（ｂｕｌｌ）、雌牛（ｃｏｗ）：及び去勢牛
（ｓｔｅｅｒ）を挙げることができる。本発明方法は、
雌牛に適用することが好ましく、子牛に適用することが
最も好ましい。
らの血清は、トキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポ
ラ・カニヌムのタンパク質、並びにそれらの断片と反応
する。ここで「反応」とは、検出可能な抗原−抗体複合体
が形成されることを意味する。抗原−抗体複合体の形成
は、ネオスポラ・カニヌムに自然に感染した動物である
ことを示している。ネオスポラ・カニヌムのワクチン接
種を予め行った動物からの血清及びネオスポラ・カニヌ
ムに対して自然にセロネガティブな動物からの血清は、
トキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポラ・カニヌム
のタンパク質、並びにそれらの断片と反応しない。従っ
て、本発明は、ワクチン接種（セロネガティブ）の動物
と、自然暴露のネオスポラ・カニヌム・セロポジティブ
の動物とを識別する方法を提供する。更に、本発明によ
れば、本発明の分析結果に基づき、所望により、ネオス
ポラ・カニヌムセロポジティブな動物に、ワクチン接種
を行うことができる。本発明において意図される動物と
しては、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）、子牛（ｃａｌｆ）、非
去勢雄牛（ｂｕｌｌ）、雌牛（ｃｏｗ）：及び去勢牛
（ｓｔｅｅｒ）を挙げることができる。本発明方法は、
雌牛に適用することが好ましく、子牛に適用することが
最も好ましい。
【０００７】本発明によれば、トキソプラスマ・ゴンデ
ィイ又はネオスポラ・カニヌムからの、任意の精製した
か、天然（ｎａｔｉｖｅ）か、又は組換えのブラディゾ
イト抗原又はその断片を、本発明による血清学的分析方
法用の検出抗原として用いることができる。ここで「断
片」とは、完全長のトキソプラスマ・ゴンディイ又はネ
オスポラ・カニヌムのタンパク質のペプチド部分であっ
て、動物血清に存在する抗体によって認識されるエピト
ープを供給するペプチド部分である。本発明によれば、
完全長のトキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポラ・
カニヌムのタンパク質の先端切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ
ｄ）形態も、断片であるものと理解されたい。
ィイ又はネオスポラ・カニヌムからの、任意の精製した
か、天然（ｎａｔｉｖｅ）か、又は組換えのブラディゾ
イト抗原又はその断片を、本発明による血清学的分析方
法用の検出抗原として用いることができる。ここで「断
片」とは、完全長のトキソプラスマ・ゴンディイ又はネ
オスポラ・カニヌムのタンパク質のペプチド部分であっ
て、動物血清に存在する抗体によって認識されるエピト
ープを供給するペプチド部分である。本発明によれば、
完全長のトキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポラ・
カニヌムのタンパク質の先端切断（ｔｒｕｎｃａｔｅ
ｄ）形態も、断片であるものと理解されたい。
【０００８】一つの態様においては、完全長ブラディゾ
イト抗原グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）融合タンパク質（ＢＡＧ−１）が、検出抗原である
（配列番号２）。別の態様では、ＢＡＧ１のＮ−末端の
２８アミノ酸が欠失した先端切断ＢＡＧ−１−ＧＳＴ融
合タンパク質が検出抗原である（配列番号３）。ＢＡＧ
−１は、当業界においてＢＡＧ−５としても知られてい
る。本発明においては、ネオスポラ・カニヌムに自然感
染した動物からの抗血清、又はネオスポラ・カニヌムの
ワクチン接種を行った動物からの抗血清、又は未感染の
抗血清をテストサンプルとして用いることができるもの
として意図されている。
イト抗原グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳ
Ｔ）融合タンパク質（ＢＡＧ−１）が、検出抗原である
（配列番号２）。別の態様では、ＢＡＧ１のＮ−末端の
２８アミノ酸が欠失した先端切断ＢＡＧ−１−ＧＳＴ融
合タンパク質が検出抗原である（配列番号３）。ＢＡＧ
−１は、当業界においてＢＡＧ−５としても知られてい
る。本発明においては、ネオスポラ・カニヌムに自然感
染した動物からの抗血清、又はネオスポラ・カニヌムの
ワクチン接種を行った動物からの抗血清、又は未感染の
抗血清をテストサンプルとして用いることができるもの
として意図されている。
【０００９】固体支持体上に固定化した場合のブラディ
ゾイト抗原又はその断片の反応性が、本発明によるネオ
スポラ・カニヌム抗体の検出方法を提供する。具体的に
は、本発明方法は、動物血清サンプルと、ブラディゾイ
ト−ステージ・タンパク質又はその断片とを接触させ
（これらは、続いて反応して抗原−抗体複合体を形成す
ることができる）、そして、反応に関して、得られた複
合体を、従来の検出及び定量方法によって検査すること
によって実施することができる。ここで「抗体」とは、
抗原の特異的エピトープと結合可能な免疫グロブリン分
子を意味する。抗体は、ポリクロナール混合物又はモノ
クロナールであることができる。抗体は、天然源又は組
換え源から誘導される完全無傷な（ｉｎｔａｃｔ）免疫
グロブリンであることもできるし、完全無傷な免疫グロ
ブリンの免疫反応性部分であることもできる。
ゾイト抗原又はその断片の反応性が、本発明によるネオ
スポラ・カニヌム抗体の検出方法を提供する。具体的に
は、本発明方法は、動物血清サンプルと、ブラディゾイ
ト−ステージ・タンパク質又はその断片とを接触させ
（これらは、続いて反応して抗原−抗体複合体を形成す
ることができる）、そして、反応に関して、得られた複
合体を、従来の検出及び定量方法によって検査すること
によって実施することができる。ここで「抗体」とは、
抗原の特異的エピトープと結合可能な免疫グロブリン分
子を意味する。抗体は、ポリクロナール混合物又はモノ
クロナールであることができる。抗体は、天然源又は組
換え源から誘導される完全無傷な（ｉｎｔａｃｔ）免疫
グロブリンであることもできるし、完全無傷な免疫グロ
ブリンの免疫反応性部分であることもできる。
【００１０】抗原−抗体複合体の量、及び／又は存在若
しくは不在を検査する多数の方法が知られており、そし
て本発明においてはそれらの全てが意図されている。例
えば、ウエスタンブロットアッセイは、固体支持体、例
えば、ニトロセルロース紙に抗原を付着させ、前記紙と
血清テストサンプルとをインキュベートし、そして、ト
キソプラスマ・ゴンディイＢＡＧ１−ＧＳＴタンパク質
の完全長体（約５５ｋＤａ）又は先端切断体（約５１ｋ
Ｄａ）の予想分子量における特定バンドの存在又は不在
に関して前記ニトロセルロース紙を検査することによっ
て実施することができる。いずれかの予想分子量のバン
ドの存在は、その動物がネオスポラ・カニヌムのセロポ
ジティブであることを示している。一方、いずれかの予
想分子量のバンドの不在は、その動物がワクチン接種を
受けたことを示している。
しくは不在を検査する多数の方法が知られており、そし
て本発明においてはそれらの全てが意図されている。例
えば、ウエスタンブロットアッセイは、固体支持体、例
えば、ニトロセルロース紙に抗原を付着させ、前記紙と
血清テストサンプルとをインキュベートし、そして、ト
キソプラスマ・ゴンディイＢＡＧ１−ＧＳＴタンパク質
の完全長体（約５５ｋＤａ）又は先端切断体（約５１ｋ
Ｄａ）の予想分子量における特定バンドの存在又は不在
に関して前記ニトロセルロース紙を検査することによっ
て実施することができる。いずれかの予想分子量のバン
ドの存在は、その動物がネオスポラ・カニヌムのセロポ
ジティブであることを示している。一方、いずれかの予
想分子量のバンドの不在は、その動物がワクチン接種を
受けたことを示している。
【００１１】本発明においては、ニトロセルロース紙に
抗原を付着させ、そして付着染料を有する抗体によって
前記抗原を染色させるウエスタンブロットアッセイも意
図されている。抗原又は抗体を酵素でラベル化する固相
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）も用いることができる。
本発明においては、抗原又は抗体を放射性元素でラベル
化するラジオイムノアッセイも、意図されている。
抗原を付着させ、そして付着染料を有する抗体によって
前記抗原を染色させるウエスタンブロットアッセイも意
図されている。抗原又は抗体を酵素でラベル化する固相
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）も用いることができる。
本発明においては、抗原又は抗体を放射性元素でラベル
化するラジオイムノアッセイも、意図されている。
【００１２】本発明は、ネオスポラ・カニヌム抗体の存
在／量、又は不在に関して動物血清を検査する方法も意
図されている、従って、ポジティブ及び/又はネガティ
ブ反応用のアッセイ及びコントロールと、他の必要な成
分とを含む診断分析方法用キットを、本発明の教示に従
って組み立てることができる。広く記載されている本発
明の精神又は範囲から逸脱しない限り、前記の具体的な
態様に示すとおり、多数の変化及び/又は変形を本発明
に加えることが可能であることは、当業者に理解される
であろう。
在／量、又は不在に関して動物血清を検査する方法も意
図されている、従って、ポジティブ及び/又はネガティ
ブ反応用のアッセイ及びコントロールと、他の必要な成
分とを含む診断分析方法用キットを、本発明の教示に従
って組み立てることができる。広く記載されている本発
明の精神又は範囲から逸脱しない限り、前記の具体的な
態様に示すとおり、多数の変化及び/又は変形を本発明
に加えることが可能であることは、当業者に理解される
であろう。
【００１３】
【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
【００１４】
【実施例１】《ネオスポラ・カニヌムセロネガティブ
で、ネオスポラ・カニヌムのワクチン接種を受けた動物
からの抗血清》セロネガティブ又はＰＣＲ陰性の動物
（これは、続いて、ネオスポラ・カニヌム・タチゾイト
系の変性ワクチン、死菌型ワクチン又はサブユニット系
ワクチンを受ける）からの任意の血清サンプルを使用す
ることができる。本実施例では、公認の獣医学的診断研
究所（Washington State Diagnostic Lab, Pullman, ワ
シントン州）によって実施した診断ＥＬＩＳＡテストに
よって、４ヶ月齢の子牛がセロネガティブであると決定
された。子牛は、０日目と２１日目に、タキゾイト系の
（ｉ）変性された生の弱毒化ネオスポラワクチン（米国
特許出願第０９／２６０，４１４号明細書「Attenuated
Live Neospora Vaccine」参照）、又は（ｉｉ）不活性
化した全細胞ホモジネートネオスポラワクチン（米国特
許出願第０９／１３８，９８５号明細書「Ne ospora Va
ccine」参照）のいずれかの接種を受けた。両方のワク
チンは、ワクチンの保護成分としてのタキゾイト抗原に
基づくものである。前記のネオスポラ・カニヌムの変性
された生の弱毒化したワクチンは、投与量当たりに５×
１０7Ｎｃｔｓ−８タキゾイトを含んでおり、セロネガ
ティブの動物３頭の皮下に投与した。前記のネオスポラ
・カニヌム不活性化ホモジネートワクチンは投与量当た
りに全タキゾイトタンパク質１００μｇを含み、サポニ
ン系アジュバント中に製剤化され（Ｑｕｉｌ Ａ７５０
μｇ／コレステロール１５０μｇ）、そしてセロネガテ
ィブの動物３頭の皮下に投与した。ワクチン接種から４
９日目及び１１９日目に、各ワクチン群の子牛３頭から
血清を採取し、プール化し、そして血清学的分析方法試
験（実施例４参照）で試験に用いるまで、−２０℃でア
リコート中に冷凍された。
で、ネオスポラ・カニヌムのワクチン接種を受けた動物
からの抗血清》セロネガティブ又はＰＣＲ陰性の動物
（これは、続いて、ネオスポラ・カニヌム・タチゾイト
系の変性ワクチン、死菌型ワクチン又はサブユニット系
ワクチンを受ける）からの任意の血清サンプルを使用す
ることができる。本実施例では、公認の獣医学的診断研
究所（Washington State Diagnostic Lab, Pullman, ワ
シントン州）によって実施した診断ＥＬＩＳＡテストに
よって、４ヶ月齢の子牛がセロネガティブであると決定
された。子牛は、０日目と２１日目に、タキゾイト系の
（ｉ）変性された生の弱毒化ネオスポラワクチン（米国
特許出願第０９／２６０，４１４号明細書「Attenuated
Live Neospora Vaccine」参照）、又は（ｉｉ）不活性
化した全細胞ホモジネートネオスポラワクチン（米国特
許出願第０９／１３８，９８５号明細書「Ne ospora Va
ccine」参照）のいずれかの接種を受けた。両方のワク
チンは、ワクチンの保護成分としてのタキゾイト抗原に
基づくものである。前記のネオスポラ・カニヌムの変性
された生の弱毒化したワクチンは、投与量当たりに５×
１０7Ｎｃｔｓ−８タキゾイトを含んでおり、セロネガ
ティブの動物３頭の皮下に投与した。前記のネオスポラ
・カニヌム不活性化ホモジネートワクチンは投与量当た
りに全タキゾイトタンパク質１００μｇを含み、サポニ
ン系アジュバント中に製剤化され（Ｑｕｉｌ Ａ７５０
μｇ／コレステロール１５０μｇ）、そしてセロネガテ
ィブの動物３頭の皮下に投与した。ワクチン接種から４
９日目及び１１９日目に、各ワクチン群の子牛３頭から
血清を採取し、プール化し、そして血清学的分析方法試
験（実施例４参照）で試験に用いるまで、−２０℃でア
リコート中に冷凍された。
【００１５】
【実施例２】《ネオスポラ・カニヌムに自然に感染し、
セロポジティブな動物からの抗血清》自然に感染したセ
ロポジティブな、又はＰＣＲ陽性の動物から、任意の抗
血清サンプルを使用することができる。本実施例では、
公認の獣医学的診断研究所（Washington State Diagnos
tic Lab, Pullman, ワシントン州）によって実施された
診断ＥＬＩＳＡ試験を用いて、市販の畜牛群から、個々
の動物の血清状態を決定した。このテストによってセロ
ポジティブであると報告された動物２１頭を同定した。
セロポジティブの各動物からの血清サンプルを収集し、
サンプルをプール化し、血清学的分析方法（実施例４参
照）で試験に用いるまでは、−２０℃でアリコート中に
冷凍された。
セロポジティブな動物からの抗血清》自然に感染したセ
ロポジティブな、又はＰＣＲ陽性の動物から、任意の抗
血清サンプルを使用することができる。本実施例では、
公認の獣医学的診断研究所（Washington State Diagnos
tic Lab, Pullman, ワシントン州）によって実施された
診断ＥＬＩＳＡ試験を用いて、市販の畜牛群から、個々
の動物の血清状態を決定した。このテストによってセロ
ポジティブであると報告された動物２１頭を同定した。
セロポジティブの各動物からの血清サンプルを収集し、
サンプルをプール化し、血清学的分析方法（実施例４参
照）で試験に用いるまでは、−２０℃でアリコート中に
冷凍された。
【００１６】
【実施例３】《ネオスポラ血清学的テストに用いるブラ
ディゾイト抗原》任意の精製、天然、若しくは組換えの
ネオスポラ・カニヌム、又はトキソプラスマ・ゴンディ
イ・ブラディゾイト・タンパク質を用いることができる
（トキソプラスマ・ゴンディイ・ブラディゾイト・タン
パク質ＢＡＧ１；ジーンバンクアクセッション番号＝Ｕ
２３９４４）。本実施例では、トキソプラスマ・ゴンデ
ィイブラディゾイト抗原であるＢＡＧ１（当業界ではＢ
ＡＧ５としても公知である）の２つの異なる組換え生成
形態を使用した。最初の形態は、アフィニティクロマト
グラフィー（S.F.Parmley, et. al. 1995. Mol. Bioche
m. Parasit. 73: 253-257参照）によって大腸菌から発
現させて精製した完全長ＢＡＧ１−グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（glutathione-S-transferase：GS
T）融合タンパク質であった。第２の形態は、アフィニ
ティクロマトグラフィー（S.F.Parmley,et. al. 1995）
によって大腸菌から発現させて精製され、最初のアミノ
酸２８残基が欠失され、先端切断されたＢＡＧ１−ＧＳ
Ｔ融合タンパク質であった。精製された組換え完全長Ｂ
ＡＧ１−ＧＳＴ及び先端切断ＢＡＧ１−ＧＳＴタンパク
質は、血清学的分析方法（実施例４参照）で試験に用い
るまでは、−２０℃でアリコート中に冷凍された。
ディゾイト抗原》任意の精製、天然、若しくは組換えの
ネオスポラ・カニヌム、又はトキソプラスマ・ゴンディ
イ・ブラディゾイト・タンパク質を用いることができる
（トキソプラスマ・ゴンディイ・ブラディゾイト・タン
パク質ＢＡＧ１；ジーンバンクアクセッション番号＝Ｕ
２３９４４）。本実施例では、トキソプラスマ・ゴンデ
ィイブラディゾイト抗原であるＢＡＧ１（当業界ではＢ
ＡＧ５としても公知である）の２つの異なる組換え生成
形態を使用した。最初の形態は、アフィニティクロマト
グラフィー（S.F.Parmley, et. al. 1995. Mol. Bioche
m. Parasit. 73: 253-257参照）によって大腸菌から発
現させて精製した完全長ＢＡＧ１−グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（glutathione-S-transferase：GS
T）融合タンパク質であった。第２の形態は、アフィニ
ティクロマトグラフィー（S.F.Parmley,et. al. 1995）
によって大腸菌から発現させて精製され、最初のアミノ
酸２８残基が欠失され、先端切断されたＢＡＧ１−ＧＳ
Ｔ融合タンパク質であった。精製された組換え完全長Ｂ
ＡＧ１−ＧＳＴ及び先端切断ＢＡＧ１−ＧＳＴタンパク
質は、血清学的分析方法（実施例４参照）で試験に用い
るまでは、−２０℃でアリコート中に冷凍された。
【００１７】
【実施例４】《血清学的テスト》当業界で知られている
任意の抗体系検出試験（ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳ
Ａ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット等）を用いることがで
きる。本実施例では、ウエスタンブロットアッセイを用
いた。総量５ｍｇのトキソプラスマ・ゴンディイ完全長
ＢＡＧ１−ＧＳＴ又は先端切断ＢＡＧ１−ＧＳＴ組換え
タンパク質を解凍し、５×ディネイチャリング・サンプ
ル・ローディングバッファー（Pierce、イリノイ州）と
混合し、１ｍｍ×２ウエルのプレキャスト４−２０％の
トリス−グリシンコンティニュアスグラジエントゲル
（Novex, San Diego, カリフォルニア州）に挿入した。
ゲルの実験は、製造業者の仕様書に従い、１２５Ｖで
１．５時間実施した。ゲルを２０μＭニトロセルロース
シート（Bio-Read, Hercules, カリフォルニア州）上に
２５Ｖで１時間ブロットした。そのシートを乾燥させ、
縦横等しい大きさのストリップにカットした。そのスト
リップをブロッキング溶液（リン酸緩衝化生理食塩水中
の５％スキムミルク）中で、室温で一晩インキュベート
し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして続いて、血清テストサン
プル（前記実施例１及び２からのサンプル）と共にイン
キュベートした。実施例１及び２からの血清テストサン
プルのアリコートを室温にて解凍し、そして新しく調製
した１：２００希釈液（ＰＢＳ中）を生成した。セロネ
ガティブなナイーブ（ｎａｉｖｅ：ワクチン未接種）の
雌牛からの血清を、ネガティブコントロール（１：２０
０希釈液）として用いた。完全長ＢＡＧ１−ＧＳＴに対
するウサギ抗血清を、ポジティブコントロール（M.McAl
listerから譲り受けた；M.McAllister, et. al., 1996.
J. Parasitol. 82(2):354-355）として使用し、そし
て、使用前にPBSにて１：１２，５００に希釈した。
任意の抗体系検出試験（ＥＬＩＳＡ、競合的ＥＬＩＳ
Ａ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット等）を用いることがで
きる。本実施例では、ウエスタンブロットアッセイを用
いた。総量５ｍｇのトキソプラスマ・ゴンディイ完全長
ＢＡＧ１−ＧＳＴ又は先端切断ＢＡＧ１−ＧＳＴ組換え
タンパク質を解凍し、５×ディネイチャリング・サンプ
ル・ローディングバッファー（Pierce、イリノイ州）と
混合し、１ｍｍ×２ウエルのプレキャスト４−２０％の
トリス−グリシンコンティニュアスグラジエントゲル
（Novex, San Diego, カリフォルニア州）に挿入した。
ゲルの実験は、製造業者の仕様書に従い、１２５Ｖで
１．５時間実施した。ゲルを２０μＭニトロセルロース
シート（Bio-Read, Hercules, カリフォルニア州）上に
２５Ｖで１時間ブロットした。そのシートを乾燥させ、
縦横等しい大きさのストリップにカットした。そのスト
リップをブロッキング溶液（リン酸緩衝化生理食塩水中
の５％スキムミルク）中で、室温で一晩インキュベート
し、ＰＢＳ中で洗浄し、そして続いて、血清テストサン
プル（前記実施例１及び２からのサンプル）と共にイン
キュベートした。実施例１及び２からの血清テストサン
プルのアリコートを室温にて解凍し、そして新しく調製
した１：２００希釈液（ＰＢＳ中）を生成した。セロネ
ガティブなナイーブ（ｎａｉｖｅ：ワクチン未接種）の
雌牛からの血清を、ネガティブコントロール（１：２０
０希釈液）として用いた。完全長ＢＡＧ１−ＧＳＴに対
するウサギ抗血清を、ポジティブコントロール（M.McAl
listerから譲り受けた；M.McAllister, et. al., 1996.
J. Parasitol. 82(2):354-355）として使用し、そし
て、使用前にPBSにて１：１２，５００に希釈した。
【００１８】実施例３で調製した個々のテストストリッ
プを、各々の希釈血清サンプルに加え、室温にて一時間
インキュベートした。そのストリップを、０．０５％ト
ゥイーン２０（Tween 20）を含むPBS（PBST）で２回簡
単に洗浄し、アフィニティ精製フォスファターゼラベル
化ヤギ抗牛IgG（KPL, Gaithersburg, メリーランド州）
の１：４００希釈液（PBS中）含有溶液に加えた。室温
で一時間インキュベートし、続いて前記ストリップをPB
STで簡単に２回洗浄し、そして、次に、フォスファター
ゼ基質であるBCIP/NBT（KPL, Gaithersburg, メリーラ
ンド州）中でインキュベートした。適当な着色が得られ
た後（約１０分間）、前記ストリップを蒸留水中に単に
入れることによって酵素反応を終了させた。次に、その
ストリップを空気乾燥させた。結果を図１に示す。
プを、各々の希釈血清サンプルに加え、室温にて一時間
インキュベートした。そのストリップを、０．０５％ト
ゥイーン２０（Tween 20）を含むPBS（PBST）で２回簡
単に洗浄し、アフィニティ精製フォスファターゼラベル
化ヤギ抗牛IgG（KPL, Gaithersburg, メリーランド州）
の１：４００希釈液（PBS中）含有溶液に加えた。室温
で一時間インキュベートし、続いて前記ストリップをPB
STで簡単に２回洗浄し、そして、次に、フォスファター
ゼ基質であるBCIP/NBT（KPL, Gaithersburg, メリーラ
ンド州）中でインキュベートした。適当な着色が得られ
た後（約１０分間）、前記ストリップを蒸留水中に単に
入れることによって酵素反応を終了させた。次に、その
ストリップを空気乾燥させた。結果を図１に示す。
【００１９】
【実施例５】《血清学的テストの解釈》ポジティブな血
清学的テストは、血清テストサンプルとネオスポラ・カ
ニヌム又はトキソプラスマ・ゴンディイ・ブラディゾイ
ト抗原との特異的反応の存在によって示される。本実施
例においては、実施例４で使用したストリップに関し
て、トキソプラスマ・ゴンディイＢＡＧ１−ＧＳＴタン
パク質の完全長体（約５５ｋDa）又は先端切断体（約５
１ｋDa）の予想分子量における特異的バンドの存在又は
不在を決定することにより、特異的反応を検査した。図
１のレーン５に示すとおり、ネオスポラ・カニヌムの自
然感染畜牛からのプール化血清と共にインキュベートし
たストリップには約５２〜５５ｋDaのバンドが存在し、
これは、ネオスポラ・カニヌム自然感染セロポジティブ
のテストサンプルと、先端切断ＢＡＧ１−ＧＳＴブラデ
ィゾイト抗原との間の特異的反応を示している。これと
は対照的に、図１中のレーン３及びレーン４には、５５
ｋDaのＢＡＧ１−ＧＳＴタンパク質に対する反応性は検
出されなかった。このことは、ネオスポラ・カニヌムの
ワクチン接種のテストサンプルのいずれかを用いた場合
には、いずれも特異的反応がないことを示している。
清学的テストは、血清テストサンプルとネオスポラ・カ
ニヌム又はトキソプラスマ・ゴンディイ・ブラディゾイ
ト抗原との特異的反応の存在によって示される。本実施
例においては、実施例４で使用したストリップに関し
て、トキソプラスマ・ゴンディイＢＡＧ１−ＧＳＴタン
パク質の完全長体（約５５ｋDa）又は先端切断体（約５
１ｋDa）の予想分子量における特異的バンドの存在又は
不在を決定することにより、特異的反応を検査した。図
１のレーン５に示すとおり、ネオスポラ・カニヌムの自
然感染畜牛からのプール化血清と共にインキュベートし
たストリップには約５２〜５５ｋDaのバンドが存在し、
これは、ネオスポラ・カニヌム自然感染セロポジティブ
のテストサンプルと、先端切断ＢＡＧ１−ＧＳＴブラデ
ィゾイト抗原との間の特異的反応を示している。これと
は対照的に、図１中のレーン３及びレーン４には、５５
ｋDaのＢＡＧ１−ＧＳＴタンパク質に対する反応性は検
出されなかった。このことは、ネオスポラ・カニヌムの
ワクチン接種のテストサンプルのいずれかを用いた場合
には、いずれも特異的反応がないことを示している。
【００２０】図２に示すように、レーン４及びレーン９
では、ネオスポラ・カニヌム自然感染畜牛からのプール
化血清と共にインキュベートされたストラップ中に約５
２〜５５ｋＤａのバンドが存在した。これは、ネオスポ
ラ・カニヌム自然感染セロポジティブのテストサンプル
と、ＢＡＧ１−ＧＳＴブラディゾイト抗原の先端切断体
（レーン４）又は完全長体（レーン９）との間の特異的
反応を示している。これとは対照的に、図２のレーン２
及びレーン７において、ネオスポラ・カニヌム死菌型ワ
クチンで免疫した雌牛からのプール化血清（１１９日
目）を用いた場合、ＢＡＧ１−ＧＳＴタンパク質のいず
れの形態に対しても反応性は検出されなかった。同様
に、図２のレーン３及びレーン８において、ネオスポラ
・カニヌム弱毒化型ワクチンで免疫した雌牛からのプー
ル化血清（１１９日目）を用いた場合、ＢＡＧ１−ＧＳ
Ｔタンパク質のいずれの形態に対しても反応性は検出さ
れなかった。
では、ネオスポラ・カニヌム自然感染畜牛からのプール
化血清と共にインキュベートされたストラップ中に約５
２〜５５ｋＤａのバンドが存在した。これは、ネオスポ
ラ・カニヌム自然感染セロポジティブのテストサンプル
と、ＢＡＧ１−ＧＳＴブラディゾイト抗原の先端切断体
（レーン４）又は完全長体（レーン９）との間の特異的
反応を示している。これとは対照的に、図２のレーン２
及びレーン７において、ネオスポラ・カニヌム死菌型ワ
クチンで免疫した雌牛からのプール化血清（１１９日
目）を用いた場合、ＢＡＧ１−ＧＳＴタンパク質のいず
れの形態に対しても反応性は検出されなかった。同様
に、図２のレーン３及びレーン８において、ネオスポラ
・カニヌム弱毒化型ワクチンで免疫した雌牛からのプー
ル化血清（１１９日目）を用いた場合、ＢＡＧ１−ＧＳ
Ｔタンパク質のいずれの形態に対しても反応性は検出さ
れなかった。
【００２１】本発明で説明したトキソプラスマ・ゴンデ
ィイ組換えブラディゾイト抗原に対する反応性の差異
は、ブラディゾイト抗原を用いる血清学的試験を用い
て、ネオスポラ・カニヌム自然感染動物とネオスポラ・
カニヌムワクチン接種動物とを識別するか、又は診断す
ることができることを示している。任意の精製したか、
又は天然の、又は組換えブラディゾイト抗原、又はその
断片であって、ネオスポラ・カニヌム由来のもの（例え
ば、配列番号１又は２）又はネオスポラ・カニヌム（例
えば、配列番号３又は４）を、この診断試験用の検出抗
原として用いることができる。ネオスポラ・カニヌム自
然感染動物、又はネオスポラ・カニヌムワクチン接種動
物からの任意の抗血清を、この診断用テストのテストサ
ンプルとして用いることができる。
ィイ組換えブラディゾイト抗原に対する反応性の差異
は、ブラディゾイト抗原を用いる血清学的試験を用い
て、ネオスポラ・カニヌム自然感染動物とネオスポラ・
カニヌムワクチン接種動物とを識別するか、又は診断す
ることができることを示している。任意の精製したか、
又は天然の、又は組換えブラディゾイト抗原、又はその
断片であって、ネオスポラ・カニヌム由来のもの（例え
ば、配列番号１又は２）又はネオスポラ・カニヌム（例
えば、配列番号３又は４）を、この診断試験用の検出抗
原として用いることができる。ネオスポラ・カニヌム自
然感染動物、又はネオスポラ・カニヌムワクチン接種動
物からの任意の抗血清を、この診断用テストのテストサ
ンプルとして用いることができる。
【００２２】〔★注：下記<110>の会社名がこのままで
良いか、確認お願いします〕
良いか、確認お願いします〕
【配列表】
<110> PFIZER PRODUCTS INC.
<120> SEROLOGICAL ASSAY FOR NEOSPORA CANINUM
<130> PC23020A
<150> 60/334,811
<151> 2001-10-31
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1219
<212> DNA
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (219)..(905)
<220>
<221> CDS
<222> (303)..(905)
<400> 1
tgcttttgcc aaaggagacc tgtgtgcaga ggacttcgct gctaaaaagc agaagagtgc 60
acggcgtgtg tagctcagtg gcatttcggg actcggtctt gcgtcgttcg cgactggacg 120
tcgtcgtctg tgagagcgtc aaactaggga gaaggggcgg gccagagcgt tcggaaaatt 180
atctgcaaag cccaggtccc gtatgatatt caaaaaag atg gcg ccg tca gca tcg 236
Met Ala Pro Ser Ala Ser
1 5
ca t ccg ccg gga gct tgt cca ccg gga tgt acc aag cat cct gct act 284
His Pro Pro Gly Ala Cys Pro Pro Gly Cys Thr Lys His Pro Ala Thr
10 15 20
gcg aca gcc att tcc ccg agt gga gtg tgt ccc atg cgt gcg ttc cat 332
Ala Thr Ala Ile Ser Pro Ser Gly Val Cys Pro Met Arg Ala Phe His
25 30 35
ccc gcg ggg cct cac tca cat ttc tca tgt tac gat gat ctc aga aat 380
Pro Ala Gly Pro His Ser His Phe Ser Cys Tyr Asp Asp Leu Arg Asn
40 45 50
agg ctg agt cac gac aaa aat gtt cga ccg gtc gcc tct caa cag cta 428
Arg Leu Ser His Asp Lys Asn Val Arg Pro Val Ala Ser Gln Gln Leu
55 60 65 70
gac tat ttg gat gaa gta agc ccg ttt gct ctg gcg tac tac cct ccc 476
Asp Tyr Leu Asp Glu Val Ser Pro Phe Ala Leu Ala Tyr Tyr Pro Pro
75 80 85
ccg ttt tgg ggt gga gtc ggt ctt aat ccc atc gac gat atg ttg ttc 524
Pro Phe Trp Gly Gly Val Gly Leu Asn Pro Ile Asp Asp Met Leu Phe
90 95 100
gag acg gcc ctc acc gca aac gaa atg atg gag gac atc acg tgg aga 572
Glu Thr Ala Leu Thr Ala Asn Glu Met Met Glu Asp Ile Thr Trp Arg
105 110 115
ccc aga gtc gac gtg gag ttc gac agc aaa aag aag gaa atg att att 620
Pro Arg Val Asp Val Glu Phe Asp Ser Lys Lys Lys Glu Met Ile Ile
120 125 130
ttg gct gac ttg cca ggt ctt cag aaa gat gac gta acc ata gaa gtc 668
Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Gln Lys Asp Asp Val Thr Ile Glu Val
135 140 145 150
gac aac gga gcc atc gtt atc aaa gga gag aag acc tcg aaa gaa gcg 716
Asp Asn Gly Ala Ile Val Ile Lys Gly Glu Lys Thr Ser Lys Glu Ala
155 160 165
gag aaa gtg gac gat ggc aaa aca aag aac att ttg act gag cga gtg 764
Glu Lys Val Asp Asp Gly Lys Thr Lys Asn Ile Leu Thr Glu Arg Val
170 175 180
tcc ggt tat ttt cgc gcc cgg ttc cag ctc ccg agt aat tac aag ccc 812
Ser Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Phe Gln Leu Pro Ser Asn Tyr Lys Pro
185 190 195
gac gga atc agt gcg gca atg gac aac ggc gtt cta cgt gtc acg atc 860
Asp Gly Ile Ser Ala Ala Met Asp Asn Gly Val Leu Arg Val Thr Ile
200 205 210
aag gtc gag gat tca ggg ggc gca aag caa caa atc agc gtg aag 905
Lys Val Glu Asp Ser Gly Gly Ala Lys Gln Gln Ile Ser Val Lys
215 220 225
tagaggcagc gatgccgttc gtggggcagg gaaacacgga ggagcctcat 955
t gaaaatgtaa aggtgtggga gaactgttga cagtgcaaga taatagtacg 1006
agtaggattg caaagaaggc ctcccgtttc tggcgccagc cgagaaaacc tggttgatgg 1066
gcagcctcat gcgtgacggt ttttctttag aggacttgtc cgtcgaggta gtgcgtatcg 1126
cgtgtctgcg gtttatcgtc acagcgcgta tccagaaacc tagcgttcaa cggctcaaga 1186
ccgtaagcga attagagttg aataggtgtg ttat 1220
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<400> 2
Met Ala Pro Ser Ala Ser His Pro Pro Gly Ala Cys Pro Pro Gly Cys
1 5 10 15
Thr Lys His Pro Ala Thr Ala Thr Ala Ile Ser Pro Ser Gly Val Cys
20 25 30
Pro Met Arg Ala Phe His Pro Ala Gly Pro His Ser His Phe Ser Cys
35 40 45
Tyr Asp Asp Leu Arg Asn Arg Leu Ser His Asp Lys Asn Val Arg Pro
50 55 60
Val Ala Ser Gln Gln Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Val Ser Pro Phe Ala
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Tyr Pro Pro Pro Phe Trp Gly Gly Val Gly Leu Asn Pro
85 90 95
Ile Asp Asp Met Leu Phe Glu Thr Ala Leu Thr Ala Asn Glu Met Met
100 105 110
Glu Asp Ile Thr Trp Arg Pro Arg Val Asp Val Glu Phe Asp Ser Lys
115 120 125
Lys Lys Glu Met Ile Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Gln Lys Asp
130 135 140
Asp Val Thr Ile Glu Val Asp Asn Gly Ala Ile Val Ile Lys Gly Glu
145 150 155 160
Lys Thr Ser Lys Glu Ala Glu Lys Val Asp Asp Gly Lys Thr Lys Asn
165 170 175
Ile Leu Thr Glu Arg Val Ser Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Phe Gln Leu
180 185 190
Pro Ser Asn Tyr Lys Pro Asp Gly Ile Ser Ala Ala Met Asp Asn Gly
195 200 205
Val Leu Arg Val Thr Ile Lys Val Glu Asp Ser Gly Gly Ala Lys Gln
210 215 220
Gln Ile Ser Val Lys
225
<210> 3
<211> 201
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<400> 3
Ser Gly Val Cys Pro Met Arg Ala Phe His Pro Ala Gly Pro His Ser
1 5 10 15
His Phe Ser Cys Tyr Asp Asp Leu Arg Asn Arg Leu Ser His Asp Lys
20 25 30
Asn Val Arg Pro Val Ala Ser Gln Gln Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Val
35 40 45
Ser Pro Phe Ala Leu Ala Tyr Tyr Pro Pro Pro Phe Trp Gly Gly Val
50 55 60
Gly Leu Asn Pro Ile Asp Asp Met Leu Phe Glu Thr Ala Leu Thr Ala
65 70 75 80
Asn Glu Met Met Glu Asp Ile Thr Trp Arg Pro Arg Val Asp Val Glu
85 90 95
Phe Asp Ser Lys Lys Lys Glu Met Ile Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly
100 105 110
Leu Gln Lys Asp Asp Val Thr Ile Glu Val Asp Asn Gly Ala Ile Val
115 120 125
Ile Lys Gly Glu Lys Thr Ser Lys Glu Ala Glu Lys Val Asp Asp Gly
130 135 140
Lys Thr Lys Asn Ile Leu Thr Glu Arg Val Ser Gly Tyr Phe Arg Ala
145 150 155 160
Arg Phe Gln Leu Pro Ser Asn Tyr Lys Pro Asp Gly Ile Ser Ala Ala
165 170 175
Met Asp Asn Gly Val Leu Arg Val Thr Ile Lys Val Glu Asp Ser Gly
180 185 190
Gly Ala Lys Gln Gln Ile Ser Val Lys
195 200
<210> 4
<211> 672
<212> DNA
<213> Neospora caninum
<400> 4
cccctttctt ctctccgttt caagatgagc aagctcagca cagacggcct gaagaaggcc 60
atcggagaga tcttggaggg ctcgcgggaa aagaagagaa agttcgtgga gaccgtcgag 120
cttcagatcg gtttgaagga ttacgacacc caaagagaca agcgtttcag cggaagcgtg 180
aggcttccta acgtcccccg cccccgcatg cgcgtgtgcg tgatgggaga tgctgtgcat 240
tgcgagcaag caaaggagct gggactggaa ttcatggacg tggaggctat gaagaagttg 300
aacaagaaca agaagcttgt gaagaaactc gcacggaagt acgacgcttt cctggcctcg 360
caagtgttga ttccgcagat cccccgtctc ctgggtccgg gtcttaacaa ggcgggcaaa 420
ttcccgacgc ttatcactca caacgataag ctcgaggata agattcagga natcaagagc 480
tcaatcaaat tccaactcag aaaggtgcct gtgcatggtg tcgccgtcng gcacgtcgac 540
atgacggagg agcaactgcg cgtgaacctg acactggcca tcaacttcct tgtctctctg 600
ctgaagaaga actggaacag cgtgagaacg ctgcacatca agagcaccat gggcaagcct 660
cagcagattt ac 672
【図１】先端切断されたトキソプラスマ・ゴンディイ・
組換えＢＡＧ１・タンパク質に対するウエスタンブロッ
トの反応性を示す図面に代わる写真である。レーン１〜
５は、レーン当たり１５μｇの先端切断されたトキソプ
ラスマ・ゴンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパク質を示
し、レーン６は分子量マーカー（ｋＤａ）を示し、レー
ン７〜１１は、レーン当たり１０μｇの先端切断された
トキソプラスマ・ゴンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパ
ク質を示す。より詳細には、レーン１はＢＡＧ５タンパ
ク質に対するポリクロナール抗体を示し、レーン２はナ
イーブな畜牛からの血清を示し、レーン３はネオスポラ
・カニヌムの死菌型（不活化）ワクチンで免疫した子牛
由来の抗血清を示し、レーン４はネオスポラ・カニヌム
の変性された生の（弱毒化）ワクチン（TS-8）で免疫し
た子牛由来の抗血清を示し、レーン５はネオスポラ・カ
ニヌムに自然感染した子牛由来の抗血清を示し、レーン
６は分子量マーカーを示し、レーン７はナイーブな畜牛
からの血清を示し、レーン８はネオスポラ・カニヌムの
死菌型（不活化）ワクチンで免疫した子牛由来の抗血清
を示し、レーン９はネオスポラ・カニヌムの変性された
生の（弱毒化）ワクチン（TS-8）で免疫した子牛由来の
抗血清を示し、レーン１０はネオスポラ・カニヌムに自
然感染した子牛由来の抗血清を示し、レーン１１はＢＡ
Ｇ５タンパク質に対するポリクロナール抗体を示す。
組換えＢＡＧ１・タンパク質に対するウエスタンブロッ
トの反応性を示す図面に代わる写真である。レーン１〜
５は、レーン当たり１５μｇの先端切断されたトキソプ
ラスマ・ゴンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパク質を示
し、レーン６は分子量マーカー（ｋＤａ）を示し、レー
ン７〜１１は、レーン当たり１０μｇの先端切断された
トキソプラスマ・ゴンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパ
ク質を示す。より詳細には、レーン１はＢＡＧ５タンパ
ク質に対するポリクロナール抗体を示し、レーン２はナ
イーブな畜牛からの血清を示し、レーン３はネオスポラ
・カニヌムの死菌型（不活化）ワクチンで免疫した子牛
由来の抗血清を示し、レーン４はネオスポラ・カニヌム
の変性された生の（弱毒化）ワクチン（TS-8）で免疫し
た子牛由来の抗血清を示し、レーン５はネオスポラ・カ
ニヌムに自然感染した子牛由来の抗血清を示し、レーン
６は分子量マーカーを示し、レーン７はナイーブな畜牛
からの血清を示し、レーン８はネオスポラ・カニヌムの
死菌型（不活化）ワクチンで免疫した子牛由来の抗血清
を示し、レーン９はネオスポラ・カニヌムの変性された
生の（弱毒化）ワクチン（TS-8）で免疫した子牛由来の
抗血清を示し、レーン１０はネオスポラ・カニヌムに自
然感染した子牛由来の抗血清を示し、レーン１１はＢＡ
Ｇ５タンパク質に対するポリクロナール抗体を示す。
【図２】先端切断されたトキソプラスマ・ゴンディイ・
組換えＢＡＧ１・タンパク質及び完全長トキソプラスマ
・ゴンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパク質に対するウ
エスタンブロットの反応性を示す図面に代わる写真であ
る。レーン１〜４は先端切断されたトキソプラスマ・ゴ
ンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパク質を示し、レーン
５は分子量マーカーを示し、レーン６〜９は完全長のト
キソプラスマ・ゴンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパク
質を示す。より詳細には、レーン１はナイーブな畜牛の
血清を示し、レーン２はネオスポラ・カニヌムの死菌型
（不活化）ワクチンで免疫した子牛由来の抗血清を示
し、レーン３はネオスポラ・カニヌムの変性された生の
（弱毒化）ワクチン（TS-8）で免疫した子牛由来の抗血
清を示し、レーン４はネオスポラ・カニヌムに自然感染
した子牛由来の抗血清を示し、レーン５は分子量マーカ
ーを示し、レーン６はナイーブな畜牛の血清を示し、レ
ーン７はネオスポラ・カニヌムの死菌型（不活化）ワク
チンで免疫した子牛由来の抗血清を示し、レーン８はネ
オスポラ・カニヌムの変性された生の（弱毒化）ワクチ
ン（TS-8）で免疫した子牛由来の抗血清を示し、レーン
９はネオスポラ・カニヌムに自然感染した子牛由来の抗
血清を示す。
組換えＢＡＧ１・タンパク質及び完全長トキソプラスマ
・ゴンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパク質に対するウ
エスタンブロットの反応性を示す図面に代わる写真であ
る。レーン１〜４は先端切断されたトキソプラスマ・ゴ
ンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパク質を示し、レーン
５は分子量マーカーを示し、レーン６〜９は完全長のト
キソプラスマ・ゴンディイ・組換えＢＡＧ１・タンパク
質を示す。より詳細には、レーン１はナイーブな畜牛の
血清を示し、レーン２はネオスポラ・カニヌムの死菌型
（不活化）ワクチンで免疫した子牛由来の抗血清を示
し、レーン３はネオスポラ・カニヌムの変性された生の
（弱毒化）ワクチン（TS-8）で免疫した子牛由来の抗血
清を示し、レーン４はネオスポラ・カニヌムに自然感染
した子牛由来の抗血清を示し、レーン５は分子量マーカ
ーを示し、レーン６はナイーブな畜牛の血清を示し、レ
ーン７はネオスポラ・カニヌムの死菌型（不活化）ワク
チンで免疫した子牛由来の抗血清を示し、レーン８はネ
オスポラ・カニヌムの変性された生の（弱毒化）ワクチ
ン（TS-8）で免疫した子牛由来の抗血清を示し、レーン
９はネオスポラ・カニヌムに自然感染した子牛由来の抗
血清を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１５年１月６日（２００３．１．６）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】
【配列表】
<110> PFIZER PRODUCTS INC.
<120> SEROLOGICAL ASSAY FOR NEOSPORA CANINUM
<130> US PC23020A
<150> 60/334,811
<151> 2001-10-31
<160> 4
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 1219
<212> DNA
<213> Toxoplasma gondii
<220>
<221> CDS
<222> (219)..(905)
<220>
<221> CDS
<222> (303)..(905)
<400> 1
tgcttttgcc aaaggagacc tgtgtgcaga ggacttcgct gctaaaaagc agaagagtgc 60
acggcgtgtg tagctcagtg gcatttcggg actcggtctt gcgtcgttcg cgactggacg 120
tcgtcgtctg tgagagcgtc aaactaggga gaaggggcgg gccagagcgt tcggaaaatt 180
atctgcaaag cccaggtccc gtatgatatt caaaaaag atg gcg ccg tca gca tcg 236
Met Ala Pro Ser Ala Ser
1 5
cat ccg ccg gga gct tgt cca ccg gga tgt acc aag cat cct gct act 284
His Pro Pro Gly Ala Cys Pro Pro Gly Cys Thr Lys His Pro Ala Thr
10 15 20
gcg aca gcc att tcc ccg agt gga gtg tgt ccc atg cgt gcg ttc cat 332
Ala Thr Ala Ile Ser Pro Ser Gly Val Cys Pro Met Arg Ala Phe His
25 30 35
ccc gcg ggg cct cac tca cat ttc tca tgt tac gat gat ctc aga aat 380
Pro Ala Gly Pro His Ser His Phe Ser Cys Tyr Asp Asp Leu Arg Asn
40 45 50
agg ctg agt cac gac aaa aat gtt cga ccg gtc gcc tct caa cag cta 428
Arg Leu Ser His Asp Lys Asn Val Arg Pro Val Ala Ser Gln Gln Leu
55 60 65 70
gac tat ttg gat gaa gta agc ccg ttt gct ctg gcg tac tac cct ccc 476
Asp Tyr Leu Asp Glu Val Ser Pro Phe Ala Leu Ala Tyr Tyr Pro Pro
75 80 85
ccg ttt tgg ggt gga gtc ggt ctt aat ccc atc gac gat atg ttg ttc 524
Pro Phe Trp Gly Gly Val Gly Leu Asn Pro Ile Asp Asp Met Leu Phe
90 95 100
gag acg gcc ctc acc gca aac gaa atg atg gag gac atc acg tgg aga 572
Glu Thr Ala Leu Thr Ala Asn Glu Met Met Glu Asp Ile Thr Trp Arg
105 110 115
ccc aga gtc gac gtg gag ttc gac agc aaa aag aag gaa atg att att 620
Pro Arg Val Asp Val Glu Phe Asp Ser Lys Lys Lys Glu Met Ile Ile
120 125 130
ttg gct gac ttg cca ggt ctt cag aaa gat gac gta acc ata gaa gtc 668
Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Gln Lys Asp Asp Val Thr Ile Glu Val
135 140 145 150
gac aac gga gcc atc gtt atc aaa gga gag aag acc tcg aaa gaa gcg 716
Asp Asn Gly Ala Ile Val Ile Lys Gly Glu Lys Thr Ser Lys Glu Ala
155 160 165
gag aaa gtg gac gat ggc aaa aca aag aac att ttg act gag cga gtg 764
Glu Lys Val Asp Asp Gly Lys Thr Lys Asn Ile Leu Thr Glu Arg Val
170 175 180
tcc ggt tat ttt cgc gcc cgg ttc cag ctc ccg agt aat tac aag ccc 812
Ser Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Phe Gln Leu Pro Ser Asn Tyr Lys Pro
185 190 195
gac gga atc agt gcg gca atg gac aac ggc gtt cta cgt gtc acg atc 860
Asp Gly Ile Ser Ala Ala Met Asp Asn Gly Val Leu Arg Val Thr Ile
200 205 210
aag gtc gag gat tca ggg ggc gca aag caa caa atc agc gtg aag 905
Lys Val Glu Asp Ser Gly Gly Ala Lys Gln Gln Ile Ser Val Lys
215 220 225
tagaggcagc gatgccgttc gtggggcagg gaaacacgga ggagcctcat 955
t gaaaatgtaa aggtgtggga gaactgttga cagtgcaaga taatagtacg 1006
agtaggattg caaagaaggc ctcccgtttc tggcgccagc cgagaaaacc tggttgatgg 1066
gcagcctcat gcgtgacggt ttttctttag aggacttgtc cgtcgaggta gtgcgtatcg 1126
cgtgtctgcg gtttatcgtc acagcgcgta tccagaaacc tagcgttcaa cggctcaaga 1186
ccgtaagcga attagagttg aataggtgtg ttat 1220
<210> 2
<211> 229
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<400> 2
Met Ala Pro Ser Ala Ser His Pro Pro Gly Ala Cys Pro Pro Gly Cys
1 5 10 15
Thr Lys His Pro Ala Thr Ala Thr Ala Ile Ser Pro Ser Gly Val Cys
20 25 30
Pro Met Arg Ala Phe His Pro Ala Gly Pro His Ser His Phe Ser Cys
35 40 45
Tyr Asp Asp Leu Arg Asn Arg Leu Ser His Asp Lys Asn Val Arg Pro
50 55 60
Val Ala Ser Gln Gln Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Val Ser Pro Phe Ala
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Tyr Pro Pro Pro Phe Trp Gly Gly Val Gly Leu Asn Pro
85 90 95
Ile Asp Asp Met Leu Phe Glu Thr Ala Leu Thr Ala Asn Glu Met Met
100 105 110
Glu Asp Ile Thr Trp Arg Pro Arg Val Asp Val Glu Phe Asp Ser Lys
115 120 125
Lys Lys Glu Met Ile Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly Leu Gln Lys Asp
130 135 140
Asp Val Thr Ile Glu Val Asp Asn Gly Ala Ile Val Ile Lys Gly Glu
145 150 155 160
Lys Thr Ser Lys Glu Ala Glu Lys Val Asp Asp Gly Lys Thr Lys Asn
165 170 175
Ile Leu Thr Glu Arg Val Ser Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Phe Gln Leu
180 185 190
Pro Ser Asn Tyr Lys Pro Asp Gly Ile Ser Ala Ala Met Asp Asn Gly
195 200 205
Val Leu Arg Val Thr Ile Lys Val Glu Asp Ser Gly Gly Ala Lys Gln
210 215 220
Gln Ile Ser Val Lys
225
<210> 3
<211> 201
<212> PRT
<213> Toxoplasma gondii
<400> 3
Ser Gly Val Cys Pro Met Arg Ala Phe His Pro Ala Gly Pro His Ser
1 5 10 15
His Phe Ser Cys Tyr Asp Asp Leu Arg Asn Arg Leu Ser His Asp Lys
20 25 30
Asn Val Arg Pro Val Ala Ser Gln Gln Leu Asp Tyr Leu Asp Glu Val
35 40 45
Ser Pro Phe Ala Leu Ala Tyr Tyr Pro Pro Pro Phe Trp Gly Gly Val
50 55 60
Gly Leu Asn Pro Ile Asp Asp Met Leu Phe Glu Thr Ala Leu Thr Ala
65 70 75 80
Asn Glu Met Met Glu Asp Ile Thr Trp Arg Pro Arg Val Asp Val Glu
85 90 95
Phe Asp Ser Lys Lys Lys Glu Met Ile Ile Leu Ala Asp Leu Pro Gly
100 105 110
Leu Gln Lys Asp Asp Val Thr Ile Glu Val Asp Asn Gly Ala Ile Val
115 120 125
Ile Lys Gly Glu Lys Thr Ser Lys Glu Ala Glu Lys Val Asp Asp Gly
130 135 140
Lys Thr Lys Asn Ile Leu Thr Glu Arg Val Ser Gly Tyr Phe Arg Ala
145 150 155 160
Arg Phe Gln Leu Pro Ser Asn Tyr Lys Pro Asp Gly Ile Ser Ala Ala
165 170 175
Met Asp Asn Gly Val Leu Arg Val Thr Ile Lys Val Glu Asp Ser Gly
180 185 190
Gly Ala Lys Gln Gln Ile Ser Val Lys
195 200
<210> 4
<211> 672
<212> DNA
<213> Neospora caninum
<400> 4
cccctttctt ctctccgttt caagatgagc aagctcagca cagacggcct gaagaaggcc 60
atcggagaga tcttggaggg ctcgcgggaa aagaagagaa agttcgtgga gaccgtcgag 120
cttcagatcg gtttgaagga ttacgacacc caaagagaca agcgtttcag cggaagcgtg 180
aggcttccta acgtcccccg cccccgcatg cgcgtgtgcg tgatgggaga tgctgtgcat 240
tgcgagcaag caaaggagct gggactggaa ttcatggacg tggaggctat gaagaagttg 300
aacaagaaca agaagcttgt gaagaaactc gcacggaagt acgacgcttt cctggcctcg 360
caagtgttga ttccgcagat cccccgtctc ctgggtccgg gtcttaacaa ggcgggcaaa 420
ttcccgacgc ttatcactca caacgataag ctcgaggata agattcagga natcaagagc 480
tcaatcaaat tccaactcag aaaggtgcct gtgcatggtg tcgccgtcng gcacgtcgac 540
atgacggagg agcaactgcg cgtgaacctg acactggcca tcaacttcct tgtctctctg 600
ctgaagaaga actggaacag cgtgagaacg ctgcacatca agagcaccat gggcaagcct 660
cagcagattt ac 672
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ダイアン マリー リッター
アメリカ合衆国 06340 コネチカット州
グロトン市 イースタン・ポイント・ロ
ード （番地なし） ファイザー・グロー
バル・リサーチ・アンド・デベロップメン
ト内
Ｆターム(参考） 4H045 AA30 BA10 CA20 DA86 EA52
Claims (15)
- 【請求項１】 動物から血清サンプルを取得し、トキソ
プラスマ・ゴンディイ・タンパク質と前記血清とを接触
させ、そして結合抗体の存在に関して前記血清を検査す
ることを含む、ネオスポラ・カニヌムに対して自然にセ
ロポジティブを示す動物とネオスポラ・ワクチンを接種
した動物とを識別する方法。 - 【請求項２】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タン
パク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タン
パク質が、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タン
パク質が、ＢＡＧ−１である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タン
パク質が、ＢＡＧ−５である、請求項２に記載の方法。 - 【請求項６】 前記タンパク質が、支持体に結合してい
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 結合抗体の存在に関してタンパク質を検
査する工程を、ウエスタンブロットアッセイによって実
施する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項８】 結合抗体の存在に関してタンパク質を検
査する工程を、ラジオイムノアッセイによって実施す
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項９】 結合抗体の存在に関してタンパク質を検
査する工程を、固相酵素免疫測定法によって実施する、
請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 タンパク質に結合した抗体の量を定量
することを更に含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１１】 動物から血清サンプルを取得し、トキ
ソプラスマ・ゴンディイ・タンパク質と前記血清とを接
触させ、そして結合抗体の存在に関して前記血清を検査
することを含む、ネオスポラ・カニヌムに感染されてし
まっている疑いのある動物の診断方法。 - 【請求項１２】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タ
ンパク質が、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は
配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１１
に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タ
ンパク質が、ＢＡＧ−１又はＢＡＧ−５である、請求項
１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 血清とトキソプラスマ・ゴンディイ・
タンパク質とを接触させ、そして結合抗体の存在に関し
て前記血清を検査することを含む、血清サンプル中の、
ネオスポラ・カニヌムに対する抗体の検出方法。 - 【請求項１５】 動物から血清サンプルを取得し、トキ
ソプラスマ・ゴンディイ・タンパク質断片と前記血清と
を接触させ、そして結合抗体の存在に関して前記血清を
検査することを含む、ネオスポラ・カニヌムに対して自
然にセロポジティブを示す動物とネオスポラ・ワクチン
を接種した動物とを識別する方法。
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|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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-
2002
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