JP2003166992A - ネオスポラ・カニヌムの血清学的分析方法 - Google Patents
ネオスポラ・カニヌムの血清学的分析方法Info
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Abstract
ジティブを示す動物とネオスポラ・ワクチンを接種した
動物とを識別する方法を提供する。 【解決手段】 識別方法は、動物から血清サンプルを取
得し、トキソプラスマ・ゴンディイ・タンパク質と前記
血清とを接触させ、そして結合抗体の存在に関して前記
血清を検査することを含み、ネオスポラ・カニヌムに対
して自然にセロポジティブを示す動物とネオスポラ・ワ
クチンを接種した動物とを識別する。
Description
ヌム(Neospora caninum)に反応性のタンパク質と対象
血清との反応による、ネオスポラ・カニヌム感染の血清
学的検出に関する。
マ・ゴンディイ(Toxoplasma gondii)は、原生動物亜
門に属し、密接に関連した寄生虫であり、多数の動物の
病気の原因となる。ネオスポラ・カニヌムは、牛や他の
動物における流産、神経関連四肢欠陥、及び新生児死亡
の原因として認識されてきた。トキソプラスマ・ゴンデ
ィイは、ヒツジの流産の一般的原因である。ネオスポラ
症及びトキソプラスマ病の有効なマネージメントには早
急な診断が必要である。従って、ネオスポラ・カニヌム
の有効な診断テストの開発は、重要である。
ニヌムに暴露されたことがあるか否かの決定に利用可能
で、当業界で承認されたテストが数種類存在する。しか
しながら、ネオスポラ・カニヌムに対して自然にセロポ
ジティブ(seropositive)を示す動物と、ネオスポラ・
ワクチンを接種した動物及び/又はネオスポラ・カニヌ
ムに対してセロネガティブ(seronegative)〔非接種〕
を示す動物とを識別する診断テスト及び方法は、従来開
発されていなかった。
カニヌムに対して自然にセロポジティブを示す動物とネ
オスポラ・ワクチンを接種した動物とを識別する方法
を、初めて提供するものである。また、本発明は、血清
学的分析方法を用いて、ネオスポラ・カニヌムに動物が
感染されたことがあるか否かを決定する方法を提供す
る。本発明は、その一つの観点によれば、トキソプラス
マ・ゴンディイ・タンパク質と血清とを接触させ、そし
て結合抗体の存在に関して前記血清を検査することによ
り、血清サンプル中における、ネオスポラ・カニヌムに
対する抗体を検出する方法を提供する。
オスポラ・セロポジティブの動物と、自然に暴露された
ネオスポラ・セロポジティブの動物とを識別することの
できる分析系を提供する。本発明によれば、トキソプラ
スマ・ゴンディイ及びネオスポラ・カニヌム由来のタン
パク質は、自然のセロポジティブ動物のみに存在するこ
とが見出された。本発明方法によって提供される分析結
果に基づいて、ネオスポラ・カニヌム・セロネガティブ
の動物と、ネオスポラ系ワクチンを先に接種されていた
動物(米国特許出願第09/260,414号明細書
「Attenuated Live Neospora Vaccine」及び米国特許出
願第09/138,985号明細書「Neospora Vaccin
e」参照)との信頼性を有する同定が今や可能になり、
そしてそれらをセロポジティブな(すなわち、自然に暴
露された)動物から隔離することができる。
らの血清は、トキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポ
ラ・カニヌムのタンパク質、並びにそれらの断片と反応
する。ここで「反応」とは、検出可能な抗原−抗体複合体
が形成されることを意味する。抗原−抗体複合体の形成
は、ネオスポラ・カニヌムに自然に感染した動物である
ことを示している。ネオスポラ・カニヌムのワクチン接
種を予め行った動物からの血清及びネオスポラ・カニヌ
ムに対して自然にセロネガティブな動物からの血清は、
トキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポラ・カニヌム
のタンパク質、並びにそれらの断片と反応しない。従っ
て、本発明は、ワクチン接種(セロネガティブ)の動物
と、自然暴露のネオスポラ・カニヌム・セロポジティブ
の動物とを識別する方法を提供する。更に、本発明によ
れば、本発明の分析結果に基づき、所望により、ネオス
ポラ・カニヌムセロポジティブな動物に、ワクチン接種
を行うことができる。本発明において意図される動物と
しては、畜牛(cattle)、子牛(calf)、非
去勢雄牛(bull)、雌牛(cow):及び去勢牛
(steer)を挙げることができる。本発明方法は、
雌牛に適用することが好ましく、子牛に適用することが
最も好ましい。
ィイ又はネオスポラ・カニヌムからの、任意の精製した
か、天然(native)か、又は組換えのブラディゾ
イト抗原又はその断片を、本発明による血清学的分析方
法用の検出抗原として用いることができる。ここで「断
片」とは、完全長のトキソプラスマ・ゴンディイ又はネ
オスポラ・カニヌムのタンパク質のペプチド部分であっ
て、動物血清に存在する抗体によって認識されるエピト
ープを供給するペプチド部分である。本発明によれば、
完全長のトキソプラスマ・ゴンディイ及びネオスポラ・
カニヌムのタンパク質の先端切断(truncate
d)形態も、断片であるものと理解されたい。
イト抗原グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GS
T)融合タンパク質(BAG−1)が、検出抗原である
(配列番号2)。別の態様では、BAG1のN−末端の
28アミノ酸が欠失した先端切断BAG−1−GST融
合タンパク質が検出抗原である(配列番号3)。BAG
−1は、当業界においてBAG−5としても知られてい
る。本発明においては、ネオスポラ・カニヌムに自然感
染した動物からの抗血清、又はネオスポラ・カニヌムの
ワクチン接種を行った動物からの抗血清、又は未感染の
抗血清をテストサンプルとして用いることができるもの
として意図されている。
ゾイト抗原又はその断片の反応性が、本発明によるネオ
スポラ・カニヌム抗体の検出方法を提供する。具体的に
は、本発明方法は、動物血清サンプルと、ブラディゾイ
ト−ステージ・タンパク質又はその断片とを接触させ
(これらは、続いて反応して抗原−抗体複合体を形成す
ることができる)、そして、反応に関して、得られた複
合体を、従来の検出及び定量方法によって検査すること
によって実施することができる。ここで「抗体」とは、
抗原の特異的エピトープと結合可能な免疫グロブリン分
子を意味する。抗体は、ポリクロナール混合物又はモノ
クロナールであることができる。抗体は、天然源又は組
換え源から誘導される完全無傷な(intact)免疫
グロブリンであることもできるし、完全無傷な免疫グロ
ブリンの免疫反応性部分であることもできる。
しくは不在を検査する多数の方法が知られており、そし
て本発明においてはそれらの全てが意図されている。例
えば、ウエスタンブロットアッセイは、固体支持体、例
えば、ニトロセルロース紙に抗原を付着させ、前記紙と
血清テストサンプルとをインキュベートし、そして、ト
キソプラスマ・ゴンディイBAG1−GSTタンパク質
の完全長体(約55kDa)又は先端切断体(約51k
Da)の予想分子量における特定バンドの存在又は不在
に関して前記ニトロセルロース紙を検査することによっ
て実施することができる。いずれかの予想分子量のバン
ドの存在は、その動物がネオスポラ・カニヌムのセロポ
ジティブであることを示している。一方、いずれかの予
想分子量のバンドの不在は、その動物がワクチン接種を
受けたことを示している。
抗原を付着させ、そして付着染料を有する抗体によって
前記抗原を染色させるウエスタンブロットアッセイも意
図されている。抗原又は抗体を酵素でラベル化する固相
酵素免疫測定法(ELISA)も用いることができる。
本発明においては、抗原又は抗体を放射性元素でラベル
化するラジオイムノアッセイも、意図されている。
在/量、又は不在に関して動物血清を検査する方法も意
図されている、従って、ポジティブ及び/又はネガティ
ブ反応用のアッセイ及びコントロールと、他の必要な成
分とを含む診断分析方法用キットを、本発明の教示に従
って組み立てることができる。広く記載されている本発
明の精神又は範囲から逸脱しない限り、前記の具体的な
態様に示すとおり、多数の変化及び/又は変形を本発明
に加えることが可能であることは、当業者に理解される
であろう。
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。
で、ネオスポラ・カニヌムのワクチン接種を受けた動物
からの抗血清》セロネガティブ又はPCR陰性の動物
(これは、続いて、ネオスポラ・カニヌム・タチゾイト
系の変性ワクチン、死菌型ワクチン又はサブユニット系
ワクチンを受ける)からの任意の血清サンプルを使用す
ることができる。本実施例では、公認の獣医学的診断研
究所(Washington State Diagnostic Lab, Pullman, ワ
シントン州)によって実施した診断ELISAテストに
よって、4ヶ月齢の子牛がセロネガティブであると決定
された。子牛は、0日目と21日目に、タキゾイト系の
(i)変性された生の弱毒化ネオスポラワクチン(米国
特許出願第09/260,414号明細書「Attenuated
Live Neospora Vaccine」参照)、又は(ii)不活性
化した全細胞ホモジネートネオスポラワクチン(米国特
許出願第09/138,985号明細書「Ne ospora Va
ccine」参照)のいずれかの接種を受けた。両方のワク
チンは、ワクチンの保護成分としてのタキゾイト抗原に
基づくものである。前記のネオスポラ・カニヌムの変性
された生の弱毒化したワクチンは、投与量当たりに5×
107Ncts−8タキゾイトを含んでおり、セロネガ
ティブの動物3頭の皮下に投与した。前記のネオスポラ
・カニヌム不活性化ホモジネートワクチンは投与量当た
りに全タキゾイトタンパク質100μgを含み、サポニ
ン系アジュバント中に製剤化され(Quil A750
μg/コレステロール150μg)、そしてセロネガテ
ィブの動物3頭の皮下に投与した。ワクチン接種から4
9日目及び119日目に、各ワクチン群の子牛3頭から
血清を採取し、プール化し、そして血清学的分析方法試
験(実施例4参照)で試験に用いるまで、−20℃でア
リコート中に冷凍された。
セロポジティブな動物からの抗血清》自然に感染したセ
ロポジティブな、又はPCR陽性の動物から、任意の抗
血清サンプルを使用することができる。本実施例では、
公認の獣医学的診断研究所(Washington State Diagnos
tic Lab, Pullman, ワシントン州)によって実施された
診断ELISA試験を用いて、市販の畜牛群から、個々
の動物の血清状態を決定した。このテストによってセロ
ポジティブであると報告された動物21頭を同定した。
セロポジティブの各動物からの血清サンプルを収集し、
サンプルをプール化し、血清学的分析方法(実施例4参
照)で試験に用いるまでは、−20℃でアリコート中に
冷凍された。
ディゾイト抗原》任意の精製、天然、若しくは組換えの
ネオスポラ・カニヌム、又はトキソプラスマ・ゴンディ
イ・ブラディゾイト・タンパク質を用いることができる
(トキソプラスマ・ゴンディイ・ブラディゾイト・タン
パク質BAG1;ジーンバンクアクセッション番号=U
23944)。本実施例では、トキソプラスマ・ゴンデ
ィイブラディゾイト抗原であるBAG1(当業界ではB
AG5としても公知である)の2つの異なる組換え生成
形態を使用した。最初の形態は、アフィニティクロマト
グラフィー(S.F.Parmley, et. al. 1995. Mol. Bioche
m. Parasit. 73: 253-257参照)によって大腸菌から発
現させて精製した完全長BAG1−グルタチオン−S−
トランスフェラーゼ(glutathione-S-transferase:GS
T)融合タンパク質であった。第2の形態は、アフィニ
ティクロマトグラフィー(S.F.Parmley,et. al. 1995)
によって大腸菌から発現させて精製され、最初のアミノ
酸28残基が欠失され、先端切断されたBAG1−GS
T融合タンパク質であった。精製された組換え完全長B
AG1−GST及び先端切断BAG1−GSTタンパク
質は、血清学的分析方法(実施例4参照)で試験に用い
るまでは、−20℃でアリコート中に冷凍された。
任意の抗体系検出試験(ELISA、競合的ELIS
A、RIA、ウエスタンブロット等)を用いることがで
きる。本実施例では、ウエスタンブロットアッセイを用
いた。総量5mgのトキソプラスマ・ゴンディイ完全長
BAG1−GST又は先端切断BAG1−GST組換え
タンパク質を解凍し、5×ディネイチャリング・サンプ
ル・ローディングバッファー(Pierce、イリノイ州)と
混合し、1mm×2ウエルのプレキャスト4−20%の
トリス−グリシンコンティニュアスグラジエントゲル
(Novex, San Diego, カリフォルニア州)に挿入した。
ゲルの実験は、製造業者の仕様書に従い、125Vで
1.5時間実施した。ゲルを20μMニトロセルロース
シート(Bio-Read, Hercules, カリフォルニア州)上に
25Vで1時間ブロットした。そのシートを乾燥させ、
縦横等しい大きさのストリップにカットした。そのスト
リップをブロッキング溶液(リン酸緩衝化生理食塩水中
の5%スキムミルク)中で、室温で一晩インキュベート
し、PBS中で洗浄し、そして続いて、血清テストサン
プル(前記実施例1及び2からのサンプル)と共にイン
キュベートした。実施例1及び2からの血清テストサン
プルのアリコートを室温にて解凍し、そして新しく調製
した1:200希釈液(PBS中)を生成した。セロネ
ガティブなナイーブ(naive:ワクチン未接種)の
雌牛からの血清を、ネガティブコントロール(1:20
0希釈液)として用いた。完全長BAG1−GSTに対
するウサギ抗血清を、ポジティブコントロール(M.McAl
listerから譲り受けた;M.McAllister, et. al., 1996.
J. Parasitol. 82(2):354-355)として使用し、そし
て、使用前にPBSにて1:12,500に希釈した。
プを、各々の希釈血清サンプルに加え、室温にて一時間
インキュベートした。そのストリップを、0.05%ト
ゥイーン20(Tween 20)を含むPBS(PBST)で2回簡
単に洗浄し、アフィニティ精製フォスファターゼラベル
化ヤギ抗牛IgG(KPL, Gaithersburg, メリーランド州)
の1:400希釈液(PBS中)含有溶液に加えた。室温
で一時間インキュベートし、続いて前記ストリップをPB
STで簡単に2回洗浄し、そして、次に、フォスファター
ゼ基質であるBCIP/NBT(KPL, Gaithersburg, メリーラ
ンド州)中でインキュベートした。適当な着色が得られ
た後(約10分間)、前記ストリップを蒸留水中に単に
入れることによって酵素反応を終了させた。次に、その
ストリップを空気乾燥させた。結果を図1に示す。
清学的テストは、血清テストサンプルとネオスポラ・カ
ニヌム又はトキソプラスマ・ゴンディイ・ブラディゾイ
ト抗原との特異的反応の存在によって示される。本実施
例においては、実施例4で使用したストリップに関し
て、トキソプラスマ・ゴンディイBAG1−GSTタン
パク質の完全長体(約55kDa)又は先端切断体(約5
1kDa)の予想分子量における特異的バンドの存在又は
不在を決定することにより、特異的反応を検査した。図
1のレーン5に示すとおり、ネオスポラ・カニヌムの自
然感染畜牛からのプール化血清と共にインキュベートし
たストリップには約52〜55kDaのバンドが存在し、
これは、ネオスポラ・カニヌム自然感染セロポジティブ
のテストサンプルと、先端切断BAG1−GSTブラデ
ィゾイト抗原との間の特異的反応を示している。これと
は対照的に、図1中のレーン3及びレーン4には、55
kDaのBAG1−GSTタンパク質に対する反応性は検
出されなかった。このことは、ネオスポラ・カニヌムの
ワクチン接種のテストサンプルのいずれかを用いた場合
には、いずれも特異的反応がないことを示している。
では、ネオスポラ・カニヌム自然感染畜牛からのプール
化血清と共にインキュベートされたストラップ中に約5
2〜55kDaのバンドが存在した。これは、ネオスポ
ラ・カニヌム自然感染セロポジティブのテストサンプル
と、BAG1−GSTブラディゾイト抗原の先端切断体
(レーン4)又は完全長体(レーン9)との間の特異的
反応を示している。これとは対照的に、図2のレーン2
及びレーン7において、ネオスポラ・カニヌム死菌型ワ
クチンで免疫した雌牛からのプール化血清(119日
目)を用いた場合、BAG1−GSTタンパク質のいず
れの形態に対しても反応性は検出されなかった。同様
に、図2のレーン3及びレーン8において、ネオスポラ
・カニヌム弱毒化型ワクチンで免疫した雌牛からのプー
ル化血清(119日目)を用いた場合、BAG1−GS
Tタンパク質のいずれの形態に対しても反応性は検出さ
れなかった。
ィイ組換えブラディゾイト抗原に対する反応性の差異
は、ブラディゾイト抗原を用いる血清学的試験を用い
て、ネオスポラ・カニヌム自然感染動物とネオスポラ・
カニヌムワクチン接種動物とを識別するか、又は診断す
ることができることを示している。任意の精製したか、
又は天然の、又は組換えブラディゾイト抗原、又はその
断片であって、ネオスポラ・カニヌム由来のもの(例え
ば、配列番号1又は2)又はネオスポラ・カニヌム(例
えば、配列番号3又は4)を、この診断試験用の検出抗
原として用いることができる。ネオスポラ・カニヌム自
然感染動物、又はネオスポラ・カニヌムワクチン接種動
物からの任意の抗血清を、この診断用テストのテストサ
ンプルとして用いることができる。
良いか、確認お願いします〕
組換えBAG1・タンパク質に対するウエスタンブロッ
トの反応性を示す図面に代わる写真である。レーン1〜
5は、レーン当たり15μgの先端切断されたトキソプ
ラスマ・ゴンディイ・組換えBAG1・タンパク質を示
し、レーン6は分子量マーカー(kDa)を示し、レー
ン7〜11は、レーン当たり10μgの先端切断された
トキソプラスマ・ゴンディイ・組換えBAG1・タンパ
ク質を示す。より詳細には、レーン1はBAG5タンパ
ク質に対するポリクロナール抗体を示し、レーン2はナ
イーブな畜牛からの血清を示し、レーン3はネオスポラ
・カニヌムの死菌型(不活化)ワクチンで免疫した子牛
由来の抗血清を示し、レーン4はネオスポラ・カニヌム
の変性された生の(弱毒化)ワクチン(TS-8)で免疫し
た子牛由来の抗血清を示し、レーン5はネオスポラ・カ
ニヌムに自然感染した子牛由来の抗血清を示し、レーン
6は分子量マーカーを示し、レーン7はナイーブな畜牛
からの血清を示し、レーン8はネオスポラ・カニヌムの
死菌型(不活化)ワクチンで免疫した子牛由来の抗血清
を示し、レーン9はネオスポラ・カニヌムの変性された
生の(弱毒化)ワクチン(TS-8)で免疫した子牛由来の
抗血清を示し、レーン10はネオスポラ・カニヌムに自
然感染した子牛由来の抗血清を示し、レーン11はBA
G5タンパク質に対するポリクロナール抗体を示す。
組換えBAG1・タンパク質及び完全長トキソプラスマ
・ゴンディイ・組換えBAG1・タンパク質に対するウ
エスタンブロットの反応性を示す図面に代わる写真であ
る。レーン1〜4は先端切断されたトキソプラスマ・ゴ
ンディイ・組換えBAG1・タンパク質を示し、レーン
5は分子量マーカーを示し、レーン6〜9は完全長のト
キソプラスマ・ゴンディイ・組換えBAG1・タンパク
質を示す。より詳細には、レーン1はナイーブな畜牛の
血清を示し、レーン2はネオスポラ・カニヌムの死菌型
(不活化)ワクチンで免疫した子牛由来の抗血清を示
し、レーン3はネオスポラ・カニヌムの変性された生の
(弱毒化)ワクチン(TS-8)で免疫した子牛由来の抗血
清を示し、レーン4はネオスポラ・カニヌムに自然感染
した子牛由来の抗血清を示し、レーン5は分子量マーカ
ーを示し、レーン6はナイーブな畜牛の血清を示し、レ
ーン7はネオスポラ・カニヌムの死菌型(不活化)ワク
チンで免疫した子牛由来の抗血清を示し、レーン8はネ
オスポラ・カニヌムの変性された生の(弱毒化)ワクチ
ン(TS-8)で免疫した子牛由来の抗血清を示し、レーン
9はネオスポラ・カニヌムに自然感染した子牛由来の抗
血清を示す。
Claims (15)
- 【請求項1】 動物から血清サンプルを取得し、トキソ
プラスマ・ゴンディイ・タンパク質と前記血清とを接触
させ、そして結合抗体の存在に関して前記血清を検査す
ることを含む、ネオスポラ・カニヌムに対して自然にセ
ロポジティブを示す動物とネオスポラ・ワクチンを接種
した動物とを識別する方法。 - 【請求項2】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タン
パク質が、配列番号2で表されるアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タン
パク質が、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項4】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タン
パク質が、BAG−1である、請求項2に記載の方法。 - 【請求項5】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タン
パク質が、BAG−5である、請求項2に記載の方法。 - 【請求項6】 前記タンパク質が、支持体に結合してい
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項7】 結合抗体の存在に関してタンパク質を検
査する工程を、ウエスタンブロットアッセイによって実
施する、請求項1に記載の方法。 - 【請求項8】 結合抗体の存在に関してタンパク質を検
査する工程を、ラジオイムノアッセイによって実施す
る、請求項1に記載の方法。 - 【請求項9】 結合抗体の存在に関してタンパク質を検
査する工程を、固相酵素免疫測定法によって実施する、
請求項1に記載の方法。 - 【請求項10】 タンパク質に結合した抗体の量を定量
することを更に含む、請求項1に記載の方法。 - 【請求項11】 動物から血清サンプルを取得し、トキ
ソプラスマ・ゴンディイ・タンパク質と前記血清とを接
触させ、そして結合抗体の存在に関して前記血清を検査
することを含む、ネオスポラ・カニヌムに感染されてし
まっている疑いのある動物の診断方法。 - 【請求項12】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タ
ンパク質が、配列番号2で表されるアミノ酸配列、又は
配列番号3で表されるアミノ酸配列を含む、請求項11
に記載の方法。 - 【請求項13】 前記トキソプラスマ・ゴンディイ・タ
ンパク質が、BAG−1又はBAG−5である、請求項
12に記載の方法。 - 【請求項14】 血清とトキソプラスマ・ゴンディイ・
タンパク質とを接触させ、そして結合抗体の存在に関し
て前記血清を検査することを含む、血清サンプル中の、
ネオスポラ・カニヌムに対する抗体の検出方法。 - 【請求項15】 動物から血清サンプルを取得し、トキ
ソプラスマ・ゴンディイ・タンパク質断片と前記血清と
を接触させ、そして結合抗体の存在に関して前記血清を
検査することを含む、ネオスポラ・カニヌムに対して自
然にセロポジティブを示す動物とネオスポラ・ワクチン
を接種した動物とを識別する方法。
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