KR102460006B1 - 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법 및 이에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물 - Google Patents

폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법 및 이에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법 및 이에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물에 관한 것으로, (S1) 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 히알루론산 20 내지 30 중량부를 혼합하는 단계; (S2) -7℃/min 내지 -5℃/min의 냉각속도로 -20℃ 내지 -50℃로 1차 동결건조하는 단계; 및 (S3) -2℃/min 내지 -3℃/min의 냉각속도로 -50℃ 내지 -70℃로 2차 동결건조하여 동결건조체를 제조하는 단계를 포함하는 본 발명에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물은 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드를 혼합시킨 다음 동결건조함으로써 작은 양을 사용하면서도 원하는 볼륨을 생성시킬 수 있으며, 다공율을 조절하여 시술 직후의 볼륨 감소를 제어할 수 있다. 또한, 동결건조 공정을 사용하여 특정크기를 가지는 기공의 다공도를 유지함으로써 장기간 동안 볼륨을 유지하는 효과를 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조직 수복용 피부 충전제 조성물은 입자 크기 및 다공율에 따라 환자에게 사용되는 필러로서 안면을 포함한 신체의 다양한 부위에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 입자의 크기가 작아 가는 주사바늘로 주사 가능하여 주사 후 환자들이 느끼는 통증과 이물감을 최소화할 수 있다.

Description

폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법 및 이에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물 {FREEZE-DRYING METHOD OF MANUFACTURING DERMAL FILLER COMPOSITIONS CONTAINING POLYNUCLEOTIDE AND HYALURONIC ACID AND THE DERMAL FILLER COMPOSITIONS CONTAINING POLYNUCLEOTIDE AND HYALURONIC ACID PREPARED THEREFROM}
본 발명은 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법 및 이에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 폴리뉴클레오타이드와 히알루론산을 혼합한 다음 동결건조시킴으로써 적은 사용량으로 원하는 볼륨감을 장기간 동안 유지할 수 있는 조직 수복용 피부 충전제 조성물의 동결건조 제조방법 및 이에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물에 관한 것이다.
사회의 구조가 변해가고 인구가 증가하면서 화상, 욕창, 외상, 성형, 난치성 궤양, 당뇨성 피부 괴사 등의 환자의 수도 점점 증가함에 따라 이에 맞는 손상된 피부의 치료 방법도 발전하고 있다. 예를 들어 화상으로 체표면적의 60% 이상이 손상되면 패혈증으로 사망하는 것이 보통이나, 최근에는 인공피부의 발전으로 수분손실과 감염을 막을 수 있어 사망률을 상당히 감소시킬 수 있게 되었다. 나아가, 미용에 대한 관심도 높아짐에 따라 미용용으로 필러가 널리 사용되고 있다.
피부용 필러는 인체에 안전한 재료를 얼굴 진피 층에 주입하여 주름을 개선하고 미관상으로 볼륨을 찾아주는 등 피부 조직을 보충해주는 주사 타입의 의료기기로서 보툴리눔 톡신(보톡스), 자가지방이식, 실리프팅, 마이크로니들, 레이저치료, 박피술 등을 비롯한 이른바 안티에이징 시술에 사용된다.
최초로 개발된 1세대 피부용 필러는 동물유래 콜라겐 필러로 시술 후 효과의 지속기간이 2~4개월로 짧고 시술 한 달 전 피부과민반응검사를 해야 한다는 번거로움 때문에 최근에는 거의 사용되고 있지 않다.
2세대 피부용 필러는 히알루론산(Hyaluronic acid) 필러로 콜라겐 필러보다 효과 지속시간이 길고 인체의 구성성분과 유사한 다당질로 구성되어 피부과민반응 등의 부작용이 현저히 적어 콜라겐 필러와 같이 피부반응 검사를 요하지 않는다는 점에서 현재 가장 많이 사용되는 필러이다. 특히, 히알루론산은 시술 및 제거가 용이하고, 점탄성(viscoelasticity)이 뛰어나며, 피부의 수분을 유지하고 피부의 볼륨 및 탄력성을 유지하여 피부용 필러의 원료로 매우 적합하다. 최근에는 히알루론산의 가교결합(cross-link)을 유도하여 입자의 크기 및 분자량을 증가시킴으로써 지속 기간을 연장시키도록 하는 연구가 활발하나 유지시간이 6~12개월로 비교적 짧기 때문에 6~12개월마다 반복하여 시술하여야 하는 번거로움이 있다.
히알루론산은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합된 직쇄상의 고분자 다당이다. 히알루론산은 포유동물의 피하조직과 연골조직 같은 결합조직에 분포되는 것 외에, 눈의 초자체나 탯줄 등에 존재하며 연쇄구균이나 간균류의 협막 등에도 존재하는 것이 알려져 있다. 히알루론산을 얻기 위한 일반적인 방법으로는 닭 벼슬, 탯줄 등에서 추출하는 방법과 연쇄구군, 간균을 배양한 후 이것으로부터 추출 정제하는 방법 등이 있다.
우수한 생체적합성을 가지는 천연 히알루론산은 종간 특이성을 갖지 않고 조직이나 장기특이성을 갖지 않으며 피부의 보습력 증진, 피부 탄력 유지 및 피부 손상 시에 피부 하층부의 손상을 줄여주고 피부의 주요구성 성분인 콜라겐이 세포 사이로의 움직임을 원활하게 하도록 윤활유와 같은 역할도 한다. 그러나 천연 히알루론산을 본연 그대로 사용하게 되면 기계적 물성이 좋지 않을 뿐만 아니라 체내에 존재하는 히알루로니다아제라는 효소에 의해 쉽게 분해되어 제거되기 때문에 다양한 응용에 있어 제한이 따르게 된다. 이와 같은 천연 히알루론산의 단점을 보완하기 위하여 화학적 수식이나 다양한 가교제를 사용한 가교를 통하여 하이드로겔을 형성하는 연구들이 많이 이루어지고 있다.
히알루론산의 화학적 수식과 가교를 통한 하이드로겔 형성은 일반적으로 히알루론산 주쇄에 존재하는 알코올 그룹과 카르복시산 그룹을 통하여 이루어진다. 히알루론산 주쇄의 카르복시산 그룹은 에스테르화(esterificatio n)에 의한 화학적 수식(D. Campoccia et al., Biomaterials, 19, 1998, 2101-2127)이 주를 이루며, 하이드로겔 형성을 위한 가교반응은 디히드라지드(K. P. Vercruysse et al., Bioconjug. Chem., 8, 1997, 686-694), 디알 데히드(Y. Luo et al., J. Control. Release, 69, 2000, 169-184), 또는 디술파이드(X. Z. Shu et al., Biomacromolecules, 3, 2002, 1304-1311)를 이용한 연구가 진행되었다. 또한, 카르복시산 그룹에 메타크릴아미드를 도입하여 광가교를 통한 하이드로겔을 제조하는 연구도 진행되었다(Y. D. Park et al., Biomaterials, 24, 2003, 893-900). 한편으로 히알루론산 주쇄의 알코올 그룹은 디비닐술폰(A. Ramamurthi et al., J. Biomed. Master Res., 60, 2002, 195-205) 또는 디글리시딜 에테르(T. Segura et al., Biomaterials, 26, 2005, 359- 371)를 이용한 연구가 진행되었다.
한편, 1980년대 후반에서 1990년대까지 하이드로겔 입자에 관한 연구는 고분자 재료를 마이크로 크기로 입자화하고 표면 및 내부를 화학적으로 개질함으로써 색전술(embolization), 효소고정화(enzyme immobilization), 약물전달(drug delivery) 등의 분야에 응용되어 왔다. 2000년대에 진입하면서는 나노기술의 발달과 더불어 수용성 고분자를 이용한 나노크기의 입자 제조 및 응용에 관한 연구가 진행되고 있다. 현재까지 하이드로겔 입자에 관한 대부분의 연구는 바이오신약 및 바이오장기 분야에 응용을 목적으로 하여 생분해성 고분자를 사용하며, 비침습적(non-invasive) 시술을 위해 주입가능형(injectable) 구조로 제조하는 것에 집중되고 있다.
다양한 장점을 가지는 히알루론산을 이용하여 하이드로겔 입자를 제조하는 연구들도 진행되고 있으며, 화학적 가교를 통해 제조되는 대부분의 히알루론산 하이드로겔 입자들이 w/o 에멀젼을 통하여 제조되어 왔다(V. Dulong et al., Carbohydrate Polymers, 57, 2004, 1-6; Y. H. Yun et al., Biomaterials, 25, 2004, 147- 157).
상기 히알루론산은 2주에서 2달 사이에 매우 빠르게 생체 내 재흡수가 일어나기 때문에 문제가 되어 상기와 같이 화학적 가교를 통해 히알루론산 하이드로겔 입자를 제조하고 있다. 하지만, 이러한 히알루론산 하이드로겔 입자의 경우에 가교 결합을 위한 가교 물질로 인해 독성이 발생하는 문제가 발생하고 있다.
한편, 3세대 필러는 폴리락트산(Polylactic acid, PLA) 또는 폴리카프로락톤(Polycaprolactone, PCL) 등의 합성고분자 필러로 인체에서 아주 서서히 분해되기 때문에 흡수성 필러인 콜라겐, 히알루론산 필러에 비하여 반영구적인 필러로 평가 및 사용되고 있다. 특히 폴리카프로락톤은 인체에 100% 흡수되어 안전한 성분이고, 피부내 이식 후 폴리락트산보다 흡수되는 속도가 느리며, 콜라겐의 생성을 촉진하여서 이물감이 없이 부드러운 느낌의 조직으로 효과가 1~4년 지속된다는 장점이 있다. 폴리카프로락톤 필러는 미립구 형태의 필러로 카복시메틸셀룰로오즈(Carboxymethylcellulose, CMC) 등과 같은 겔 캐리어에 현탁하여 투여하여야 하며 미립구의 평균 입경이나 크기 분포도에 따라 피부에 주입 시 종종 막힘 현상 등이 나타나 굵은 주사 바늘로 교체하여야 한다. 또한, 피부 내에 주입 후 3~4일 내지 4주간 볼륨의 일시적인 감소가 일어났다가 6~8주 이후에야 회복되어 시술 후 즉각적인 효과가 나타나는 히알루론산 필러보다는 시술의 만족도가 떨어진다는 단점이 있다.
이와 관련하여, 생체 내 지속성(즉, 주사 부위에서 겔의 체류 시간)을 증가시키고, 그에 의해 치료 효능의 지속시간을 증가시키기 위해 히알루론산-기반 겔의 물리화학적 안정성을 개선시키기 위한 많은 노력이 추진되었다.
한편, DNA 분획물은 인산, 4종류의 염기, 데옥시리보오스와 같은 생체 고분자들로 이루어져 있으며, 이들 성분이 혼합된 조성물은 세포의 필수 구성성분으로서 이들 분획물을 상처 부위 등에 주입함으로써 상처 부위의 치료 및 개선 등을 목적으로 하는 의약품이나 세포활성과 관련된 주름 개선 등을 목적으로 하는 화장품 등 여러 용도로 사용되고 있다.
DNA 주사는 생체 적합 물질인 폴리뉴클레오타이드(Polynucleotide, PN) 또는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드 (Polydeoxyribonucleotide, PDRN)가 함유된 주사를 말한다. DNA 분획물은 세포 간 구성 물질인 세포외 기질 (ECM, Extracellular matrix) 생성을 촉진시키고, 인체 안에서 피부치유 능력을 활성화시키는 역할을 함으로써 피부 스스로 노화되고 위축된 재생능력을 회복시켜주는 기능을 하기 때문에 피부 자체의 기능성을 높여준다.
이러한 배경하에서 본 발명자들은 볼륨감을 장기간 동안 유지할 수 있는 조직수복용 충전제 조성물을 개발하기 위해 계속 연구를 진행하던 중 폴리뉴클레오타이드에 히알루론산을 혼합한 다음 동결건조시킴으로써 적은 사용량으로 원하는 볼륨감을 장기간 동안 유지할 수 있다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 KR 특1997-0010841호
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 원하는 볼륨감을 장기간 동안 유지할 수 있는 조직수복용 충전제 조성물의 제조방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 제조방법에 따라 제조된 조직수복용 충전제 조성물을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법을 제공한다:
(S1) 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 히알루론산 20 내지 30 중량부를 혼합하는 단계;
(S2) -7℃/min 내지 -5℃/min의 냉각속도로 -20℃ 내지 -50℃로 1차 동결건조하는 단계; 및
(S3) -2℃/min 내지 -3℃/min의 냉각속도로 -50℃ 내지 -70℃로 2차 동결건조하여 동결건조체를 제조하는 단계.
바람직하게, 상기 단계 (S1)에서 NaCl, Na2HPO4 및 NaH2PO4으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 NaCl, Na2HPO4 및 NaH2PO4으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 0.1 내지 1 중량부의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 (S1)에서 히알루론산은 생분해성 강화제에 의해 가교된 것임을 특징으로 한다.
상기 생분해성 강화제는 폴리락산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리하이드록시발러릭산(Polyhydroxyvaleric acid), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락트산(Polyethyleneoxide-polylactic acid), 폴리에틸렌옥사이드-(폴리락산-글리콜산 공중합체)(Polyethyleneoxide- polylactic-coglycolic acid) 및 폴리-4-하이드록시부티레이트(Poly-4-hydroxybutyrate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 히알루론산의 가교는 알칼리 수용액 하에서 히알루론산을 선형화시킨 다음 가교제를 사용하여 수행되는 것임을 특징으로 한다.
상기 알칼리 수용액은 NaOH, KOH 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 한다.
상기 알칼리 수용액은 pH가 12 내지 14로 조정되고, 온도가 10 내지 50℃에서 조정된 것임을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 단계 (S1)에서 리도카인(Lidocaine), 부피바카인(Bupivacaine), 리그노카인(Lignocaine), 로피바케인(Ropivacaine), 코카인(Cocaine), 테트라카인(Tetracaine), 아메토카인(Amethocaine), 아밀로카인(Amylocaine), 벤지다민(Benzydamine), 신코카인(Cinchocaine), 레보부피바카인(Levobupivacaine), 메피바카인(Mepivacaine), 옥시부프로카인(Oxybuprocaine), 프리로카인(Prilocaine), 프로카인 (Procaine) 및 프로파라카인(Proparacaine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 통증완화제를 히알루론산 100 중량부를 기준으로 하여 0.1 내지 1 중량부의 양으로 추가로 첨가하는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 동결건조체의 기공 직경은 100 내지 10,000 ㎛이고, 기공간 격벽의 너비는 0.1 내지 10㎛인 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 상기 동결건조체의 기공도는 20 내지 85%인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 상기 제조방법에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물을 제공한다.
이와 같이, 본 발명에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물은 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드를 혼합시킨 다음 동결건조함으로써 작은 양을 사용하면서도 원하는 볼륨을 생성시킬 수 있으며, 다공율을 조절하여 시술 직후의 볼륨 감소를 제어할 수 있다. 또한, 동결건조 공정을 사용하여 특정 크기를 가지는 기공의 다공도를 유지함으로써 장기간 동안 볼륨을 유지하는 효과를 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물은 입자 크기 및 다공율에 따라 환자에게 사용되는 필러로서 안면을 포함한 신체의 다양한 부위에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 입자의 크기가 작아 가는 주사바늘로 주사 가능하여 주사 후 환자들이 느끼는 통증과 이물감을 최소화할 수 있다.
이하 본 발명을 좀더 상세하게 설명한다.
하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법을 제공한다:
(S1) 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 히알루론산 20 내지 30 중량부를 혼합하는 단계;
(S2) -7℃/min 내지 -5℃/min의 냉각속도로 -20℃ 내지 -50℃로 1차 동결건조하는 단계; 및
(S3) -2℃/min 내지 -3℃/min의 냉각속도로 -50℃ 내지 -70℃로 2차 동결건조하여 동결건조체를 제조하는 단계.
본 명세서에서, '충전제(filler)'는 조직 부피의 증가(예를 들면 조직확대) 및/또는 조직 기능의 향상, 및 성형 가공성을 향상할 목적으로 사용됨을 의미한다. 따라서 본 발명의 조직 수복용 피부 충전제 조성물은 의학적, 또는 미용적으로 연조직의 조직부피의 증가 또는 조직 기능의 향상을 나타내는데 사용될 수 있으며, 특히 피부의 주름을 제거 또는 개선시키거나; 볼, 입술, 가슴, 엉덩이 등의 신체부위의 부피를 확대시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용하는 "폴리뉴클레오타이드"는 당업자에 의해 이해되는 뉴클레오타이드 단위들로 구성된 폴리머를 말한다. 바람직하게는 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)을 포함하는 뉴클레오타이드 단위들을 포함할 수 있다. 또한 상기 단위는 변형될 수 있으며 변형된 뉴클레오타이드 단위들은, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록실메틸)우리딘, 2-O-메틸시티딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노-메틸우리딘, 디히드로우리딘, 2-O-메틸슈도우리딘, 2-O-메틸구아노신, 이노신, N6-이소펜틸아데노신, 1-메틸아데노신, 1-메틸슈도우리딘, 1-메틸구아노신, 1-메틸 이노신, 2,2-디메틸구아노신, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 5-메틸시티딘, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우리딘, 5-메톡시카르보닐메틸우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜틸아데노신, 우리딘-5-옥시아세트산- 메틸에스테르, 우리딘-5-옥시아세트산, 와이부톡소신(wybutoxosine), 와이부토신(wybutosine), 슈도우리딘, 퀘우오신(queuosine), 2-티오시티딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 5-메틸우리딘, 2-O-메틸 -5-메틸우리딘 및 2-0-메틸우리딘로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 자연적으로 발생하는 핵산, 예를 들어, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)이며, 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 이뿐만 아니라 핵산 유사체를 포함할 수 있고, 상기 핵산 유사체들은 비-자연적으로 발생하는 염기, 자연적으로 발생하는 포스포디에스테르 결합이 아닌 다른 뉴클레오타이드와의 연결(linkage)에 관여하는 뉴클레오타이드, 또는 포스포디에스테르 결합이 아닌 연결(linkage)을 통하여 부착된 염기들을 포함하는 뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 유사체들을 포함한다. 상기 뉴클레오타이드 유사체는, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로트리에스테르 (phosphorotriester), 포스포라미데이트(phosphoramidate), 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트, 카이랄-메틸포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오타이드, 또는 펩타이드-핵산(PNA), 기타 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 또한 그 안에 합성 또는 변형 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 올리고뉴클레오티드에 대한 다수의 상이한 형태의 변형법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드의 분자량은 350 내지 2,300 킬로달톤일 수 있고, 구체적으로는 250 내지 2100 킬로달톤일 수 있고, 더욱 구체적으로는 480 내지 2,000 킬로달톤일 수 있다. 480 킬로달톤 이하일 경우, 제형의 점탄성 개선효율이 저하되며, 2,000 킬로달톤을 초과할 경우, 과도한 점성증가로 인하여, 주입압력이 증가할 수 있다.
본 발명의 필러에 포함되는 히알루론산(이하, 'HA'라고도 함)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 이루어진 반복 단위가 선형으로 연결되어 있는 생체 고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액, 닭벼슬 등에 많이 존재하며, 우수한 생체적합성을 갖기 때문에, 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질, 점안제, 주름개선제 등의 의료 및 의료 용구나 화장품 용도로 널리 사용되고 있다. 구체적으로 본 발명의 필러에 포함되는 히알루론산은 히알루론산 외에도 이의 염을 의미할 수 있다. 상기 히알루론산의 염은 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 히알루론산을 폴리뉴클레오타이드 100 중량부에 대하여 20 내지 30 중량부의 양으로 첨가하여 혼합하는 것을 특징으로 한다. 이 때 상기 히알루론산의 양이 20 중량부 미만으로 첨가될 경우에는 피부 충전제의 볼륨 증대 및 유지효과를 수득하기 어려우며, 상기 히알루론산이 30 중량부 초과의 양으로 첨가될 경우에는 사용량 대비 효과가 비례하지 않아 비경제적이다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 히알루론산은 생분해성 강화제에 의해 가교시키는 것을 특징으로 한다.
바람직하게, 히알루론산의 가교를 위해서는 알칼리 수용액 하에서 히알루론산을 선형화시킨 다음 가교제를 사용하여 가교시키는 것을 특징으로 한다. 상기 알칼리 수용액으로는 NaOH, KOH 또는 이의 혼합물을 사용하며, 바람직하게는 NaOH 수용액을 사용할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 알칼리 수용액의 알칼리도를 높일수록 히알루론산의 용해 속도가 증가하게 된다. 다만, pH가 너무 높으면 즉 알칼리성이 커질수록 히알루론산이 가수분해될 수 있어, 알칼리 용액의 농도는 pH 9.0 내지 14.0 정도의 조건에서 용해하고 용해가 완료된 후 가교제를 첨가하기 직전에 농축 알칼리 용액을 첨가하여 pH를 12 내지 14 정도로 높이는 것이 바람직하다.
상기 알칼리 수용액의 pH를 12 내지 14로 조정한 후 수용액의 온도를 조정한다. 가교결합의 속도는 온도에 영향을 받으므로 가교속도를 조절하기 위해 수용액의 온도를 10 내지 50℃에서 조정할 수 있다.
상기 설정된 온도에 도달하면 가교제를 투입하여 가교를 진행한다. 투입된 가교제의 양에 비례하여 가교도가 높아지게 된다. 다만, 가교제가 너무 많이 첨가되면, 가교 반응 이외에 펜던트 형성율도 높아질 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 히알루론산 20 내지 30 중량부 및 생분해성 강화제 1 내지 10 중량부를 반응시켜 혼합하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 생분해성 강화제는 폴리락산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리하이드록시발러릭산(Polyhydroxyvaleric acid), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락트산(Polyethyleneoxide-polylactic acid), 폴리에틸렌옥사이드-(폴리락산-글리콜산 공중합체)(Polyethyleneoxide- polylactic-coglycolic acid) 및 폴리-4-하이드록시부티레이트(Poly-4-hydroxybutyrate)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
상기 생분해성 강화제는 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드의 혼합효율을 증대시킬 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 생분해성 강화제는 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 1 내지 10 중량부의 양으로 사용하는 것이 바람직하다. 이 때 상기 생분해성 강화제를 1 중량부 미만의 양으로 사용될 경우에는 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드의 혼합효율을 증대시키기 어려우며, 상기 생분해성 강화제의 양이 10 중량부 초과일 경우에는 과량의 사용으로 인해 오히려 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드의 혼합효율을 저하시킬 수 있다.
본 발명의 조직 수복용 피부 충전제 조성물에 포함되는 가교된 히알루론산은 특히 낮은 농도 및 적은 양의 가교제를 사용하여도 높은 유변학적 특성(점탄성, 응집성) 및 리프트 능력(Lift capability)을 나타내고, 낮은 주사압을 나타낸다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 단계 (S1)에서 NaCl, Na2HPO4 및 NaH2PO4으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 첨가하는 것을 특징으로 한다.
상기 NaCl, Na2HPO4 및 NaH2PO4으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 0.1 내지 1 중량부의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 조직 수복용 피부 충전제에는 통증완화를 위해 통증완화제를 추가로 첨가할 수 있으며, 통증완화제로는 당분야에서 통상적으로 사용되는 것으로, 예를 들어 리도카인(Lidocaine), 부피바카인(Bupivacaine), 리그노카인(Lignocaine), 로피바케인(Ropivacaine), 코카인(Cocaine), 테트라카인(Tetracaine), 아메토카인(Amethocaine), 아밀로카인(Amylocaine), 벤지다민(Benzydamine), 신코카인(Cinchocaine), 레보부피바카인(Levobupivacaine), 메피바카인(Mepivacaine), 옥시부프로카인(Oxybuprocaine), 프리로카인(Prilocaine), 프로카인 (Procaine) 및 프로파라카인(Proparacaine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 통증완화제는 히알루론산 100 중량부를 기준으로 하여 0.1 내지 1 중량부의 양으로 추가로 첨가하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드 혼합물을 동결건조하여 동결건조체를 수득하는 것을 특징으로 한다.
상기 동결건조는 -7℃/min 내지 -5℃/min의 냉각속도로 -20℃ 내지 -50℃로 1차 동결한 다음 -2℃/min 내지 -3℃/min의 냉각속도로 -50℃ 내지 -70℃로 동결건조하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 동결건조체의 기공 직경은 100 내지 10,000 ㎛이고, 기공간 격벽의 너비는 0.1 내지 10㎛인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 상기 동결건조체의 기공도는 20 내지 85%인 것을 특징으로 한다.
한편, 본 발명에서는 상기 제조방법에 따라 제조된 조직 수복용 피부 충전제 조성물을 제공한다.
이와 같이, 본 발명에 따라 제조된 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물은 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드를 혼합시킨 다음 동결건조함으로써 작은 양을 사용하면서도 원하는 볼륨을 생성시킬 수 있으며, 다공율을 조절하여 시술 직후의 볼륨 감소를 제어할 수 있다. 또한, 동결건조 공정을 사용하여 특정크기를 가지는 기공의 다공도를 유지함으로써 장기간 동안 볼륨을 유지하는 효과를 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조직 수복용 피부 충전제 조성물은 입자 크기 및 다공율에 따라 환자에게 사용되는 필러로서 안면을 포함한 신체의 다양한 부위에 사용될 수 있을 뿐만 아니라 입자의 크기가 작아 가는 주사바늘로 주사 가능하여 주사 후 환자들이 느끼는 통증과 이물감을 최소화할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 조직 수복용 피부 충전제 조성물 제조
1000ml 용량의 비이커에 0.1mol/L 농도의 NaOH 용액 200ml을 넣고 상온에서 기계식 교반기로 교반하였다. 상기 수산화 소듐 용액에 극한점도 값이 1.8 m3/kg이고, 환산 분자량이 1,300,000 Da인 히알루론산 소듐 12g을 넣어 농도가 6중량% (w/v)인 히알루론산 수용액을 제조하였다.
상기 히알루론산 수용액에 농축 NaOH을 첨가하여 pH를 13으로 조정하였다.
상기 비이커를 가열하여 히알루론산 수용액의 온도를 35℃로 조정하였다.
상기 히알루론산 수용액을 생분해성 강화제로 폴리락산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid)) 0.5g을 첨가하여 가교시킨 다음 폴리뉴클레오타이드 20g에 대하여 분자량 1,000,000 Da의 히알루론산 5g이 되도록 첨가하여 교반하였다. 교반을 멈추고 30분간 반응을 지속하여 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드의 혼합물을 제조하였다.
이어서, -7℃/min 내지 -5℃/min의 냉각속도로 -30℃로 1차 동결한 다음 -2℃/min 내지 -3℃/min의 냉각속도로 -60℃로 동결건조하여 동결건조체를 제조하였다.
상기 동결건조체의 기공 직경은 100 내지 10,000 ㎛이고, 기공간 격벽의 너비는 0.1 내지 10㎛이었으며, 기공도는 50%이었다.
<실시예 2>
NaCl를 0.1g을 추가로 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드의 혼합물의 동결건조체를 포함하는 조직 수복용 피부 충전제 조성물을 제조하였다.
<실시예 3>
Na2HPO4를 0.1g을 추가로 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드의 혼합물의 동결건조체를 포함하는 조직 수복용 피부 충전제 조성물을 제조하였다.
<실시예 4>
NaH2PO4를 0.1g을 추가로 첨가하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 히알루론산과 폴리뉴클레오타이드의 혼합물의 동결건조체를 포함하는 조직 수복용 피부 충전제 조성물을 제조하였다.
<비교예 1>
폴리뉴클레오타이드 20g에 대하여 히알루론산을 10g의 양으로 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 조직 수복용 피부 충전제를 제조하였다.
<비교예 2>
1차 동결건조를 수행하지 않는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 조직 수복용 피부 충전제를 제조하였다.
<비교예 3>
2차 동결건조를 수행하지 않는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 조직 수복용 피부 충전제를 제조하였다.
<시험예 1> 조직 수복용 피부 충전제 조성물의 물성 평가
본 발명에 따라 제조된 조직 수복용 피부 충전제 조성물의 생체조직내 지속 성능을 확인하기 위해 다음과 같이 시험하였다.
본 시험은 토끼(New Zealand White Rabbit)를 이용하였으며, 36 마리의 수컷 토끼에 조직 수복용 피부 충전제 조성물을 각 동물 당 0.6ml씩 4군데에 피내 주사하고, 주사 후 5주, 10주 및 20주째에 3마리씩 안락사시킨 후 부검을 실시하고 투여 부위를 적출하여 투여 부위의 조직 수복용 피부 충전제 조성물의 잔재 여부를 확인하였다.
잔존 조직 수복용 피부 충전제 조성물은 버어니어캘리퍼스(AND AD-5763-200)를 이용하여 크기를 측정하였다.
또한 전 시험기간 동안 일반증상을 관찰하여 이상 여부를 확인하였다.
투여 부위의 크기에 대한 자료는 one way ANOVA test를 실시하여 유의성 관찰 후 사후검정으로 Scheffe 다중검정을 실시하였으며, 통계분석은 SPSS 통계프로그램을 사용하였다.
실시예 1 내지 4 및 비교예 1 내지 3의 조직 수복용 피부 충전제 조성물에서 히알루론산의 농도, 압출력, 산도, 삼투압, 멍 유무, 지혈 유무 및 세포독성을 평가한 결과는 표 1과 같다.
히알루론산 농도
(mg/ml)		 압출력
(N)		 pH 삼투압
(mOsm/Kg)		 멍 유무 지혈 유무 세포독성
실시예 1 20.1 83.6 7.4 302 X O X
실시예 2 20.5 85.9 7.4 312 X O X
실시예 3 20.7 83.7 7.4 325 X O X
실시예 4 20.6 83.9 7.4 314 X O X
비교예 1 21.8 78.5 7.0 287 X O X
비교예 2 19.1 79.6 7.2 276 O X O
비교예 3 19.7 78.3 7.1 291 X O O
상기 실험 결과에 따르면, 본 발명의 실시예 1 내지 4의 조직 수복용 피부 충전제 조성물은 세포독성이 나타나지 않고, 농도, 압출력 및 삼투압 조건이 우수함을 확인하였다. 반면, 비교예 1은 세포독성은 문제되지 않았으나, 압출력 및 삼투압에서 실시예 1 내지 4의 조직 수복용 피부 충전제 조성물에 비해 효과가 떨어짐을 확인하였다. 또한, 비교예 2 및 3은 세포독성이 문제되어 체내 주입이 불가하다고 할 것이다.
본 발명의 조직 수복용 피부 충전제 조성물을 투여한 후, 투여 부위에 대한 시간의 경과 후, 입자의 크기를 확인한 결과는 하기 표 2와 같다.
크기(mm)
부검일 Vertical Diameter Horizontal Diameter
실시예 1 Group 1 5주 20.31 ± 1.90 20.01 ± 1.21
Group 2 10주 20.55 ± 2.23 20.42 ± 1.56
Group 3 20주 21.06 ± 3.11 20.54 ± 1.43
실시예 2 Group 1 5주 22.23 ± 1.12 20.31 ± 1.63
Group 2 10주 22.51 ± 2.26 21.37 ± 1.15
Group 3 20주 23.01 ± 3.26 22.12 ± 1.26
실시예 3 Group 1 5주 21.31 ± 1.11 20.26 ± 1.27
Group 2 10주 22.51 ± 2.65 21.41 ± 1.52
Group 3 20주 22.24 ± 3.21 22.54 ± 1.12
실시예 4 Group 1 5주 21.18 ± 1.34 20.21 ± 1.26
Group 2 10주 22.34 ± 1.36 21.27 ± 1.51
Group 3 20주 23.37 ± 2.27 22.51 ± 1.27
비교예 1 Group 1 5주 18.23 ± 1.81 18.31 ± 2.45
Group 2 10주 16.81 ± 2.45 14.02 ± 1.83
Group 3 20주 12.64 ± 1.13 12.76 ± 2.43
비교예 2 Group 1 5주 - -
Group 2 10주 - -
Group 3 20주 - -
비교예 3 Group 1 5주 - -
Group 2 10주 - -
Group 3 20주 - -
상기 실험 결과에 따르면, 실시예 1 내지 4는 20주 경과 후에도 입자의 직경에서 큰 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있어, 체내 조직 수복용 피부 충전제 조성물의 주입에 의한 효과가 장시간 유지됨을 확인할 수 있으나, 비교예 1의 경우에는 20주 경과 후 직경이 급격하게 작아진 것을 확인할 수 있어, 체내에서의 분해 속도에서 차이가 현저히 나타남을 확인하였다.
본 발명의 조직 수복용 피부 충전제 조성물을 투여한 후, 이상 여부 및 일반증상을 확인한 실험 결과는 하기 표 3과 같다.
부검일 Mortality (dead/total) 일반증상
실시예 1 Group 1 5주 0(0/3) NAD
Group 2 10주 0(0/3) NAD
Group 3 20주 0(0/3) NAD
실시예 2 Group 1 5주 0(0/3) NAD
Group 2 10주 0(0/3) NAD
Group 3 20주 0(0/3) NAD
실시예 3 Group 1 5주 0(0/3) NAD
Group 2 10주 0(0/3) NAD
Group 3 20주 0(0/3) NAD
실시예 4 Group 1 5주 0(0/3) NAD
Group 2 10주 0(0/3) NAD
Group 3 20주 0(0/3) NAD
비교예 1 Group 1 5주 0(0/3) NAD
Group 2 10주 0(0/3) NAD
Group 3 20주 0(0/3) NAD
비교예 2 Group 1 5주 - -
Group 2 10주 - -
Group 3 20주 - -
비교예 3 Group 1 5주 - -
Group 2 10주 - -
Group 3 20주 - -
상기 표 3에서 보듯이, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 조직 수복용 피부 충전제 조성물 모두 이상 여부 및 일반증상은 나타나지 않는 것으로 확인되었다.
<시험예 2> 생체조직내 지속 성능 평가
상기 시험예 1에 이어 주사 주입된 부위의 크기를 측정하였고, 일정 기간을 주기로 지속적으로 볼륨의 변화를 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 비교예 1
시술 직후 100% 100% 100% 100% 98%
5주 100% 100% 100% 100% 93%
10주 100% 100% 100% 100% 82%
20주 100% 100% 100% 100% 75%
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 조직 수복용 피부 충전제 조성의 경우 시술 초기 볼륨이 장기간 동안 유지되는 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법:
    (S1) 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 히알루론산 20 내지 30 중량부를 혼합하는 단계;
    (S2) -7℃/min 내지 -5℃/min의 냉각속도로 -20℃ 내지 -50℃로 1차 동결건조하는 단계; 및
    (S3) -2℃/min 내지 -3℃/min의 냉각속도로 -50℃ 내지 -70℃로 2차 동결건조하여 동결건조체를 제조하는 단계를 포함하되,
    상기 폴리뉴클레오타이드는, 분자량이 480 내지 2,000 킬로달톤이고,
    상기 히알루론산은, pH 9.0 내지 14.0 이고 온도 10 내지 50℃인 알칼리 수용액 하에서 히알루론산을 선형화시킨 다음 폴리락산-글리콜산 공중합체(Poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리하이드록시발러릭산(Polyhydroxyvaleric acid), 폴리에틸렌옥사이드-폴리락트산(Polyethyleneoxide-polylactic acid), 폴리에틸렌옥사이드-(폴리락산-글리콜산 공중합체)(Polyethyleneoxide- polylactic-coglycolic acid) 및 폴리-4-하이드록시부티레이트(Poly-4-hydroxybutyrate)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 하나 이상의 생분해성 강화제에 의해 가교된 것이며,
    상기 단계 (S1)에서 NaCl, Na2HPO4 및 NaH2PO4으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 폴리뉴클레오타이드 100 중량부를 기준으로 하여 0.1 내지 1 중량부의 양으로 첨가하고. 리도카인(Lidocaine), 부피바카인(Bupivacaine), 리그노카인(Lignocaine), 로피바케인(Ropivacaine), 코카인(Cocaine), 테트라카인(Tetracaine), 아메토카인(Amethocaine), 아밀로카인(Amylocaine), 벤지다민(Benzydamine), 신코카인(Cinchocaine), 레보부피바카인(Levobupivacaine), 메피바카인(Mepivacaine), 옥시부프로카인(Oxybuprocaine), 프리로카인(Prilocaine), 프로카인 (Procaine) 및 프로파라카인(Proparacaine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 통증완화제를 히알루론산 100 중량부를 기준으로 하여 0.1 내지 1 중량부의 양으로 첨가하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법.
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  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 알칼리 수용액은 NaOH, KOH 또는 이의 혼합물인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법.
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  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 동결건조체의 기공 직경은 100 내지 10,000 ㎛이고, 기공간 격벽의 너비는 0.1 내지 10㎛인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 동결건조체의 기공도는 20 내지 85%인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물의 동결건조 제조방법.
  12. 제 1 항에 따른 제조방법에 따라 제조된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오타이드 및 히알루론산 포함하는 피부 필러 조성물.
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