CN102703455B

CN102703455B - 一种人心肌肌钙蛋白i适配子及筛选方法和应用

Info

Publication number: CN102703455B
Application number: CN 201210227783
Authority: CN
Inventors: 张娟琨; 刘珺; 蒋树海; 徐锦锋
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2012-07-03
Filing date: 2012-07-03
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2032-07-03
Also published as: CN102703455A

Abstract

本发明涉及一种人心肌肌钙蛋白I适配子，具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。本发明的人心肌肌钙蛋白I（心肌肌钙蛋白I）适配子与cTn I结合的亲和力高、特异性强，提高了在心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或应用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化的灵敏性。

Description

一种人心肌肌钙蛋白I适配子及筛选方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种人心肌肌钙蛋白I适配子，尤其是一种人心肌肌钙蛋白I适配子及筛选方法和应用。

背景技术

急性心肌梗死(AMI)是我国病死率很高的心血管疾病之一，其早期诊断和及时治疗是降低死亡率的关键。心肌肌钙蛋白I以其高度的灵敏性和组织器官特异性及较长的诊断窗口期在AMI和其他心脏疾病的诊断中显示出其特殊的优越性，并将其作为急性心肌梗死检测的“金标准”。

核酸适配子是一类近年来出现的生物分子人工配体，通过体外筛选技术从大容量的单链寡核苷酸文库中筛选出高亲和力及特异性的心肌肌钙蛋白I适配子，将其与电化学技术相结合，构建心肌肌钙蛋白I适配子传感器，为急性心肌梗死的早期诊断奠定基础。因此，急需大量能与心肌肌钙蛋白I特异性结合且具有高亲和力及特异性的心肌肌钙蛋白I适配子。

目前，SELEX技术是一种新的组合化学技术，虽然也可以通过该技术进行筛选获得心肌肌钙蛋白I适配子，但是目前一般SELEX筛选循环数为8-15轮，轮数太少，得不到高亲和力的适配子，轮数太多，浪费人力、物力及时间。

通过检索，发现一篇与本发明申请相关的如下专利公开文献：

人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子及应用（CN1974594A），该发明公开了具有三种核苷酸序列的人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子，该种人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子可以在心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断上应用或用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化，本发明人心肌肌钙蛋白I亚基核酸适配子是寡核苷酸，分子量较小，可以化学合成，成本低；具有比抗体更高的亲和性和特异性；便于标记且可以在不同部位有选择性的标记；重复性和稳定性好，且易于保存，即对高温和剧烈条件不敏感，因此，具有良好的应用前景。

通过对比，本发明申请与上述专利公开文献有本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种人心肌肌钙蛋白I适配子及筛选方法和应用，该心肌肌钙蛋白I适配子能与心肌肌钙蛋白I特异性结合，具有高亲和力及特异性强的特点，该心肌肌钙蛋白I适配子的筛选方法进行12轮筛选即可得到足量和高纯度的ssDNA文库，得到高亲和力的适配子，轮数较少、节约了人力、物力及时间。

本发明实现目的的技术方案是：

一种人心肌肌钙蛋白I适配子，具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.2所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.3所述的核苷酸序列或具有序列表中SEQ ID No.4所述的核苷酸序列。

而且，所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列具有下述结构：

一种人心肌肌钙蛋白I适配子的筛选方法，步骤如下：

⑴合成随机ssDNA文库

合成长度为81bp的随机ssDNA文库，两端为固定序列，中间19个碱基为随机序列；

P81库：5'-CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CGAN19GCC GCA AGA AAAAGT TTG AGA GCAAGC TTC CG-3′。

其中：上游引物为：序列5；下游引物为：序列6；

⑵人心肌肌钙蛋白I适配子的筛选

将人心肌肌钙蛋白I按照表1中的量包被，包被液为pH9.6，0.05mol/LNaHCO₃，于4℃过夜，同时设空白对照孔，其样品孔和空白对照孔均加入50μL3%BSA封闭2h，4℃过夜；

将合成的随机ssDNA文库配制成浓度为100μmol/L的溶液；将200μL结合缓冲液与随机ssDNA文库按照表1中的文库量进行混合，在90℃下加热变性5min后，迅速置于冰上10min，然后室温变性15min；

再将已变性的ssDNA先与由3%BSA封闭的空白对照孔结合，37℃孵育，然后转移到人心肌肌钙蛋白I包被孔与人心肌肌钙蛋白I结合，37℃孵育40min，反筛除去与BSA结合ssDNA；

用洗涤缓冲液洗涤，洗去未结合心肌肌钙蛋白I的ssDNA；

在人心肌肌钙蛋白I与ssDNA结合的孔中加入洗脱缓冲液，80℃下培养10min，洗脱下与人心肌肌钙蛋白I结合的ssDNA；

向洗脱液中加入等体积的酚：氯仿抽提，震荡混匀后4℃、10000rpm离心5min，吸上清，向上清中加入2倍上清液体积的无水乙醇沉淀ssDNA，4℃、10000rpm离心5min，弃去上清，用1mL70%乙醇洗涤沉淀，37℃倒置烘干；

将沉淀溶解于20μL TE缓冲液中，贮存于-20℃，作为PCR反应的模板；

⑶PCR扩增单链DNA过程

PCR扩增引物：上游引物：序列5；下游引物：序列6；

扩增模板为步骤⑵中洗脱纯化的ssDNA，其扩增的反应条件为：94℃预变性3min；然后，94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸40s，12个循环；最后，72℃延伸7min；

反应体系25μL：ssDNA模板1μL，10×PCR Buffer2.5μL，MgCl₂1.5μL，10mM的dNTPs2.5μL，10pmo l的上、下游引物各2μL，，Taq酶0.2μL，灭菌双蒸水13.3μL；

⑷不对称PCR制备ssDNA次级文库

上游引物：序列7；下游引物：序列8；上游引物：下游引物的比例为80：1；

扩增模板为步骤⑶中的PCR扩增产物，其扩增的反应条件为：94℃预变性3min；然后，94℃变性45s，60℃退火30s，72℃延伸40s，40个循环；最后，72℃延伸7min；

反应体系25μL：ssDNA模板1μL，10×PCR Buffer2.5μL，MgCl₂1.5μL，10mM的dNTPs2.5μL，10pmol的上游引物和下游引物的量共为4μL，Taq酶0.2μL，灭菌双蒸水13.3μL；

表1心肌肌钙蛋白I蛋白适配子的12轮筛选的参数

如上所述的人心肌肌钙蛋白I适配子在心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或应用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明的人心肌肌钙蛋白I适配子与人心肌肌钙蛋白I结合的亲和力高、特异性强，提高了在心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断上的应用或应用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化的灵敏性。

2、本发明的筛选方法筛选过程中条件的控制是决定实验成败的关键，主要包括蛋白与文库的比例、二者的结合时间及背景非特异性结合的高低等。本筛选方法12轮筛选产物即得到足量和高纯度的ssDNA文库，得到高亲和力的适配子，轮数较少、节约了人力、物力及时间。

3、本发明的筛选方法的筛选过程中在结合缓冲液中加入了一定量的BSA，以封闭非特异性结合位点，去除非特异性结合，提高了筛选效率。为了尽可能多地获得心肌肌钙蛋白I适配子，开始几轮，ssDNA文库与蛋白的投入量均较高，随着筛选的进行，高特异性的适配子已经得到了富集；为了提高筛选过程的严谨性，逐渐减少二者的投入，同时增加筛选条件的严格性，缩短孵育时间，增加洗涤次数，以减少一些非特异性反应。

附图说明

图1是本发明筛选方法中心肌肌钙蛋白I蛋白与ssDNA文库的亲和力图；

图2是本发明PCR扩增反应条件的优化过程中不同循环次数的扩增结果图，其中，M表示DNAMarker，1-8分别表示5、8、12、16、20、24、28和32个循环时的PCR扩增产物；

图3为本发明PCR扩增反应条件的优化过程中不同退火温度的扩增结果图，其中，1-5分别表示退火温度为40℃、50℃、55℃、60℃和65℃时的PCR扩增产物；

图4为本发明PCR扩增反应条件的优化过程中不同模板量的扩增结果图，其中，M表示DNA Marker，1-3分别表示模板量为0.5μL、1μL和2μL时的PCR扩增产物；

图5本发明PCR扩增反应条件的优化过程中不对称PCR引物比例的优化结果图；其中，M表示DNA Marker，1-5分别表示P₁:P₂（心肌肌钙蛋白I的上游引物及下游引物）为30:1、50:1、80:1和100：1时的不对称PCR扩增产物；

图6是本发明人心肌肌钙蛋白适配子（Aptamer）的特异性分析图；

图7是本发明具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列的人心肌肌钙蛋白适配子的测序峰图；

图8是本发明具有序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列的人心肌肌钙蛋白适配子的测序峰图；

图9是本发明具有序列表中SEQ ID No.3的核苷酸序列的人心肌肌钙蛋白适配子的测序峰图；

图10是本发明具有序列表中SEQ ID No.4的核苷酸序列的人心肌肌钙蛋白适配子的测序峰图；

图11是本发明人心肌肌钙蛋白适配子的一级结构同源性分析图，其中，第一行为序列表中SEQ ID No.1的部分核苷酸序列；第二行为序列表中SEQ ID No.2的部分核苷酸序列；第三行为序列表中SEQ ID No.3的部分核苷酸序列；第四行为序列表中SEQ ID No.4的部分核苷酸序列。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明制备方法所使用的各种物质，如无特殊说明，均为市售产品；使用的方法，如无特殊说明，均为特殊方法。

本实验采用SELEX技术，使用微孔板法筛选心肌肌钙蛋白I蛋白适配子，首先将随机合成的单链寡核苷酸文库与蛋白结合，洗涤未结合的寡核苷酸文库，并将结合的序列洗脱下来，作为模板进行PCR扩增。然后通过不对称PCR制备次级文库，再与靶蛋白进行结合，重复多次循环。通过反复筛选与扩增，低亲和力的序列逐渐被除去，能和靶蛋白高亲和力及高特异性结合的寡核苷酸序列被富集，从而得到能与心肌肌钙蛋白I特异性结合的适配子。

SEQ ID No.1所述的核苷酸序列：CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CGAGTTTACATCGGGGGTACAT GCC GCAAGAAAAAGT TTGAGAGCAAGC TTC CG 81

SEQ ID No.2所述的核苷酸序列：CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CGAAGCGGAAGACATCAGACCT GCC GCA AGA AAA AGT TTG AGA GCA AGC TTC CG 81

SEQ ID No.3所述的核苷酸序列：CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CGATTCGTACGACACTAGTGGT GCC GCA AGA AAA AGT TTG AGA GCA AGC TTC CG 81

SEQ ID No.4所述的核苷酸序列：CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CGATGTACGCCTACTACTGTGT GCC GCAAGAAAAAGT TTG AGA GCAAGC TTC CG 81。

一种人心肌肌钙蛋白I适配子，所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列具有下述结构：

如上所述的人心肌肌钙蛋白I适配子的筛选方法，采用SELEX技术进行筛选，具体步骤如下：

1、随机ssDNA文库和引物的合成

用于SELEX技术筛选的长度为81bp的随机ssDNA文库由北京鼎国生物有限公司合成，两端为固定序列，中间19个碱基为随机序列。

P81库：5′–CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CGA(N19)GCC GCA AGA AAAAGT TTG AGA GCAAGC TTC CG-3′。

其中：

上游引物为：5′–CGG GAA TTC TAT GGC GGATGG GAG CAG CGA-3′；

下游引物为：5′–CGG AAG CTT GCT CTC AAA CTT TTT CTT GCG GC–3′。

2、心肌肌钙蛋白I适配子的筛选过程

⑴将心肌肌钙蛋白I蛋白按照表1中的量包被于96孔酶联微孔板上，包被液为pH9.6，0.05mol/LNaHCO₃，于4℃过夜，同时设空白对照孔，为降低背景结合，其样品孔和空白对照孔均加入50μL3%BSA封闭2h，4℃过夜；

⑵将合成的随机ssDNA文库配制成浓度为100μmol/L的溶液；将200μL结合缓冲液（具体配方为：20mmol/L pH7.35的Hepes，20mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl₂，1mmol/LMgCl₂，高压灭菌，置于棕色瓶中，放入4℃冰箱备用。）与随机ssDNA库按照表1中的文库量进行混合，按表1中的ssDNA文库量加入到结合缓冲液中，在90℃下加热变性5min后，迅速置于冰上10min，然后室温变性15min；

⑶再将步骤⑵中的随机文库ssDNA先与由3%BSA封闭的空白对照孔结合，37℃按照表1孵育一定时间，然后转移到蛋白包被孔与蛋白结合，37℃孵育40min，反筛除去与BSA结合ssDNA；

⑷使用洗涤缓冲液（具体的配方：SHCMK：20mmol/L Hepes pH7.35，20mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2，高压灭菌，置于棕色瓶中，放入4℃冰箱备用。液加入体积百分数为0.05%Tween20，高压灭菌，放入4℃冰箱备用。）按表1的洗涤次数进行洗涤，洗去未结合蛋白的ssDNA；

⑸在蛋白与ssDNA结合的孔中加入洗脱缓冲液（具体配方为：20mmol/L Tris-HCl，4mol/L异硫氰酸胍，1mol/LDTT，调pH8.3），80℃下培养10min，洗脱下与蛋白结合ssDNA；

⑹在洗脱液中加入与步骤⑸中洗脱液等体积的酚：氯仿（其中，酚与氯仿的体积比为1:1）抽提，震荡混匀后4℃10000rpm离心5min，吸取上清入另一管，向上清中加入2倍上清液体积的无水乙醇沉淀ssDNA，4℃10000rpm离心5min，弃去上清，用1mL70%乙醇洗涤沉淀，37℃倒置烘干；

⑺将沉淀溶解于20μL TE缓冲液中，贮存于-20℃，作为PCR反应的模板。

心肌肌钙蛋白I蛋白适配子的筛选过程共进行了12轮，每轮筛选筛选条件见表1。

表1心肌肌钙蛋白I蛋白适配子的12轮筛选的参数

实验结果：

筛选过程中，在结合缓冲液中加入了一定量的BSA，以封闭非特异性结合位点，去除非特异性结合，提高筛选效率。为了尽可能多地获得心肌肌钙蛋白I适配子，开始几轮，ssDNA文库与蛋白的投入量均较高，随着筛选的进行，由于高特异性的适配子已经得到富集，为了提高筛选过程的严谨性，逐渐减少二者的投入，同时增加筛选条件的严格性，缩短孵育时间，增加洗涤次数，以减少一些非特异性反应。

筛选过程中条件的控制是决定实验成败的关键，主要包括蛋白与文库的比例、二者的结合时间及背景非特异性结合的高低等。一般SELEX筛选循环数为8-15轮，轮数太少，得不到高亲和力的适配子，轮数太多，浪费人力、物力及时间。最终循环数根据心肌肌钙蛋白I蛋白与ssDNA文库的亲和力来确定，结果见图1。

结果显示：心肌肌钙蛋白I适配子的筛选共进行了12轮，ssDNA文库与心肌肌钙蛋白I的结合率由第一轮的1.3%上升到最终的33.1%。

3、PCR扩增反应条件的优化

SELEX筛选过程中制备下一轮文库时涉及到普通PCR及不对称PCR扩增，为了保证文库的特异性及足够的量，必须进行PCR优化。

在本发明中，主要对其最佳退火温度、循环次数以及模板量进行优化。

⑴PCR扩增单链DNA过程

PCR扩增引物：

上游引物：5'-CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CAG CGA-3′；

下游引物：5'-CGG AAG CTT GCT CTC AAA CTT TTT CTT GCG GC3′；

PCR反应体系见表2：

以第一轮SELEX筛选中洗脱纯化的ssDNA为模板进行PCR扩增。

具体的反应体系见表2。

表2PCR反应体系

PCR反应条件：

94℃预变性3min；

然后，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸40s；

最后，72℃延伸7min。

PCR反应条件的优化：

a)循环次数的优化：PCR反应体系25μL，平行8管。第5、8、12、16、20、24、28个循环时各取出一管，置冰箱中，至最后一管32个循环时各管72℃再延伸7min，退火温度设为55℃；

b)退火温度的优化：退火温度设为45℃、50℃、55℃、60℃及65℃，其他条件不变，分别进行PCR扩增；

c)模板量的优化：模板量分别设为0.5μL、1μL、2μL，其它条件按上述步骤a)及步骤b)的优化结果。

采用2%琼脂糖凝胶电泳分析上述PCR扩增产物。其中，不同循环次数的扩增结果见图2；不同退火温度的扩增结果见图3；不同模板量的扩增结果见图4。

实验结果：

从图2、图3及图4的扩增结果中可以看出，在PCR扩增过程中，确定了循环次数为12个循环、退火温度为60℃及模板量为1μL时为最佳扩增条件。

⑵不对称PCR技术制备ssDNA次级文库

在不对称PCR中，每管P₂（P₂指心肌肌钙蛋白I的下游引物）为l pM，P₁：P₂（P₁指心肌肌钙蛋白I的上游引物）引物比设为30：1、50：l、80：l及100：l，分别进行PCR扩增，反应体系25μL，其他各组分浓度同上，退火温度根据上述优化结果确定，循环次数40次。

根据2%琼脂糖凝胶电泳分析不对称PCR扩增产物，根据结果确定最佳条件。不对称PCR引物比例的优化结果见图5。

实验结果：

采用不对称PCR技术制备ssDNA次级文库方法较稳定，最佳引物比例为80：1，12轮筛选产物均得到足量和高纯度的ssDNA文库。对最后一轮筛选文库进行克隆，筛选出4个高亲和力及特异性的人心肌肌钙蛋白适配子，AP-1、AP-2、AP-4、AP-10。

筛选得到的人心肌肌钙蛋白适配子的测定：

1、人心肌肌钙蛋白适配子特异性测定

挑选出亲和力较高的的4个适配子，即AP-1、AP-2、AP-4、AP-10，分析其特异性，以牛血清白蛋白(BSA)为对照，分别测定适配子与心肌肌钙蛋白I及BSA结合的ssDNA的浓度，计算其浓度比（aptamer-心肌肌钙蛋白I/aptamer-BSA）。比值越大，其特异性越好，

测定结果见图6，结果显示，适配子特异性最好。

2、人心肌肌钙蛋白适配子的测序与二级结构分析

⑴人心肌肌钙蛋白适配子的一级结构

将筛选出4个特异性强的人心肌肌钙蛋白适配子进行测序分析，其序列长度与预期值一致为81bp，具体序列如下：

人心肌肌钙蛋白适配子AP-1（即SEQ ID No.1）的核苷酸序列为：CGG GAA TTC TATGGC GGA TGG GAG CGA GTTTACATCGGGGGTACAT GCC GCA AGA AAA AGT TTGAGAGCAAGC TTC CG81；

测序的适配子序列峰图见图7。

人心肌肌钙蛋白适配子AP-2（即SEQ ID No.2）的核苷酸序列为：CGG GAA TTC TATGGC GGA TGG GAG CGA AGCGGAAGACATCAGACCT GCC GCA AGA AAA AGT TTGAGAGCAAGC TTC CG81；

测序的适配子序列峰图见图8。

人心肌肌钙蛋白适配子AP-4（即SEQ ID No.3）的核苷酸序列为：CGG GAA TTC TATGGC GGA TGG GAG CGA TTCGTACGACACTAGTGGT GCC GCA AGA AAA AGT TTGAGAGCAAGC TTC CG81；

测序的适配子序列峰图见图9。

人心肌肌钙蛋白适配子AP-10（即SEQ ID No.4）的核苷酸序列为：CGG GAA TTC TATGGC GGA TGG GAG CGA TGTACGCCTACTACTGTGT GCC GCA AGA AAA AGT TTG AGAGCAAGC TTC CG81；

测序的人心肌肌钙蛋白适配子序列峰图见图10。

克隆测序证实各适配子的长度、固定序列与文库相符，随机区序列不同。使用ClustalX软件对适配子随机序列一级结构同源性进行分析，结果发现，具有SEQ ID No.1所述的核苷酸序列和具有SEQ ID No.2所述的核苷酸序列的适配子均含有保守序列ACATC，其余适配子无保守序列，其一级结构同源性分析如下图11所示。

⑵适配子二级结构的预测

蛋白是一个含有多个表位的靶分子，针对同一个表位的适配子含有相同的序列，即保守序列。人心肌肌钙蛋白适配子I AP-1与AP-2存在保守序列，因而它们在二级结构上会有一定的相似性，其亲和力也相近，为适配子与蛋白结合的结构基础提供了依据。

为了进一步进行了解，利用DNAMAN软件模拟各适配子的二级结构，适配子二级结构可能是其与心肌肌钙蛋白I蛋白结合的结构基础，ssDNA在溶液中折叠成各种特殊结构，如茎环、发夹、假结、G-四聚体等，适配子只能识别与其互补的结构，通过氢键、范德华力等与靶分子形成稳定复合物。适配子模拟图显示适配子的二级结构以颈环结构为主。

各适配子的二级结构如下所示：

所述SEQ ID No.1所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.2所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.3所述的核苷酸序列具有下述结构：

所述SEQ ID No.4所述的核苷酸序列具有下述结构：

如上结构所示，各人心肌肌钙蛋白I适配子的二级结构主要以茎环结构为主。具有SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列和具有SEQ ID No.2所述的核苷酸序列的适配子的二级结构为5′端与3′端形成茎环结构，中央随机区也为茎环结构；具有SEQ ID No.4所述的核苷酸序列的适配子的二级结构为中央随机区为G-四聚体结构。

该四种人心肌肌钙蛋白I（心肌肌钙蛋白I）适配子可应用于心肌肌钙蛋白I早期检测和临床心肌损伤的诊断或应用于心肌肌钙蛋白I的分离纯化。

Claims

1.一种人心肌肌钙蛋白I适配子，其特征在于：所述适配子的核苷酸序列为：CGG GAA TTC TAT GGC GGA TGG GAG CAG CGA GTTTACATCGGGGGTACAT GCC GCA AGA AAA AGT TTG AGA GCA AGC TTC CG。

2.权利要求1所述的人心肌肌钙蛋白I适配子在心肌肌钙蛋白I的分离纯化中的应用。