CN102382194A - 自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用 - Google Patents
自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102382194A CN102382194A CN2011103408856A CN201110340885A CN102382194A CN 102382194 A CN102382194 A CN 102382194A CN 2011103408856 A CN2011103408856 A CN 2011103408856A CN 201110340885 A CN201110340885 A CN 201110340885A CN 102382194 A CN102382194 A CN 102382194A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- autophagy
- sequence
- mwasabi
- fusion rotein
- mtagrfp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用。本发明提供了一种用于检测细胞自噬的融合蛋白，由红色荧光蛋白mTagRFP、绿色荧光蛋白mWasabi和自噬标记蛋白LC3组成；所述红色荧光蛋白mTagRFP、所述绿色荧光蛋白mWasabi均位于所述自噬标记蛋白LC3的氨基端。本发明的实验证明，本发明提供的mTagRFP-mWasabi-LC3，对荧光蛋白标签进行了关键性的改良。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用。
背景技术
研究自噬及其复杂的分子诱导机制，探索自噬在肿瘤发生、发展中发挥的作用，是利用细胞自噬为疾病治疗，如恶性肿瘤治疗提供新途径的基础。
通过调节自噬活性治疗已经成为当代肿瘤治疗和帕金森等神经性疾病治疗领域的一个新靶点和研究热点。因此，无论是科研单位还是制药公司对药物诱导的自噬在疾病治疗中的应用表示出极大的兴趣，希望通过研究自噬和死亡的关系和分子机制，进而利用自噬的调节作用，使其疾病治疗中发挥作用。
目前，观察自噬的方法有很多种。电镜是检测自噬体，判断自噬发生的金标准。但是由于其样品制备过程繁琐，电镜操作技术要求高，只能通过观察某一个时间段的细胞切片中自噬体，并且电镜下的这些结构很容易混淆，如：吞噬泡和自噬泡，溶酶体和自噬溶酶体泡。因此，需要一个能在活细胞内实时动态的观察自噬泡的形成和变化，进一步观察细胞内自噬流的变化，这对在判断细胞内自噬是否被激活的研究中展示出其极大的优势。
利用细胞内转染荧光蛋白与LC3融合表达的质粒作为自噬探针，动态观察自噬发生和发展的技术已经成为目前最简便并有效的检测方法，目前广为应用的标签分子包括：RFP-LC3，GFP-LC3，CFP-LC3，YFP-LC3，RFP1-EGFP-LC3，mCherry-EGFP-LC3。在这些方法中，RFP1-EGFP-LC3及其改良的mCherry-EGFP-LC3均是利用红色与绿色两种荧光蛋白的发光团对酸的耐受性差异，进而观察自噬流的变化。当自噬体与溶酶体融合后，由于RFP1/mCherry荧光的耐酸性强而EGFP不耐酸的特点，自噬溶酶体中只能观察到红色荧光。
随着荧光蛋白标记技术的不断发展，RFP1-EGFP-LC3及mCherry-EGFP-LC3探针在研究自噬中表现出了其自身的局限性。RFP1-EGFP-LC3及mCherry-EGFP-LC3探针的主要原理是根据荧光蛋白的耐酸性差异对自噬流进行观测。mCherry-EGFP-LC3中将mCherry取替RFP1仅仅是对红色荧光蛋白的性能进行了简单的改良。而随着荧光蛋白的发展和对EGFP进一步的研究发现，EGFP的荧光在酸性环境下并不会迅速消失，这使得该方法在检测自噬体与溶酶体融合过程中容易出现误差。
而EGFP-LC3与Lamp-RFP共转染48h后，EGFP-LC3趋向聚集与溶酶体的位置，并且EGFP在溶酶体中仍具有荧光。这使得统计自噬体和自噬溶酶体的数量，判断自噬活性上容易造成误差。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测细胞自噬的融合蛋白。
本发明提供的融合蛋白，包括红色荧光蛋白mTagRFP、绿色荧光蛋白mWasabi和自噬标记蛋白LC3；所述红色荧光蛋白mTagRFP、所述绿色荧光蛋白mWasabi均位于所述自噬标记蛋白LC3的氨基端。
在上述融合蛋白中，所述mTagRFP蛋白、所述mWasabi蛋白和所述自噬标记蛋白LC3顺次连接；
其中，mTagRFP的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第1-231位氨基酸；
其中，mWasabi的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第235-470位氨基酸；
其中，自噬标记蛋白LC3的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第475-615位氨基酸。
上述的融合蛋白为如下1)或2)的蛋白：
1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
2)将序列2的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白；
上述融合蛋白中，所述几个氨基酸残基的取代、缺失或添加为不超过10个的氨基酸残基的取代、缺失或添加。
上述融合蛋白的编码基因也是本发明保护的范围。
上述融合蛋白的编码基因是下述1)-3)中任一所述基因：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的且编码具有相同功能的蛋白所示的DNA分子。
在上述编码基因中，所述严格条件所述严格条件为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有上述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也是本发明保护的范围。
上述重组载体具体为将所述融合蛋白的编码基因插入表达载体pcDNA3.1(+)的EcoRI和XbaI位点间，得到表达所述融合蛋白的载体。
上述转基因细胞系为将所述的重组表达载体转入宿主细胞得到的细胞系，在本发明的实施例中，宿主细胞具体为Hela细胞系。
上述重组载体、上述融合蛋白或上述融合蛋白编码基因在制备检测细胞自噬荧光探针中的应用也是本发明保护的范围；
上述重组载体、上述融合蛋白或上述融合蛋白编码基因或上述转基因细胞系在检测细胞自噬流和/或自噬溶酶体中的应用也是本发明保护的范围。
本发明的还可以提供一种检测或辅助检测待测细胞自噬流和/或自噬溶酶体的方法。
本发明提供的方法，包括如下步骤：
1)将所述的重组载体转入待测细胞中，得到转基因细胞系；
2)检测步骤1)得到的转基因细胞系的荧光发光情况，若转基因细胞系的荧光发光情况，随着自噬的发生，若所述转基因细胞系中红色荧光斑点多于绿色荧光斑点，则所述待测细胞形成或候选形成自噬流(完整自噬流)或产生或候选产生自噬溶酶体(既诱导了自噬，并且具有完整的自噬流，即自噬体最终溶酶体融合，进一步降解内容物)，若所述转基因细胞系中红色荧光斑点等于绿色荧光斑点，则所述待测细胞抑制或候选抑制自噬流形成或不产生或候选不产生自噬溶酶体。
在上述方法中的步骤2)中，所述红色荧光荧光斑点多于绿色荧光斑点体现在两种荧光叠加图中仅有红色荧光没有绿色荧光；
在上述方法中的步骤2)中，所述红色荧光斑点等于绿色荧光斑点数体现在两种荧光叠加图中没有红色荧光，仅有红色和绿色的叠加的黄色。
上述方法中，所述转基因细胞系经过加入EBSS，Z18或者CQ处理。
上述判断方法也可以为若在荧光显微镜的叠加照片中红色荧光聚集点比绿色荧光聚集点并不完全重叠，红色荧光聚集点逐渐增加，则所述待测细胞在诱导自噬过程中具有完整的自噬流，若在荧光显微镜的叠加照片中红色和绿色荧光聚集的点能重叠在一起，则所述待测细胞的自噬流被抑制。
在步骤1)和步骤2)之间还包括如下步骤：将步骤1)得到的转基因细胞系经自噬诱导剂诱导的步骤，所述自噬诱导剂为EBSS或Z18。
自噬流：细胞发生自噬，形成双层膜的自噬体，包裹细胞内部分的胞质和细胞内需要降解的细胞器、蛋白质等，并最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其包裹的内容物的过程，此过程为完整的自噬流。如图3所示。
上述方法中，检测具体为通过激光共聚焦荧光显微镜进行。
本发明的实验证明，本发明提供的mTagRFP-mWasabi-LC3，对荧光蛋白标签进行了关键性的改良。mTagRFP相比RFP1而言，荧光亮度更亮，光学特性更好，更耐酸。mWasabi对酸非常敏感，在溶酶体所在的位置无mWasabi的荧光。同时，构建mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG，作为其对照。该方法在监测自噬的过程中，具有更加灵敏和准确的特性，这种是目前最为有效、可行的方法。
附图说明
图1为本发明所使用的荧光蛋白和参考文献所用荧光蛋白特性的比较
图2为mTagRFP-mWasabi-LC3，mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG，mWasabi-LC3与EGFP-LC3载体的多克隆位点示意图
图3为自噬流原理示意图
图4为mWasabi与EGFP耐酸性比较图
图5为mTagRFP-mWasabi-LC3和mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG在监测自噬流的应用
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
mTagRFP相比RFP1而言，荧光亮度更亮，光学特性更好，更耐酸(Merzlyak EM，Nat Methods 2007；4：555-7.)。通过比较EGFP和mWasabi的特性(Chudakov DM，Physiol Rev 2010；90：1103-63.)以及实验结果发现，EGFP与现在的绿色荧光蛋白mWasabi相比，mWasabi(pKa＝6.5)比EGFP(pKa＝5.9)更不耐酸，在溶酶体的酸性环境下荧光迅速消失，对酸的灵敏度比EGFP强，具体特性比较如图1所示。
融合蛋白中的mTagRFP是红色荧光蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端的第1-231位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列1的自5’末端的第1-693位核苷酸，
融合蛋白中的mWasabi是绿色荧光蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端的第235-470位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列1的自5’末端的第703-1410位核苷酸，
融合蛋白中的LC3是自噬标签蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端的第475-615位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列1的自5’末端的第1423-1848位核苷酸，该蛋白的作用是检测自噬；
mWasabi-LC3(氨基酸序列为序列表中的序列4，核苷酸序列为序列表中的序列3)，其中mWasabi是绿色荧光蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列4的自5’末端的第1-236位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列3的自5’末端的第1-708位核苷酸，其中的LC3其氨基酸序列为序列表中的序列4的自5’末端的第240-364位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列3的自5’末端的第721-1146位核苷酸。
EGFP-LC3(氨基酸序列为序列表中的序列6，核苷酸序列为序列表中的序列5)，其中EGFP是绿色荧光蛋白，其氨基酸序列为序列表中的序列6的自5’末端的第1-240位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列5的自5’末端的第1-717位核苷酸，其中的LC3其氨基酸序列为序列表中的序列5的自5’末端的第244-364位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列6的自5’末端的第730-1155位核苷酸。
已知：EBSS，Z18能诱导细胞发生自噬，自噬流完整；CQ通过破坏溶酶体的结构与功能，阻止自噬体与溶酶体融合，自噬流被阻断。
下述实施例中所用的引物如表2所示。
表2、合成中需要的引物
实施例1、mTagRFP-mWasabi-LC3的表达载体及其相关系列载体的构建
(一)表达融合蛋白EGFP-LC3，mWasabi-LC3，mTagRFP-mWasabi-LC3的表达载体的构建
EGFP，mWasabi，mTagRFP，LC3的插入位点如图2所述。
首先，从invitrogen公司购买pcDNA3.1(+)载体，货号V790-20；
其次，PCR扩增得到LC3，并用BspEI+XbaI插入到pcDNA3.1(+)载体上面得到LC3pcDNA3.1(+)。
接着PCR扩增得到EGFP，mWasabi，并用NotI+ClaI插入到LC3pcDNA3.1(+)载体上面得到EGFP-LC3，mWasabi-LC3；PCR扩增得到mTagRFP和mWasabi，分别用EcoRI+NotI和NotI+ClaI插入到LC3 pcDNA3.1(+)载体上面得到mTagRFP-mWasabi-LC3。
1、LC3pcDNA3.1(+)表达载体构建步骤如下：
1)PCR扩增LC3
模板LC3基因(人工合成序列1的自5’末端的第1423-1848位核苷酸)1ul
反应条件：94度5min
94度40sec
30cycles 60度40sec
72度1min
4度10min
得到426bpPCR产物。
2)酶切PCR产物
37度酶切4h
3)酶切载体pcDNA3.1(+)
37度酶切4h
4)胶回收酶切后的载体(步骤参照天跟公司胶回收试剂盒)
5)连接
室温连接2h
6)转化：取10ul连接产物加入大肠杆菌感受态细胞，冰浴20min，42度热击90s，冰浴5min，加入500ul LB培养基，37度温箱温浴1小时，涂Ampicillin(100μg/ml)。
7)挑克隆PCR鉴定，引物为LC3-n-primer和LC3-c-primer，得到426bp的产物为阳性克隆；
8)提取阳性克隆的质粒送去测序，结果该质粒为将序列表中的序列1的自5’末端的第1422-1848位核苷酸(LC3基因)插入载体pcDNA3.1(+)的BsPEI和XbaI酶切位点间得到的重组载体，将该重组载体记作LC3 pcDNA3.1(+)；该重组载体LC3pcDNA3.1(+)表达LC3蛋白。
2、表达EGFP-LC3，mWasabi-LC3的重组载体的构建
分别人工合成mWasabi(序列4的自5’末端的第1-236位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列3的自5’末端的第1-708位核苷酸)和EGFP(序列表中的序列6的自5’末端的第1-240位氨基酸，其核苷酸序列为序列表中的序列5的自5’末端的第1-717位核苷酸，)，并分别以此为模板进行扩增，用其对应的引物mWasabi(WasabiOct19n和WasabiOct19c)，EGFP(EGFP-Not1-N和EGFP-Cla1-C)分别进行PCR扩增，扩增引物和酶切位点分别如表2所示，分别得到PCR产物mWasabi(711bp)、EGFP(717bp)；
分别将上述PCR产物EGFP和mWasabi按照上述(一)的方法分别进行NotI和ClaI酶切，并与同样进行NotI和ClaI酶切的LC3pcDNA3.1(+)载体进行连接，分别得到重组载体p-EGFP-LC3和p-mWasabi-LC3，经过测序，p-EGFP-LC3为将序列表中序列5的自5’末端的第1-717位核苷酸插入LC3pcDNA3.1(+)载体的NotI和ClaI位点间得到的载体；p-mWasabi-LC3为将序列表中的序列3的自5’末端的第1-708位核苷酸插入LC3 pcDNA3.1(+)载体的NotI和ClaI位点间得到的载体。
3、表达mTagRFP-mWasabi-LC3的重组载体的构建
分别以人工合成的mWasabi和mTagRFP为模板，利用相对应的引物mWasabi(WasabiOct19n和WasabiOct19c)，mTagRFP(mTagRFP Mer20n和mTagRFP Mer20c)进行扩增，分别得到PCR产物mWasabi(711bp)，mTagRFP(693bp)。
将上述得到的PCR产物mTagRFP用EcoRI+NotI酶切，得到酶切产物与经过同样酶切得到的由上述1得到的LC3pcDNA3.1(+)载体连接，得到中间载体1；再将PCR产物mWasabi用NotI+ClaI酶切，得到的酶切产物与经过同样酶切得到的中间载体1连接，得到重组载体p-mTagRFP-mWasabi-LC3，经过测序，该载体为将序列表中的序列1插入pcDNA3.1(+)的EcoRI和XbaI间得到的载体。
(二)表达融合蛋白LC3的突变体mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG
1、诱导突变基因(PCR反应)
1)对照反应体系(50μl反应体系)(上海赛百盛基因技术有限公司，货号LINK-30)
37度酶切4h
2)样品反应体系(50μl反应体系)
3)反应条件：
94度30sec
94度30sec
20cycles 60度1min
72度1min per plasmid Kb
4度10min
2、突变质粒选择
PCR反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。
(1)准备PCR反应产物。
(2)加入1μl(10U/μl)MutazymeTM酶37℃温育1小时。
(3)转化
反应完毕后，把这个质粒DNA转入E.coli中，参照一般的转化步骤进行，得到转化子，提取转化子的质粒送去测序，结果为该质粒为将p-mTagRFP-mWasabi-LC3中的序列表中的序列1自5’末端第1827-1830位核苷酸敲除，即为将序列表中的序列2自5’末端第610位氨基酸缺失(参考Tanida I，Autophagy 2008；4：131-4)。将该载体记作p-mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG。
实施例2、mTagRFP-mWasabi-LC3在检测自噬流中的应用
图3为本发明的原理示意图。
1、EGFP蛋白和mWasabi蛋白在诱导自噬过程中酸敏感性比较
细胞培养和质粒转染：
HeLa细胞购自美国模式培养物研究所(简称ATCC，CCL-2.2TM)。转染试剂购自威格拉斯生物技术(北京)有限公司(Vigofect)。
将HeLa细胞于37℃，5％的二氧化碳的加湿孵化器中培养，培养液为含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco’Modified Eagle’s medium)，然后将细胞移至24孔组织培养板，当细胞密度达到70％，进行转染。
分别将由实施例1获得的质粒p-EGFP-LC3(400ng)+质粒p-Lamp 1-RFP(是带有TurboRFP红色荧光标签的溶酶体膜相关蛋白1，该蛋白的作用是指示溶酶体定位和空间分布，质粒购自addgene公司，货号：1817)和由实施例1获得的质粒p-mWasabi-LC3(400ng)+质粒p-Lamp1-RFP(400ng)转染细胞，使用Lipofectmin2000转染试剂。得到转染细胞后，再过48小时观察细胞内荧光的分布。
数据分析方法：使用A1Rsi激光共聚焦荧光显微镜为所有转染细胞进行荧光图像拍摄。结果如图4，其中A和C中，在红色溶酶体所在的位置中，EGFP-LC3中的EGFP仍然发出绿色荧光，相反，在红色溶酶体所在的位置中，mWasabi-LC3则完全没有荧光，说明mWasabi比EGFP对溶酶体的酸性环境更敏感。尽管自噬体与溶酶体已经融合，但由于EGFP仍然发出绿色荧光，EGFP-LC3在指示自噬体与自噬溶酶体，判断自噬流的过程中，往往容易将自噬溶酶体误认为是自噬体。
结果进一步说明mWasabi比EGFP对酸更敏感，更适合用于构建串联荧光标签，检测自噬体与溶酶体融合，观察自噬流的变化。
2、mTagRFP-mWasabi-LC3在检测自噬流中的应用
(1)细胞培养和质粒转染
Hela细胞分别采用上述的方法转染质粒mTagRFP-mWasabi-LC3(400ng)和质粒mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG，转染24小时后，得到转染后细胞Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3和Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG；
将Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3和Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG分别进行如下处理：
空白对照：将Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3和Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG分别在细胞培养基(DMEM培养基，购自Hyclone公司，货号：SH30019.01)中处理(37℃，CO2：5％)20小时；处理组中细胞的终浓度均为5×104个/ml。
自噬诱导剂Z18(为军事医学科学院合成，结构式如下)：
将Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3和Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG分别在含有15μM Z18的细胞培养基(DMEM培养基，购自Hyclone公司，货号：SH30019.01)中处理(37℃，CO2：5％)8小时；处理组中细胞的终浓度均为5×104个/ml。
自噬诱导剂EBSS(Sigma，货号E7510。平衡盐溶液)：将Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3和Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG分别在EBSS中处理(37℃，CO2：5％)24小时；处理组中细胞的终浓度均为5×104个/ml。
自噬抑制剂CQ(Sigma，货号C6628，30μg)：将Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3和Hela/mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG分别在含有30μg/mlCQ的细胞培养基(DMEM培养基，购自Hyclone公司，货号：SH30019.01)中处理(37℃，CO2：5％)8小时；处理组中细胞的终浓度均为5×104个/ml。
每个实验组分别随机选取100组照片，然后由激光共聚焦荧光显微镜进行拍照和荧光分布分析，得出各组的红色荧光和绿色荧光分别变化的数据。
结果如图5所示，其中5A为空白对照组；5B为EBSS组；5C为Z18组；5D为CQ组，荧光蛋白标签mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG作为mTagRFP-mWasabi-LC3的负对照，在观察自噬点状聚集时能有效扣除由于过表达导致的荧光点状聚集，避免在统计自噬点状聚集时，带进误差。
可以看出，图A-D中，mTagRFP-mWasabi-LC3ΔG在各个实验组中，LC3的点状聚集都未增加，说明LC3点突变以后尽管进入诱导细胞发生自噬的药物，LC3均不会发生聚集，而转染细胞在未进行自噬诱导时的少数几个点状聚集，是属于非特异性的聚集，应该扣除。
图A-D中，mTagRFP-mWasabi-LC3在Z18，EBSS诱导下发生点状聚集，随着自噬的发展，自噬体与溶酶体融合，绿色荧光mWasabi由于不耐酸，红色荧光mTagRFP耐酸，叠加图中有红色荧光斑点(如5B，5C中白色箭头所示)和黄色荧光斑点(如5B，5C，5D中灰色箭头所示)，而没有绿色荧光的斑点，说明产生自噬溶酶体(红色荧光斑点)和自噬体(黄色斑点)。
mTagRFP-mWasabi-LC3在CQ处理组中，发生点状聚集，但由于CQ处理后，提高了溶酶体的pH值，破坏了溶酶体的功能，看到大量红色和绿色点状聚集的出现，在叠加图中，有红色和绿色叠加成的黄色斑点为自噬体(箭头所指)，而没有单独的红色点状聚集(没有自噬溶酶体)。
以上的结果表明，本发明的检测方法不仅能用于检测自噬的发生，并能够检测自噬流过程，结果也更加可靠。
Claims (10)
1.一种用于检测细胞自噬的融合蛋白，包括红色荧光蛋白mTagRFP、绿色荧光蛋白mWasabi和自噬标记蛋白LC3；所述红色荧光蛋白mTagRFP、所述绿色荧光蛋白mWasabi均位于所述自噬标记蛋白LC3的氨基端。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：
所述融合蛋白中，所述mTagRFP蛋白、所述mWasabi蛋白和所述自噬标记蛋白LC3顺次连接；
所述mTagRFP的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第1-231位氨基酸；
所述mWasabi的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第235-470位氨基酸；
所述自噬标记蛋白LC3的氨基酸序列为序列表中的序列2的自5’末端第475-615位氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于：
所述融合蛋白为如下1)或2)的蛋白：
1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
2)将序列2的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。
4.权利要求1-3中任一所述融合蛋白的编码基因。
5.根据权利要求4所述的编码基因，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因是下述1)-3)中任一所述基因：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)与1)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码具有相同功能的蛋白所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交的且编码具有相同功能的蛋白所示的DNA分子。
6.含有权利要求1-3中任一所述融合蛋白的编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于：
所述重组载体为将权利要求1-3中任一所述融合蛋白的编码基因插入表达载体pcDNA3.1(+)中，得到表达所述融合蛋白的载体。
8.根据权利要求6所述的转基因细胞系，其特征在于：所述转基因细胞系为将权利要求7所述的重组载体转入宿主细胞得到的细胞系；所述宿主细胞具体为Hela细胞系。
9.权利要求6或7所述重组载体、权利要求1-3中任一所述融合蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白编码基因在制备检测细胞自噬荧光探针中的应用；
权利要求6或7所述重组载体、权利要求1-3中任一所述融合蛋白或权利要求4或5所述融合蛋白编码基因或权利要求6或8所述转基因细胞系在检测细胞自噬流和/或自噬溶酶体中的应用。
10.一种检测或辅助检测待测细胞自噬流和/或自噬溶酶体的方法，包括如下步骤：
1)将权利要求6或7所述的重组载体转入待测细胞中，得到转基因细胞系；
2)检测步骤1)得到的转基因细胞系的荧光发光情况，若所述转基因细胞系中红色荧光斑点多于绿色荧光斑点，则所述待测细胞形成或候选形成自噬流或产生或候选产生自噬溶酶体，若所述转基因细胞系中红色荧光斑点等于绿色荧光斑点，则所述待测细胞抑制或候选抑制自噬流形成或不产生或候选不产生自噬溶酶体；
所述检测具体为通过激光共聚焦荧光显微镜进行。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110340885.6A CN102382194B (zh) | 2011-11-02 | 2011-11-02 | 自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110340885.6A CN102382194B (zh) | 2011-11-02 | 2011-11-02 | 自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102382194A true CN102382194A (zh) | 2012-03-21 |
| CN102382194B CN102382194B (zh) | 2014-04-16 |
Family
ID=45822078
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110340885.6A Expired - Fee Related CN102382194B (zh) | 2011-11-02 | 2011-11-02 | 自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102382194B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103115907A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-22 | 华中科技大学 | 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法 |
| EP3147361A4 (en) * | 2014-05-21 | 2017-11-22 | The University of Tokyo | Fusion protein suitable for measurement of autophagy, nucleic acid encoding said fusion protein, and use of these |
| CN109053884A (zh) * | 2015-11-02 | 2018-12-21 | 东南大学 | Wasabi蛋白纳米抗体及其编码序列与应用 |
| CN113621579A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-11-09 | 华南师范大学 | 用于指示细胞自噬的双荧光s2细胞系及其制备方法 |
-
2011
- 2011-11-02 CN CN201110340885.6A patent/CN102382194B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| EKATERINA M MERZLYAK ER AL.: "Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime", 《NATURE METHODS》 * |
| HUI-WANG AI ET AL.: "Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging", 《BMC BIOLOGY》 * |
| PAUL NICKLIN ET AL: "Bidirectional Transport of Amino Acids Regulates mTOR and Autophagy", 《CELL》 * |
| SUZANNE S. ET AL.: "Molecular Characterizationo f Light Chain 3", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103115907A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-22 | 华中科技大学 | 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法 |
| CN103115907B (zh) * | 2013-01-29 | 2015-03-18 | 华中科技大学 | 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法 |
| EP3147361A4 (en) * | 2014-05-21 | 2017-11-22 | The University of Tokyo | Fusion protein suitable for measurement of autophagy, nucleic acid encoding said fusion protein, and use of these |
| CN109053884A (zh) * | 2015-11-02 | 2018-12-21 | 东南大学 | Wasabi蛋白纳米抗体及其编码序列与应用 |
| CN113621579A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-11-09 | 华南师范大学 | 用于指示细胞自噬的双荧光s2细胞系及其制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102382194B (zh) | 2014-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Müller et al. | The FtsZ-like protein FtsZm of Magnetospirillum gryphiswaldense likely interacts with its generic homolog and is required for biomineralization under nitrate deprivation | |
| CN102382194B (zh) | 自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用 | |
| Bezanilla et al. | Myosin-II tails confer unique functions in Schizosaccharomyces pombe: characterization of a novel myosin-II tail | |
| WO2022166895A1 (zh) | Crispr酶和系统以及应用 | |
| US11198880B2 (en) | Methods for producing microcompartments | |
| CN101830972B (zh) | 基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统 | |
| CA3104848A1 (en) | Enzymes of luciferin biosynthesis and use thereof | |
| US8975042B2 (en) | Fluorescent and colored proteins and methods for using them | |
| CN105859863B (zh) | 凡纳滨对虾抗菌肽-CrustinB基因及其重组蛋白的制备与应用 | |
| US9771402B2 (en) | Fluorescent and colored proteins and methods for using them | |
| CN102037126B (zh) | 赋予或增强微生物非特异黏附性和/或凝集性的方法和基因 | |
| Zackova Suchanova et al. | Diatom adhesive trail proteins acquired by horizontal gene transfer from bacteria serve as primers for marine biofilm formation | |
| CN116987166A (zh) | 橡胶树HbSTRAP2基因及其应用 | |
| CN107082804A (zh) | 一种卵形鲳鲹β‑胸腺素及其应用 | |
| CN102653771B (zh) | 谷氨酰胺转运蛋白1融合蛋白表达载体的应用 | |
| Pathak et al. | Construction and characterization of mutated LEA peptides in Escherichia coli to develop an efficient protein expression system | |
| CN101979572B (zh) | 中国南海线纹芋螺毒素s4．3的制备及应用 | |
| Grishin et al. | Creation of thermostable polypeptide cassettes for amino acid balancing in farm animal rations | |
| CN104672314B (zh) | 一种重组古紫质4蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN101979589A (zh) | 类单胺氧化酶C类脱水酶MaoC基因克隆及蛋白的制备方法及其应用 | |
| CN101967187A (zh) | 一种与细胞应激相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN116855503B (zh) | 过表达mrgprx2的稳转细胞株及其构建方法和应用 | |
| Guo et al. | Status and developmental trends in recombinant collagen preparation technology | |
| EP4303310A1 (en) | Method for producing cas3 protein | |
| CN110592054B (zh) | 海马孵化酶基因及其编码蛋白和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140416 Termination date: 20141102 |
|
| EXPY | Termination of patent right or utility model |