CN103115907A - 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法 - Google Patents

一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103115907A
CN103115907A CN2013100319262A CN201310031926A CN103115907A CN 103115907 A CN103115907 A CN 103115907A CN 2013100319262 A CN2013100319262 A CN 2013100319262A CN 201310031926 A CN201310031926 A CN 201310031926A CN 103115907 A CN103115907 A CN 103115907A
Authority
CN
China
Prior art keywords
spot
protein
microtubule
light chain
associated protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2013100319262A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103115907B (zh
Inventor
骆清铭
张智红
王亮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Huazhong University of Science and Technology
Original Assignee
Huazhong University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huazhong University of Science and Technology filed Critical Huazhong University of Science and Technology
Priority to CN201310031926.2A priority Critical patent/CN103115907B/zh
Publication of CN103115907A publication Critical patent/CN103115907A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103115907B publication Critical patent/CN103115907B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，属于细胞成像技术领域。该方法是观测荧光蛋白偶联的微管相关蛋白1轻链3蛋白（FP-LC3）斑点，与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3是否存在完全、快速的交换行为。如果存在，则表明FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则表明FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。利用该方法可以准确、快速判定LC3斑点类型。

Description

一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法
技术领域
本发明属于细胞成像技术领域，具体涉及一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法。
背景技术
在自吞噬研究领域，经常需要表征细胞内自吞噬结构。微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白被认为是一种自吞噬结构的标记性蛋白。通常将荧光（FP）蛋白与LC3融合表达于哺乳动物细胞，以便应用荧光显微镜动态观察自吞噬结构的形成与动态变化。在荧光显微成像中，可见均匀分布于胞浆和细胞核的荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3蛋白（FP-LC3）分子或分布于胞浆中的斑点状的结构，后者主要代表自吞噬结构。
但是，近5年的最新研究结果表明，这些FP-LC3斑点结构并不一定代表自吞噬囊泡结构，也可能代表LC3分子参与的蛋白聚集体（不含膜成分）。有研究表明，LC3的突变体LC3G120A(LC3□G)可以仅标记蛋白聚集体而不标记自吞噬囊泡结构，因此发展出了利用FP-LC3G120A(FP-LC3□G)来作为自吞噬结构的一个阴性对照。然而，现有的研究结果显示，虽然在特定条件下FP-LC3G120A(FP-LC3□G)确实主要标记蛋白聚集体而不标记自吞噬结构，但是在某些情况下FP-LC3G120A(FP-LC3□G)仍然会进入自吞噬囊泡，从而标记自吞噬结构。这表明，FP-LC3G120A(FP-LC3□G)并非一个完美的区分自吞噬结构或者蛋白聚集体的工具。
因此，发展出一种判定LC3斑点类型的方法，在活细胞内快速鉴别自吞噬结构与蛋白聚集体，对于提升生物学研究的准确性具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确、快速判定LC3斑点类型的方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，包括以下步骤：
（1）将荧光蛋白（FP）与微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白融合，转染并表达于哺乳动物细胞中；
（2）对步骤（1）得到的哺乳动物细胞进行处理，使哺乳动物细胞内形成荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3蛋白（FP-LC3）斑点；
（3）对步骤（2）得到的FP-LC3斑点进行分析，若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在完全、快速的交换行为，则FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。
优选地，所述步骤（3）中，分析方法为荧光漂白后恢复（FRAP）方法。
进一步地，所述FRAP方法为：对FP-LC3斑点进行FRAP分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半恢复时间<1s，恢复程度>80%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。
优选地，所述步骤（3）中，分析方法为荧光激活后重分布（FRAPa）方法。
进一步地，所述FRAPa方法为：对FP-LC3斑点进行FRAPa分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半衰减时间<2s，衰减程度>60%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。
优选地，所述步骤（3）是利用荧光显微镜进行观察。
本发明具有以下优点：
本发明是一种判定LC3斑点类型的方法，该方法的关键在于，观测FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3是否存在完全、快速的交换行为，如果存在，则表明FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则表明FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。利用本方法可以准确、快速地在活细胞内判定LC3斑点是自吞噬结构还是蛋白聚集体，判定的准确率达到100%，对提升生物学研究的准确性具有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中用FRAPa技术判定puromcyin诱导的dendra2-LC3斑点类型的图；
图2为本发明实施例2中阴性对照组(未处理组)的图；
图3为本发明实施例2中CQ诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；
图4为本发明实施例2中rapamycin诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；
图5为本发明实施例2中阴性对照组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图；
图6为本发明实施例2中CQ处理组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图；
图7为本发明实施例2中rapamycin处理组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图；
图8为本发明实施例2中FRAP技术检测CQ诱导的GFP-LC3斑点的类型的图；
图9为本发明实施例2中FRAP技术检测rapamycin诱导的GFP-LC3斑点的类型的图；
图10为本发明实施例3中LY294002诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；
图11为本发明实施例3中wortmannin诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；
图12为本发明实施例3中MG-132诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；
图13为本发明实施例3中FRAP技术检测LY294002诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；
图14为本发明实施例3中FRAP技术检测wortmannin诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；
图15为本发明实施例3中FRAP技术检测MG-132诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；
图16为本发明实施例4中atg5-/-MEFs中瞬时表达24小时的GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图；
图17为本发明实施例4中FRAP技术检测atg5-/-MEFs中GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
在本实施例中，首先将dendra2光转化蛋白融合的LC3蛋白（dendra2-LC3）转染到HeLa细胞中，过24小时。接着用嘌呤霉素（puromycin）处理细胞2.5小时,均诱导形成了dendra2-LC3斑点。Puromycin是广泛使用的诱导自吞噬斑点形成的试剂。最后用FRAPa方法进行分析。图1是FRAPa技术判定puromcyin诱导的dendra2-LC3斑点类型的图，从图中可以看出，dendra2-LC3标记的蛋白聚集体被光激活后，斑点处荧光有快速的和明显程度的降低。
实施例2
本实施例中，首先将GFP融合的LC3蛋白（GFP-LC3）和mCherry融合的LC3蛋白（mCherry-LC3G120A）共转染到HeLa细胞，过24小时。接着用嘌呤霉素（Rapamycin）和氯喹（chloroquine，简写为CQ）处理细胞6小时。Rapamycin和CQ是广泛使用的诱导自吞噬斑点形成的试剂。最后利用FRAP方法进行分析，图2为阴性未处理组对照组图，图3为CQ诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图4为rapamycin诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图5为阴性对照组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图，图6为CQ处理组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图，图7为rapamycin处理组中细胞内平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的统计的图，图8为FRAP技术检测CQ诱导的GFP-LC3斑点的类型的图，图9为FRAP技术检测rapamycin诱导的GFP-LC3斑点的类型的图。从图2至图9中可以看出，诱导形成了大量的GFP-LC3斑点而非mCherry-LC3G120A斑点，GFP-LC3斑点均没有展示出荧光漂白后恢复的特性，表明这些斑点结构为自噬体结构。图2至图7中，R-LC3-G120A代表mCherry-LC3G120A。
实施例3
本实施例中，首先将GFP-LC3和mCherry-LC3G120A共转染到HeLa细胞，过24小时。接着用LY294002、渥曼青霉素（wortmannin）和MG132处理细胞6小时。LY294002、wortmannin和MG132是被报道的可以诱导蛋白聚集体的化学试剂。最后利用FRAP方法进行分析，图10为LY294002诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图11为wortmannin诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图12为MG-132诱导GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图13为FRAP技术检测LY294002诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；图14为中FRAP技术检测wortmannin诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图；图15为FRAP技术检测MG-132诱导GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图。从图10至图15可以看出，诱导形成了一定量的蛋白聚集体。这些荧光蛋白标记的蛋白聚集体斑点，均展示出快速且几乎完全的荧光漂白后恢复特性，表明这些斑点结构为蛋白聚集体结构。图10至图12中，R-LC3-G120A代表mCherry-LC3G120A。
实施例4
有报道指出，FP-LC3表达于自吞噬缺陷细胞株永生化的atg5基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（atg5/MEFs）中，可形成非自吞噬的斑点。本实施例中，将GFP-LC3和mCherry-LC3G120A共转染到atg5/MEFs，24小时后用共聚焦显微镜观察，可见形成了一定量的蛋白聚集体。利用FRAP方法进行分析，图16为atg5/-MEFs中瞬时表达24小时的GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑点的图，图17为FRAP技术检测atg5/-MEFs中GFP-LC3+/mCherry-LC3G120A+斑点的GFP-LC3的动力学的图。从图16和图17中可以看出，这些蛋白聚集体斑点均展示出快速且几乎完全的荧光漂白后恢复特性，表明这些斑点结构为蛋白聚集体结构。图16和图17中R-LC3-G120A代表mCherry-LC3G120A。
本发明是一种判定LC3斑点类型的方法，该方法的关键在于，观测若FP-LC3与哺乳动物细胞中胞浆中FP-LC3是否存在完全、快速的交换行为，如果存在，则表明FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则表明FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。利用本方法可以准确、快速在活细胞内快速判定LC3斑点是自吞噬结构还是蛋白聚集体，判定的准确率达到100%，对提升生物学研究的准确性具有重要的应用价值。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将荧光蛋白（FP）与微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白融合，转染并表达于哺乳动物细胞中；
（2）对步骤（1）得到的哺乳动物细胞进行处理，使哺乳动物细胞内形成荧光蛋白-微管相关蛋白1轻链3蛋白（FP-LC3）斑点；
（3）对步骤（2）得到的FP-LC3斑点进行分析，若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在完全、快速的交换行为，则FP-LC3斑点的类型为蛋白聚集体；若FP-LC3与哺乳动物细胞胞浆中的FP-LC3存在少量或者不存在交换行为，则FP-LC3斑点的类型为自吞噬结构。
2.根据权利要求1所述的判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，分析方法为荧光漂白后恢复（FRAP）方法。
3.根据权利要求1所述的判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述FRAP方法为：对FP-LC3斑点进行FRAP分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半恢复时间<1s，恢复程度>80%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。
4.根据权利要求1所述的判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，分析方法为荧光激活后重分布（FRAPa）方法。
5.根据权利要求4所述的判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述FRAPa方法为：对FP-LC3斑点进行FRAPa分析，如果检测FP-LC3斑点的荧光信号的半衰减时间<2s，衰减程度>60%，则表明该FP-LC3斑点是蛋白聚集体。
6.根据权利要求1所述的判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法，其特征在于，所述步骤（3）是利用荧光显微镜进行观察。
CN201310031926.2A 2013-01-29 2013-01-29 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法 Active CN103115907B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310031926.2A CN103115907B (zh) 2013-01-29 2013-01-29 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310031926.2A CN103115907B (zh) 2013-01-29 2013-01-29 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103115907A true CN103115907A (zh) 2013-05-22
CN103115907B CN103115907B (zh) 2015-03-18

Family

ID=48414333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310031926.2A Active CN103115907B (zh) 2013-01-29 2013-01-29 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103115907B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109374823A (zh) * 2014-03-27 2019-02-22 联合传感器传感器系统有限公司 基于聚合物的固有荧光和标记剂的荧光的荧光衰减时间的自动分选聚合物材料

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101224207A (zh) * 2007-10-12 2008-07-23 中国科学院上海有机化学研究所 具有诱导自吞噬治疗错误折叠蛋白聚集所致疾病的药物及其筛选方法
US20100233730A1 (en) * 2008-11-19 2010-09-16 Rutgers, The State University Of New Jersey Therapeutic modulation of autophagy
WO2011019636A2 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancers and pathogenic infections
CN102115730A (zh) * 2010-09-29 2011-07-06 复旦大学附属中山医院 稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法
CN102382194A (zh) * 2011-11-02 2012-03-21 北京大学 自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用
WO2012154944A2 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 Stc.Unm Methods of treating autophagy-associated disorders and related pharmaceutical compositions, diagnostics, screening techniques and kits

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101224207A (zh) * 2007-10-12 2008-07-23 中国科学院上海有机化学研究所 具有诱导自吞噬治疗错误折叠蛋白聚集所致疾病的药物及其筛选方法
US20100233730A1 (en) * 2008-11-19 2010-09-16 Rutgers, The State University Of New Jersey Therapeutic modulation of autophagy
WO2011019636A2 (en) * 2009-08-11 2011-02-17 University Of Florida Research Foundation, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancers and pathogenic infections
CN102115730A (zh) * 2010-09-29 2011-07-06 复旦大学附属中山医院 稳定指示自噬的高转移潜能肝癌细胞株及其建立和应用方法
WO2012154944A2 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 Stc.Unm Methods of treating autophagy-associated disorders and related pharmaceutical compositions, diagnostics, screening techniques and kits
CN102382194A (zh) * 2011-11-02 2012-03-21 北京大学 自噬串联荧光探针mTagRFP-mWasabi-LC3及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CUIHONGZHOU等: "monitoring autophagic flux by an improved tandem fluorescent-tagged LC3(mTagRFP-mWasabi-LC3) reveals that high-dose rapamycin impairs sutophagic flux in cancer cells", <AUTOPHAGY>, vol. 8, no. 8, 31 August 2012 (2012-08-31), pages 1215 - 1226 *
郭焱: "组蛋白H2A与染色质的动态结合", 《北京大学学报（自然科学版）》, vol. 39, no. 2, 31 March 2003 (2003-03-31), pages 182 - 186 *
金鹰等: "肿瘤细胞中表达的GFP蛋白的荧光漂白特性的研究", 《光谱学与光谱分析》, vol. 24, no. 12, 31 December 2004 (2004-12-31), pages 1626 - 1629 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109374823A (zh) * 2014-03-27 2019-02-22 联合传感器传感器系统有限公司 基于聚合物的固有荧光和标记剂的荧光的荧光衰减时间的自动分选聚合物材料

Also Published As

Publication number Publication date
CN103115907B (zh) 2015-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mitchison et al. Roles of polymerization dynamics, opposed motors, and a tensile element in governing the length of Xenopus extract meiotic spindles
Schreiner et al. The tethering of chromatin to the nuclear envelope supports nuclear mechanics
Zwetsloot et al. Measuring microtubule dynamics
du Toit et al. Measuring autophagosome flux
Long et al. A conserved ankyrin repeat-containing protein regulates conoid stability, motility and cell invasion in Toxoplasma gondii
Stoner et al. High sensitivity flow cytometry of membrane vesicles
Salmon et al. Rapid rate of tubulin dissociation from microtubules in the mitotic spindle in vivo measured by blocking polymerization with colchicine.
Pelham et al. Role of actin polymerization and actin cables in actin-patch movement in Schizosaccharomyces pombe
Martin et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts
Zapotoczny et al. Actin‐spectrin scaffold supports open fenestrae in liver sinusoidal endothelial cells
Larina et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells
Seibertz et al. A modern automated patch-clamp approach for high throughput electrophysiology recordings in native cardiomyocytes
Hinterndorfer et al. Ultrastructure expansion microscopy reveals the cellular architecture of budding and fission yeast
Filby et al. The analysis of cell cycle, proliferation, and asymmetric cell division by imaging flow cytometry
Halls et al. Detection and quantification of intracellular signaling using FRET-based biosensors and high content imaging
Aeffner et al. Validation of a muscle-specific tissue image analysis tool for quantitative assessment of dystrophin staining in frozen muscle biopsies
Liang et al. Noninvasive determination of cell nucleoplasmic viscosity by fluorescence correlation spectroscopy
Fedr et al. Variability of fluorescence intensity distribution measured by flow cytometry is influenced by cell size and cell cycle progression
CN103115907B (zh) 一种判定微管相关蛋白1轻链3蛋白斑点类型的方法
Rozario et al. 3D single molecule super-resolution microscopy of whole nuclear lamina
Nascimento et al. High‐throughput detection and quantification of mitochondrial fusion through imaging flow cytometry
Di Martino et al. STED microscopy: a simplified method for liver sinusoidal endothelial fenestrae analysis
Tutucci et al. Simultaneous detection of mRNA and protein in S. cerevisiae by single-molecule FISH and immunofluorescence
Lee et al. Image-based single-molecule analysis of Notch-dependent transcription in its natural context
Greene et al. Application of GFP-labeling to study prions in yeast

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant