CN105087566B - 鉴定白木香的荧光定量pcr方法、引物和探针及其应用 - Google Patents
鉴定白木香的荧光定量pcr方法、引物和探针及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105087566B CN105087566B CN201510519667.7A CN201510519667A CN105087566B CN 105087566 B CN105087566 B CN 105087566B CN 201510519667 A CN201510519667 A CN 201510519667A CN 105087566 B CN105087566 B CN 105087566B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- probe
- bmx
- suspension culture
- aquilaria sinensis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了鉴定白木香的方法、引物和探针及其应用，所述引物和探针具有白木香的专属特异性。本发明一方面检测样本量少，不会破坏木材及其木材成品本身的结构形态。另一发面以木材特有的DNA信息为依据，能快速、准确、客观地获得白木香的种属鉴定结果，避免了传统鉴定方法必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构基础上的缺陷，实现对白木香检测的高特异性和高灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体地说涉及对白木香的DNA鉴定方法及其专用的引物和探针。
背景技术
白木香（Aquilaria sinensis (Lour.) Spreng.），又称土沉香，是瑞香科沉香属双子叶常绿乔木，为国家二级重点野生保护植物。白木香不仅是珍贵的药用植物而且还有极高的经济价值。随着人们对沉香需求量的正价，沉香价格不断攀升，市场上出现了大量的伪品，严重扰乱了市场秩序。但迄今为止，对白木香的鉴定依然采用传统的木材鉴定手段，即解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。
所谓的传统鉴定方法主要依赖宏观识别，而微观识别则需要使用光学显微镜观察其内部的解剖结构特征，也就是观察构成木材的各类细胞与组织的形态及排列特征，该方法涉及的识别特征较多，鉴定相对准确，但对于鉴定工作者的要求很高，要对此做出准确的鉴定，必须具有丰富的实践经验。近年来研究工作者开发了基于数字图像处理的木材图像识别技术，大大提高了木材识别的准确性,推动了木材识别技术的发展。但是，无论是基于识别者经验的传统识别技术还是基于计算机图像检索的识别技术，都没有脱离木材本身的形态结构及特征。同时，相近种属木材易出现材质结构的相似，为木材识别的准确性带来困难。
然而，目前对白木香的鉴定依然采用传统的木材鉴定手段，即解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。因此建立起白木香的分子鉴定方法，实现白木香的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明提供一种白木香DNA鉴定的专用引物和探针，所述引物和探针序列包括：
bmx Primer-F：5'- GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC -3'
bmx Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
bmx Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
进一步地，所述引物和探针的PCR反应条件为：95℃，10min；95℃ 15s，60℃1min，共40个循环。
进一步地，所述引物和探针的使用浓度比为：bmx Primer-F:bmx Primer-R:bmxPrimer Probe=900nM:900nM:250nM。
本发明还提供了一种白木香DNA鉴定的方法，包括如下步骤：
（1）木材样本的预处理；
（2）提取经（1）处理后的木材样本中的 DNA；
（3）利用引物bmx Primer-F和bmx Primer-R，以及探针bmx Primer Probe对（2）中提取的DNA进行荧光PCR扩增；
（4）木材种类的确定；
所述引物和探针序列包括：
bmx Primer-F：5'- GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC -3'
bmx Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
bmx Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
进一步地，所述的荧光PCR扩增条件为：95℃10min；95℃ 15;60℃1min，共40个循环。
引物和探针在鉴定白木香荧光定量PCR上的应用，所述引物和探针序列包括：
bmx Primer-F：5'- GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC -3'
bmx Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
bmx Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：本发明通过一对特异性扩增引物及MGB探针对目的基因进行扩增，条件依赖少，一般的PCR实验室设备即可满足，对结果的分析非常直观。实时荧光定量PCR技术(real time quantitative PCR，RQ-PCR)具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时检测。该法综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，易于统一标准。
本发明在对白木香大量基因信息进行分析比较的基础上，并根据序列位点多态性，设计白木香种属特异引物和探针，建立了白木香特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。本发明并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过木材特有的DNA信息做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本发明采用ARMS技术利用特异引物对突变靶序列进行高精准PCR扩增放大，与此同时，利用探针对扩增产物进行检测，在实时荧光定量 PCR平台上实现对白木香检测的高特异性和高灵敏度。
附图说明
图1是白木香和对照组树种DNA提取效果实验。
图2是本发明方法的特异性实验结果。
图3是本发明方法的灵敏度实验结果。
图4是取自针对经不同处理方式得到的木材样本的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。
实施例1 检测白木香的引物、探针和检测试剂盒
利用NCBI等资源信息，找出白木香与其他木材的基因差异位点，筛选出一对特异性扩增引物对（bmx Primer-F和bmx Primer-R），并在该引物对的扩增区域设定了一条特异性的探针（bmx Primer Probe）。所述扩增引物对和探针序列分别是：
bmx Primer-F：5'- GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC -3'
bmx Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
bmx Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
一种检测白木香的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。
其中所述qPCR扩增反应体系为：20µl的体系包括：
Taqman getyping master mix（2×） 10µl
bmx Primer Probe 终浓度(250nM)
bmx Primer-F（20µM） 终浓度（900nM）
bmx Primer-R（20µM） 终浓度（900nM）
DNA样品模板 1~20ng
其中所述引物和探针序列分别为：
bmx Primer-F：5'- GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC -3'
bmx Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
bmx Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
阳性对照品：含有本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。
阴性对照品：不含本发明所述的特异性扩增片段的质粒溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质的ddH2O。
实施例2：实时荧光PCR的鉴定方法
（1）木材样本的预处理：
用75%的乙醇对木材表面进行彻底的消毒，经无菌水冲洗并用擦干木材。切除待测木材表面部分以避免其他职务组织的污染。取一定量的木材样本，在预冷的研钵中加入液氮和石英砂研磨成粉末备用。当不立即使用时，样品DNA溶液在-20℃下保存待用。
（2）木材样本 DNA提取：
采用植物基因组提取试剂盒（Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN）提取步骤（1）中预处理的木材总DNA，置于-40℃冰箱中备用。
（3）实时荧光PCR扩增：
将步骤（2）中提取的DNA进行qPCR检测。其中扩增条件为：95℃10min；95℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环。本实施例所述qPCR扩增是在ABI公司的ABI 7500 Real Time PCRSystem完成。也可以在其他的扩增仪器上完成。
（4）确定木材种类
根据荧光PCR扩增结果确定木材样品的种类。
所述的扩增引物和探针为：
bmx Primer-F：5'- GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC -3'
bmx Primer-R：5'- CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT -3'
bmx Primer Probe ：5'-VIC- TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
实施例3：DNA提取与检测
分别提取白木香（实验组1）、对照组：A. malaccensis（马来沉香）；A. beccariana（北氏白木香）；A. crassna；A. urdanetensis；A. yunnanensis（云南沉香）；A. khasiana；A. parvifolia；A. citrinacarpa总共8个对照的基因组DNA作为模板，利用植物內源基因tRNALeu及实施例1的反应体系和实施例2所述的检测方法，对提取的DNA进行检测。
tRNALeu的引物和探针序列分别为（标准）
tRNALeu-F：5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3'
tRNALeu-R：5'-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3'
tRNALeu Probe ：5'-FAM-GCAATCCTGAGCCAAATCC-TAMRA-3'
如图1表明实施例3中实验组和对照组样本的DNA均已经被成功提取。
实施例4：荧光PCR扩增的特异性
以实施例3提取DNA作为模版，实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法，进行白木香荧光PCR检测的特异性实验。
如图2所示实验结果表明，本发明所述的引物、探针和方法能扩增出白木香。而同属的A. malaccensis（马来沉香）；A. beccariana（北氏白木香）；A. crassna；A.urdanetensis；A. yunnanensis（云南沉香）；A. khasiana；A. parvifolia；A.citrinacarpa均为阴性，均不能被扩增。因此本发明所述引物、探针和方法能够检测出白木香，检测特异性好。
另外，将本实施例实验组和对照组的完整木材用传统的鉴定方法作进一步确认实验。结果表明，利用本发明所述分子鉴定方法确认的结果准确。由此可见，本发明具有很好的特异性。
实施例5：荧光PCR扩增的灵敏度
以同一根干燥的白木香木材为材料，烘干至恒重，然后分别以0.1g、0.5g、1.0g和2.0g取样，利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。
图3所示，随着样品量的增加，对应qPCR的Ct值成比例下降，样品取样量与结果对应性强。实验结果表明，利用本发明所述的引物和探针，可以检测出样品量仅为0.1g的DNA信息。
由于本发明所述分子鉴定方法只需要极少量的木材样本就可完成检测，它并不依赖于木材的形态结构是否完整。因此本发明不仅可以对形态完整的白木香进行鉴定，还可以对看不出原始形态的白木香加工成品或半成品等进行鉴定。
实施例6：检测经不同处理方式得到的木材样本
选用的木材样本分别来自：利用25℃和65℃三种温度干燥的木材；潮湿木材，即受潮的木材；分别采用挤压、熏蒸或气干处理的木材。利用实施例1和实施例2所述的引物、探针和检测方法进行检测。如图4所示的实验结果表明本发明所述的引物和探针，可以准确地分析出利用不同方法处理后的白木香的DNA情况。其中图中的A、B、C、D分别表示A：干燥木材；B：潮湿木材；C：挤压木材；D：熏蒸木材；E：气干木材。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 鉴定白木香的荧光定量PCR方法、引物和探针及其应用
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaaacttaca tacaaagtcg tcccttc 27
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cattaccaag acatcatcct catttt 26
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgacatagac acaagtc 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgaaatcggt agacgctacg 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttccattgag tctctgcacc t 21
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcaatcctga gccaaatcc 19
Claims (6)
1.用于鉴定白木香的荧光定量PCR的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列包括：
bmx Primer-F：5'-GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC-3'
bmx Primer-R：5'-CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT-3'
bmx Primer Probe：5'-VIC-TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的PCR反应条件为：95℃10min；95℃15s；60℃1min，共40个循环。
3.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述引物和探针的使用浓度比为：bmxPrimer-F:bmx Primer-R:bmx Primer Probe＝900nM:900nM:250nM。
4.用于鉴定白木香荧光定量PCR的方法，包括如下步骤：
(1)木材样本的预处理；
(2)提取经(1)处理后的木材样本中的DNA；
(3)利用引物bmx Primer-F和bmx Primer-R，以及探针bmx Primer Probe对(2)中提取的DNA进行荧光PCR扩增；
(4)木材种类的确定；
其特征在于，所述引物和探针序列包括：
bmx Primer-F：5'-GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC-3'
bmx Primer-R：5'-CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT-3'
bmx Primer Probe：5'-VIC-TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述木材样本的预处理步骤包括：用75％的乙醇对木材表面进行彻底的消毒，经无菌水冲洗并用擦干木材，切除待测木材表面部分以避免其他植物组织的污染；所述的荧光PCR扩增条件为：95℃10min；95℃15s；60℃1min，共40个循环。
6.引物和探针在鉴定白木香荧光定量PCR上的应用，其特征在于，所述引物和探针序列包括：
bmx Primer-F：5'-GAAACTTACATACAAAGTCGTCCCTTC-3'
bmx Primer-R：5'-CATTACCAAGACATCATCCTCATTTT-3'
bmx Primer Probe：5'-VIC-TGACATAGACACAAGTC-MGB-3'。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510519667.7A CN105087566B (zh) | 2015-08-21 | 2015-08-21 | 鉴定白木香的荧光定量pcr方法、引物和探针及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510519667.7A CN105087566B (zh) | 2015-08-21 | 2015-08-21 | 鉴定白木香的荧光定量pcr方法、引物和探针及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105087566A CN105087566A (zh) | 2015-11-25 |
| CN105087566B true CN105087566B (zh) | 2017-12-26 |
Family
ID=54568900
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510519667.7A Active CN105087566B (zh) | 2015-08-21 | 2015-08-21 | 鉴定白木香的荧光定量pcr方法、引物和探针及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105087566B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109486983A (zh) * | 2017-09-11 | 2019-03-19 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 土沉香、云南沉香、马来沉香的snp分子标记及应用 |
| CN109486981A (zh) * | 2017-09-11 | 2019-03-19 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 土沉香的鉴定 |
-
2015
- 2015-08-21 CN CN201510519667.7A patent/CN105087566B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 正交实验设计优化白木香ISSR-PCR反应体系的研究;申彦晶;《药物生物技术》;20080520;第15卷(第1期);第31-34页 * |
| 白木香SRAP-PCR反应体系的建立;邹枚伶等;《基因组学与应用生物学》;20090131;第28卷(第1期);第137-140页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105087566A (zh) | 2015-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Benito-Kwiecinski et al. | An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain | |
| CN110205407A (zh) | 快速检测鲤浮肿病毒的raa扩增引物和探针及检测试剂盒与使用方法 | |
| CN105087798B (zh) | 红木中降香黄檀的分子鉴定方法及其引物和探针 | |
| CN106967838A (zh) | 一种检测鸭源性成分的rpa引物、试剂盒及检测方法 | |
| Phillips et al. | Single-cell RT–PCR as a tool to study gene expression in central and peripheral autonomic neurones | |
| CN109825575A (zh) | 辅助诊断结核病的miRNA标志物及其应用 | |
| CN109266772A (zh) | 柑橘黄龙病三种病原菌实时荧光定量pcr的检测方法 | |
| CN108342461A (zh) | ddPCR技术检测IDH1基因变异的引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN105087566B (zh) | 鉴定白木香的荧光定量pcr方法、引物和探针及其应用 | |
| CN107345246A (zh) | 一种硅藻rbcL基因分析方法及其在法医检测中的应用 | |
| CN105002300B (zh) | 一种鱼类神经坏死病毒现场快速高灵敏检测方法及试剂盒 | |
| CN105132541B (zh) | 红木中交趾黄檀dna鉴定的方法及专用引物和探针 | |
| CN103074428B (zh) | 一种结核分枝杆菌tb检测试剂盒 | |
| CN105112410B (zh) | 用于马来沉香鉴定的基因检测引物、探针和方法 | |
| CN105132542A (zh) | 利用pcr技术鉴定红木中阔叶黄檀的方法、引物和探针 | |
| CN108384876A (zh) | 鉴定三七成分的环介导等温扩增荧光检测方法、引物、试剂盒及应用 | |
| CN105132540B (zh) | 白木香的双重pcr鉴定方法、引物和探针 | |
| CN109182555A (zh) | 一种荧光定量pcr检测鉴定森林葱蜗牛的方法 | |
| Nawshad et al. | Laser capture microdissection (LCM) for analysis of gene expression in specific tissues during embryonic epithelial–mesenchymal transformation | |
| Zhao et al. | Application of the Ludox-QPS method for estimating ciliate diversity in soil and comparison with direct count and DNA fingerprinting | |
| DeCarlo et al. | Gene expression analysis of interferon κ in laser capture microdissected cervical epithelium | |
| CN108384857A (zh) | ddPCR技术检测IDH1 R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法 | |
| CN109486983A (zh) | 土沉香、云南沉香、马来沉香的snp分子标记及应用 | |
| CN104263821B (zh) | 陈旧性动物样本种属鉴定试剂盒及制备方法 | |
| CN104032015B (zh) | 羊肝片吸虫的荧光定量pcr检测试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |