CN113621579A

CN113621579A - 用于指示细胞自噬的双荧光s2细胞系及其制备方法

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Publication number: CN113621579A
Application number: CN202110920860.7A
Authority: CN
Inventors: 余小强; 张�杰; 卢玉珍; 文靓; 汤婷
Original assignee: South China Normal University
Current assignee: South China Normal University
Priority date: 2021-08-11
Filing date: 2021-08-11
Publication date: 2021-11-09

Abstract

本发明属于细胞自噬检测技术领域，具体涉及用于指示细胞自噬的双荧光S2细胞系及其制备方法，本发明基于果蝇S2细胞构建了一种可稳定表达RFP‑GFP‑LC3蛋白的RFP‑GFP‑LC3‑S2细胞，保藏编号为CCTCCNO:C2021160，本发明的RFP‑GFP‑LC3‑S2细胞可大规模传代培养，用于指示细胞自噬，能够更加敏感高效的指示细胞自噬的发生阶段，以及细胞中细胞自噬强弱水平，可用于检测不同环境条件，不同药物处理以及不同基因表达情况下所诱导的细胞自噬水平，以及自噬的发生情况，有利于筛选具有商业或科学价值的环境因素以及药物处理等影响细胞自噬发生的因素。

Description

用于指示细胞自噬的双荧光S2细胞系及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞自噬检测技术领域，具体涉及用于指示细胞自噬的双荧光S2细胞系及其制备方法。

背景技术

细胞自噬是在真核细胞中普遍存在的一类保守的应对外界环境变化的机制，自噬主要负责降解一些长寿命蛋白、细胞大分子甚至是受损伤的细胞器。在自噬的过程中，首先会形成双层膜结构的自噬小体，然后通过自噬小体包裹所要降解的相应细胞内物质，而后自噬小体通过与溶酶体相融合而形成自噬溶酶体，从而降解其中所包含的内容物。这一机制可以为细胞提供一些可再利用的氨基酸或者其它营养物质，以应对外界的不良环境。同时，在正常条件下一定水平的细胞自噬也是需要的，用以清除一些代谢产生的积累物、错误折叠的蛋白以及损伤的细胞器等，这对细胞的正常存活是必要的。有研究发现，细胞自噬与细胞的存活与死亡、癌症、疾病以及免疫都存在一定的联系。

哺乳动物微管相关蛋白-轻链3(Microtubule-associated protein1 lightchain3,MAP1LC3或称LC3)最初是作为微管相关蛋白1(MAP1)的第三条轻链被发现的,是自噬相关基因Atg8在哺乳动物中的同源基因。在自噬相关蛋白中，Atg8/MAP1LC3(microtubule associated protein 1light-chain 3,LC3,in mammals)作为一种与泛素化相关的蛋白，被认为与自噬体膜的延伸以及自噬体的成熟密切相关。当自噬被诱导发生时，以LC3作为自噬标记分子，可以很好地指示自噬体的形成，自噬发生过程中LC3由LC3I变为LC3II，由LC3I的细胞胞浆内弥散分布变为LC3II的富集于自噬体上。而当自噬发生时，荧光蛋白标记的LC3能更好的指示自噬的过程，自噬体形成时，在荧光显微镜下可以观察到融合蛋白的荧光斑点，通过荧光分布的改变及变化程度来观察分析自噬的发生和发生强度。

因此，理论上利用荧光蛋白标记的LC3检测细胞自噬具有实时动态观察、简便快捷等诸多优势，但在实际工作中却不易实现。因为目前仍缺乏有效的方法构建稳定表达带荧光标记的LC3蛋白的细胞系，主要表现在构建的细胞系普遍存在转染效率低，不能稳定表达LC3蛋白(即细胞不能传代，传代多次后不能再表达LC3蛋白)等问题。可见，构建稳定表达带荧光标记的LC3蛋白的细胞系对于检测细胞自噬的发生具有重要的应用价值。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明基于果蝇S2细胞构建了一种可稳定表达RFP-GFP-LC3蛋白的RFP-GFP-LC3-S2细胞系，该细胞可大规模传代培养，并通过外源LC3蛋白融合的双荧光标记，更加敏感高效的指示细胞自噬的发生阶段，以及细胞中细胞自噬强弱水平。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种双荧光S2细胞系，所述细胞系为RFP-GFP-LC3-S2细胞系，保藏编号为CCTCCNO:C2021160。

本发明还提供了上述的双荧光S2细胞系在指示细胞自噬中的应用。

本发明还提供了上述的双荧光S2细胞系的构建方法，该方法包括以下步骤：

S1、通过重叠PCR方法扩增RFP、GFP和LC3的基因序列，使LC3与RFP以及GFP融合表达，得到RFP-GFP-LC3序列；

S2、通过特异引物扩增RFP-GFP-LC3序列，使序列两端带EcoR V和Not I酶切位点；

S3、将步骤S2的片段经酶切连接克隆至表达载体pAc5.1A的多克隆位点处，得pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒；

S4、将pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒和抗性质粒共传染至S2细胞，使RFP-GFP-LC3蛋白可以在S2细胞中表达并伴随细胞复制而传代表达；

S5、通过含抗生素的培养基传代培养传染后的S2细胞，筛选出对抗生素产生抗性且在荧光显微镜下能观察到红色荧光以及绿色荧光的细胞系，即为可稳定表达RFP-GFP-LC3蛋白的双荧光S2细胞系。

果蝇拥有两个Atg8/LC3同源物，即Atg8a和Atg8b，其中Atg8a被认为是监测自噬的标记分子，通过使用细胞生物学和生物化学的方法鉴定Atg8-PE的形成，可以用于监测细胞自噬的进程。而LC3蛋白作为Atg8的同源分子，在果蝇系统中，当自噬被诱导发生时，以LC3作为自噬体膜的特异性标记物可以检测到自噬小体的形成。

为构建稳定表达带荧光标记的LC3蛋白的细胞系，本发明基于果蝇S2细胞，首先通过将外源LC3蛋白与红色荧光蛋白(RFP)、绿色荧光蛋白(GFP)融合表达，然后将融合片段克隆至表达载体pAc5.1A的多克隆位点处，得pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒，再将该重组质粒转染至果蝇S2细胞，从而构建得到可稳定表达RFP-GFP-LC3蛋白的RFP-GFP-LC3-S2细胞系。当自噬体形成时，由于RFP-GFP-LC3蛋白既能与红色荧光蛋白融合，也能与绿色荧光蛋白融合，因此其荧光斑点在荧光显微镜下可以形成红色或绿色的荧光斑点，融合后为黄色的荧光斑点。但GFP蛋白对酸性环境敏感，当自噬体与溶酶体融合后，自噬溶酶体中的环境为酸性，GFP蛋白的绿色荧光会随之淬灭，使观察成熟的自噬溶酶体时，其荧光斑点只为红色。因此，该细胞系可用于指示环境条件改变，或药物处理等所诱导的细胞自噬响应，有利于筛选具有商业或科学价值的环境因素以及药物处理等影响细胞自噬发生的因素。

优选地，步骤S2所述的特异引物具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

优选地，步骤S4中，在转染前将S2细胞接种于30mm细胞培养皿中，27℃恒温条件下过夜培养并长至覆盖培养皿的70％-80％。进一步地，培养S2细胞采用常规的培养液(如TNM-FH、SF-X、Grace’s以及TC-100等)，并在培养液中加入5％-10％(体积比)的胎牛血清。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

细胞自噬是真核细胞中普遍存在的一类保守的应对外界环境变化的机制，细胞自噬与细胞的存活与死亡、癌症、疾病以及免疫都存在一定的联系。本发明基于果蝇S2细胞构建了一种可稳定表达RFP-GFP-LC3蛋白的RFP-GFP-LC3-S2细胞系(保藏编号为CCTCC NO:C2021160)，从而指示细胞自噬。本发明的RFP-GFP-LC3-S2细胞可大规模传代培养，并通过外源LC3蛋白融合的双荧光标记，更加敏感高效的指示细胞自噬的发生阶段，以及细胞中细胞自噬强弱水平，可用于检测不同环境条件，不同药物处理以及不同基因表达情况下所诱导的细胞自噬水平，以及自噬的发生情况，有利于筛选具有商业或科学价值的环境因素以及药物处理等影响细胞自噬发生的因素。

附图说明

图1为RFP-GFP-LC3-S2细胞系在激光共聚焦显微镜下的LC3荧光斑点(A为对照组，细胞在完全培养基中培养；B为细胞培养于PBS缓冲液中20min饥饿处理，C为细胞培养于PBS缓冲液中6h饥饿处理)；

图2为RFP-GFP-LC3-S2细胞系表达LC3-II蛋白的免疫印迹检测结果(上图为使用anti-LC3抗体检测LC3-II条带的形成；下图为anti-tubulin抗体检测tubulin蛋白；M：蛋白marker；泳道1为对照组，细胞在完全培养基中培养；泳道2为细胞培养于PBS缓冲液中20min饥饿处理；泳道3为细胞培养于PBS缓冲液中6h饥饿处理)；

图3为不同传代后的RFP-GFP-LC3-S2细胞系表达LC3-II蛋白的免疫印迹检测结果(上图为使用anti-LC3抗体检测LC3-II条带的形成；下图为anti-tubulin抗体检测tubulin蛋白；M：蛋白marker；泳道1为对照组，泳道2为首次传代的RFP-GFP-LC3-S2细胞系，泳道3为第五次传代的RFP-GFP-LC3-S2细胞系，泳道4为第十次传代的RFP-GFP-LC3-S2细胞系)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。

实施例1RFP-GFP-LC3-S2细胞系的构建

1、pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒构建：

(1)通过重叠PCR方法扩增RFP、GFP和LC3的基因序列，使LC3基因可以与红色荧光蛋白(RFP)以及绿色荧光蛋白(GFP)融合表达，得到RFP-GFP-LC3序列(SEQ ID NO.1，其中，无下划线部分为RFP片段，直线下划线部分为GFP片段，波浪线下划线部分为LC3片段)，具体扩增方法如下：

分别使用上游引物1(ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAT，SEQ ID NO.2)和下游引物1(CCTGGGCCAGCGGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTC，SEQ ID NO.3)扩增RFP片段；使用上游引物2(GACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCCGCTGGCCCAGG，SEQ ID NO.4)和下游引物2(GAAGGTCTTCTCCGACGGCATGAATTCGGTACCGGATCTGAG，SEQ ID NO.5)扩增GFP片段；使用上游引物3(CTCAGATCCGGTACCGAATTCATGCCGTCGGAGAAGACCTTC，SEQ ID NO.6)和下游引物3(TTACACTGACAATTTCATCCCGAACGT，SEQ ID NO.7)扩增LC3片段。得到三段相应的目的序列后，以上游引物1为上游引物，以下游引物2为下游引物，以上述RFP和GFP的PCR产物为模板进行PCR扩增，得到RFP-GFP融合的PCR产物片段。

而后以上游引物4(ATATGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAT，SEQ ID NO.8)为，以下游引物4(ATATGCGGCCGCTTACACTGACAATTTCATCCCGAACGT，SEQ ID NO.9)为扩增引物，以上述RFP-GFP的PCR产物以及LC3的PCR产物为模板进行PCR扩增，即得到RFP-GFP-LC3融合的序列。

上述的各种PCR扩增，反应的体系为：TaKaRa ExTaq(5U/μL)0.25μL，10×PCRBuffer(Mg²⁺Plus)5μL，dNTP Mixture(各2.5mmol/L)4μL，上游引物(20μmol/L)1μL，下游引物(20μmol/L)1μL，模板DNA 2.5ng，加ddH₂O至总体积50μL。反应程序为：94℃×3min→(94℃×1min→55℃×30s→72℃×1-2min)×38cycles→72℃×10min。

SEQ ID NO.1：

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGgCGCcTACAaCGTCaACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCCGCTGGCCCAGGAACAAGTTTGTACAAAAA AGCAGGCTTTCCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAG CTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGA CCCTGAaGTTCATCTGCACcACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGT GCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCC AGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTA CAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACA TCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCC GACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGA GTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCCGGTACCGAATTCA TGCCGTCGGAGAAGACCTTCAAGCAGCGCCGCACCTTCGAACAAAGAGTAGAAGATGTCCGACTTATTCGAGAGCAG CATCCAACCAAAATCCCGGTGATAATAGAACGATACAAGGGTGAGAAGCAGCTTCCTGTTCTGGATAAAACAAAGTT CCTTGTACCTGACCATGTCAACATGAGTGAGCTCATCAAGATAATTAGAAGGCGCTTACAGCTCAATGCTAATCAGG CCTTCTTCCTGTTGGTGAACGGACACAGCATGGTCAGCGTCTCCACACCAATCTCAGAGGTGTATGAGAGTGAGAAA GATGAAGATGGATTCCTGTACATGGTCTATGCCTCCCAGGAGACGTTCGGGATGAAATTGTCAGTGTAA

(2)通过特异引物扩增RFP-GFP-LC3序列，使其两端带有EcoR V和Not I酶切位点：

PCR扩增的条件为：TaKaRaExTaq(5U/μL)0.25μL，10×PCRBuffer(Mg²⁺Plus)5μL，dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL，上游引物(20μmol/L)1μL，下游引物(20μmol/L)1μL，模板DNA2.5ng，加ddH₂O至总体积50μL。反应程序为：94℃×3min→(94℃×1min→55℃×30s→72℃×1-2min)×38cycles→72℃×10min。

其中，上游引物的序列同步骤(1)的上游引物4:ATATGATATCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAT(SEQ ID NO.8)；

下游引物的序列同步骤(1)的下游引物4:ATATGCGGCCGCTTACACTGACAATTTCATCCCGAACGT(SEQ ID NO.9)。

(3)将扩增后的片段经酶切连接克隆至S2细胞的表达载体pAc5.1A(Invitrogenlife technologies，Catalog no.V4110-20)的多克隆位点处，得pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒：

酶切连接的条件如下：

分别回收酶切后的目的RFP-GFP-LC3基因片段以及酶切后的pAC5.1载体片段，在如下列所示的连接体系中加入相应试剂进行连接反应，16℃恒温连接过夜：

上述体系混合后瞬时离心放入16℃恒温中进行反应，经测序获得的重组质粒中的基因序列与目的基因序列一致。

2、RFP-GFP-LC3-S2细胞系的构建

(1)将pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒和抗性质粒共传染至S2细胞(Invitrogenlife technologies，Catalog no.R690-07)：在转染前将S2细胞接种于30mm细胞培养皿【SF-X培养基(含10％胎牛血清)】中，细胞27℃过夜培养并长至覆盖培养皿的70％-80％时，将pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒与抗性质粒pCoBlast(Invitrogen life technologies，Catalog no.K5120-01)共转染至S2细胞。共转染使用Effectene Transfection reagent转染试剂(德国QIAGEN公司)，过程如下：

1)在正常生长情况下，当细胞处于对数生长期，并且铺满培养皿的70％-80％时，进行转染；

2)将pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒19μg与pCoBlast无内毒素质粒1μg溶于150μLEC buffer中，然后加入8μL Enhancer，混匀，室温静置2-5min；

3)加入25μL Effectene Transfection Reagent至(2)的混合体系中，用移液器或涡旋混匀，室温静置5～10min；

4)吸掉培养皿中的培养基，用0.1mol/LPBS清洗细胞一次，重新加入新鲜培养基；

5)加1mL培养基至(3)中，混匀，然后将混合物加入到细胞培养皿中；

6)转染48h后，镜检观察细胞，以剔除生长不正常或不稳定的细胞。

(2)可稳定表达RFP-GFP-LC3重组蛋白的S2细胞系的筛选：转染72h后更换细胞培养基，换用新的S2细胞培养基，并在其中加入终浓度为25μg/mL的Blasticidine Shydrochloride抗生素(盐酸雷公藤碱，购自Sigma公司)。使用该抗生素持续传代培养已转染的S2细胞，直至出现对此抗生素产生抗性的细胞克隆团，在荧光显微镜下观察有抗性的细胞，在细胞团中观察到红色荧光以及绿色荧光，表明该细胞可以表达所需的RFP-GFP-LC3重组蛋白，从而得到RFP-GFP-LC3-S2细胞系，保藏编号为CCTCC NO:C2021160，保藏机构为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉.武汉大学。

继续用带有25μg/mL抗生素的培养基传代扩大培养此细胞，以备后续实验。

实施例2RFP-GFP-LC3-S2指示细胞自噬的检测

按照【Guidelines for the used and interpretation ofassays formonitoring autophagy(Daniel J.Klionsky,et al.2012)】中检测细胞自噬的方法，对实施例1构建的RFP-GFP-LC3-S2细胞系进行饥饿处理以诱导自噬响应，即将RFP-GFP-LC3-S2细胞培养于PBS缓冲液中分别进行20min和6h的饥饿处理，对照组则将RFP-GFP-LC3-S2细胞置于完全培养基中培养。

诱导自噬响应后，通过激光共聚焦显微镜观察，可发现荧光斑点的形成(图1B,C)。对照组正常培养的细胞，产生的荧光均匀分布于细胞中，不产生大量的斑点(图1A)。而短时间饥饿处理(20min)的细胞，由于自噬体与溶酶体没有融合，或者没有完全融合，仍有绿色荧光产生，与红光一起成为黄色的荧光斑点(图1B)。而长时间饥饿处理(6h)的细胞，由于自噬体成熟，绿色荧光淬灭所以产生红色荧光斑点(图1C)。

使用免疫印迹法检测此细胞系经饥饿处理后形成的LC3-II条带。检测时，将细胞分为三组，一组使用完全培养基培养设为对照组，另两组在培养过程中将培养基换成PBS缓冲液，对细胞进行20min和6h饥饿处理，此两组设为饥饿处理组。而后分别收集两组细胞，使用RIPA(购自上海碧云天生物有限公司)蛋白提取试剂抽提细胞的总蛋白，具体操作如下：

1)将细胞处理后收集于1.5mL离心管中，短暂离心使细胞沉淀在离心管底部；

2)使用500μL预冷的PBS缓冲液清洗细胞，2000g离心3min，共清洗3次，弃上清；

3)使用100μLRIPA细胞裂解液抽提细胞蛋白，加入裂解液后吹打细胞，而后冰上放置细胞悬浮液30min，

4)4℃，8000g离心3)中裂解的细胞，离心2min；

9)离心后的上清液即为细胞总蛋白提取液，保存于-80℃，待后续实验使用。

而后进行免疫印迹(Western blot)检测，具体操作如下：

1)SDS-PAGE电泳：SDS-PAGE电泳的浓缩胶和分离胶，按照相应比例进行分离胶和浓缩胶的制备；

2)将制好的凝胶放入Bio-Rad小型电泳槽，加入电泳缓冲液，取样品10～20μL加入凝胶孔中，一块胶用普通Marker，另一块用预染Marker，开始电压为100v，待样品进入分离胶后，将电压调至150v，电泳结束后将普通Marker的胶用5倍体积的考马斯亮蓝染液浸泡凝胶1h，再用甲醇-冰醋酸脱色液浸泡2h左右(其间应更换脱色液2次)，最后用扫描仪扫描拍照，另一块用预染Marker的凝胶用于Westernblot检测；

3)转膜前准备：剪2张长9cm、宽8.5cm的Western blot滤纸，1张PVDF膜，剪成与凝胶同样大小，将PVDF膜在甲醇中浸泡5～10min后，将PVDF膜、滤纸和海绵放入转移缓冲液中平衡30min；

4)凝胶平衡：将电泳后的SDS-PAGE胶板置于转移液中平衡10min左右；

5)按(负极)黑板－海绵－滤纸－胶块－PVDF膜－滤纸－海绵－红板(正极)的顺序逐层铺平，各层之间不要留有气泡和皱折；

6)开始转移，连接正负极，盖好盖子，接上电源，100V，4℃转移90min；

7)转移结束后，取出PVDF膜，于5％脱脂奶粉/TBST中封闭，室温封闭30min；

8)倒出封闭液，加入4mL脱脂奶粉/TBST稀释的一抗(anti-LC3抗体购自Sigma公司，anti-Tubulin单克隆抗体购自上海碧云天生物技术公司)，尽可能排除气泡，于平缓摇动的摇床4℃，杂交过夜，回收一抗；

9)TBST清洗3次，每次10min；

10)将滤膜置于4mL脱脂奶粉/TBST稀释的二抗(山羊抗兔以及山羊抗小鼠二抗购自碧云天生物技术研究所，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔)中，室温孵育2h；

11)TBST清洗3次，每次10min；

12)ECL化学发光法检测：按ECL化学发光法检测试剂盒(中国普利莱基因技术有限公司，北京)说明进行，TBST清洗膜以后，用Super ECLPlus超敏发光液A液和B液等体积的混合工作液，在可见光下室温孵育膜10min，将印迹膜置于Tanon-5200全自动化学发光图像分析系统进行拍摄以及保存相应图片。

由图2的检测结果可以发现，无论长时间(6h)饥饿或是短时间(20min)饥饿处理(图2的泳道2和泳道3)，与正常培养的细胞(图2的泳道1，正常培养的细胞自噬较弱或不发生自噬，因此LC3-II条带较弱)相比，LC3蛋白都会形成LC3-II条带，指示自噬发生。图中的Tubulin蛋白为内参对照蛋白，表明两种样品在进行Westernblot过程中总蛋白量基本一致。

实施例3RFP-GFP-LC3-S2细胞表达RFP-GFP-LC3蛋白的稳定性检测

以正常S2细胞为对照，使用免疫印迹法检测经过多次传代培养后的RFP-GFP-LC3-S2细胞系表达RFP-GFP-LC3蛋白的稳定性。

首先使用常规的培养液(如TNM-FH、SF-X、Grace’s以及TC-100等，本实施例使用TNM-FH)，并在培养液中加入5％-10％(体积比)的胎牛血清，以及终浓度为25μg/mL的Blasticidine S hydrochloride抗生素(盐酸雷公藤碱，购自Sigma公司)，27℃恒温条件下培养3-4天为一代，一直培养至第10代。最后以首次传代、第五次传代、第十次传代的RFP-GFP-LC3-S2细胞系为测试样品进行免疫印迹法检测(具体检测方法同实施例2)。

检测结果如图3所示，泳道1为正常S2细胞，其Western blot检测不到RFP-GFP-LC3蛋白的表达，而泳道2为首次传代的RFP-GFP-LC3-S2细胞系，检测到了相应蛋白，泳道3为第五次传代培养，泳道4为第十次传代的RFP-GFP-LC3-S2细胞系，均检测到了相应蛋白表达。Tubulin蛋白为内参对照蛋白，表明两种样品在进行Western blot过程中总蛋白量基本一致，并且两个细胞中均能检测到内参。上述结果表明，本发明构建的RFP-GFP-LC3-S2细胞系经过多次传代培养后仍能稳定表达RFP-GFP-LC3蛋白，具有较高的目标蛋白表达稳定性。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 华南师范大学

<120> 用于指示细胞自噬的双荧光S2细胞系及其制备方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1896

<212> DNA

<213> RFP-GFP-LC3(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60

gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120

cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180

ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240

cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300

gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360

ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420

atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480

gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540

gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600

aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660

cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtc cggactcaga 720

tccgctggcc caggaacaag tttgtacaaa aaagcaggct ttccggtcgc caccatggtg 780

agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 840

gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 900

ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 960

accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 1020

gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 1080

gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 1140

cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 1200

gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 1260

aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 1320

taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg 1380

agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg 1440

gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtccggactc 1500

agatccggta ccgaattcat gccgtcggag aagaccttca agcagcgccg caccttcgaa 1560

caaagagtag aagatgtccg acttattcga gagcagcatc caaccaaaat cccggtgata 1620

atagaacgat acaagggtga gaagcagctt cctgttctgg ataaaacaaa gttccttgta 1680

cctgaccatg tcaacatgag tgagctcatc aagataatta gaaggcgctt acagctcaat 1740

gctaatcagg ccttcttcct gttggtgaac ggacacagca tggtcagcgt ctccacacca 1800

atctcagagg tgtatgagag tgagaaagat gaagatggat tcctgtacat ggtctatgcc 1860

tcccaggaga cgttcgggat gaaattgtca gtgtaa 1896

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 上游引物1(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtgagca agggcgagga ggat 24

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213> 下游引物1(Artificial Sequence)

<400> 3

cctgggccag cggatctgag tccggacttg tacagctcgt c 41

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 上游引物2(Artificial Sequence)

<400> 4

gacgagctgt acaagtccgg actcagatcc gctggcccag g 41

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 下游引物2(Artificial Sequence)

<400> 5

gaaggtcttc tccgacggca tgaattcggt accggatctg ag 42

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 上游引物3(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcagatccg gtaccgaatt catgccgtcg gagaagacct tc 42

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 下游引物3(Artificial Sequence)

<400> 7

ttacactgac aatttcatcc cgaacgt 27

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 上游引物4(Artificial Sequence)

<400> 8

atatgatatc atggtgagca agggcgagga ggat 34

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 下游引物4(Artificial Sequence)

<400> 9

atatgcggcc gcttacactg acaatttcat cccgaacgt 39

Claims

1.一种双荧光S2细胞系，其特征在于，所述细胞系为RFP-GFP-LC3-S2细胞系，保藏编号为CCTCC NO:C2021160。

2.权利要求1所述的双荧光S2细胞系在指示细胞自噬中的应用。

3.权利要求1所述的双荧光S2细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、通过特异引物扩增RFP-GFP-LC3序列，使序列两端带EcoRV和NotI酶切位点；

S4、将pAc5.1-RFP-GFP-LC3重组质粒和抗性质粒共传染至S2细胞；

4.根据权利要求3所述的双荧光S2细胞系的构建方法，其特征在于，步骤S2所述的特异引物具有如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。