CN103173480B - 一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法 - Google Patents
一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种质粒载体，所述的质粒载体包含人ABCB1基因的3′UTR序列和双荧光素酶基因。本发明还涉及一种筛选多药耐药相关microRNA的方法，它是将待测试microRNA和如上所述的质粒载体共转染多药耐药宿主细胞，以转染microRNA的多药耐药宿主细胞为对照，观测双荧光素酶活性的变化，确定待测试microRNA是否为多药耐药相关microRNA。本发明还涉及一种microRNA在制备逆转多药耐药的药物中的用途。使用本发明的方法筛选多药耐药相关microRNA具有快速、高效、简单易行的优点，为提高microRNA检测的灵敏度和特异性，以及研发和检测通过基因调控逆转多药耐药的药物开辟了新的途径。
Description
技术领域
本发明涉及多药耐药相关microRNA的筛选，具体地说，是一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法。
背景技术
对化疗药物产生耐药性是当今肿瘤治疗的一大难题。肿瘤的多药耐药(multi-drug resistance，MDR)是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，不仅对此种化疗药物产生耐药性，而且对其他结构和功能不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性的现象。自从化疗药物开始应用于肿瘤的治疗后，就一直伴随着多药耐药的发生，因此怎样逆转肿瘤多药耐药一直以来都被认为是与临床结合最为密切的研究方向。近年来，随着分子生物学和遗传学的发展，复杂的肿瘤耐药机制研究已由单纯的病理生理学转向分子病理学范畴，耐药基因的表达增加已经被肯定与肿瘤的耐药性有明显的关系。研究表明ABCB1（MDR1）基因编码的P糖蛋白（P-glucoprotein，P-gp）在多药耐药中起着主要作用，主要作用机理是能量依赖性地将化疗药物转运出肿瘤细胞，减少药物在细胞内的蓄积，导致MDR。P-gp是一种分子量为170kd的跨膜糖蛋白，由1280个氨基酸残基组成，具有12个跨膜区和2个细胞内ATP连结点。当肿瘤细胞长期接触抗癌药物时，ABCB1基因被诱导扩增，P-gp被大量表达，当肿瘤药物再次与P-gp结合时，其ATP结合点上连接的ATP水解后释放的能量能将抗癌药物转移到细胞外，使细胞内蓄积药物减少，减少作用靶点部位的药物浓度，导致化学治疗的效果下降乃至消失。
人ABCB1基因位于7号染色体的7q21.1，含有28个外显子，其cDNA全长4.5kb，含有一个开放阅读框架(ORF)，基因启动子包含：CAAT盒的同感序列、GC盒样序列、Y-box(反向CCAAT元件)、HSE(热休克元件)、P53元件、AP-1元件、TCF元件、类固醇异种生物受体元件、C/EBP元件和起始元件。此外，还含有增强子等元件与hmdrl基因的组织特异性表达有关，但无TATA盒。ABCB1表达的调控主要在转录和转录后水平，与大多数细胞和病毒无TATA盒启动子的基因调控相似，与ABCB1转录起始序列GC盒、Y盒、CCAAT盒、HSE和AP-1等结合的转录。
非编码小RNA(microRNA，miRNA)是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，长度为22-28个核苷酸，广泛存在于真核生物细胞内，是最大的基因家族之一，约占整个基因组的1%-4%。目前，人类基因组中确认的miRNA约500个，至少有200多种与癌症的发生有关，不少miRNA可能扮演着癌基因和抑癌基因的角色。由于miRNA作用靶点是基因的3'UTR区域，因此基因的3'UTR的改变程度能够直接指示该基因受到miRNA的调控程度。有研究发现，不同miRNA对多药耐药基因3'UTR区域的影响也不同，而多药耐药基因3'UTR区域mRNA的变化又直接影响该基因的改变程度，最终该耐药基因的变化直接影响耐药性。因此通过修复microRNAs的表达，改变耐药基因的表达，已成为通过基因调控逆转耐药的重要方向之一。然而，由于microRNAs的发现始于本世纪初，而microRNAs与MDR的研究更是尚处于起步阶段，一些问题仍限制其应用和发展。例如：如何准确预测调控靶基因的microRNAs，如何提高microRNAs检测的灵敏度和特异性等，这对于基因调控逆转耐药的药物研发具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种质粒载体。
本发明的再一的目的是，提供一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法。
本发明的另一的目的是，提供上述microRNA的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
一种质粒载体，所述的质粒载体是在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒载体的第6832-7349bp区段内插入了人ABCB1基因的3′UTR序列。
优选的，所述的人ABCB1基因的3′UTR序列插入在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒载体的sacI和xhoI限制性酶切位点之间。
所述的人ABCB1基因的3′UTR序列包含下述核苷酸序列：
a）如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；和/或
b）与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法，它至少设置以下实验组：
a）将待测试microRNA和如上任一所述的质粒载体共转染多药耐药宿主细胞；
b）将待测试microRNA转染多药耐药宿主细胞，作为对照，
检测并比较a）组相对于b）组的双荧光素酶活性变化，确定待测试microRNA是否为多药耐药相关microRNA。
上述方法还可以包括以下实验组：c）多药耐药宿主细胞组作为空白对照，和/或d）待测试microRNA和如上任一所述的质粒载体的突变型质粒共转染多药耐药宿主细胞。
所述的多药耐药宿主细胞是人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
microRNA在制备调控人ABCB1基因3′UTR序列表达的药物中的用途，所述的microRNA选自：a）如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或b）如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
microRNA在制备抑制人P糖蛋白表达的药物中的用途，所述的microRNA选自：a）如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或b）如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
microRNA在制备逆转多药耐药的药物中的用途，所述的microRNA选自：a）如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或b）如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
本发明优点在于：
1、本发明提供了一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法，该方法是利用构建的含有人ABCB1基因3'UTR序列和双荧光报告基因的质粒载体，将该载体连同待测试microRNA共转染多药耐药细胞株，观察双荧光报告基因的表达情况，从而确定待测试microRNA对人ABCB1基因3'UTR序列的作用，用于筛选调控人ABCB1基因3'UTR表达的microRNA。使用该方法预测调控人ABCB1基因3'UTR表达的microRNA具有快速、高效、简单易行的优点，为提高microRNA检测的灵敏度和特异性，以及研发和检测通过基因调控逆转多药耐药的药物开辟了新的途径；
2、本发明提供了能够调控人ABCB1基因3′UTR序列表达的两种microRNA，可用于制备逆转多药耐药的药物。
附图说明
图1是PMD18T载体图谱。
图2为ABCB1基因3'UTR序列的克隆其PCR产物的电泳图谱，其中Maker为DL2000，1和2均为ABCB1基因的3'UTR片段(379bp)。
图3是pmirGLO Dual-Luciferase-promoter双荧光报告基因载体图谱。
图4为pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter重组质粒的scaI和xhoI双酶切产物电泳图谱，其中Maker为DL10000，1、2、3均为pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter双酶切产物。
图5为pmirGLO-ABCB1-3'UTR-promoter重组质粒3'UTR片段测序结果与NCBI公布的ABCB1基因的3'UTR序列进行Blast分析的序列比对图。
图6是在细胞中检测microRNA minics对于ABCB1基因3'UTR影响获得的双荧光素酶活性柱状图。每组中数字含义为：1.转染microRNA mimics的对照组，2.hsa-miR-200a mimics/质粒组，3. hsa-miR-497 mimics/质粒组，4. hsa-miR-200c mimics/质粒组。
图7是筛选出的对于ABCB1基因有抑制作用的microRNA minics的westernblot杂交图谱。图中，1为空白对照组，2为转染microRNA mimics的对照组，3为hsa-miR-497 mimics组，4 为hsa-miR-200c mimics组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1 构建含ABCB1基因3'UTR序列和报告基因的重组T载体
一、材料
1.质粒
PMD18T载体质粒购自美国Promega公司，其载体图谱如图1所示。
2.主要试剂
限制性内切酶scaI和xhoI，以及DNA Ligation Kit(DNA连接试剂盒)购自TaKaRa公司。DL2000 maker购自上海MajorBio公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自KenReal公司。质粒提取试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自Tiangen公司。
二、方法与结果
1.血样采集和基因组DNA抽提
采集健康志愿者外周血5mL，置于EDTA抗凝的玻璃试管，贮存于-40℃冰箱备用。按照标准苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，置于4℃冰箱备用。
2.ABCB1基因的PCR扩增
引物设计：根据人ABCB1基因的3'UTR序列(NCBI的gene ID: 5243)设计两端引物：引物1和引物2。
引物1为上游5'端引物，其中包含27个ABCB1基因的3'UTR序列互补碱基，一个scaI识别位点，6个保护碱基；引物2为下游3'端引物，其中包含28个ABCB1基因的3'UTR序列互补碱基，一个xhoI识别位点，6个保护碱基。具体引物序列如下：
以步骤1抽提的基因组DNA为模板，采用常规PCR反应进行扩增，体系如下：
反应条件如下：
反应结束后，取5 μL反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图谱如图2所示。琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用DNA片段回收试剂盒回收扩增产物。
3.ABCB1基因3'UTR序列片段和PMD18 T载体质粒的连接，构建PMD18T-ABCB1-3'UTR重组载体
将ABCB1基因3'UTR序列的回收产物和PMD18T载体质粒进行连接。连接反应体系如下：
将所有反应物混匀，4℃连接过夜。
4.重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增
将上述连接产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过含有氨苄青霉素(0.001mg/L)的LB平板固体培养基中选择培养，从转化子的平板上挑取单菌落，经含氨苄青霉素的LB液体培养基扩增培养，培养后用试剂盒提取质粒备用，具体步骤如下：
1）取-80℃保存的DH5α大肠杆菌感受态细胞悬液200 μL，室温下解冻后，置于冰上；
2）加入20 μL连接产物溶液，摇匀，冰上放置30min；
3）42℃水浴中热击90 sec或者37℃水浴5min，热击后置冰上冷却3-5 min；
4）向管中加入700 μL不含Amp的LB液体培养基，混匀；
5）调整摇床数据，转数：200rpm，温度：37℃，振荡培养1h；
6）1h后取出，放于离心机内，4000rpm，2 min，弃大部分液体，仅留少许，混匀；
7）用移液枪吸出，滴在LB培养板上，用接种环涂匀；
8）将涂满菌液的平板置于37℃培养箱内，1h后翻转，37℃过夜；
9）待培养皿长出单菌落后，挑取4-5个单菌落，分别放于已装有5mL含1:1000的AmpLB液体培养基的管中，37℃，200rpm摇床过夜，使含重组质粒的大肠杆菌在LB液体培养基中大量扩增；
10）同时将上述4-5个单菌落溶于LB液体培养基后，各取2 μL做PCR克隆鉴定，方法及条件同上述步骤2，结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见其中两个克隆均出现379bp的目的片段，显示结果均为阳性。
5.测序
将获得的含有ABCB1基因3'UTR序列的重组质粒PMD18T-ABCB1-3'UTR送上海生工生物有限公司测序，测序结果（SEQ ID NO.3）与NCBI公布的ABCB1基因的3'UTR序列进行Blast分析。Blast分析结果显示，获得的ABCB1基因的3'UTR序列与标准ABCB1基因的3'UTR序列相一致，说明此质粒构建成功。
6.PMD18-ABCB1-3'UTR重组质粒的提取
PMD18-ABCB1-3'UTR重组质粒的提取按照质粒小量提取试剂盒的操作提取，所得质粒不含内毒素，可用于转染细胞和其他分子生物学实验，具体步骤如下：
1）收菌：取5mL上述过夜培养的大肠杆菌菌液，13000rpm室温离心1min，用移液器小心的吸弃上清，
2）重组悬液：将250μL Resuspension Buffer（已加Rnase A）加入菌液沉淀，Vortex充分悬浮细菌沉淀，
3）碱裂解：将250μL Lysis Buffer 加入重悬菌液，上下翻转6-10次，使菌体裂解不超过5min，至溶液变的清亮，
4）中和：加入400μL Nentralization Buffer，上下翻转混合6-10次，室温静置5 min，13000rpm室温离心10min，
5）柱预处理：在柱中加入500μL Column Preparation Buffer13000rpm室温离心1min，弃滤液，
6）柱结合：将上述步骤（4）的上清液转移至预处理过的Spin Column中，13000rpm室温离心1min，弃滤液，
7）去蛋白：将500μL的Protein remove Buffer加入柱中，13000rpm室温离心30-60s，弃滤液，
8）漂洗：将600μL的Washer Buffer加入柱中，13000rpm室温离心30-60s，弃滤液，空柱13000rpm室温离心2min，室温下防治3-5min，除去残留的漂洗液，
9）洗脱：将柱安置于新的1.5mL的离心管上，在柱膜的中央加入60-100μL60℃预热的ddH2O或Elution Buffer，室温静置1min，13000rpm室温离心1min洗脱DNA，
10）用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的质粒DNA的大小及浓度。
实施例2 构建含ABCB1基因3'UTR序列和双荧光报告基因的重组质粒载体pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter
一、材料
1.质粒
pmirGLO Dual-Luciferase-promoter双荧光报告基因载体购于美国Promega公司，载体图谱如图3所示。
2.主要试剂
限制性内切酶scaI和xhoI，以及DNA Ligation Kit(DNA连接试剂盒)购自TaKaRa公司。DL2000 maker 购自上海MajorBio公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自KenReal公司。质粒提取试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自Tiangen公司。
二、方法与结果
1. PCR扩增ABCB1基因的3'UTR序列片段
以实施例1获得的PMD18-ABCB1-3'UTR质粒为模板，利用和实施例1相同的PCR扩增方法扩增ABCB1基因的3'UTR序列片段。反应结束后，取5 μL反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳后，切胶，用DNA片段回收试剂盒回收扩增产物。
2.用pmirGLO Dual-Luciferase-promoter载体质粒转化常规制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行扩增，裂解法制备pmirGLO Dual-Luciferase质粒，电泳检测质粒的纯度和含量。
3.ABCB1基因3'UTR序列片段与pmirGLO Dual-Luciferase-promoter载体质粒的双酶切
将上述获得的pmirGLO Dual-Luciferase-promoter载体质粒和回收的含ABCB1基因3'UTR序列的目的片段分别使用scaI和xhoI双酶切，酶切体系如下：
37℃酶切过夜后，取5 μL酶切产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，观察双酶切的质粒分子量及浓度。并用DNA片段小量纯化试剂盒凝胶回收酶切产物，以备连接使用。
4.ABCB1基因3'UTR序列片段和pmirGLO Dual-Luciferase-promoter载体质粒的连接
将经过双酶切的pmirGLO Dual-Luciferase-promoter载体和ABCB1基因3'UTR片段进行连接，连接反应体系如下：
将上述反应物混匀，4℃连接过夜。
5.重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞及扩增
将连接产物直接转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过在含有氨苄青霉素的LB平板固体培养基中选择培养，从转化子的平板上挑取单菌落，经含氨苄青霉素的LB液体培养基扩增培养，培养后用试剂盒抽提法提取质粒备用，方法同实施例1。
6. pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter重组载体的双酶切初步验证
使用scaI和xhoI双酶切步骤5提取的质粒，结果如图4所示，表明ABCB1基因的3'UTR片段已经连接到pmirGLO Dual-Luciferase-promoter载体质粒上。
7.测序
将获得的ABCB1基因的3'UTR重组质粒送上海生工生物有限公司测序，测序结果与NCBI公布的ABCB1基因的3'UTR序列进行Blast分析，结果见图5。Blast分析结果显示，获得的ABCB1基因的3'UTR重组质粒中的3'UTR序列与标准ABCB1基因的3'UTR序列相一致，未发现有碱基突变，说明此质粒构建成功。
8.pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter重组质粒的提取
pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter重组质粒的提取按照质粒小量提取试剂盒的操作提取，所得质粒不含内毒素，可用于转染细胞和其他分子生物学实验，方法同实施例1。
实施例3 microRNA mimics（模拟物）/质粒DNA/脂质体共转染人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP
一、材料
1.细胞株
细胞株：人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP，购于上海中医药大学中西医结合肿瘤介入研究所，耐受化疗药倍数如下表：
表1 四种化疗药物对HCT116和HCT116/L-OHP敏感性的影响
*P <0.01，HCT116/L-OHP vs HCT116组。
二、方法
1.细胞的培养和铺板
将人肠癌多药耐药HCT116/L-OHP细胞培养于含有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640完全培养基（37℃、5％ CO2、饱和湿度）中，并使之维持单层贴壁生长。按5×105个细胞/孔的量在96孔板中接种指数生长期的细胞，在37℃，5％ CO2培养箱中过夜培养，直至细胞到80％汇片。
2. microRNA mimics/质粒DNA/脂质体共转染
本发明共检测了五种microRNA mimics对人ABCB1基因的3'UTR序列的影响，该五种microRNA mimics的名称及序列如下表所示：
表2 待测试microRNA mimics及其序列
实验组设置如下：（1）空白对照组：即原始人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP；（2）转染microRNA mimics的对照组：使用待测试microRNA mimics分别转染人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP；（3）microRNA mimics/pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒组：使用待测试microRNA mimics结合pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒共转染人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP；（4）microRNA mimics/pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter质粒组：使用待测试microRNA mimics结合pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter质粒共转染人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP；（5）microRNA mimics/ pmirGLO-ABCB1-3'UTR-mut-promoter质粒组：使用待测试microRNA mimics结合pmirGLO-ABCB1-3'UTR-mut-promoter质粒共转染人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP，其中，pmirGLO-ABCB1-3'UTR-mut-promoter质粒是以pmirGLO-ABCB1-3'UTR-promoter质粒为野生型模板按照本领域常规方法构建的突变型质粒，具体为：把pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter质粒中5'端到3'端312bp位置: AGUAUU碱基替换成AGUGAU，其余不变。
具体共转染方法为：在1.5mL的离心管中配制microRNA mimics/质粒DNA/脂质体混合物如下：分别稀释质粒DNA (4μg/管)及microRNA mimics (80nM/管)于不含血清和抗生素的RPMI-1640培养基(250μL/管)中，稀释脂质体(10μL/管) 至不含血清和抗生素的RPMI-1640培养基(250μL/管)中，分别室温放置5 min。然后将所有上述稀释液混合，室温放置20 min，使microRNA mimics/质粒DNA与脂质体结合。吸取96孔板中的完全培养液，用不含血清和抗生素的RPMI-1640润洗一次，每孔加入100μL无血清无抗生素的RPMI-1640培养基后，再每孔加入62.5μL对应的microRNA mimics/质粒DNA/脂质体复合物，37℃，5% CO2培养箱内培养3-5h后，吸弃培养液，加入100μL含血清含抗生素的RPMI-1640培养基，继续培养48h后收集样品，进行双荧光素酶活性的检测。
实施例4 双荧光素酶活性的检测
一、方法
按照Kenreal试剂盒（购于Promega公司）说明书指导配制工作液：
工作液1：A液(2mL)+B液(40μL)+C液(10μL)混合均匀，用于测定萤火虫荧光素酶活性；
工作液2：D液(2mL)+E液(40μL)+F液(10μL)混合均匀，用于测定海肾荧光素酶活性。
转染有microRNA mimics，microRNA mimics/pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒，microRNA mimics/pmirGLO-ABCB1-3’UTR-promoter质粒，microRNA mimics/pmirGLO-ABCB1-3'UTR-mut-promoter质粒的细胞经过一定时间的培养后收集。
细胞裂解：每孔加入裂解液500μL/孔，室温摇动15min。取15-20μL细胞裂解液于1.5mL的离心管中。加入工作液1，设定延迟2sec，发光仪测度10sec。加入工作液2，设定延迟2sec，发光仪测度10sec。
二、结果
结果显示，通过运用构建的pmirGLO-ABCB1-3'UTR-promote质粒进行筛选，hsa-miR-497 mimics和hsa-miR-200c mimics对于ABCB1基因3'UTR活性均产生抑制效果，而hsa-miR-200a mimics没有产生抑制效果。如图6所示，hsa-miR-497 mimics和hsa-miR-200c mimics引起pmirGLO-ABCB1-3'UTR-promoter质粒荧光信号的变化，而没有引起pmirGLO- Dual-Luciferase-promoter质粒、pmirGLO-ABCB1-3'UTR-mut-promoter质粒荧光信号的变化。
实施例5 Western blot法检测筛选获得的microRNA mimics对ABCB1基因编码的P-gp蛋白的作用
一、方法
1.蛋白质抽提
1）蛋白样品细胞的转染方法同上，混合物配置为microRNA mimics和脂质体；
2）小心倾去细胞培养液；
3）用预冷的PBS清洗细胞2次，小心倾去PBS，勿留残夜；
4）配制含抑制剂的裂解液（1ml裂解液中加入15μl蛋白酶抑制剂和10μl PMSF）；
5）向细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的裂解液（107个细胞中加入0.5ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.2ml抽提试剂），使裂解液尽量留遍所有细胞表面；
6）用预冷的细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动30分钟进行裂解；
7）4℃离心12000rpm，5min。将上清液立刻转移入新的微量离心管中，-80℃保存待用。
2.BCA蛋白质定量实验步骤
1）取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液（配制后可立即使用，也可以-20℃长期保存）；
2）取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20μl 25mg/ml蛋白标准，加入980μl PBS稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准；
将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加PBS补足到20μl；
3）加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS补足到20μl；
4）各孔加入200μl BCA工作液（使用前按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀）。盖好微孔板，37°C孵育30分钟；
5）测定A570。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
3.SDS-PAGE电泳实验步骤
1）制备分离胶：
将配制好的溶液缓慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左右，预留1.5cm高度配制积层胶。每板凝胶溶液上压dH2O，静置30min~1h，待肉眼可见胶与水之间有水平线存在时，将水倒出，准备灌制积层胶。
2）制备积层胶：
混匀后加入玻璃板内，加满为止，避免气泡产生，之后立即插上梳子（梳子要清洁，干燥），插梳子时要使梳子保持水平，室温静置30min或更长。
3）样品准备：
样本与RIPA及5×LB混匀后，100℃煮5～10min变性，准备上样。
4）上样：
凝胶电泳前，小心拔去梳子。上、下层电泳槽中加入电泳缓冲液，上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1至2cm。BioRad电泳槽中需加入500 ml的电泳缓冲液。将准备好的样品分别上样，标准加进第一个孔中。
5）电泳：
使用BioRad电泳装置，首先在20 mA恒定电流下电泳至染料接近分离胶顶端。然后60mA恒定电流电泳至溴酚蓝刚出胶底部。条件：室温100v；时间约1.5~2h。
4.蛋白质转移
将凝胶取出，切去堆积胶，浸泡于转膜液中；剪取与胶同样大的硝酸纤维素膜及3MM滤纸（膜要比滤纸稍大一些），浸泡于转膜液中30min。在半干转膜仪中由下至上依次放置，3MM滤纸–PVDF膜–凝胶–3MM滤纸，确保各层间均无气泡。转膜条件：电压15V，时间45min。
5.膜的封闭和抗体孵育
1）膜在5％脱脂奶粉溶液中(1g奶粉+20ml TBST，依此类推)室温震荡2h，封闭膜上的非特异结合；
2）封闭过的膜加入一抗（P-gp蛋白）4℃过夜，抗原抗体结合（一抗配制：1：500，以5%脱脂奶粉为溶剂）。用TBST洗膜3次，每次10min；
3）加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体，膜室温孵育1.5小时（二抗配制：1：10000，以5%脱脂奶粉为溶剂）。用TBST洗膜3次，每次10分钟。
6.显影
在暗室中，将荧光底物A和B两种试剂等体积混合；1-2min后将其加到膜上，1min后弃尽残液，用塑料保鲜膜包好。将显影液和定影液分别到入塑料盘中，在红灯下取出X-光片，（比膜的长和宽均需大1cm）放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时（根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果）。曝光完成后，将X-光片迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，立即终止显影。显影时间一般为1~2min（20~25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间。显影结束后，立即将X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5~10min，以胶片透明为止，之后用自来水冲去残留的定影液，室温下晾干。
二、结果
验证结果参见图7，结果显示，所筛选出的microRNA mimics：hsa-miR-497 mimics和hsa-miR-200C mimics均对目标蛋白ABCB1/P-gp有抑制作用，证明本发明所建立的以ABCB1基因3′UTR为靶点的多药耐药相关microRNA的筛选方法是切实可行的。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海中医药大学附属曙光医院 上海中医药大学附属普陀医院
<120> 一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法
<130> /
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agctacgagc tcactctgac tgtatgagat gttaaatac 39
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atacggctcg agcacatgaa agtttagttt tattatagac 40
<210> 3
<211> 379
<212> DNA
<213> human
<400> 3
actctgactg tatgagatgt taaatacttt ttaatatttg tttagatatg acatttattc 60
aaagttaaaa gcaaacactt acagaattat gaagaggtat ctgtttaaca tttcctcagt 120
caagttcaga gtcttcagag acttcgtaat taaaggaaca gagtgagaga catcatcaag 180
tggagagaaa tcatagttta aactgcatta taaattttat aacagaatta aagtagattt 240
taaaagataa aatgtgtaat tttgtttata ttttcccatt tggactgtaa ctgactgcct 300
tgctaaaaga ttatagaagt agcaaaaagt attgaaatgt ttgcataaag tgtctataat 360
aaaactaaac tttcatgtg 379
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 4
uaacacuguc ugguaaagau gg 22
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
uaauacugcc ggguaaugau gga 23
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 6
acaucguuac cagacagugu ua 22
<210> 7
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 7
uaauacugcc ugguaaugau ga 22
<210> 8
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 8
uaauacuguc ugguaaaacc gu 22
Claims (4)
1.一种质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体是在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒载体的第6832-7349bp区段内插入了人ABCB1基因的3′UTR序列；所述的人ABCB1基因的3′UTR序列为：a）如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，或b）与SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述的人ABCB1基因的3′UTR序列插入在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒载体的SacI和XhoI限制性酶切位点之间。
3.一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法，其特征在于，它至少设置以下实验组：
a）将待测试microRNA和权利要求1或2所述的质粒载体共转染多药耐药宿主细胞；
b）将待测试microRNA转染多药耐药宿主细胞，作为对照，
检测并比较a）组相对于b）组的双荧光素酶活性变化，确定待测试microRNA是否为多药耐药相关microRNA；所述的多药耐药宿主细胞是人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-OHP。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，它还包括以下实验组：c）多药耐药宿主细胞组作为空白对照，和/或d）待测试microRNA和权利要求1或2所述的质粒载体的突变型质粒共转染多药耐药宿主细胞。
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