CN112813100A - 单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法，具体包括：对pmirGLO‑RAGE5’‑UTR及pmirGLO‑mut‑RAGE载体的构建；基因目的片段退火合成双链DNA，95℃热变性2min，每90s温度下降1℃，至25℃，放置30min，4℃存，‑20℃冻存备用；用Sac I和Xho I酶对pmir GLO载体进行双酶切，使之解链成线性化；双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行DNA回收，再将线性载体和RAGE5’‑UTR载体相连接；同法连接突变型目的片段，构建突变型重组载体质粒；将两种重组载体质粒和空载体质粒分别转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取菌落，进行质粒的抽提和鉴定；培养293T细胞，通过LipofectamineTM2000转入含有重组pmirGLO‑RAGE5’‑UTR或pmirGLO‑mut‑RAGE的质粒，转染24小时后，检测转染效率，选取稳定转染的细胞，即构建成功筛选系统。该筛选体系简单、有效，可更换靶位点推广应用。

Description

单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法
技术领域
本发明涉及一种筛选体系的构建方法，具体涉及单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法。
背景技术
老年性瓣膜病是一组累及多个瓣膜的退行性疾病，尤以主动脉瓣钙化所致的瓣口狭窄或关闭不全为甚。随着我国逐步进入高龄化社会，老年性主动脉瓣钙化(aortic valvecalcification)的发病率逐年上升，50岁以上人群中瓣膜钙化检出率达12.5％，其中主动脉瓣受累占94.4％。目前，老年性主动脉瓣钙化性疾病(calcified aortic valvedisease，CAVD)仅能采取手术或介入换瓣治疗策略，目前的置换瓣膜分生物瓣或机械瓣两种，生物瓣膜置换后需十年后再次开胸更换瓣膜，而机械瓣置换后需终生服用抗凝剂。瓣膜置换术费用高、风险大、恢复周期长，患者生活质量差。对有手术或介入禁忌症的患者，以及未达到手术条件但存在瓣膜钙化的病人，目前缺乏针对性治疗手段延缓或控制病程进展。因此，加强CAVD治疗药物的基础与临床研究，变被动手术为主动防控，提高CAVD治疗水平，具有深远意义。
近年研究表明，CAVD的发生是血液中钙盐沉积在瓣膜表面形成钙结节的被动过程。但近年来研究表明，CAVD的发生人群几乎90％以上存在notch1基因突变，且主动脉瓣钙化狭窄与动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)发病机制类似，是多种细胞和信号蛋白介导的主动性炎症性病理过程，并非单纯的细胞外基质异常沉积。在瓣膜中，瓣膜细胞成分是维持瓣膜形态和功能的基本要素，而瓣膜间质细胞(VICs)则是细胞成分中与间质钙盐沉积最相关的细存在于间质，与其他的间质细胞如血管平滑肌细胞具有同源性，但其所在位置特殊，血流动力学改变复杂，其他种类的心血管间质细胞研究完全不能替代VICs。VICs在多种复杂应力及体内异常成分作用下，出现凋亡、收缩、钙化等改变，可直接导致间质钙盐沉积，结缔组织过度增生，形成瓣膜钙化、僵硬、瓣口狭窄，影响瓣膜启闭。炎症激活与瓣膜间质细胞成骨样分化及瓣膜组织钙化密切相关，18F-脱氧葡萄糖正电子发射断层摄影(PET)技术及连续免疫荧光技术均证实，炎症贯穿于CAVD始终。因此，VICs的炎症及钙化是目前公认的CAVD发病中枢环节。流行病学调查显示代谢综合征和糖尿病是CAVD发病的高危因素，这类病患血浆和组织的晚期糖基化终产物(AGEs)水平明显升高。晚期糖基化终产物受体(Receptor for advanced glycation end-products，RAGE)是细胞表面免疫球蛋白超家族的一员，可与AGEs、高迁移率族蛋白1及S100/钙粒蛋白等多种配体相结合，激活下游信号通路，最终影响核转录因子κB(NF-κB)、AP-1、CREB、STAT3、NFAT等通路，调控炎症因子及粘附分子分泌、参与巨噬细胞招募、细胞增殖与自噬等。在脑血管疾病中，以RAGE为靶点使用吡格列酮等西药，可减缓血管性痴呆等疾病的发生。
我国古典医籍中无“主动脉瓣钙化性疾病”或“主动脉瓣狭窄”之名，其临床表现散见于“胸痹”、“心痛”等病症中。该病病因多与心气不足、心阳不振、年老体弱等因素有关。病机多属本虚标实，本虚多因气血不足，气血生成、运行、气化、濡润等功能下降，血脉失养，运行不畅，阴阳失调，心、脾、肝等脏功能减退有关。标实则与血瘀、痰浊等痹阻心阳有关。诸多医家在诊治CAVD上颇有心得，如应用活血化瘀法、清热化痰法、固本培元法等一系列治法治疗该疾病，均取得了一定疗效。
但是，如前所述，目前抗CAVD中药的筛选主要依据中医理论推断获得，缺乏客观的科学实验证据。如何在极其丰富的中药资源宝库中，筛选出抗CAVD的药物，仍然是亟需解决的问题。
发明内容
针对上述内容，本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
(1)pmirGLO-RAGE5’-UTR及pmirGLO-mut-RAGE载体的构建:在RAGE5’端UTR中exon选择46个碱基构成的序列pmirGLO-RAGE5’-UTR载体和pmirGLO-mut-RAGE载体；
(2)在目的片段的5’端和3’端分别加入了Sac I和Xho I两个限制性内酶切位点；
(3)基因目的片段退火合成双链DNA，95℃热变性2min，每90s温度下降1℃，至25℃，放置30min，4℃存，-20℃冻存备用；
(4)用Sac I和Xho I酶对pmir GLO载体进行双酶切，使之解链成线性化；
(5)双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行DNA回收，再将线性载体和RAGE5’-UTR载体相连接；
(6)同法连接突变型目的片段，构建突变型重组载体质粒；将两种重组载体质粒和空载体质粒分别转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取菌落，进行质粒的抽提和鉴定；
(7)培养293T细胞，通过LipofectamineTM2000(promega)转入含有重组pmirGLO-RAGE5’-UTR或pmirGLO-mut-RAGE的质粒，转染24小时后，检测转染效率，选取稳定转染的细胞，即构建成功筛选系统；
(8)将含药血清加入构建的PmirGLO-RAGE 3’-UTR细胞检测系统，24小时后进行双荧光报告基因检测，通过荧光强弱筛选出有效抑制RAGE的药物。
优选地，所述pmirGLO-RAGE5’-UTR载体
正义链：
5’-GATCGGGGGCTCTGAGGGAATGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC-3’
反义链：
5’-TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCATTCCCTCAGCCCCCGATCGAGCT-3’。
优选地，所述pmirGLO-mut-RAGE载体
正义链：
5’-GATCGGGGGCTCTGAGTAGTGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC-3’
反义链：
5’-TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCACTACTCAGCCCCCGATCGAGCT-3’。
双荧光素酶报告基因系统是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法，具有灵敏度高、特异性好、检测时间短等特点，且对所测定的活体细胞没有任何毒性。在此基础上，将目标作用靶点的RAGEpromoter连接入pmirGLO载体，该载体中含有能在同一细胞中同时表达的两种荧光素酶基因，一个是萤火虫荧光素酶报告基因，另一个是海肾荧光素酶报告基因。萤火虫荧光素酶报告基因为主要报告基因，目的基因片段被克隆至萤火虫荧光素酶报告基因下游的多克隆位点上。若该药物可抑制目的基因表达，则使萤火虫荧光素酶转录过程受阻，萤火虫荧光值下降，而作为标准化内参照的海肾荧光素酶的表达不受影响，此时可通过药物对萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性值下降判断不同药物对重组载体靶点promoter作用，对单味中药进行有效性筛选与靶点选择，对筛选出来的药物可再进行进一步的体内、外实验论证。
本发明的有益效果：
(1)该药物筛选体系可有效筛选出针对靶位点的中药；
(2)筛选出的中药具有抗老年性瓣膜钙化的作用；
(3)筛选出中药的作用靶点与该药物筛选体系预测基本一致；
(4)该筛选体系简单、有效，可更换靶位点推广应用。
具体实施方式：
为了更好的理解本发明，下面结合实施实例进一步阐述本发明的内容，但本发明的内容并不仅仅局限于下述的实施例。
实施例
(1)药物制备：利用SD大鼠制备10种目标中药单药颗粒的含药血清，选取CNKI上搜索得到的抗CAVD中药，如丹参、黄芪、瓜蒌等中药(国家获批使用)，按照药典标准购买符合国家规定的单味中药配方颗粒，水溶后按照人-大鼠体表面积换算方法进行给药剂量换算，成年Wistar大鼠(体重200g左右)，连续7天，每日4pm-5pm给药，第8天同一时间采血、分离含药血清。含药血清56℃水浴30min灭活后(除菌滤器过滤)，-80℃保存备用。
(2)药物筛选细胞检测系统体系构建
pmirGLO-RAGE5’-UTR及pmirGLO-mut-RAGE载体的构建:生物信息学分析后，在RAGE5’端UTR中exon选择46个碱基构成的序列pmirGLO-RAGE5’-UTR载体
正义链：
5’-GATCGGGGGCTCTGAGGGAATGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC-3’
反义链：
5’-TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCATTCCCTCAGCCCCCGATCGAGCT-3’
pmirGLO-mut-RAGE载体
正义链：
5’-GATCGGGGGCTCTGAGTAGTGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC-3’
反义链：
5’-TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCACTACTCAGCCCCCGATCGAGCT-3’。
在目的片段的5’端和3’端分别加入了Sac I和Xho I两个限制性内酶切位点，粗体显示即为该位点。基因目的片段退火合成双链DNA，95℃热变性2min，每90s温度下降1℃，至25℃，放置30min，4℃存，-20℃冻存备用。pmirGLO载体本身含有Sac I和Xho I两种限制性内切酶切位点，用Sac I和Xho I酶对pmirGLO载体进行双酶切，使之解链成线性化。双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行DNA回收，再将线性载体和RAGE5’-UTR载体相连接。同法连接突变型目的片段，构建突变型重组载体质粒。将两种重组载体质粒和空载体质粒分别转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取菌落，进行质粒的抽提和鉴定。
(3)利用筛选体系进行药物筛选：培养293T细胞，通过LipofectamineTM2000(promega)转入含有重组pmirGLO-RAGE5’-UTR或pmirGLO-mut-RAGE的质粒。转染24小时后，检测转染效率，选取稳定转染的细胞，即构建成功筛选系统。将含药血清加入构建的PmirGLO-RAGE 3’-UTR细胞检测系统，24小时后进行双荧光报告基因检测，通过荧光强弱筛选出有效抑制RAGE的药物。
(4)筛选药物有效性论证
①原代瓣膜间质细胞oxLDL损伤模型的建立：猪瓣膜间质细胞培养方法，取成年健康新鲜猪心，顺主动脉瓣叶交界处剪开后，取带有主动脉瓣叶的少量主动脉及心室流出道部分于生理盐水中反复漂洗。再分离主动脉瓣三个瓣叶于冰PBS中反复漂洗至瓣叶呈白色。分离后的主动脉瓣叶浸泡于1mg/mLII型胶原酶-DMEM溶液，37℃培养箱放置半小时，剧烈震荡1min分离内皮后再将瓣叶组织置于新1mg/mL II型胶原酶-DMEM溶液中，37℃5％CO2培养箱4-6小时。取出含有主动脉瓣叶的II型胶原酶溶液，1000rpm离心10min后弃上清，加入含10％胎牛血清的DMEM溶液，反复吹打混匀，转至培养瓶。原代培养的VICs采用免疫荧光法(或激光共聚焦)鉴定表型(α-SMA+、vimentin+、CD31-)。
培养后的VICs传代至2-4代，将该细胞转骨化培养基培养(含10mMβ-甘油磷酸，50μg/ml维生素C，100nM地塞米松的标准培养基)，100μg/ml oxLDL(Solarbio，Beijing)诱导即建立oxLDL损伤的VICs模型。
②药物干预后，检测瓣膜间质细胞向成骨细胞分化:western-blot检测成骨细胞分化相关因子Runx2、osteoponin、osteocalcin的表达水平；ALP检测钙化形成水平。
③药物干预后，western-blot检测RAGE蛋白表达。
研究结果
(1)药物筛选体系初筛药物结果
Figure BDA0002277946980000051
Figure BDA0002277946980000061
(2)初筛药物有效性论证
对初步筛查的中药进行有效性论证，结果显示
①筛选中药对瓣膜间质细胞成骨化蛋白表达的影响(western-blot相对值)
组别 Osteoponin Osteocalcin Runx2
空白组 0.12±0.02 0.14±0.05 0.25±0.01
模型组 1.00±0.02 1.00±0.04 1.00±0.04
丹参组 0.68±0.09 0.71±0.11 0.77±0.08
葛根组 0.57±0.05 0.59±0.12 0.59±0.03
②筛选中药对瓣膜间质细胞RAGE蛋白表达的影响(western-blot相对值)
Figure BDA0002277946980000062
Figure BDA0002277946980000071
③筛选中药对瓣膜间质细胞ALP的影响
组别 ALP
空白组 0.30±0.11
模型组 1.00±0.10
丹参组 0.77±0.08
葛根组 0.69±0.15
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南中医药大学
<120> 单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version3.5
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
GATCGGGGGCTCTGAGGGAATGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC
<210> 2
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCATTCCCTCAGCCCCCGATCGAGCT
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
GATCGGGGGCTCTGAGTAGTGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCACTACTCAGCCCCCGATCGAGCT

Claims (3)

1.单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)pmirGLO-RAGE5’-UTR及pmirGLO-mut-RAGE载体的构建:在RAGE5’端UTR中exon选择46个碱基构成的序列pmirGLO-RAGE5’-UTR载体和pmirGLO-mut-RAGE载体；
(2)在目的片段的5’端和3’端分别加入了Sac I和Xho I两个限制性内酶切位点；
(3)基因目的片段退火合成双链DNA，95℃热变性2min，每90s温度下降1℃，至25℃，放置30min，4℃存，-20℃冻存备用；
(4)用Sac I和Xho I酶对pmir GLO载体进行双酶切，使之解链成线性化；
(5)双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳进行DNA回收，再将线性载体和RAGE5’-UTR载体相连接；
(6)同法连接突变型目的片段，构建突变型重组载体质粒；将两种重组载体质粒和空载体质粒分别转化大肠杆菌DH5ɑ，挑取菌落，进行质粒的抽提和鉴定；
(7)培养293T细胞，通过LipofectamineTM2000(promega)转入含有重组pmirGLO-RAGE5’-UTR或pmirGLO-mut-RAGE的质粒，转染24小时后，检测转染效率，选取稳定转染的细胞，即构建成功筛选系统；
(8)将含药血清加入构建的PmirGLO-RAGE 3’-UTR细胞检测系统，24小时后进行双荧光报告基因检测，通过荧光强弱筛选出有效抑制RAGE的药物。
2.根据权利要求1所述单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法，其特征在于，所述pmirGLO-RAGE5’-UTR载体
正义链：
5’-GATCGGGGGCTCTGAGGGAATGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC-3’
反义链：
5’-TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCATTCCCTCAGCCCCCGATCGAGCT-3’。
3.根据权利要求1所述单味中药治疗老年性瓣膜病药物筛选体系的构建方法，其特征在于，所述pmirGLO-mut-RAGE载体
正义链：
5’-GATCGGGGGCTCTGAGTAGTGAGACCCTAGAGGGTACACTCCCC-3’
反义链：
5’-TCGAGGGGGAGTACCCTCTAGGGTCTCACTACTCAGCCCCCGATCGAGCT-3’。
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CN103173480A (zh) * 2013-03-01 2013-06-26 上海中医药大学附属曙光医院 一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法
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WO2018144831A1 (en) * 2017-02-02 2018-08-09 Duke University Compositions and methods for controlling gene expression

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Title
余之晨: "糖基化终末产物对钙化性主动脉瓣膜病的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 (医药卫生科技辑)》 *
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