CN109554368A - 靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法及其应用 - Google Patents

靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及靶向抑制miR‑34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法及其应用，该通用表达框架由上游序列、中间序列以及下游序列三部分组成。按本发明所述的靶向抑制miR‑34a的人工环状RNA通用表达框架可由质粒或病毒工具介导在细胞内表达靶向抑制miR‑34a的人工环状RNA分子，具备在胞内实现抑制miR‑34a‑5p生物功能的能力。本发明还涉及该通用表达框架及携带此表达框架的真核表达质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒在制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物中的应用。

Description

靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法 及其应用
[技术领域]
本发明涉及靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法及其在制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物中的应用。
[背景技术]
近年随着人们生活水平的提高，能量摄入过剩相关的肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病等诸多代谢异常疾病的患病率日益升高。据2018中国国民健康与营养大数据报告显示，超重或肥胖的国民或超过2亿，其中血脂异常(含高脂血症)患者1.6亿、脂肪肝患者1.2亿、糖尿病患者超过9000万，糖脂代谢异常疾病严重影响人们的健康，因此，开发有效调节糖脂代谢，维持糖脂代谢稳态的药物对于肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的治疗具有重要价值。
肝脏在能量代谢过程中发挥重要作用，肝脏糖代谢和脂代谢功能的紊乱与包括肥胖、脂肪性肝病、高脂血症以及糖尿病等代谢类疾病的发生息息相关。CRTC2是维持肝脏糖脂代谢稳态的一个重要调节因子。研究证实，在长期能量摄入过剩的条件下，肝脏Crtc2高表达并激活Creb转录活性。Crtc2/Creb复合体启动miR-34a的转录，肝脏细胞高表达miR-34a抑制Sirt1/Pparα信号通路。做为肝脏甘油三酯代谢的重要调控通路，Sirt1/Pparα信号通路的抑制会导致脂代谢异常，肝脏和血液甘油三酯的含量上升。同时Sirt1/Pparα信号通路的抑制会降低FGF21的分泌，致使肝脏能量代谢失衡，胰岛素敏感性降低，胰岛负荷增加。因此，长期能量摄入过剩条件下，miR-34a过量表达诱导的sirt1/Pparα信号通路的长期抑制是肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病等代谢疾病的重要诱因。研究人员在高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型中证实，miR-34a的表达抑制是解除长期能量摄入过剩条件下肝脏病变和能量代谢失调的关键。因此，miR-34a作为靶点，在肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物开发中极具价值。
目前，以microRNA作为靶点的药物开发主要集中在体外合成microRNA的模拟物或拮抗分子，在体内模拟或抑制microRNA的生物活性，以期进行疾病的治疗。例如EnGenelC开发的MesomiR-1(miR-16mimic)和Mirna Therapeutics开发的MRX34(miR-34mimic)两种核酸小分子药物，均为microRNA的模拟物。然而，限于核酸药物本身的理化性质，microRNA的模拟物或拮抗物药物开发存在诸多障碍，其中最主要的就是药物分子在体内靶向递送和半衰期。虽然目前核酸分子的化学修饰技术以及核酸药物的递送技术有了很大的提高，但是microRNA的模拟物或拮抗分子药物开发仍需更有效的解决递送效率和体内稳定性的问题。
[发明内容]
本发明的目的在于提供一种具备高效靶向抑制miR-34a的人工环状RNA及其通用表达框架，以及携带该人工环状RNA分子通用表达框架的真核表达质粒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒在制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明包括一种式I序列的人工环状RNA的通用表达框架，
其中，
US为上游序列，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，
DS为下游序列，碱基序列如SEQ ID NO.2所示，
34inh为miR-34a-5p的吸附抑制位点的序列，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，
LS为连接序列，碱基序列如SEQ ID NO.4所示，
n个miR-34a-5p吸附位点序列通过连接序列连接并隔离，避免相邻两个吸附位点之间的干扰，n为自然数。
IS为环状RNA的鉴定序列，碱基序列如SEQ ID NO.5所示，用于环状RNA鉴定引物的结合。
上述人工环状RNA的通用表达框架还具有如下优化方案：
连接序列主要的作用是将相邻的两个吸附点位进行连接并隔离，避免相邻两个吸附位点之间的干扰，诸如可以采用GTGTGT。
miR-34a-5p吸附抑制位点的序列由人源miR-34a-5p的反向互补DNA序列决定，亦可模拟microRNA与靶基因结合的原则对个别碱基进行优化调整或对吸附位点碱基数进行合理调整。
而其中的n为自然数，最佳范围为5≤n≤50。
本发明还包括一种靶向抑制miR-34a的人工环状RNA分子rs-ciR34-10的通用表达框架，如式I所示，该通用表达框架中IS序列前后两个LS-34inh序列组件重复次数n均等于5，碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还包括又一种人工环状RNA的通用表达框架，碱基序列如SEQ ID NO.7所示。相较于人工环状RNA分子rs-ciR34-10的通用表达框架，该人工环状RNA的通用表达框架的差异在于原“34inh”元件被替换为miR-34a-5p反向互补DNA的随机打乱序列(scramble)，用于表达rs-ciR34-10的阴性对照RNA序列。
本发明还包括一种人工线性RNA的表达框架，碱基序列如SEQ ID NO.8所示，该人工线性RNA表达框架序列与上述SEQ ID NO.6所示的rs-ciR34-10通用表达框架的差异在于缺少式I所示的US序列和DS序列，用做鉴定rs-ciR34-10通用表达框架转录后环化为rs-ciR34-10分子的线性对照。
本发明还包括一种上述人工环状RNA的通用表达框架的表达方法，利用真核质粒表达系统、慢病毒表达系统、腺病毒表达系统、腺相关病毒表达系统或逆转录表达系统表达。
上述人工环状RNA的通用表达框架可以应用到制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病治疗药物中。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明提供了一种具备高效靶向抑制miR-34a能力的人工环状RNA的通用表达框架，框架中的上下游序列能够高效的表达并剪切环化为环状RNA分子。所述人工环状RNA通用表达框架可利用真核载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及逆转录病毒载体进行表达。为相应基因治疗药物提供了多种介导工具的选择。
2.本发明提供的靶向抑制miR-34a的人工环状RNA通用表达框架可以用于包含肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病在内的多种糖脂代谢异常疾病的基因治疗药物开发。
[附图说明]
图1为靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架的示意图。
图2为携带人工环状RNA分子rs-ciR34-10、对照人工环状RNA分子rs-ciRscramble-10、线性对照分子rs-liR34-10的通用表达框架的慢病毒感染293T细胞后，RT-PCR检测转录产物环化效果的电泳图。
图3为高糖高脂饮食条件下，携带rs-ciR34-10表达框架的慢病毒干预组和携带rs-ciRscramble-10阴性对照表达框架的慢病毒干预组小鼠的体重曲线以及皮下脂肪重量对比。
图4为高糖高脂饮食条件下，携带rs-ciR34-10表达框架的慢病毒干预组和携带rs-ciRscramble-10阴性对照表达框架的慢病毒干预组小鼠的随机血糖和口服糖耐量对比。
图5为高糖高脂饮食条件下，携带rs-ciR34-10表达框架的慢病毒干预组和携带rs-ciRscramble-10阴性对照表达框架的慢病毒干预组小鼠血清和肝脏中甘油三脂含量对比。
图6为高糖高脂饮食条件下，携带rs-ciR34-10表达框架的慢病毒干预组和携带rs-ciRscramble-10阴性对照表达框架的慢病毒干预组小鼠肝脏HE染色和油红染色图片。
图7为高糖高脂饮食条件下，携带rs-ciR34-10表达框架的慢病毒干预组和携带rs-ciRscramble-10阴性对照表达框架的慢病毒干预组小鼠肝脏中sirt1、Ppar、FGF21的表达检测对比。
[具体实施方式]
以下结合慢病毒介导的rs-ciR34-10的通用表达框架的实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
本发明所涉及的技术为基因合成、载体构建、细胞培养、质粒转染、病毒包装、RT-PCR、qPCR、DIO小鼠模型构建、H&E染色、油红染色、血糖检测、ELISA检测等常规技术手段，其中涉及的相关实验条件在未作说明的情况下均可根据本领域技术人员的经验进行合理选择，其中涉及试剂耗材属于市售的普通产品，细胞为ATCC来源，实验动物来源于上海西普尔-必凯实验动物有限公司。其中涉及的检测手段以及仪器也均为本领域技术人员所熟知并熟练掌握。
下面通过实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例一：人工环状RNA表达框架序列以及对应的线性RNA对照表达框架序列的涉及和合成。
1.利用miRbase数据库查询到人源miR-34a-5p的序列为“uggcagugucuuagcugguugu”，其反向互补DNA序列为“ACAACCAGCTAAGACACTGCCA”，以该序列替换通用框架式I中的
“34inh”。LS序列为“GTGTGT”，IS序列为
“ACAAAACAGCCACGCTTCGAGCACGAATCGCCAACTCACGAACG”，自然数n＝5，结合如SEQIDNO.1和SEQ ID NO.2所示通用框架式I中的US和DS序列元件，得到人工环状RNA分子rs-ciR34-10的通用表达框架，碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
2.将上述miR-34a-5p的反向互补DNA序列进行随机打乱，并以随机打乱序列(scramble)替换上述SEQ ID NO.6所示人工环状RNA分子rs-ciR34-10的通用表达框架中的“34inh”，得到阴性对照环状RNA的通用表达框架，碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
3.将上述SEQ ID NO.6所示人工环状RNA分子rs-ciR34-10的通用表达框架中的US和DS序列元件删除，得到rs-ciR34-10分子线性对照的表达框架，碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
4.将上述SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示碱基序列进行全序列合成，由南京金斯瑞公司完成。将序列构建至慢病毒载体plenti6.3-MCS中，得到人工环状RNA分子rs-ciR34-10、对照人工环状RNA分子、线性对照分子的慢病毒表达质粒，分别命名为plenti6.3-rs-ciR34-10、plenti6.3-rs-ciR-scramble-10、plenti6.3-rs-liR34-10，plenti6.3-MCS质粒购自invitrogen。
实施例二：慢病毒包装
1.转染前24h，用胰酶消化对数生长期的293T细胞，传代到10cm细胞培养皿，37℃、5％CO2培养箱内培养。24h待细胞密度达70％～80％时即可用于转染。细胞状态对于病毒包装至关重要，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2.转染前将细胞培养基更换为无血清培养基。
3.向灭菌离心管中分别加入所制备的各质粒DNA溶液(慢病毒质粒10μg，辅助质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG各5μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为1.5ml。
4.将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取60μl Lipofectamine 2000试剂在另一管中与1.5ml Opti-MEM混合，在室温下温育5分钟。
5.把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡。
6.混合后，在室温下温育20分钟，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
7.将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃,5％CO2细胞培养箱中培养。
8.培养6小时后吸去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞中加入含10％血清的细胞培养基10ml，于37℃、5％CO2培养箱内继续培养48小时。
9.收集转染后48小时和72小时(转染即可为0小时计起)的293T细胞上清液。
10.于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。
11.以0.45μm滤器过滤上清液于50ml离心管中。
12.把病毒粗提液样品加入到过滤杯中，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。
13.组合好后，做好平衡，放在转头上。
14.在5000×g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。
15.离心结束后，过滤杯中的即为病毒浓缩液。
16.将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，可在4℃保存一周，或-80℃长期保存。取其中一支进行病毒生物学滴度测定。
实施例三：慢病毒感染LO2细胞RT-PCR检测环状RNA分子的表达
1.复苏LO2细胞，按照相应培养条件，在37℃，5％CO2培养箱培养。
2.将胞悬液接种于6孔板中(40万个/孔)，37℃，5％CO2培养箱培养。
3.根据结肠癌细胞MOI和各病毒滴度向细胞中分别加入适量的人工环状RNA过表达慢病毒、线性对照序列慢病毒和阴性对照慢病毒，同时加入浓度终为8ug/ml的Polybrene增强感染。
4.感染24h后更换无慢病毒的完全培养基继续培养。
5.感染72h后，6孔板每孔加入1ml Trizol，用1ml枪头反复吹打10次，收集到EP管内；12000g离心15分钟，取上清。
6.向上清中加入200ul氯仿，上下用力颠倒混匀半分钟，静置3分钟。
7.于4℃，12000g离心15分钟，此时可见裂解液分三层：上层为水相的RNA；中层为DNA,脂类等；下层为细胞残渣，蛋白，多糖等。
8.取上清500ul到新的EP管内，167ul吸三次；加入等体积的异丙醇，混匀，静置10分钟后，4℃，12000g离心10分钟。
9.小心去掉上清，注意不要丢失RNA沉淀，加入1ml 75％乙醇,上下颠倒，使沉淀块重悬起。
10.于4℃，12000g离心10分钟,小心去掉上清，尽量吸干管壁的液体，注意不要丢失RNA沉淀，若沉淀松动可再次离心。晾干约15分钟，至管壁无液体。
11.加入适量体积(20-30ul)的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分钟。
12,取出2ul定量，测量buffer:10mM TrisCl(pH7.8)，根据定量结果进行逆转录。(1A260＝40μg/ml,A260/A280＝1.8～2.1)
13.RNA反转录
根据操作说明书进行反转录，体系如下：
在RNase-Free的PCR管中加入(总体系20ul)
混匀，65℃孵育10min，立刻冰浴，然后加入
2.5 U/μl Poly A Polymerase 1μl
RTase Mix 1μl
5×PAP/RT Buffer 5μl
dd H<sub>2</sub>O(RNase/Dnase free) 8μl
37℃孵育60min，85℃，5min；cDNA冻存于-20℃或即刻PCR。
14.RT-PCR检测
1)引物设计合成
divergent primer-F：如SEQ ID NO.9所示。
divergent primer-R：如SEQ ID NO.10所示。
convergent primer-F：如SEQ ID NO.11所示。
convergent primer-R：如SEQ ID NO.12所示。
上述引物序列由上海华大基因公司进行合成。
2)在RT-PCR预实验摸索出最佳的引物退火温度和模板量的前提下，使用2×RT-PCRMaster Mix配制PCR Mix，根据需要上机的样品数和重复数，计算并配制PCR Mix，体系如下：
2×RT-PCR Master Mix 10μl
PCR引物Mix 1μl
模板 5μl
超纯水 4μl
总体积 20μl
3)将上述样品放入PCR仪，PCR程序设置如下：
PCR反应可设成3步法：(退火温度结合引物的Tm值及RT-PCR预实验的结果自行设
定，融解曲线可设60-95℃)
预变性Cycle 1:(1X)
Step 1: 95.0℃ for 02:00.
PCR循环Cycle 2:(40X)
Step 1: 95.0℃ for 00:15.
Step 2: 60.0℃ for 00:20.
Step 3: 72.0℃ for 00:20.
4)琼脂糖凝胶电泳检测环状RNA分子的PCR产物，验证环状RNA表达框架的环化效果。
检测结果如图2所示。泳道1、2、4为利用convergent primer F/convergentprimer R分别对plenti6.3-rs-ciR34-10、plenti6.3-rs-ciR-scramble-10、plenti6.3-rs-liR34-10感染后的LO2细胞cDNA进行的PCR产物，电泳显示三条泳道均存在325bp的阳性片段，提示三种病毒感染后所携带的表达框架均存在阳性表达。泳道5、6、7为利用divergent primer F/divergent primer R分别对plenti6.3-rs-ciR34-10、plenti6.3-rs-ciR-scramble-10、plenti6.3-rs-liR34-10感染后的LO2细胞cDNA进行的PCR产物，电泳显示泳道5、6均存在325bp的阳性片段，而泳道7无阳性片段，提示plenti6.3-rs-ciR34-10、plenti6.3-rs-ciR-scramble-10两种病毒感染后所携带的表达框架表达后在胞内环化为环状RNA，而plenti6.3-rs-liR34-10携带的表达框架因不携带US和DS元件，无法环化，故不存在阳性产物。
实施例四：慢病毒介导的人工环状RNA体内调节糖脂代谢的活性检测
1，4周龄雄性C57小鼠30只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
利用高脂饲料(60％fat diet，D12492，Research Diets)饲养C57小鼠至10周龄。
3，10周龄时，小鼠随机分为2组。实验组10只，利用plenti6.3-rs-ciR34-10慢病毒尾静脉注射，每次注射病毒总量10^8TU,体积≤100ul，总计注射10次，同时继续高脂饲养至20周龄；对照组10只，利用plenti6.3-rs-ciR-scramble-10慢病毒尾静脉注射，每次注射病毒总量10^8TU,体积≤100ul，总计注射10次，同时继续高脂饲养至20周龄。
4，20周龄时，称取各组小鼠体重。
慢病毒干预第70天，分别测量各组小鼠的禁食血糖、随机血糖、血液TG含量。
慢病毒干预第70天，分别进行各组小鼠的口服葡萄糖糖耐检测。
慢病毒干预第70天，处死小鼠，剥离小鼠腹股沟、性腺以及内脏脂肪，称取各组小鼠脂肪湿重。取肝脏组织，测量肝脏TG含量。
对各组小鼠肝脏组织进行总RNA抽提，qPCR检测各组小鼠肝脏中sirt1、Ppar、FGF21的表达。
检测结果显示相较对照组，plenti6.3-rs-ciR34-10慢病毒干预显示出显著的降低DIO小鼠血糖血脂、调节体重体脂以及改善肝脏脂质沉积的作用，如图3-6所示；同时，plenti6.3-rs-ciR34-10慢病毒干预显著增加肝脏组织中脂肪酸β氧化的关键因子Sirt1和Pparα以及FGF21的表达，如图7所示。
上述结果提示，plenti6.3-rs-ciR34-10慢病毒感染后表达的rs-ciR34-10环状RNA分子通过竞争性吸附抑制miR-34a的生物活性，通过调控Sirt1和Pparα以及FGF21的表达参与肝脏糖脂代谢的稳态维持。本发明涉及靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架在制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物中具有巨大的应用价值。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域技术人员对本发明的技术方案所作的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围之内。
<110> 上海锐赛生物技术有限公司
<120> 靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架、表达方法及其应用
<130> AJ181880
<160> 12
<210> 1
<211> 89
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tgagattaca ggtgtgagcc accacccccg gcctcacttt ttgtaaaggt acgtactaat 60
gacttttttt ttatacttca ggtaagtct 89
<210> 2
<211> 70
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tctctctctc ttcaggtaag tagcaaggaa aagagttagg cccggcacgg tagctcacac 60
ctgtaatccc 70
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
acaaccagct aagacactgc ca 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gtgtgt 6
<210> 5
<211> 44
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
acaaaacagc cacgcttcga gcacgaatcg ccaactcacg aacg 44
<210> 6
<211> 461
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
tgagattaca ggtgtgagcc accacccccg gcctcacttt ttgtaaaggt acgtactaat 60
gacttttttt ttatacttca ggtaagtctg tgtgtacaac cagctaagac actgccagtg 120
tgtacaacca gctaagacac tgccagtgtg tacaaccagc taagacactg ccagtgtgta 180
caaccagcta agacactgcc agtgtgtaca accagctaag acactgccag tgtgtacaac 240
cagctaagac actgccagtg tgtacaacca gctaagacac tgccagtgtg tacaaaacag 300
ccacgcttcg agcacgaatc gccaactcac gaacggtgtg tacaaccagc taagacactg 360
ccagtgtgta caaccagcta agacactgcc atctctctct cttcaggtaa gtagcaagga 420
aaagagttag gcccggcacg gtagctcaca cctgtaatcc c 461
<210> 7
<211> 461
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
tgagattaca ggtgtgagcc accacccccg gcctcacttt ttgtaaaggt acgtactaat 60
gacttttttt ttatacttca ggtaagtctg tgtgtacaac cttcacagga cccaagagtg 120
tgtaacacac tgcaggatca ccgcagtgtg taacacactg caggatcacc gcagtgtgta 180
acacactgca ggatcaccgc agtgtgtaac acactgcagg atcaccgcag tgtgtaacac 240
actgcaggat caccgcagtg tgtaacacac tgcaggatca ccgcagtgtg tacaaaacag 300
ccacgcttcg agcacgaatc gccaactcac gaacggtgtg taacacactg caggatcacc 360
gcagtgtgta ccctgtcaga caaaaacgcc atctctctct cttcaggtaa gtagcaagga 420
aaagagttag gcccggcacg gtagctcaca cctgtaatcc c 461
<210> 8
<211> 325
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
gtaagtctgt gtgtacaacc agctaagaca ctgccagtgt gtacaaccag ctaagacact 60
gccagtgtgt acaaccagct aagacactgc cagtgtgtac aaccagctaa gacactgcca 120
gtgtgtacaa ccagctaaga cactgccagt gtgtacaacc agctaagaca ctgccagtgt 180
gtacaaccag ctaagacact gccagtgtgt acaaaacagc cacgcttcga gcacgaatcg 240
ccaactcacg aacggtgtgt acaaccagct aagacactgc cagtgtgtac aaccagctaa 300
gacactgcca tctctctctc ttcag 325
<210> 9
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
acgaatcgcc aactcacgaa cg 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
gctcgaagcg tggctgtttt gt 22
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
gtaagtctgt gtgtacaacc 20
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ctgaagagag agagatggc 19

Claims (9)

1.一种式I序列的靶向抑制miR-34a的人工环状RNA的通用表达框架，
其中，
US为上游序列，碱基序列如SEQ ID NO.1所示，
DS为下游序列，碱基序列如SEQ ID NO.2所示，
34inh为miR-34a-5p的吸附抑制位点的序列，碱基序列如SEQ ID NO.3所示，
LS为连接序列，碱基序列如SEQ ID NO.4所示，
n个miR-34a-5p吸附位点序列通过连接序列连接并隔离，避免相邻两个吸附位点之间的干扰，n为自然数，
IS为环状RNA的鉴定序列，碱基序列如SEQ ID NO.5所示，用于环状RNA鉴定引物的结合。
2.如权利要求1所述的人工环状RNA的通用表达框架，其特征在于所述的连接序列为GTGTGT。
3.如权利要求1所述的人工环状RNA的通用表达框架，其特征在于miR-34a-5p吸附抑制位点的序列由人源miR-34a-5p的反向互补DNA序列决定，亦可模拟microRNA与靶基因结合的原则对个别碱基进行优化调整或对吸附位点碱基数进行合理调整。
4.如权利要求1所述的人工环状RNA的通用表达框架，其特征在于5≤n≤50。
5.一种靶向抑制miR-34a的人工环状RNA分子rs-ciR34-10的通用表达框架，其特征在于碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
6.一种靶向抑制miR-34a的人工环状RNA分子rs-ciRscramble-10的通用表达框架，其特征在于碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
7.权利要求1～6所述任一人工环状RNA的通用表达框架的表达方法，其特征在于利用真核质粒表达系统、慢病毒表达系统、腺病毒表达系统、腺相关病毒表达系统或逆转录表达系统表达。
8.一种靶向抑制miR-34a的人工环状RNA，其特征在于由权利要求1～7所述任一人工环状RNA的通用表达框架利用真核质粒表达系统、慢病毒表达系统、腺病毒表达系统、腺相关病毒表达系统或逆转录表达系统表达。
9.如权利要求1～7所述任一人工环状RNA的通用表达框架在制备肥胖、脂肪肝、高脂血症和糖尿病的药物中的应用。
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