CN109384844A

CN109384844A - 一种抗金黄色葡萄球菌α溶血素单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN109384844A
Application number: CN201710659435.0A
Authority: CN
Inventors: 杨光; 刘方杰; 刘玉; 刘成华; 高亚萍; 冯健男; 沈倍奋
Original assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Current assignee: Institute of Basic Medical Sciences of AMMS
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2017-08-04
Publication date: 2019-02-26
Anticipated expiration: 2037-08-04
Also published as: CN109384844B

Abstract

本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌α溶血素单克隆抗体及应用。该单克隆抗体由重链和轻链组成；所述重链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列2所示；所述轻链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列4所示。本发明以α‑溶血素为靶抗原，从噬菌体抗体库中快速地筛选出全人源抗α‑溶血素的单克隆抗体。该单克隆抗体是一个全新的抗体，具有较高的亲和力和抑制α‑溶血素的溶血活性，并能提高感染金黄色葡萄球菌小鼠的生存率。本发明提供的单克隆抗体对于金黄色葡萄球菌的防控具有重要的应用价值。

Description

一种抗金黄色葡萄球菌α溶血素单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗金黄色葡萄球菌α溶血素单克隆抗体及应用，尤其涉及该单克隆抗体在制备用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)简称金葡菌，是一种自然界中分布广泛的革兰氏阳性致病菌。据估计有20-30％的人群都携带该病原菌，该菌主要存在于人体的粘膜、皮肤、特别是鼻咽部。金葡菌可以引发一系列的疾病，从轻微的皮肤感染，到烫伤样皮肤综合征，到脓肿，再到威胁生命的肺炎、脑膜炎、心内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合征等。金葡菌感染影响范围很广，可累及皮肤、软组织、呼吸道、骨髓、关节、血管等等。

金黄色葡萄球菌主要是通过分泌各种外毒素来引发机体感染，如α溶血素、β溶血素、γ溶血素和δ溶血素。其中α-溶血素(alpha hemolysin，Hla)是影响金葡菌致病性的最关键毒力因子之一，几乎对所有的哺乳动物细胞都具有毒性，可引发败血症、肺炎以及严重的皮肤感染等疾病。α-溶血素由293个氨基酸组成，分子量约为33kD，等电点为pH 8.5。该毒素属于穿孔毒素(pore forming cytotoxins，PFTs)家族的一员，常以水溶性单体形式分泌到细胞外，在宿主细胞膜上结合并寡聚化形成七聚体形式，从而形成孔道并裂解细胞。

目前,临床上主要使用抗生素来治疗金葡菌引起的感染。随着抗生素的大量使用，临床分离的金黄色葡萄球菌大都对一种或多种抗生素敏感性降低。MRSA(超级细菌)出现后，抗生素治疗受到了很大的挑战。面对日益严峻的金葡菌耐药性,人们开始思考新的抗感染策略,如通过使用抗体中和金葡菌菌分泌的外毒素而非直接杀死金葡菌来达到治疗的效果。α-溶血素作为金葡菌致病性的关键毒力因子，成为抗体药物研发的重要靶标。目前针对金黄色葡萄球菌感染的在研单抗有MEDI4893、KBSA-301、514G3和ASN200等。

全人源抗体是治疗性抗体发展的主要方向，噬菌体抗体库技术的出现为全人源抗体的制备提供了良好的技术平台。噬菌体抗体库技术采用PCR方法体外扩增人抗体VH和VL部分基因，然后将VH和VL随机重组克隆至噬菌体展示载体上。呈现在噬菌体表面的抗体能够在体外与固相化的靶向抗原相互作用，通过反复洗涤去除非特异性结合抗体，然后洗脱并收集与抗原结合的噬菌体，该噬菌体再次感染大肠杆菌，使特异性的噬菌体得到富集。最后通过DNA测序工作，获得与靶向抗原特异性结合的抗体序列。噬菌体抗体库技术模拟了体内免疫系统的选择作用和抗体亲和力成熟的过程，无需经过杂交瘤技术，甚至无需经过免疫过程即可获得特异性的和高亲和力的各种抗体分子片段，大大缩短了抗体的研发时间。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种抗金黄色葡萄球菌α溶血素单克隆抗体。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种单克隆抗体，为一种IgG抗体，其可由重链和轻链组成；所述重链可变区的氨基酸序列可如序列表的序列2所示；所述轻链可变区的氨基酸序列可如序列表的序列4所示。所述IgG抗体可为抗金黄色葡萄球菌α溶血素的单克隆抗体。

编码所述IgG抗体的核酸分子也属于本发明的保护范围。

编码所述IgG抗体的核酸分子可由编码所述重链可变区的核酸分子和编码所述轻链可变区的核酸分子组成。

编码所述重链可变区的核酸分子可为序列表的序列1所示的DNA分子。

编码所述轻链可变区的核酸分子可为序列表的序列3所示的DNA分子。

所述IgG抗体或所述核酸分子在制备用于抑制金黄色葡萄球菌的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

所述IgG抗体或所述核酸分子在制备用于中和金黄色葡萄球菌分泌的外毒素的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述外毒素可为α溶血素。

本发明还保护一种用于抑制金黄色葡萄球菌的药物，其可含有所述IgG抗体。

本发明还保护一种用于中和金黄色葡萄球菌分泌的外毒素的药物，其可含有所述IgG抗体。

上述药物中，所述外毒素可为α溶血素。

所述IgG抗体或所述核酸分子在制备用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述疾病可为败血症和/或腹膜炎。

本发明还保护一种用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物，其可含有所述IgG抗体。

上述药物中，所述疾病可为败血症和/或腹膜炎。

上述任一所述α溶血素即为Hla蛋白。所述Hla蛋白的氨基酸序列可如序列表中序列6所示。本发明还保护由所述IgG抗体衍生的人源化抗体，可由重链和轻链组成；所述重链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列2所示；所述轻链的可变区的氨基酸序列可如序列表的序列4所示。

本发明以α-溶血素为靶抗原，从噬菌体抗体库中快速地筛选出全人源抗α-溶血素的单克隆抗体。该单克隆抗体是一个全新的抗体，具有较高的亲和力和抑制α-溶血素的溶血活性，并能提高感染金黄色葡萄球菌小鼠的生存率。本发明提供的单克隆抗体对于金黄色葡萄球菌的防控具有重要的应用价值。

附图说明

图1为实施例1步骤1的实验结果。

图2为实施例1步骤2的实验结果。

图3为实施例2步骤二的实验结果。

图4为实施例3步骤一的实验结果。

图5为实施例3步骤二的实验结果。

图6为实施例3步骤三的实验结果。

图7为实施例3步骤四的实验结果。

图8为实施例3步骤五的实验结果。

图9为实施例3步骤六的实验结果。

图10为实施例4步骤一的实验结果。

图11为实施例4步骤二中1的实验结果。

图12为实施例4步骤二中2的实验结果。

图13为实施例4步骤三的实验结果。

图14为实施例4步骤四中1的实验结果。

图15为实施例4步骤四中2的实验结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、α溶血素(Hla蛋白)的制备及其功能研究

1、Hla蛋白的制备

(1)将载体pET28a的限制性内切酶BamHI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为序列表中序列5所示的DNA分子(编码Hla蛋白的基因)，得到重组质粒pET28a-Hla。

重组质粒pET28a-Hla中，序列表的序列5所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成融合基因，表达具有His-tag标签的Hla蛋白(即融合蛋白)。Hla蛋白的氨基酸序列如序列表中序列6所示。

(2)将重组质粒pET28a-Hla导入大肠杆菌BL21，得到重组菌，将该重组菌命名为E.coli BL21(pET28a-Hla)。

(3)取E.coli BL21(pET28a-Hla)单克隆，接种至5mL LB液体培养基(含c卡那霉素(Kana))，37℃、180rpm振荡培养过夜，得到培养菌液。

(4)取培养菌液，按体积比为1:100接种至LB液体培养基(含50μg/mL Kana)，37℃、180rpm振荡培养至OD_600nm值达到0.6，然后加入IPTG并使其浓度为0.05mmol/L，37℃、120rpm振荡培养6h，4℃、6000rpm离心15min，收集菌体沉淀。

(5)取菌体沉淀，加入结合缓冲液(含20mmol/LNa₃PO₄、0.5mol/LNaCl和20mmol/L咪唑的水溶液，调节pH值至7.4)重悬，超声破碎，然后4℃、6000rpm离心10min，收集上清液。

(6)将上清液经Ni²⁺亲和柱进行亲和纯化：先使用含20mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱，再使用含500mmol/L咪唑的洗脱液进行洗脱，并收集洗脱液。

将洗脱液进行SDS-PAGE。实验结果见图1。结果表明，洗脱液中含有高纯度的Hla蛋白，Hla蛋白的纯度在99％以上。

2、Hla蛋白溶血活性验证

(1)兔红细胞悬液的制备

将2mL新鲜兔血用PBS缓冲液反复洗涤3次(每次4℃、2000rpm离心10min)，然后加入PBS缓冲液，得到浓度为4％(v/v)的兔红细胞悬液。

(2)Hla蛋白溶液的制备

采用含1％(v/v)BSA的PBS缓冲液将Hla蛋白从4μg/mL开始进行对倍稀释(共设9个稀释梯度)，得到不同浓度的Hla蛋白溶液。

(3)Hla蛋白溶血活性验证

将1体积份的Hla蛋白溶液和1体积份的兔红细胞悬液混合，得到混合液；取混合液，37℃温育1h后低速离心；取上清，使用酶联仪测定其在波长为405nm的光密度值。以Hla蛋白在混合液中的浓度为横坐标，以在波长为405nm的光密度值为纵坐标，绘制曲线。

实验结果见图2。结果表明，Hla蛋白能够显著的裂解兔红细胞，并呈明显的剂量依赖关系。

实施例2、噬菌体抗体库筛选抗Hla单克隆抗体

一、抗Hla单克隆抗体的生物淘选

A、Hla组

1、第一轮亲和淘选

(1)用500μL浓度为10μg/mL的Hla蛋白溶液(向Hla蛋白中加入无菌的PBS缓冲液得到)包被免疫管，4℃过夜。

(2)取所述免疫管，加入4％(v/v)Milk-PBST缓冲液，室温封闭1h。

(3)取噬菌体抗体库，加入4％(v/v)Milk-PBST缓冲液，室温封闭1h。

(4)取完成步骤(2)的免疫管，先加入无菌的PBS缓冲液洗涤3次，然后加入完成步骤(3)的噬菌体抗体库(噬菌体投入量约为1.2×10¹²)，室温静置1h。

(5)完成步骤(4)后，取所述免疫管，先加入适量无菌的PBS缓冲液洗涤(目的为洗去未结合的噬菌体)，再加入500μL pH2.2、0.1M的HCl-Glycine洗脱phage-Abs，收集洗脱液并加入1.5M的Tris-HCl(pH8.8)调节pH值至7.4。

(6)将大肠杆菌TG1单克隆接种至LB液体培养基，37℃、180rpm振荡培养至对数生长期，得到培养菌液。

(7)将完成步骤(5)的500μL洗脱液和10mL步骤(6)得到的培养菌液混合，37℃静置30min(目的为感染)，然后4000rpm离心15min，收集菌体并均匀涂布于2YTAG平板上，37℃培养过夜。

(8)完成步骤(7)后，刮下2YTAG平板上的菌落，然后接种于2YTAG培养基中进行噬菌体展示，采用PEG/Nacl沉淀，得到噬菌体。该噬菌体即为经过一轮淘选后获得的噬菌体。

2、第二轮亲和淘选

将步骤1中(3)的“噬菌体抗体库”替换为步骤1中(8)获得的噬菌体，其它步骤均不变，得到噬菌体。该噬菌体即为经过二轮淘选后获得的噬菌体。

3、第三轮亲和淘选

将步骤1中(3)的“噬菌体抗体库”替换为步骤2获得的噬菌体，其它步骤均不变，得到噬菌体。该噬菌体即为经过三轮淘选后获得的噬菌体。

B、对照组

按照Hla组三轮亲和淘选的步骤，将浓度为10μg/mL的Hla蛋白溶液替换为PBS缓冲液，其它步骤均不变，得到相应的噬菌体(作为对照)。

各轮亲和淘选的噬菌体的数量见表1。结果表明，经过三轮淘选后，Hla组获得的重组噬菌体的数量明显呈增加趋势，而对照组中噬菌体的数量变化不大。这说明与Hla结合的噬菌体得到明显富集。

表1

二、抗Hla单克隆抗体阳性克隆的筛选

1、完成步骤一后，分别取Hla组三轮淘选后获得的176个克隆，接种于1mL 2YTAG培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，得到培养菌液。

2、取30μL培养菌液，接种至900μL 2YTAG培养基中，37℃、220rpm振荡培养至OD_600nm值达到0.6-0.8，然后加入5×10¹⁰的辅助噬菌体M13KO7，37℃静置30min。

3、完成步骤2后，4℃、1800rpm离心15min，收集沉淀并用1mL 2YTAK重悬，28℃、220rpm培养过夜。

4、完成步骤3后，phage-ELISA鉴定阳性克隆，并将阳性克隆进行测序。

实验结果见图3。结果显示，在176个克隆中有42个克隆的ELISA信号值显示阳性，阳性率为24％。选取ELISA信号值较高的16个克隆送测序，获得1个抗体序列，命名为AAH-1抗体。

AAH-1抗体的重链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列2所示，其编码基因如序列表的序列1所示。AAH-1抗体的轻链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列4所示，其编码基因如序列表的序列3所示。

实施例3、AAH-1抗体的功能鉴定

一、AAH-1抗体的制备

载体pCDNA3.1为Invitrogen公司的产品。

1、重组质粒的构建

将载体pCDNA3.1的限制性内切酶XhoI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为序列表中序列1所示的DNA分子，得到重链表达载体。

将载体pCDNA3.1的限制性内切酶XhoI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子，得到轻链表达载体。

2、重组细胞的构建

将重链表达载体和轻链表达载体共转染293T细胞，得到重组细胞。

3、抗体的制备

(1)取步骤2得到的重组细胞，在含2％胎牛血清的DMEM培养基培养72h，然后4℃、4000rpm离心30min，收集上清液。

(2)亲和层析

亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；

亲和层析的柱填料：protein A beads(Thermo公司的产品，产品目录号10006D)；

操作步骤：①将300mL步骤(1)得到的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育16h；②用60mL结合缓冲液洗涤柱子；③用30mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。

结合缓冲液：将甘氨酸112.6g和氯化钠175.2g溶于水并用水定容至1L，用氢氧化钠调节pH值至8.0。

洗脱缓冲液：取甘氨酸7.5g，溶于水并用水定容至500mL，用盐酸调pH至3.0。

(3)取步骤(2)得到的过柱后溶液，用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为pH7.2、10mM的PBS缓冲液，得到AAH-1抗体溶液。

实验结果见图4(M为蛋白Marker，非还原为未加入还原剂2-巯基乙醇，还原为加入1％还原剂2-巯基乙醇)。

二、梯度稀释ELISA检测AAH-1抗体的结合活性

1、取ELISA板，用包被液包被抗原(Hla蛋白)，抗原浓度为10μg/mL，4℃包被过夜。

2、完成步骤1后，取所述ELISA板，加入PBST缓冲液洗涤三次。

3、完成步骤2后，取所述ELISA板，加入4％(v/v)Milk-PBST缓冲液，37℃封闭1h。

4、采用PBS缓冲液将AAH-1抗体从10μg/mL开始进行三倍梯度稀释(共设9个稀释梯度)，得到不同浓度的AAH-1抗体溶液。

5、完成步骤3和4后，取所述ELISA板，加入PBS缓冲液(作为对照)或步骤4得到的不同浓度的AAH-1抗体溶液(每孔100μL)，37℃孵育1h。

6、完成步骤5后，取所述ELISA板，加入PBST缓冲液洗涤三次(每孔200μL)。

7、完成步骤6后，取所述ELISA板，加入HRP标记的山羊抗人IgG二抗稀释液(将HRP标记的山羊抗人IgG二抗按1:40000稀释于4％(v/v)Milk-PBST缓冲液中得到)，37℃孵育1h。

8、完成步骤7后，取所述ELISA板，加入显色试剂(每孔100μL)，室温显色5min。显色试剂为TMB显色试剂盒中的组件。

9、完成步骤8后，取所述ELISA板，加入10％(v/v)H₂SO₄水溶液终止显色(每孔50μL)，然后检测在450nm波长下OD值。

实验结果见图5。结果表明，AAH-1抗体可以与Hla蛋白结合，且结合活性较高，其半数有效浓度EC50值为75ng/mL。

三、BIAcore测定AAH-1抗体的亲和力

采用捕获法测定抗体的亲和力，具体步骤如下：将抗人F_C段的抗体偶联至芯片CM5的表面上，稀释AAH-1抗体至0.5ug/mL，保证约100RU抗体被抗人Fc的抗体捕获。将Hla蛋白设置一系列的浓度梯度(浓度分别为33nM、13.2nM、5.3nM、2.1nM和0.85nM)流经固定相表面，测定抗体的亲和力。

实验结果图6和表2。结果表明，AAH-1抗体的亲和力为1.922nM。

表2

	Kon(1/MS)	Koff(1/S)	KD
				AAH-1	1.328E+5	2.552E-4	1.922E-9

四、AAH-1抗体抑制Hla蛋白溶血活性检测

(1)将2mL新鲜兔血用PBS缓冲液反复洗涤3次(每次4℃、2000rpm离心10min)，然后加入PBS缓冲液，得到浓度为4％(v/v)的兔红细胞悬液。

(2)采用含1％(v/v)BSA的PBS缓冲液将AAH-1抗体从0.12μg/m L开始进行对倍稀释(共设8个稀释梯度)，得到不同浓度的AAH-1抗体溶液。

(3)完成步骤(2)后，将1体积份不同浓度的AAH-1抗体溶液和1体积份浓度为0.06μg/mL的Hla蛋白溶液(含1％(v/v)BSA的PBS缓冲液稀释Hla蛋白得到)，37℃孵育30min；然后加入1体积份步骤(1)制备的兔红细胞悬液，37℃孵育1h后低速离心；取上清，使用酶联仪测定其在波长为405nm的光密度值。

实验结果见图7。结果表明，AAH-1抗体可以有效的抑制Hla蛋白对兔红细胞的溶血活性，且有剂量依赖关系。当AAH-1抗体和Hla蛋白的摩尔浓度比为1:1时，AAH-1抗体能够完全抑制Hla蛋白介导的兔红细胞溶血。

五、小鼠败血症模型验证AAH-1抗体的功能

Balb/c雌鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。

将16只8周大小的Balb/c雌鼠随机分成两组(每组8只)。一组注射AAH-1抗体(100μg/只)，另一组注射等体积的PBS缓冲液，作为阴性对照。

具体步骤如下：

(1)用1％戊巴比妥钠麻醉小鼠(腹腔注射，200μL/只)。

(2)AAH-1抗体用无菌PBS缓冲液稀释至浓度为0.5mg/mL，攻毒前4h腹腔注射。

(3)先无菌PBS缓冲液清洗过夜培养的Newman菌(洗涤一次)，再用无菌PBS缓冲液将Newman菌的OD_600nm调整为0.25，最后通过球后静脉丛注射老鼠体内(注射剂量为2.5×10⁸cfu/只)，观察老鼠死亡情况。

实验结果见图8。结果表明，AAH-1给药组小鼠生存率为85.7％，PBS组小鼠生存率为28.5％。因此，AAH-1抗体可以有效的提高败血症小鼠的生存率。

六、小鼠腹膜炎模型验证AAH-1抗体功能

CD1雌鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。

将16只8周大小的CD1雌鼠随机分成两组(每组8只)。一组注射AAH-1抗体(100μg/只)，另一组注射等体积的PBS缓冲液，作为阴性对照。

具体步骤如下：

(1)AAH-1抗体用无菌PBS缓冲液稀释至浓度为0.5mg/mL，攻毒前2h腹腔注射。

(2)先无菌PBS缓冲液清洗过夜培养的8325-4菌(洗涤一次)，再用无菌PBS缓冲液将8325-4菌的OD_600nm调整为0.38，最后通过腹腔注射老鼠体内(注射剂量为3.8×10⁸cfu/只)，观察老鼠死亡情况。

实验结果见图9。结果表明，AAH-1给药组小鼠生存率为87.5％，PBS组小鼠生存率为50％。因此，AAH-1抗体可以有效的提高腹膜炎小鼠的生存率。

实施例4、AAH-1抗体与Hla蛋白结合表位研究

通过计算机建模技术模拟AAH-1抗体与Hla蛋白的结合方式，分析AAH-1抗体与Hla蛋白的结合位点，共预测了AAH-1抗体与Hla蛋白结合的三个关键区域，分别为：Hla28-33(YDKENG)、Hla64-71(QYRVYSEE)和Hla205-212(KAADNFLD)。将这三个关键区域的氨基酸用Ala代替，构建三个Hla突变体，依次命名为Hlam1蛋白、Hlam2蛋白和Hlam3蛋白。

一、Hlam1蛋白、Hlam2蛋白和Hlam3蛋白的表达

按照实施例1步骤1中(2)-(6)的方法，将重组质粒pET28a-Hla替换为重组质粒pET28a-Hlam1，其它步骤均不变，得到洗脱液m1。重组质粒pET28a-Hlam1为将pET28a载体的限制性内切酶XhoI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为编码Hlam1蛋白的基因(采用Overlap PCR法扩增得到)，得到重组质粒。

按照实施例1步骤1中(2)-(6)的方法，将重组质粒pET28a-Hla替换为重组质粒pET28a-Hlam2，其它步骤均不变，得到洗脱液m2。重组质粒pET28a-Hlam2为将pET28a载体的限制性内切酶XhoI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为编码Hlam2蛋白的基因(采用Overlap PCR法扩增得到)，得到重组质粒。

按照实施例1步骤1中(2)-(6)的方法，将重组质粒pET28a-Hla替换为重组质粒pET28a-Hlam3，其它步骤均不变，得到洗脱液m3。重组质粒pET28a-Hlam3为将pET28a载体的限制性内切酶XhoI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为编码Hlam3蛋白的基因(采用Overlap PCR法扩增得到)，得到重组质粒。

将实施例1步骤1中得到的洗脱液、洗脱液m1、洗脱液m2和洗脱液m3进行SDS-PAGE。

实验结果见图10(Marker为蛋白Marker，Hla为洗脱液，Hlam1为洗脱液m1，Hlam2为洗脱液m2，Hlam3为洗脱液m3)。结果表明，洗脱液中含有高纯度的Hla蛋白，洗脱液m1中含有高纯度的Hlam1蛋白，洗脱液m2中含有高纯度的Hlam2蛋白，洗脱液m3中含有高纯度的Hlam3蛋白。

二、Hlam1蛋白、Hlam2蛋白和Hlam3蛋白与AAH-1抗体结合能力检测和溶血活性检测

1、Hlam1蛋白、Hlam2蛋白和Hlam3蛋白与AAH-1抗体结合能力检测

按照实施例3步骤二的步骤，将Hla蛋白替换为Hlam1蛋白、Hlam2蛋白或Hlam3蛋白，其它步骤均不变。

实验结果见图11。结果表明，与Hla蛋白与AAH-1抗体结合能力相比，Hla突变体与AAH-1抗体结合能力明显下降，其中Hlam1蛋白下降6.5倍，Hlam2蛋白下降4.9倍，Hlam3蛋白下降24.5倍。

2、AAH-1抗体抑制Hla突变体溶血活性检测

按照实施例3步骤四的步骤，将Hla蛋白替换为Hlam1蛋白、Hlam2蛋白或Hlam3蛋白，其它步骤均不变。

实验结果见图12。结果表明，与AAH-1抗体抑制Hla蛋白对兔红细胞的溶血活性相比，AAH-1抗体抑制Hla突变体的溶血活性明显下降，其中Hlam1蛋白溶血活性降低3.7倍，Hlam2蛋白和Hlam3蛋白溶血活性丧失。

三、Hlam3-3蛋白、Hlam3-4蛋白和Hlam3-34蛋白的表达

经过计算机模建分析发现，Hlam3蛋白中，209位的Asn和210位的Phe在Hla蛋白与AAH-1抗体的结合过程中发挥关键作用。将这两个关键区域的氨基酸分别和同时用Ala代替，构建三个Hla突变体，依次命名为Hlam3-3蛋白、Hlam3-4蛋白和Hlam3-34蛋白。

按照实施例1步骤1中(2)-(6)的方法，将重组质粒pET28a-Hla替换为重组质粒pET28a-Hlam3-3，其它步骤均不变，得到洗脱液m3-3。重组质粒pET28a-Hlam3-3为将pET28a载体的限制性内切酶XhoI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为编码Hlam3-3蛋白的基因(采用Overlap PCR法扩增得到)，得到重组质粒。

按照实施例1步骤1中(2)-(6)的方法，将重组质粒pET28a-Hla替换为重组质粒pET28a-Hlam3-4，其它步骤均不变，得到洗脱液m3-4。重组质粒pET28a-Hlam3-4为将pET28a载体的限制性内切酶XhoI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为编码Hlam3-4蛋白的基因(采用Overlap PCR法扩增得到)，得到重组质粒。

按照实施例1步骤1中(2)-(6)的方法，将重组质粒pET28a-Hla替换为重组质粒pET28a-Hlam3-34，其它步骤均不变，得到洗脱液m3-34。重组质粒pET28a-Hlam3-34为将pET28a载体的限制性内切酶XhoI和HindⅢ识别序列间的小片段替换为编码Hlam3-34蛋白的基因(采用Overlap PCR法扩增得到)，得到重组质粒。

将实施例1步骤1中得到的洗脱液、洗脱液m3-3、洗脱液m3-4和洗脱液m3-34进行SDS-PAGE。

实验结果见图13(Marker为蛋白Marker，Hlam3-3为洗脱液m3-3，Hlam3-4为洗脱液m3-4，Hlam3-34为洗脱液m3-34)。结果表明，洗脱液中含有高纯度的Hla蛋白，洗脱液m3-3中含有高纯度的Hlam3-3蛋白，洗脱液m3-4中含有高纯度的Hlam3-4蛋白，洗脱液m3-34中含有高纯度的Hlam3-34蛋白。

四、Hlam3-3蛋白、Hlam3-4蛋白和Hlam3-34蛋白与AAH-1抗体结合能力检测和溶血活性检测

1、Hlam3-3蛋白、Hlam3-4蛋白和Hlam3-34蛋白与AAH-1抗体结合能力检测

按照实施例3步骤二的步骤，将Hla蛋白替换为Hlam3-3蛋白、Hlam3-4蛋白或Hlam3-34蛋白，其它步骤均不变。

实验结果见图14。结果表明，与Hla蛋白与AAH-1抗体结合能力相比，Hla突变体与AAH-1抗体结合能力明显下降，其中Hlam3-3蛋白下降2.5倍，Hlam3-4蛋白下降14.2倍，Hlam3-34蛋白下降22.8倍。

2、AAH-1抗体抑制Hla突变体溶血活性检测

按照实施例3步骤四的步骤，将Hla蛋白替换为Hlam3-3蛋白、Hlam3-4蛋白或Hlam3-34蛋白，其它步骤均不变。

实验结果见图15。结果表明，与AAH-1抗体抑制Hla蛋白对兔红细胞的溶血活性相比，AAH-1抗体抑制Hla突变体的溶血活性明显下降，其中Hlam3-3蛋白溶血活性降低7.7倍，Hlam3-4蛋白溶血活性降低9.9倍，Hlam3-34蛋白溶血活性丧失。

上述结果表明，Hla28-33(YDKENG)、Hla64-71(QYRVYSEE)和Hla205-212(KAADNFLD)是Hla蛋白与AAH-1抗体发挥作用的关键区域，其中在Hla205-212(KAADNFLD)处，第209位的Asn和第210位的Phe是发挥与AAH-1抗体结合的关键性位点。

<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120> 一种抗金黄色葡萄球菌α溶血素单克隆抗体及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag ataaggaggc ctgggtcctt ggtgaaggtc 60

tcctgccagg cttccggagg ctcgttcaaa aactttgctt taaactgggt gcggcaggcc 120

cctggactgg ggcttcagtg gatgggaagc atcacccctt tcctgaatgt gccaacctac 180

gcacagcagt ttcagggtag agtcaccatg agtacagaca catccacgag cacagcctac 240

atggtgctga ggagactgac atcggacgac acagccgtgt attactgcgc gcgagggaac 300

tccctcctcg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctca 348

<210> 2

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Ile Arg Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Leu Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Ser Phe Lys Asn Phe

20 25 30

Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Leu Gly Leu Gln Trp Met

35 40 45

Gly Ser Ile Thr Pro Phe Leu Asn Val Pro Thr Tyr Ala Gln Gln Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Val Leu Arg Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asn Ser Leu Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gaaattgtgc tgactcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga tggagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagt ggcaacttag cctggtacca gaagaaacct 120

ggccaggctc ccaggctcct catttatgac acatccatcc gggccgctgg tgtcccgccc 180

aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240

gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag tatcataatt tgcctcccct cactttcggc 300

cctgggacca aactcgagat caaa 324

<210> 4

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Asp Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Gly Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Thr Ser Ile Arg Ala Ala Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Asn Leu Pro Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 882

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

gcagattctg atattaatat taaaaccggt actacagata ttggaagcaa tactacagta 60

aaaacaggtg atttagtcac ttatgataaa gaaaatggca tgcacaaaaa agtattttat 120

agttttatcg atgataaaaa tcataataaa aaactgctag ttattagaac gaaaggtacc 180

attgctggtc aatatagagt ttatagcgaa gaaggtgcta acaaaagtgg tttagcctgg 240

ccttcagcct ttaaggtaca gttgcaacta cctgataatg aagtagctca aatatctgat 300

tactatccaa gaaattcgat tgatacaaaa gagtatatga gtactttaac ttatggattc 360

aacggtaatg ttactggtga tgatacagga aaaattggcg gccttattgg tgcaaatgtt 420

tcgattggtc atacactgaa atatgttcaa cctgatttca aaacaatttt agagagccca 480

actgataaaa aagtaggctg gaaagtgata tttaacaata tggtgaatca aaattgggga 540

ccatatgata gagattcttg gaacccggta tatggcaatc aacttttcat gaaaactaga 600

aatggctcta tgaaagcagc agataacttc cttgatccta acaaagcaag ttctctatta 660

tcttcagggt tttcaccaga cttcgctaca gttattacta tggatagaaa agcatccaaa 720

caacaaacaa atatagatgt aatatacgaa cgagttcgtg atgactacca attgcactgg 780

acttcaacaa attggaaagg taccaatact aaagataaat ggatagatcg ttcttcagaa 840

agatataaaa tcgattggga aaaagaagaa atgacaaatt aa 882

<210> 6

<211> 293

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

Ala Asp Ser Asp Ile Asn Ile Lys Thr Gly Thr Thr Asp Ile Gly Ser

1 5 10 15

Asn Thr Thr Val Lys Thr Gly Asp Leu Val Thr Tyr Asp Lys Glu Asn

20 25 30

Gly Met His Lys Lys Val Phe Tyr Ser Phe Ile Asp Asp Lys Asn His

35 40 45

Asn Lys Lys Leu Leu Val Ile Arg Thr Lys Gly Thr Ile Ala Gly Gln

50 55 60

Tyr Arg Val Tyr Ser Glu Glu Gly Ala Asn Lys Ser Gly Leu Ala Trp

65 70 75 80

Pro Ser Ala Phe Lys Val Gln Leu Gln Leu Pro Asp Asn Glu Val Ala

85 90 95

Gln Ile Ser Asp Tyr Tyr Pro Arg Asn Ser Ile Asp Thr Lys Glu Tyr

100 105 110

Met Ser Thr Leu Thr Tyr Gly Phe Asn Gly Asn Val Thr Gly Asp Asp

115 120 125

Thr Gly Lys Ile Gly Gly Leu Ile Gly Ala Asn Val Ser Ile Gly His

130 135 140

Thr Leu Lys Tyr Val Gln Pro Asp Phe Lys Thr Ile Leu Glu Ser Pro

145 150 155 160

Thr Asp Lys Lys Val Gly Trp Lys Val Ile Phe Asn Asn Met Val Asn

165 170 175

Gln Asn Trp Gly Pro Tyr Asp Arg Asp Ser Trp Asn Pro Val Tyr Gly

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Met Lys Thr Arg Asn Gly Ser Met Lys Ala Ala Asp

195 200 205

Asn Phe Leu Asp Pro Asn Lys Ala Ser Ser Leu Leu Ser Ser Gly Phe

210 215 220

Ser Pro Asp Phe Ala Thr Val Ile Thr Met Asp Arg Lys Ala Ser Lys

225 230 235 240

Gln Gln Thr Asn Ile Asp Val Ile Tyr Glu Arg Val Arg Asp Asp Tyr

245 250 255

Gln Leu His Trp Thr Ser Thr Asn Trp Lys Gly Thr Asn Thr Lys Asp

260 265 270

Lys Trp Ile Asp Arg Ser Ser Glu Arg Tyr Lys Ile Asp Trp Glu Lys

275 280 285

Glu Glu Met Thr Asn

290

Claims

1.一种IgG抗体，由重链和轻链组成；所述重链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列2所示；所述轻链的可变区的氨基酸序列如序列表的序列4所示。

2.编码权利要求1所述IgG抗体的核酸分子。

3.权利要求1所述IgG抗体或权利要求2所述核酸分子在制备用于抑制金黄色葡萄球菌的药物中的应用。

4.权利要求1所述IgG抗体或权利要求2所述核酸分子在制备用于中和金黄色葡萄球菌分泌的外毒素的药物中的应用。

5.一种用于抑制金黄色葡萄球菌的药物，其含有权利要求1所述IgG抗体。

6.一种用于中和金黄色葡萄球菌分泌的外毒素的药物，其含有权利要求1所述IgG抗体。

7.如权利要求4所述的应用，或，权利要求6所述的药物，其特征在于：所述外毒素为α溶血素。

8.权利要求1所述IgG抗体或权利要求2所述核酸分子在制备用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物中的应用。

9.一种用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物，其含有权利要求1所述IgG抗体。

10.如权利要求8所述的应用，或，权利要求9所述的药物，其特征在于：所述疾病为败血症和/或腹膜炎。