CN116789814B - 一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用 - Google Patents

一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合金黄色葡萄球菌α‑溶血素的抗体及其应用，所述Hla‑20包含如SEQ ID NO.1、2、3所示氨基酸序列的重链可变区的H‑CDR1、H‑CDR2、H‑CDR3；以及如SEQ ID NO.5、6、7所示氨基酸序列的轻链可变区的L‑CDR1、L‑CDR2、L‑CDR3。本发明同时公开了编码所述Hla‑20的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体、宿主细胞、衍生物、药物组合物、免疫原性组合物。本发明同时公开了一种生成金黄色葡萄球菌α‑溶血素抗体Hla‑20的方法及其在制备诊断或治疗金黄色葡萄球菌α‑溶血素感染的产品中的应用。经实验证实Hla‑20能够抑制金黄色葡萄球菌溶血素的感染，在治疗金黄色葡萄球菌感染引起的疾病中具有良好的应用前景。

Description

一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用
技术领域
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)是引起医院感染和社区感染的一种重要致病菌。感染以急性、化脓性为特征，局部可引起皮肤和软组织等的化脓性感染，经久不愈；全身可导致急性肺炎、脓毒血症、心内膜炎、脓毒性关节炎、骨髓炎等严重感染及并发症，死亡率高达20％。同时，SA的外毒素还可引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征和中毒性休克综合征等全身致死性感染。随着抗生素长期、广泛地使用，细菌耐药性问题日益突出，作为典型代表的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meticillin-resistant Staphylococcusaureus,MRSA)自1961年被首次发现至今已成为全球重症监护病房、术后感染、烧伤、战创伤等感染率最高的院内感染病原菌之一。万古霉素作为MRSA感染治疗的最后手段，形势严峻，随着使用量的增加，现已出现了万古霉素中间耐药金葡菌(VISA)和万古霉素耐药金葡菌(VRSA)菌株。
感染性疾病的严重程度与金黄色葡萄球菌表达的毒力因子有关，包括α-溶血素(Hla)、杀白细胞素(PVL)、免疫逃避表面因子(荚膜和蛋白A)以及促进组织侵袭的酶(透明质酸酶)等。这些毒力因子的致病机制可分为三类：膜损伤机制，α-溶血素可通过受体介导或δ-溶血素受体非依赖性方式破坏宿主细胞膜；干扰受体功能但不破坏细胞膜的肠毒素；分泌酶，降解宿主分子或影响宿主防御机制。特别是Hla，它是金黄色葡萄球菌致病性较强的毒素之一，也是第一个发现形成β-桶状毒素的典型。
基于金黄色葡萄球菌α-溶血素的免疫制剂在动物模型中的主动免疫和被动免疫均显示出保护作用，Hla已成为预防金葡菌感染疾病的疫苗靶标。已经报道的针对Hla毒素的免疫制品主要有Hla无毒突变体疫苗，Hla表位疫苗，抗Hla单克隆抗体等。国内外已有多个SA治疗性抗体开展了或正在开展临床试验，但所针对的SA毒力因子和靶点单一，还未有治疗性单抗成功上市。因此，发展具有高特异性、低毒副作用、优良临床药效的抗Hla抗体是迫切而必要的，这将给癌症、感染等疾病患者提供更多的用药选择。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体及其在制备诊断或治疗金黄色葡萄球菌α-溶血素感染的产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；所述H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO.7所示的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3；所述L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3的氨基酸序列为如SEQ ID NO.8所示的轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3。
进一步，所述CDR是以Kabat、Chothia、Abm、Contact、IMGT中的任意一种或多种定义方案定义的。
进一步，所述CDR是以IMGT定义方案定义的。
进一步，所述H-CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步，所述H-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述H-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步，所述L-CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步，所述L-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步，所述L-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述抗原结合片段包含Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体或单链抗体。
进一步，所述抗原结合片段为Fab。
进一步，所述抗体或其抗原结合片段包含重链恒定区和/或轻链恒定区。
进一步，所述重链恒定区包含IgG、IgA和IgM恒定区中的任意一种或多种。
进一步，所述轻链恒定区包含IgGκ和IgGλ轻链恒定区中的任意一种或多种。
进一步，所述抗体包含单克隆抗体或嵌合抗体。
进一步，所述抗体为单克隆抗体。
进一步，所述抗体为全人源抗体。
进一步，所述金黄色葡萄球菌包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌、万古霉素中间耐药金葡菌或万古霉素耐药金葡菌。
进一步，所述金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
进一步，编码H-CDR1的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.9所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
进一步，所述编码H-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步，编码H-CDR2的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.10所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
进一步，所述编码H-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步，编码H-CDR3的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.11所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
进一步，所述编码H-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步，编码L-CDR1的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.12所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
进一步，所述编码L-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
进一步，编码L-CDR2的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.13所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
进一步，所述编码L-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步，编码L-CDR3的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.14所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
进一步，所述编码L-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步，编码重链可变区的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.15所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
进一步，所述编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
进一步，编码轻链可变区的核苷酸序列包含与SEQ ID NO.16所示序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性。
进一步，所述编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明的第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体包含本发明的第二方面所述的核酸分子。
进一步，所述表达载体包含DNA载体、RNA载体、质粒或病毒载体。
进一步，所述表达载体为质粒。
进一步，所述质粒包含pGP、pEF、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pSVK3、pMSG、pSVL或pcDNA3.4。
进一步，所述质粒为pcDNA3.4。
本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述重组宿主细胞包含本发明的第二方面所述的核酸分子或本发明的第三方面所述的表达载体。
进一步，所述宿主细胞包含原核生物细胞、真核生物细胞。
进一步，所述宿主细胞为真核生物细胞。
进一步，所述真核生物细胞包含哺乳动物细胞。
进一步，所述哺乳动物细胞包含CHO细胞、NS0细胞、HEK 293细胞、HEK 293T细胞、HEK 293E细胞、HEK 293-6E细胞、HEK 293F细胞和/或per.C6细胞。
进一步，所述哺乳动物细胞为HEK 293F细胞。
本发明的第五方面提供了一种衍生物，所述衍生物包含可检测标记的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和/或本发明的第二方面所述的核酸分子、赋予抗生素抗性的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和/或本发明的第二方面所述的核酸分子、与治疗剂结合或偶联的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和/或本发明的第二方面所述的核酸分子。
进一步，所述可检测标记包含荧光染料、胶体金、化学发光标记物、化学发光催化剂。
进一步，所述抗生素抗性的基因包含青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。
进一步，所述治疗剂包含放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂。
本发明的第六方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的表达载体、本发明的第四方面所述的宿主细胞或本发明的第五方面所述的衍生物。
进一步，所述药物组合物具有抑制生物学细胞的溶解、抑制与金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的肿瘤细胞的溶解、抵抗金黄色葡萄球菌感染。
进一步，所述生物学细胞包含红细胞、中性粒细胞、上皮细胞、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。
进一步，所述生物学细胞为红细胞。
进一步，所述肿瘤细胞包含前列腺癌、膀胱癌、肝癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌或肺癌细胞。
进一步，所述肿瘤细胞为肺癌细胞。
进一步，所述肺癌细胞包含A549、NCI-H460、HCC827或H1299细胞。
进一步，所述肺癌细胞为A549细胞。
进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明的第七方面一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述免疫原性组合物还包含免疫原。
进一步，所述抗体或其抗原结合片段用作佐剂。
进一步，所述抗体或其抗原结合片段与所述免疫原作为分离的组分或作为同一组合物的组分提供。
本发明的第八方面提供了一种检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品，所述产品包含本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和/或本发明的第五方面所述的衍生物。
本发明的第九方面提供了如下任一项方法：
(1)一种非诊断目的的检测样本中金黄色葡萄球菌α-溶血素的方法，所述方法包含将所述样本与本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段接触。
进一步，所述方法(1)还包含检测金黄色葡萄球菌α-溶血素与抗体或其抗原结合片段的免疫反应。
(2)一种制备本发明的第四方面所述的宿主细胞的方法，所述方法包含将本发明的第二方面所述的核酸分子或本发明的第三方面所述的表达载体引入细胞中。
进一步，所述表达载体在引入细胞前转化为DH5α感受态细菌。
进一步，所述引入的方法包括使用转染试剂。
进一步，所述转染试剂包括Lipofectamine2000、Lipofectamine3000或PEI。
进一步，所述转染试剂为PEI。
(3)一种生成本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包含培养本发明的第四方面所述的宿主细胞，从培养物中分离出所述抗体或其抗原结合片段。
(4)一种特异性地抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素活性的方法，所述方法包含使用本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素的活性或将本发明的第二方面所述的核酸分子引入到生物体细胞中，通过表达本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素的活性。
本发明的第十方面提供了如下任一项应用：
(1)本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的表达载体、本发明的第四方面所述的宿主细胞、本发明的第五方面所述的衍生物或本发明的第六方面所述的药物组合物在制备诊断或治疗金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病的产品中的应用。
(2)本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段在制备本发明的第二方面所述的核酸分子、本发明的第三方面所述的表达载体、本发明的第四方面所述的宿主细胞、本发明的第五方面所述的衍生物、本发明的第六方面所述的药物组合物、本发明的第七方面所述的免疫原性组合物或本发明的第八方面所述的检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品中的应用。
(3)本发明的第二方面所述的核酸分子在制备本发明的第三方面所述的表达载体、本发明的第四方面所述的宿主细胞、本发明的第五方面所述的衍生物或本发明的第六方面所述的药物组合物中的应用。
(4)本发明的第三方面所述的表达载体在制备本发明的第四方面所述的宿主细胞、本发明的第五方面所述的衍生物或本发明的第六方面所述的药物组合物中的应用。
(5)本发明的第四方面所述的宿主细胞在制备本发明的第五方面所述的衍生物或本发明的第六方面所述的药物组合物中的应用。
(6)本发明的第五方面所述的衍生物在制备本发明的第六方面所述的药物组合物或本发明的第八方面所述的检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品中的应用。
进一步，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病包括肺炎、全身感染、皮肤脓肿、心肌内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合症或败血症。
进一步，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病为肺炎、全身感染。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体(被命名为Hla-20)能特异性结合野生型金黄色葡萄球菌α-溶血素和突变型金黄色葡萄球菌a-溶血素，较常规单克隆抗体用途更广，特异性更强。且Hla-20抗体在感染期间抑制金黄色葡萄球菌溶血素的感染；Hla-20还能够抵抗MRSA的全身性侵袭、抵抗MRSA对肺炎的侵袭，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是SDS-PAGE检测wtHla和mHla蛋白的结果图；
图2是Fab文库筛选结果图，其中2A为Kappa轻链文库筛选结果图，2B为Lambda轻链文库筛选结果图；
图3是SDS-PAGE检测Hla-20抗体表达及纯化结果图；
图4是Hla-20抗体和mHla、wtHla的结合活性检测结果图，其中4A为Hla-20抗体和wtHla的结合活性结果图，4B为Hla-20抗体和mHla的结合活性结果图；
图5是WB检测Hla-20抗体的结果图；
图6是Hla-20中和wtHla裂解兔红细胞结果图，其中6A为兔红细胞悬液终浓度筛选结果图，6B为wtHla的最佳溶血浓度筛选结果图，6C为中和活性检测实验结果图；
图7是Hla-20抗体中和wtHla杀伤A549细胞结果图，其中7A为最佳孵育时间筛选结果图，7B为wtHla蛋白浓度筛选结果图，7C为中和活性检测实验结果图；
图8为Hla-20抗体中和wtHla体内保护效果结果图，其中8A为wtHla剂量摸索实验结果图，8B为Hla-20中和保护率测定结果图；
图9是MRSA全身感染模型的建立及保护性结果图，其中9A为MRSA全身感染模型感染剂量摸索实验结果图，9B为MRSA全身感染模型生存率分析实验结果图；
图10是MRSA肺炎感染模型的建立及保护性结果图，其中10A为MRSA肺炎模型感染剂量摸索实验结果图，10B为MRSA肺炎模型生存率分析实验结果图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本发明中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明通过广泛而深入的研究，筛选并制备了一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体Hla-20，通过结合活性检测实验发现Hla-20能与mHla和wtHla结合；通过Hla-20抗体对a-溶血素溶血活性及a-溶血素裂解A549细胞的中和作用实验发现Hla-20不仅能够抑制a-溶血素对红细胞的损害作用，还能够抑制wtHla介导的人A549细胞的溶解；通过构建MRSA全身感染模型实验发现Hla-20治疗能够抵抗MRSA的全身性侵袭；通过构建MRSA肺炎模型实验发现Hla-20能抵抗MRSA对肺部的侵袭。
在本发明中，术语“α-溶血素”、“Hla”、“α毒素”或“AT”可互换使用，是指细菌α毒素多肽，其包括但不限于天然α毒素多肽和α毒素多肽的同工型。术语“α毒素”涵盖未经处理的全长α毒素多肽以及由细胞内处理产生的α毒素多肽形式。如本文所用，术语“金黄色葡萄球菌α-溶血素”是指包含野生型金黄色葡萄球菌a-溶血素(wtHla)氨基酸序列的多肽和突变型金黄色葡萄球菌a-溶血素(mHla)氨基酸序列的多肽，所述mHla为金黄色葡萄球菌α毒素H35L突变体。
在本发明中，术语“抗体”意指经由免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点，识别并特异性结合于目标，如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、聚核苷酸、脂质或上述的组合的免疫球蛋白分子。如本文所用，只要抗体呈现所需生物活性，则术语“抗体”涵盖完整单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、包含抗体的融合蛋白和任何其它经修饰的免疫球蛋白分子。在本发明的具体实施例中，所述抗体为单克隆抗体。抗体可基于其重链恒定结构域(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的一致性而具有任何五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其子类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。免疫球蛋白的不同类别具有不同并且熟知的次单元结构和三维构型。抗体可为裸抗体或与如毒素、放射性同位素等其它分子结合。
在本发明中，术语“单克隆抗体”是指由B细胞的单一克隆产生并结合于相同的表位的抗体。术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”或“抗原结合区”可互换使用，是指结合于抗原的完整抗体的一部分。抗原结合片段可含有完整抗体的抗原决定区(例如互补决定区(CDR))。抗原结合片段包括但不限于所述单克隆抗体的Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、线性抗体和单链抗体。抗体的抗原结合片段可源于任何动物物种，如啮齿动物(例如小鼠、大鼠或仓鼠)和人类或可人工产生。
完整抗体通常由四个多肽组成：重(H)链多肽的两个一致拷贝和轻(L)链多肽的两个一致拷贝。重链中的每一个含有一个N端可变(VH)区和三个C端恒定(CHI、CH2和CH3)区，并且每一轻链含有一个N端可变(VL(Kappa、Lambda))区和一个C端恒定(CL)区。每对轻链和重链的可变区形成抗体的抗原结合位点。VH区和VL区具有相同通式结构，其中每一区包含四个框架区，其序列相对保守。如本发明所用，术语“框架区”是指位于高变区或互补决定区(CDR)之间的可变区内相对保守的氨基酸序列。在每一可变结构域中存在四个框架区，称为FR1、FR2、FR3和FR4。框架区形成提供可变区的结构框架的β片(参见例如C.A.詹韦(C.A.Janeway)等人(编),免疫学(Immunobiology),第5版,加兰德出版公司(GarlandPublishing),纽约,NY(2001))。称为CDR1、CDR2和CDR3的三个CDR形成抗体的“高变区”，其负责抗原结合。
在本发明中，术语“VL”和“VL结构域”可互换地用于指抗体的轻链可变区。术语“VH”和“VH结构域”可互换地用于指抗体的重链可变区。
在本发明中，CDR在本领域以多种方式定义，包括但不限于Kabat、Chothia、Abm、Contact和IMGT。本发明所使用的IMGT定义来自于IMGT(国际ImMunoGeneTics网址imgt.org，建立者和主管：Marie-Paule Lefranc，Montpellier，France，参见，例如，Lefranc，M.-P.，1999，The Immunologist，7:132-136和Lefranc，M.-P.等，1999，NucleicRes.，27:209-212，其均在此全文引入作为参考)。对于IMGT编号系统，(i)H-CDR1通常位于重链氨基酸位点26-33，(ii)H-CDR2通常位于重链氨基酸位点51-58，(iii)H-CDR3通常位于重链氨基酸位点97-111。对于IMGT编号系统，(i)K-CDR1通常位于轻链氨基酸位点27-32，(ii)K-CDR2通常位于轻链氨基酸位点50-52，(iii)K-CDR3通常位于轻链氨基酸位点89-97。
在本发明中，术语“恒定区”或“恒定结构域”为可互换的并具有其在所属领域中的共同含义。恒定区为抗体部分，例如不与抗体与抗原的结合直接相关但可展现各种效应功能(如与Fc受体的相互作用)的轻和/或重链的羧基端部分。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区的氨基酸序列一般较保守。
在本发明中，术语“重链”当在关于抗体使用时，基于恒定结构域的氨基酸序列，可指任何不同类型，例如阿尔法(alpha，α)、德耳塔(delta，δ)、伊普西隆(epsilon，ε)、伽玛(gamma，γ)和米欧(mu，μ)，其分别产生抗体的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类别，包括IgG的子类，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链氨基酸序列为所属领域中熟知的。
在本发明中，术语“轻链”当在关于抗体使用时，基于恒定结构域的氨基酸序列，可指任何不同类型，例如卡帕(kappa，κ)或拉姆达(lambda，λ)。轻链氨基酸序列为所属领域中熟知的。
在本发明中，术语“特异性结合”指示抗体或其抗原结合片段经由其抗原结合结构域结合于表位，并且所述结合需要抗原结合结构域与表位之间的一些互补性。因此，举例来说，如通过例如放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)、酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、BiaCore或octet结合分析所测量，“特异性结合”如本发明中所述的金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体也可结合于其它金黄色葡萄球菌α-溶血素，但与无关的非α-溶血素蛋白质的结合程度小于抗体与本发明中所述的金黄色葡萄球菌白细胞毒素的结合的约10％。
本发明还提供一种分离的核酸分子，其编码结合于α-溶血素的抗体或其抗原结合片段(抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或片段)。在本发明中，术语“核酸分子”意图涵盖DNA或RNA的聚合物，即聚核苷酸，其可为单链或双链的并且可含有非天然或改变的核苷酸。如本文所用，术语“核酸”和“聚核苷酸”是指任何长度的核苷酸，核糖核苷酸(RNA)或去氧核糖核苷酸(DNA)的聚合形式。这些术语是指分子的一级结构，并且因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。所述术语包括由核苷酸类似物和经修饰的聚核苷酸(如但不限于甲基化和/或封端聚核苷酸)制成的RNA或DNA类似物作为等效物。尽管所属领域中已知许多其它键(例如硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯等)，但核酸通常经由磷酸酯键连接以形成核酸序列或聚核苷酸。
在本发明中，术语“同一性”表示至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，特别是至少90％，进一步更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以及最优选更高％在核苷酸序列全长上的序列同一性或者氨基酸序列全长上的序列同一性。本发明因此还包括本文所述的具有上述百分比同一性的对根据本发明的所有核酸或氨基酸序列进行的所有这些修饰。
本发明进一步提供一种表达载体，其包含一种编码结合于α-溶血素的抗体或其抗原结合片段(抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体或片段)的核酸序列。术语“表达载体”是指一种设计用来在表达载体中正确插入所选感兴趣基因时表达所述基因(通常为一种蛋白质)的重组DNA构建体。表达载体的非限制性实例包括DNA载体、RNA载体、质粒或病毒载体。合适的表达载体可以包括调控元件，例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多聚腺苷酸信号和增强子，并且可以根据预期用途以各种方式制备。载体的启动子可以是组成型的或可诱导的。具体而言，表达载体可以通过使用质粒载体来制备。质粒的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)、pCRTOPO(Invitrogen)、pJOE、pBACKBONE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)、pTriEx-Hygro、pCINeo(Promega)、pUC19、pMB1、pSC101、pBEU1、pBEU2、pDF41、pDF42、pBR322、ptdTomato-N1、pGP、pEF、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pSVK3、pMSG或pSVL或pcDNA3.4。在本发明的具体实施例中，质粒为pcDNA3.4。
本发明还提供一种宿主细胞，其包含编码结合于α-溶血素的抗体或其抗原结合片段(抗体或其抗原结合多种为单克隆抗体或片段)的核酸的载体可引入细胞中，所述细胞可表达由此编码的多肽，包括任何适合的原核或真核生物细胞。可使用的细胞包括可以容易并且可靠地生长、具有合理的快速生长速率、具有良好特征的表达系统并且可容易和有效地转化或转染的细胞。真核细胞为所属领域中已知并包括但不限于例如酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。在一个实施例中，所述载体于哺乳动物细胞中表达。许多适合的哺乳动物宿主细胞为所属领域中已知。适合哺乳动物细胞的实例包括(但不限于)中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)(ATCC第CCL61号)、CHO DHFR细胞(乌尔劳布(Urlaub)等人,美国国家科学院院刊,97:4216-4220(1980))、人类胚肾(human embryonickidney，HEK)293、HEK 293E、HEK 293-6E、HEK 293F或293T细胞(ATCC第CRL1573号)和3T3细胞(ATCC第CCL92号)。其它适合的哺乳动物细胞系为猴COS-1(ATCC第CRL1650号)和COS-7细胞系(ATCC第CRL1651号)、per.C6细胞、CV-1细胞系(ATCC第CCL70号)、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞以及NS0细胞。哺乳动物细胞理想为人类细胞。在本发明的具体实施例中，宿主细胞为HEK 293F细胞。可通过转染、转化或转导将本文所述的编码抗体或抗原结合片段(任选地为单克隆抗体或片段)中的任一种的氨基酸的核酸序列引入细胞中。
在本发明中，术语“可检测标记”指与探针相关的分子或化合物或一组分子或一组化合物，它们用于鉴定杂交到基因组核酸或参考核酸的探针。在一些情况下，可检测标记可被直接地检测。在其它情况下，可检测标记可以是结合对的一部分，它可然后被接着检测。来自可检测标记的信号可通过各种方式被检测，并将依赖于可检测标记的性质。检测可检测标记的方式的例子包括但并不限于分光镜的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、电磁的、放射化学的或化学的方式，诸如荧光染料、胶体金、化学发光催化剂或化学发光标记物或任何其它的合适方式。术语“化学发光标记物”涉及作为化学反应的结果，伴随着有限的发热，能够发出光线(发光)的标记物。化学发光标记物包括但不限于鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、cyalume、焦酚、草酰氯、光泽精、TMAE(四(二甲氨基)乙烯)、吖啶酯及其衍生物、金刚烷、稀土元素、联吡啶钌配合物、acridinumester或二氧杂环丁烷(dioxetane)。化学发光催化剂包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。本发明定义的“抗生素抗性基因”包括特意提供给载体并被用作选择系统的异源核酸序列。抗生素抗性的基因包括但不限于青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。如本申请所用的术语“治疗剂”是指当以有效量存在时对有此需要的受试者产生所需治疗效果的化合物。治疗剂包括但不限于放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂。所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、TNF-α、G-CSF、M-CSF；所述化疗剂包括但不限于顺铂、紫杉醇、长春新碱、门冬酰胺酶、奥沙利铂、草酸铂、乐沙定。
在本发明中，术语“治疗”是指(1)防止易感或尚未显示病症的受试者出现症状或疾病；(2)抑制疾病或阻止其发展或复发；或(3)改善或导致疾病或病症消退。如本领域所理解的，“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于减轻或改善一个或多个症状、病症(包括疾病)程度的减轻、病症(包括疾病)状态的稳定(即，不恶化)，病症(包括疾病)的延迟或减缓、病症(包括疾病)、状态和缓解(无论是部分还是全部)的进展、改善或缓解，无论是否可检测。
在本发明中，术语“治疗有效量”是指在必需剂量下并在必需时间段内有效实现所需治疗结果(例如治疗金黄色葡萄球菌感染)的量。治疗有效量可根据以下因素而变化，如个体的疾病病况、年龄、性别和体重，以及抗体或抗原结合片段在个体中引发所需反应的能力。
在本发明中，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。本发明中所使用的术语“药物组合物”是指呈使得一种或多种活性成分的生物活性有效的形式、并且不含对所述配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。因此，它是适合于哺乳动物受试者(通常是人类)的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。此类配制品可以是无菌的。
本发明中所用的术语“药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂”，所述载体、赋形剂或稀释剂包括任何和全部溶剂、稀释剂或其它液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，只要对所需的具体剂型是合适的。除非任何常规的载体介质例如由于会产生任何不合乎需要的生物学效应或以别的方式与药物组合物的一种或多种任何其它组分以有害的方式相互作用而与本发明化合物不相容，否则任何常规载体介质的使用也被认为处于本发明的范围内。
在本发明中，药物组合物的功能包括抑制红细胞的溶解和/或抑制与Hla介导的肿瘤细胞的溶解。肿瘤细胞的非限制性实例包括前列腺癌、膀胱癌、肝癌、头颈癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、肺癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、肾癌、间皮瘤、骨肉瘤、胆管癌、卵巢癌、胃癌、脑膜瘤、胰腺癌、多发性鳞状细胞瘤、口腔癌、食管癌、结直肠癌、乳腺癌、成神经管细胞瘤、鼻咽癌、胸腺癌、淋巴恶性肿瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、黑色素瘤、急性白血病、慢性白血病、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病或脊髓发育不良细胞。进一步，肿瘤细胞为肺癌细胞。在一些实施方案中，肺癌细胞包括非小细胞肺癌细胞、小细胞肺癌细胞或肺腺癌细胞。在一些实施方案中，肺癌细胞是人的肺癌细胞。在一些实施方案中，肺癌细胞包括但不限于肺癌细胞系A549、NCI-H460、CL1-0、CL1-5、DMS11、HCC827或H12994。在本发明的具体实施方案中，肺癌细胞为A549细胞。
在本发明中，术语“免疫原性细菌组合物”、“免疫原性组合物”和“疫苗”在本文中可互换使用，以意指当以足够量施用以引起针对所述制剂中存在的表位的免疫应答时，能够在受试者中引起细胞和/或体液免疫应答的制剂。
在本发明中，佐剂是添加至免疫原性组合物以例如增强、维持、定位或调节对免疫原的免疫应答的物质。术语“佐剂”是指具有(1)改变或增加对特定抗原的免疫应答或(2)增加或有助于药剂的作用的能力的任何材料。可增加多肽的表达、抗原性或免疫原性的任何化合物都是潜在佐剂。
可用于本文所述的免疫原性组合物中的佐剂包括但不限于：抗体；惰性载剂，如明矾、膨润土、胶乳和丙烯酸类颗粒；不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂；基于铝的盐，如氢氧化铝；(Al(OH)3)；磷酸铝(AlPO4)；基于钙的盐；二氧化硅；任何TLR生物配体；IDC-1001(也称为GLA-SE；吡喃葡萄糖基脂质佐剂稳定乳液)(Coler等人,PLoS One,2010.5(10):第e13677页；Coler等人,PLoS One,2011.6(1):第e16333页)；CpG(Mullen等人,PLoS One,2008.3(8):第e2940页)或其任何组合。佐剂的量、如何配制以及如何施用的所有参数完全在本领域普通技术人员的能力范围内。在本发明的具体实施例中，佐剂为本发明所述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明中，术语“引入”是指将载体提供给细胞，以使得所述载体变得内化在细胞中。举例来说，载体可使用转染、转化和/或注射引入到细胞中，并且还可以使用所属领域的普通技术人员已知的其它方法来引入到细胞中。转染试剂包括但不限于Lipofectamine2000、Lipofectamine3000、Turbiofect、PEI等脂质体转染试剂或化学转染试剂或通过电转化转染。进一步，转染试剂为PEI。
在本发明中，金黄色葡萄球菌也简称为StaphA或S.aureus。金黄色葡萄球菌的非限制性实例包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌、万古霉素中间耐药金葡菌(VISA)和万古霉素耐药金葡菌(VRSA)。术语“耐甲氧西林金黄色葡萄球菌”(MRSA)也称为多药耐药性金黄色葡萄球菌或耐苯唑西林金黄色葡萄球菌(ORSA)，是指对β-内酰胺抗生素有抗性的金黄色葡萄球菌菌株，其中包括青霉素(如甲氧西林、双氯西林、萘夫西林、苯唑西林等)和头孢菌素类。术语“甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌”(MSSA)是指对β-内酰胺抗生素敏感的金黄色葡萄球菌的任何菌株。在本发明的具体实施例中，金黄色葡萄球菌α-溶血素感染为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌α-溶血素感染。
金黄色葡萄球菌α-溶血素感染可例如以皮肤或软组织感染(SSTI)或菌血症形式发生。金黄色葡萄球菌细菌可穿过血流并感染体内部位，引起肺炎、ICU肺炎、全身感染、皮肤脓肿、心肌内膜炎、糖尿病下肢感染、糖尿病性足溃疡(DFU)、骨或关节感染、装置感染、伤口感染、手术部位感染、骨髓炎中毒性休克综合症或败血症。在本发明的具体实施例中，金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起肺炎、全身感染。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1Hla的表达及纯化
1、野生型金黄色葡萄球菌α-溶血素(wtHla)的表达及纯化
以金黄色葡萄球菌菌株MRSA 252基因组(BX571856.1，GI:49240382)SAR1136基因为模板，去掉SAR1136基因前端的信号肽序列，将密码子TAG突变为CAG(编码谷氨酰胺Gln，成熟肽第87位)使得Hla基因能完整表达，并根据大肠杆菌偏好进行了密码子优化，N端加入BamHⅠ位点，C端加入NotI位点。目的基因交由上海捷瑞生物技术有限公司合成，构建于pGEX-6P-2载体上，将其在XL1-Blue大肠杆菌中表达。取wtHla工程菌在含有氨苄青霉素的LB培养基内37℃培养过夜，次日进行扩大培养及IPTG诱导表达，离心收获并裂解菌体，利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(美国GE Healthcare公司)纯化获得wtHla-GST融合蛋白，再使用PP酶(Prescission蛋白酶，美国GE Healthcare公司)进行酶切洗脱切除GST标签，通过Q HP(美国GE Healthcare公司)阴离子交换层析获得野生型wtHla蛋白。使用SDS-PAGE检测蛋白纯度。
2、突变型金黄色葡萄球菌α-溶血素(mHla)的表达及纯化
以金黄色葡萄球菌菌株MRSA 252基因组(BX571856.1GI:49240382)SAR1136基因为模板，进行Hla(H35L)的改造构建。去掉SAR1136基因前端的信号肽序列，将编码成熟肽的第35位组氨酸活性位点的密码子CAC突变为CTG(编码亮氨酸)去除Hla毒性，并将密码子TAG突变为CAG(编码谷氨酰胺Gln，成熟肽第87位)使得Hla基因能完整表达，N端加入NcoI酶切位点，C端加入XhoI酶切位点。目的基因交由上海捷瑞生物技术有限公司合成，构建于pET22b载体上，将其在BL21(DE3)大肠杆菌中表达。取mHla工程菌在含有氨苄青霉素的LB培养基内37℃培养过夜，次日进行扩大培养及IPTG诱导表达，离心收获并裂解菌体，利用Ni-TED(中科森辉微球技术(苏州)有限公司)纯化、G25(博格隆(上海)生物技术有限公司)脱盐、SP HP(美国GE Healthcare公司)阳离子交换层析、QHP(美国GE Healthcare公司)阴离子交换层析获得突变型mHla蛋白。使用SDS-PAGE检测蛋白纯度。
3、实验结果
Hla的表达及纯化结果如图1所示，结果显示wtHla蛋白分子量约33.0kDa，SDS-PAGE检测纯度为92.2％；mHla蛋白分子量约35.5kDa，SDS-PAGE检测纯度为100.0％。
实施例2人源特异性抗金黄色葡萄球菌Fab抗体文库的建立
1、PBMC细胞的来源
成都欧林生物科技股份有限公司和中国人民解放军陆军军医大学联合研制的“重组金黄色葡萄球菌疫苗(大肠杆菌)”，用于预防金黄色葡萄球菌感染，于2015年6月18日获批国家药监局“预防用生物制品1类”Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床研究批件(批件号：2015L01247)，2016.5～2017.9开展并完成174例健康受试者的Ia期临床试验，2019.5～2019.12开展并完成144例健康受试者的Ib期临床试验，2018.10～2021.7开展并完成了348例骨创伤高危医院感染人群的II期临床试验，并于2022.06在55家临床中心启动了约6000例闭合性骨折择期手术患者的Ⅲ期临床试验。
本发明单位重庆原伦生物科技有限公司是成都欧林生物科技股份有限公司(股票代码：688319)的全资子公司，基于该金黄色葡萄球菌疫苗的Hla保护性抗原，通过江苏省疾病预防控制中心的伦理审查委员会批准取得伦理审查批件，从重组金黄色葡萄球菌疫苗(大肠杆菌)Ia期临床试验中心，获得冻存于液氮中的Ia期受试者外周血淋巴细胞样本。
2、噬菌体表面展示技术构建人源特异性抗金黄色葡萄球菌Fab抗体文库
根据体液免疫原性(以mHla蛋白(HPLC纯度＞95％)为抗原进行Luminex检测)及有效性评价技术(OPKA检测)结果，选择Luminex及OPKA结果值显著高于安慰剂组平均值和免前的9个受试者的PBMC，提取总RNA(QIAGEN，RNeasy Plus Mini Kit(250))，使用SuperScriptTM III反转录酶(Invitrogen，SuperScriptTM III Reverse Transcriptase)和随机引物合成cDNA，反转cDNA文库混合后作为基因模板，使用Ig引物组通过PCR扩增人轻链(VL+CL)Kappa/Lambda、重链Fd段。轻链VL+CL基因PCR回收产物通过SacI-HF酶与XbaI-HF酶双酶切后，连接到pComb3XSS噬菌体展示载体中，VL+CL(Kappa)和VL+CL(Lambda)轻链库分别构建成功后，再将重链Fd段通过XhoI-HF和SpeI-HF限制性酶切位点分别克隆入已经连有轻链基因片段的pComb3XSS载体，构成Fab噬菌体载体。连接产物转化入TG1感受态细胞，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。取5μLPCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
3、实验结果
Fab文库筛选结果如图2所示，结果显示Fab(Kappa轻链)文库(图2A)和Fab(Lambda轻链)文库(图2B)的阳性克隆率均超过80％，并且文库的库容量超过108。
实施例3人源特异性抗金黄色葡萄球菌Fab抗体文库筛选
1、细菌纯化及抗体噬菌体制备
将冻存的文库菌液按照1:100的比列接种LB-青霉素培养基进行复苏，待OD600读值在0.5～0.6之间时取出菌液并按照1:1000的比列加入辅助噬菌体M13。37℃静置30min后继续震荡培养30min，离心收集菌体并且用含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基30℃恒温摇床过夜培养。将菌液4℃3000g离心10min收集上清噬菌体，加入PEG/NaCl溶液充分混合，置于冰上静置30min后，4℃3000g离心20min，去除上清，沉淀加入PEG/NaCl溶液充分混合，置于冰上30min后，4℃11000g离心2min，去除上清，沉淀使用1mLPBS重悬并加入甘油-80℃保存备用。
2、抗原包被
wtHla蛋白按100μL 5×1011μg/mL4℃包被过夜；除去上清后使用PBS洗1次，拍干，用3％脱脂奶粉封闭，于37℃孵育2h，去除封闭液使用PBST洗涤3次，存4℃备用。
3、噬菌体文库淘选
将抗体噬菌体加入抗原包被的ELISA板，37℃孵育20min，依次使用PBST和PBS溶液洗涤10次去除不结合的噬菌体；使用胰酶消化下结合的噬菌体之后，加入培养至OD600在0.5～0.6的TG1细菌侵染30min。离心收集菌体并涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃过夜培养。次日通过梯度稀释确定淘选的噬菌体子文库的滴度并收集菌体，将噬菌体子文库使用上述的方法重新进行噬菌体包装作为下一轮淘选的输入噬菌体文库。淘选过程重复三轮以最大限度的富集高亲和力的抗体。
4、噬菌体文库筛选
经过淘选富集的噬菌体通过含有氨苄青霉素的LB平板涂布产生细菌单克隆，挑取单克隆到96孔培养板中培养并包装噬菌体，以进行噬菌体ELISA的筛选。将抗体噬菌体加入抗原包被的ELISA板，37℃孵育20min，使用PBST溶液洗涤3次以去除没有结合的噬菌体；加入荧光标记抗体，37℃孵育20min，使用PBST洗涤3次；检测ELISA荧光信号强度筛选特异性抗体，扩增对应阳性孔抗体噬菌粒，并进行测序分析。
实施例4抗Hla全人源抗体的克隆、表达和纯化
1、实验方法
实施例3中筛选出的阳性Fab展示载体作为模板，使用载体引物通过PCR分别扩增人Ig VH和VK/L，产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
抗体基因序列测定与生物信息学分析：将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体基因PCR产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒进行纯化，并分别从正向与反向进行序列测定，用IMGT在线服务器(http：//imgt.cines.fr/)来分析抗体基因家族、突变率及CDR区。
将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因的PCR产物利用TA克隆的方法连接到含有重链恒定区或者轻链恒定区的pcDNA3.4载体上，构建全人源抗Hla抗体的表达载体，然后将表达载体转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，28个循环；72℃延伸5min。取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
将所得阳性转化子中的载体质粒转化DH5α进行大量扩增，快速提取重组质粒后，与转染试剂PEI 37℃共孵育15～20min后转染HEK 293F细胞，并在37℃摇床，5％CO2培养箱中125rpm/min震荡培养。5d后3000g，4℃离心30min收集细胞上清，利用蛋白A亲和层析法进行纯化；利用SDS-PAGE检验抗体的表达及纯化情况。
2、实验结果
该方案成功构建了一系列抗体的重链和轻链表达载体。并将其中一种抗体克隆命名为全人源Hla单克隆抗体Hla-20(简称Hla-20抗体或Hla-20单克隆抗体)。
SDS-PAGE检测结果如图3所示，结果显示转染细胞中Hla-20抗体的相对分子量约160～180kDa，重链约55kDa，轻链约25kDa，表明转染细胞能成功表达抗体。
Hla-20抗体序列如下：
1)氨基酸序列
1.1)H-CDR1(SEQ ID NO.1)：EFIFSNYA。
1.2)H-CDR2(SEQ ID NO.2)：ISYDGSNA。
1.3)H-CDR3(SEQ ID NO.3)：ARARGPYDDISGYPH。
1.4)L-CDR1(SEQ ID NO.4)：QSVSSN。
1.5)L-CDR2(SEQ ID NO.5)：GAS。
1.6)L-CDR3(SEQ ID NO.6)：QQYNNWPLT。
1.7)重链可变区(SEQ ID NO.7)：
EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASEFIFSNYAMHWVRQAPGKGLEWVADISYDGSNAHYADSVKGRFSISRDNSKNTLYLQMNSLRNDDTAVYYCARARGPYDDISGYPHWGRGTLVTVSS。
1.8)轻链可变区(SEQ ID NO.8)：
ELVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPKLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPLTFGGGTRLEIK。
2)核苷酸序列
2.1)H-CDR1(SEQ ID NO.9)：GAATTCATCTTCAGTAACTATGCT。
2.2)H-CDR2(SEQ ID NO.10)：ATTTCATATGATGGAAGCAATGCA。
2.3)H-CDR3(SEQ ID NO.11)：
GCGAGAGCCCGCGGACCTTATGATGATATTAGTGGTTATCCTCAT。
2.4)L-CDR1(SEQ ID NO.12)：CAGAGTGTTAGCAGCAAC。
2.5)L-CDR2(SEQ ID NO.13)：GGTGCATCC。
2.6)L-CDR3(SEQ ID NO.14)：CAGCAGTATAATAATTGGCCTCTCACT。
2.7)重链可变区(SEQ ID NO.15)：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGAATTCATCTTCAGTAACTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCTGACATTTCATATGATGGAAGCAATGCACACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCTCCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAAATGACGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGCCCGCGGACCTTATGATGATATTAGTGGTTATCCTCATTGGGGCCGGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA。
2.8)轻链可变区(SEQ ID NO.16)：
GAGCTCGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAA
AGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAACTTAGCC
TGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAAGCTCCTCATCTATGGTGCAT
CCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGA
CAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTA
TTACTGTCAGCAGTATAATAATTGGCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACACGACTGGAGATTAAA。
实施例5Hla-20抗体的结合活性检测
1、实验方法
以野生型wtHla(2μg/mL)和重组表达的mHla(2μg/mL)蛋白分别为抗原包被ELISA96孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2h。实施例5中转染表达的Hla-20抗体(300μg/mL)倍比稀释后，每个稀释度每孔100μL；阳性对照为疫苗血清(1:1000倍稀释)每孔100μL，阴性对照为阴性血清(1:50倍稀释)和阴性对照无关抗体IgG1(0.5μg/mL)每孔100μL，空白加100μL封闭液，均为3个复孔，37℃孵育1h。
用PBST缓冲液洗板一次(3个循环)，每孔加100μL用封闭液按1:5000进行稀释的Goat-Anti-Human-IgG-Fab-HRP(二抗)，37℃孵育1h。PBST缓冲液洗板一次(5个循环)，避光，每孔加TMB 100μL，37℃放置5～10min，立即用50μL的2M H2SO4终止。双波长450/650nm检测OD值。计算阴性对照无关抗体IgG1的均值，算出阈值(均值的3倍)，大于阈值为阳性抗体，并计算EC50。
2、实验结果
结合活性检测实验结果如图4所示，结果表明全人源Hla单克隆抗体Hla-20能与mHla和wtHla结合。wtHla和mHla的EC50计算结果分别为0.152μg/mL和0.962μg/mL。
实施例6Hla-20抗体的表位类型确定
1、实验方法
1)蛋白样品制备：0.8μg mHla和wtHla蛋白样品中加入2.5μL还原型LoadingBuffer(含β－巯基乙醇)，用PBS补足10μL并在沸水浴中煮5min。安装电泳槽和预制胶，加入电泳缓冲液，拔掉梳子后上样。设定电泳仪电压为140V电泳时间1～2h。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。电泳胶用水冲洗后，与转膜试剂盒一起组装后放入转膜仪，使用自动转膜仪转膜；转膜后的PVDF膜用含5％脱脂奶粉的TBST溶液完全覆盖后封闭，放在摇床上室温封闭1h。PVDF膜用TBST溶液洗3次，每次5min；然后用TBST配制含有1％脱脂奶粉的溶液，随后按照1:7500加入抗人IgG-AP，将PVDF膜放入上述溶液中，置于水平摇床上室温孵育1h。
2)TBST液：50mL 20×TBS，5mL Tween20，945mL水补足1L，混匀后使用。
3)使用免疫蛋白印迹(WB)检测抗体抗原结合反应。具体步骤如下：PVDF膜用TBST溶液洗3次，每次5min；将PVDF膜放入干净的平皿中，每块膜避光滴加约1mL的AP显色液，观察条带显色，至条带明显时，加入水终止反应。
2、实验结果
WB检测结果如图5所示，结果显示Hla-20抗体能够和变性后的mHla和wtHla结合，表明Hla-20抗体的表位为线性表位。
实施例7Hla-20抗体对α-溶血素溶血活性的中和作用
1、实验方法
将10％兔红细胞(RBC)悬液进行2倍倍比稀释，分别加入150μL 0.25％Triton X-100，考察兔红细胞(RBC)悬液浓度以确保在540nm处OD值约为1。将wtHla蛋白做2倍倍比稀释，于37℃预孵育0.5h，分别加入150μL的1.5％兔红细胞(RBC)，37℃溶血1h，确定wtHla的最佳溶血浓度(≥90％溶血)；将75μL 5.0μg/mL的wtHla分别与75μL不同浓度的Hla-20及对照抗体(不与wtHla反应的抗体，即IgG1)在37℃预孵育0.5h，加入1.5％兔红细胞(RBC)37℃溶血1h后，将完整的细胞通过离心而沉淀。将200μL的上清液转移至新的96孔平底板，并且用分光光度计测量A540。中和活性是相对于仅使用RBC和wtHla的溶解度来计算的，计算公式为：中和率％＝[1-(试验孔A540-PBS对照孔A540)/(wtHla对照孔A540-PBS对照孔A540)]×100％。在恒定数量的wtHla和兔RBC的存在下，将纯化的Hla-20抗体逐步提高剂量，通过上清液中的血红蛋白释放来测量溶血。计算EC50。
2、实验结果
实验结果如图6所示，结果显示兔红细胞(RBC)悬液浓度为0.75％，wtHla的最佳溶血浓度为5.0μg/mL(149.70nM)，中和活性EC50为3.95μg/mL(26.36nM)，以上表明Hla-20抗体可以有效地抑制a-溶血素对兔红细胞的损害作用。
实施例8Hla-20抗体对a-溶血素裂解A549细胞的中和作用
1、实验方法
在wtHla介导的人细胞系A549(肺泡上皮细胞系)的溶解中检查纯化抗体的活性，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的抑制率％来量化细胞溶解。从每个孔减去背景LDH，对LDH释放的抑制率％＝[1-(试验孔A450-PBS对照孔A450)/(wtHla对照孔A450-PBS对照孔A450)]×100％。
将A549细胞悬液调至1.5×105/mL，维持在补充有非必需氨基酸谷氨酰胺和10％的胎牛血清的DMEM中，100μL/孔加入到96孔U形板在5％CO2、37℃培养箱中培养2～4h使细胞贴壁；将100μL野生型wtHla(100μg/mL)蛋白加入A549细胞孵育6h、9h、12h，每100μL培养基加10μL CCK-8试剂，37℃孵育1h后，测定450nm吸光度，确定最佳孵育时间。不同浓度wtHla在37℃预孵育0.5h后、加入A549细胞孵育6h裂解A549细胞，测定wtHla蛋白浓度及杀伤率；将50μLwtHla蛋白和不同浓度的Hla-20抗体及阴性对照抗体(不与wtHla反应的抗体，即IgG1)在37℃预孵育0.5h，随后添加A549细胞培养6h，按照CCK8试剂盒说明书，测定细胞溶解后测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放量，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的抑制率％来量化细胞溶解。
2、实验结果
实验结果如图7所示，结果显示最佳孵育时间为6h，wtHla蛋白浓度为85.50μg/mL(2559.88nM)时杀伤率为59.3％，Hla-20抗体的中和活性EC50为116.32μg/mL(775.44nM)。以上结果表明抑制兔RBC溶解的Hla-20抗体也抑制wtHla介导的人A549细胞的溶解，体现了Hla-20抗体在感染期间抑制金黄色葡萄球菌溶血素的潜在效用，由此限制金黄色葡萄球菌相关症状和疾病的进展。
实施例9Hla-20抗体体内中和保护性评价试验
1、实验方法
1)wtHla剂量摸索
将wtHla用生理盐水稀释成200、150、100及50μg/mL，用于腹腔攻毒，以200μg/mL的mHla作为阴性对照，取以上各浓度的wtHla及mHla各100μL，置于37℃水浴锅中温浴30min后，对小鼠进行腹腔注射，100μL/只。小鼠分为5组，每组6只小鼠。试验周期为7天，腹腔注射后，每12h记录小鼠生存情况并计算生存率。
2)Hla-20中和保护率测定
将50μL分别含有2.5μg、5μg、10μg、20μg Hla-20抗体的抗体溶液分别与50μL含有15μg wtHla的抗原溶液混合，于37℃孵育30min后，每组6只小鼠，每只老鼠进行腹腔注射。试验周期为7天，每12h记录小鼠生存情况并计算生存率。
2、实验结果
实验结果如图8所示，剂量摸索实验结果显示20μg wtHla能够导致小鼠100％死亡，15μg wtHla可致死＞80％的小鼠(N＝6)，5μg wtHla及20μg mHla腹腔注射后，不引起小鼠死亡。中和保护性评价实验结果显示20μg Hla-20抗体组小鼠生存率＞80％，即保护率＞80％，10μg Hla-20抗体保护率为50％，5μg及2.5μg Hla-20抗体能够保护＞30％小鼠(N＝6)，以上四组小鼠生存率明显高于阴性对照组生存率，差异具有统计学意义(p<0.05)；此结果表明有效抑制性抗体被动给予是用于疾病预防的有效途径。总之，该试验结果说明金黄色葡萄球菌α-溶血素在致病菌中的作用，并且提供了能抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素功能以及限制金黄色葡萄球菌感染导致严重致病甚至死亡的抗体的用途和证据。
实施例10MRSA全身感染模型的建立及保护性评价
1、实验方法
1)MRSA全身感染模型(菌血症模型)感染剂量摸索：试验共分为6组，每组10只BALB/c小鼠。生理盐水对照组：每只小鼠静脉注射100μL生理盐水；3×108CFU组：每只小鼠静脉注射3×109CUFs/mL的USA 300菌液100μL(3×108CFU/只)；4×108CFUs组：每只小鼠静脉注射4×109CUFs/mL的USA 300菌液100μL(4×108CFUs/只)；5×108CFUs组：每只小鼠静脉注射5×109CUFs/mL的USA300菌液100μL(5×108CFUs/只)；6×108CFUs组：每只小鼠静脉注射6×109CUFs/mL的USA300菌液100μL(6×108CFUs/只)；7×108CFUs组：每只小鼠静脉注射7×109CUFs/mL的USA 300菌液100μL(7×108CFUs/只)。试验周期为7天，攻毒后每12h观察并记录小鼠生存情况并计算生存率。
2)MRSA全身感染模型生存率分析：取40只BALB/c小鼠(20g±1g)，分为四组，每组10只。每只小鼠静脉注射6.0×108CFUs的USA 300菌液100μL(6×108CFUs/只)。2h后，对四组小鼠按如下分组进行抗体注射，20mg/kg组：尾静脉注射400μg Hla-20，体积100μL；10mg/kg组：尾静脉注射200μg Hla-20，体积100μL；无关抗体对照组：尾静脉注射400μg IgG1，体积100μL；生理盐水对照组：尾静脉注射100μL生理盐水。试验周期为7天，每12h观察小鼠生存时间及计算生存率。
2、实验结果
实验结果如图9所示，MRSA全身感染模型感染剂量摸索结果显示，6×108CFUs/只可以导致90％小鼠死亡，故选择此剂量作为生存率分析试验感染剂量；MRSA全身感染模型生存率分析结果显示，20mg/kg体重的Hla-20组小鼠生存率为90％，10mg/kg Hla-20组小鼠生存率为70％，两组小鼠生存率明显高于阴性对照组(0％)，差异具有统计学意义(p<0.05)，无关抗体对照组小鼠生存率为10％。表明全人源抗Hla抗体Hla-20能抵抗MRSA的全身性侵袭。
实施例11MRSA肺炎模型
1、实验方法
1)MRSA肺炎模型感染剂量摸索：试验共分为6组，每组10只BALB/c小鼠。生理盐水对照组：每只小鼠气管注射20μL生理盐水；0.7×108CFUs组：每只小鼠静脉注射3.5×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(0.7×108CFUs/只)；0.8×108CFUs组：每只小鼠静脉注射4.0×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(0.8×108CFUs/只)；0.9×108CFUs组：每只小鼠静脉注射4.5×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(0.9×108CFUs/只)；1.0×108CFUs组：每只小鼠静脉注射5.0×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(1.0×108CFUs/只)；1.1×108CFUs组：每只小鼠静脉注射5.5×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(1.1×108CFUs/只)。试验周期为7天，攻毒后每12h观察小鼠生存时间及计算生存率。
2)MRSA肺炎模型生存率分析：取40只BALB/c小鼠(20g±1g)，分为四组，每组10只。对所有小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉(30mg/kg)后，通过气管注射20μL USA300菌液对小鼠攻毒(1.0×108CFUs/只)。攻毒2h后，对四组小鼠按如下分组进行抗体注射，20mg/kg组：尾静脉注射400μg Hla-20，体积100μL；10mg/kg组：尾静脉注射200μg Hla-20，体积100μL；无关抗体对照组：尾静脉注射400μg IgG1，体积100μL；生理盐水对照组：尾静脉注射100μL生理盐水。试验周期为7天，每12h观察小鼠生存时间及计算生存率。
2、实验结果
实验结果如图10所示，MRSA肺炎模型感染剂量摸索实验结果显示，1×108CFUs/只可以导致90％小鼠死亡，故选择此剂量作为生存率分析试验感染剂量。MRSA肺炎模型生存率分析结果显示，20mg/kg体重的Hla-20组小鼠生存率为80％，10mg/kg Hla-20组小鼠生存率为60％，两组小鼠生存率明显高于阴性对照组(0％)，差异具有统计学意义(p<0.05)，无关抗体对照组小鼠生存率为10％。以上表明全人源抗Hla抗体Hla-20能抵抗MRSA的肺部感染，抑制疾病进展。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (40)

1.一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体，其特征在于，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包含H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3；所述轻链可变区包含L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
所述CDR是以IMGT定义方案定义的；
所述H-CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示；
所述H-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示；
所述H-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO .3所示；
所述L-CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO .4所示；
所述L-CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO .5所示；
所述L-CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO .6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含单克隆抗体或嵌合抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体为全人源抗体。
5.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌包含耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌、万古霉素中间耐药金葡菌或万古霉素耐药金葡菌。
6.根据权利要求5所述的抗体，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-6任一项所述的抗体；
所述编码H-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO .9所示；
所述编码H-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO .10所示；
所述编码H-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO .11所示；
所述编码L-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO .12所示；
所述编码L-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO .13所示；
所述编码L-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO .14所示。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，所述编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO .15所示；
所述编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO .16所示。
9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求7或8所述的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含DNA载体、RNA载体、质粒或病毒载体。
11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒。
12.根据权利要求11所述的表达载体，其特征在于，所述质粒包含pGP、pEF、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pSVK3、pMSG、pSVL或pcDNA3.4。
13.根据权利要求12所述的表达载体，其特征在于，所述质粒为pcDNA3.4。
14.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求7或8所述的核酸分子或权利要求9-13任一项所述的表达载体。
15.根据权利要求14所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含原核生物细胞、真核生物细胞。
16.根据权利要求15所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为真核生物细胞。
17.根据权利要求16所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核生物细胞包含哺乳动物细胞。
18.根据权利要求17所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞包含CHO细胞、NS0细胞、HEK 293细胞、HEK 293T细胞、HEK 293E细胞、HEK 293-6E细胞、HEK 293F细胞和/或per.C6细胞。
19.根据权利要求18所述的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞为HEK 293F细胞。
20.一种衍生物，其特征在于，所述衍生物为可检测标记的权利要求1-6任一项所述的抗体和/或权利要求7或8所述的核酸分子。
21.根据权利要求20所述的衍生物，其特征在于，所述可检测标记包含荧光染料、胶体金、化学发光标记物、化学发光催化剂。
22.一种衍生物，其特征在于，所述衍生物为赋予抗生素抗性的权利要求1-6任一项所述的抗体和/或权利要求7或8所述的核酸分子。
23.根据权利要求22所述的衍生物，其特征在于，所述抗生素抗性的基因包含青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。
24.一种衍生物，其特征在于，所述衍生物为与治疗剂结合或偶联的权利要求1-6任一项所述的抗体和/或权利要求7或8所述的核酸分子。
25.根据权利要求24所述的衍生物，其特征在于，所述治疗剂包含放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂。
26.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含治疗有效量的权利要求1-6任一项所述的抗体、权利要求7或8所述的核酸分子、权利要求9-13任一项所述的表达载体、权利要求14-19任一项所述的宿主细胞或权利要求20-25任一项所述的衍生物。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物具有抑制生物学细胞的溶解、抑制与金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的肿瘤细胞的溶解或抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力；
所述生物学细胞为红细胞；
所述肿瘤细胞为肺癌细胞。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其特征在于，所述肺癌细胞包含A549、NCI-H460、HCC827或H1299细胞。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其特征在于，所述肺癌细胞为A549细胞。
30.根据权利要求26所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
31.一种检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1-6任一项所述的抗体和/或权利要求20-25任一项所述的衍生物。
32.如下任一项方法：
（1）一种非诊断目的的检测样本中金黄色葡萄球菌α-溶血素的方法，其特征在于，所述方法包含将所述样本与权利要求1-6任一项所述的抗体接触；
（2）一种制备权利要求14-19任一项所述的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包含将权利要求7或8所述的核酸分子或权利要求9-13任一项所述的表达载体引入细胞中；
（3）一种生成权利要求1-6任一项所述的抗体的方法，其特征在于，所述方法包含培养权利要求14-19任一项所述的宿主细胞，从培养物中分离出所述抗体；
（4）一种非治疗目的的特异性地抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素活性的方法，其特征在于，所述方法包含使用权利要求1-6任一项所述的抗体抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素的活性或将权利要求7或8所述的核酸分子引入到生物体细胞中，通过表达权利要求1-6任一项所述的抗体抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素的活性。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法（1）还包含检测金黄色葡萄球菌α-溶血素与抗体的免疫反应。
34.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述表达载体在引入细胞前转化为DH5α感受态细菌。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述引入的方法包括使用转染试剂。
36.根据权利要求35所述的方法，其特征在于，所述转染试剂包括Lipofectamine2000、Lipofectamine3000或PEI。
37.根据权利要求36所述的方法，其特征在于，所述转染试剂为PEI。
38.如下任一项应用：
（1）权利要求1-6任一项所述的抗体、权利要求7或8所述的核酸分子、权利要求9-13任一项所述的表达载体、权利要求14-19任一项所述的宿主细胞、权利要求20-25任一项所述的衍生物或权利要求26-30任一项所述的药物组合物在制备诊断或治疗金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病的产品中的应用；
（2）权利要求1-6任一项所述的抗体在制备权利要求7或8所述的核酸分子、权利要求9-13任一项所述的表达载体、权利要求14-19任一项所述的宿主细胞、权利要求20-25任一项所述的衍生物、权利要求26-30任一项所述的药物组合物或权利要求31所述的检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品中的应用；
（3）权利要求7或8所述的核酸分子在制备权利要求9-13任一项所述的表达载体、权利要求14-19任一项所述的宿主细胞、权利要求20-25任一项所述的衍生物或权利要求26-30任一项所述的药物组合物中的应用；
（4）权利要求9-13任一项所述的表达载体在制备权利要求14-19任一项所述的宿主细胞、权利要求20-25任一项所述的衍生物或权利要求26-30任一项所述的药物组合物中的应用；
（5）权利要求14-19任一项所述的宿主细胞在制备权利要求20-25任一项所述的衍生物或权利要求26-30任一项所述的药物组合物中的应用；
（6）权利要求20-25任一项所述的衍生物在制备权利要求26-30任一项所述的药物组合物或权利要求31所述的检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品中的应用。
39.根据权利要求38所述的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病包括肺炎、全身感染、皮肤脓肿、心肌内膜炎、骨髓炎、中毒性休克综合症或败血症。
40.根据权利要求39所述的应用，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病为肺炎、全身感染。
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