CN116789813A - 一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗金黄色葡萄球菌α‑溶血素的单克隆抗体及其应用。本发明提供了新型全人源抗金黄色葡萄球菌α‑溶血素的Hla‑38抗体，以及编码Hla‑38抗体的多核苷酸、重组载体、重组细胞、衍生物、药物组合物及疫苗，还公开了制备Hla‑38抗体的方法以及Hla‑38抗体在制备治疗或诊断金黄色葡萄球菌α‑溶血素感染引起的疾病的药物中的应用。本发明提供的Hla‑38抗体较常规单克隆抗体用途更广，特异性更强，安全性更高、并具有较好的灵敏度；Hla‑38抗体为金黄色葡萄球菌α‑溶血素感染患者提供了更多的用药选择，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的单克隆抗体及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)有“嗜肉菌”的别称，是一种流行广泛、造成医院、社区相关感染的主要人类病原菌。特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)，其因致病性强、传播途径广泛、易暴发流行，呈多重耐药性发展而成为临床上治疗的难点，严重威胁人类健康。2022年1月全球204个国家的多中心研究人员联合在《Lancet》上发表的系统回顾性研究表明：耐药性细菌感染是当今全球主要死亡原因，2019年有622万人的死亡与耐药性细菌感染有关，作为“超级细菌”的典型代表—MRSA直接导致100万人死亡。2017年WHO将MRSA确定为对人类构成致命威胁的12种“超级细菌”之一。
金葡菌致病因素复杂，能够分泌多种外毒素，包括α-溶血素(Hla)、β-毒素、超抗原(SAgs)、白细胞毒素、酚类可溶调素(PSMs)等，能够直接导致人体各种症状或加重其感染程度、加快疾病进程，如引起食物中毒、烫伤样皮肤综合征甚至中毒性休克综合征等全身致死性疾病。α-溶血素(Hla)是金葡菌致病的关键毒力因子之一，Hla与宿主细胞膜上的锌依赖金属蛋白酶ADAM10结合，形成七聚体跨膜离子通道，破坏细胞渗透压平衡而使其裂解；因为ADAM10主要分布于红细胞和肺上皮细胞，因此Hla对这两类细胞具有导致红细胞溶血、引起上皮细胞穿孔裂解及促进炎症反应等特点，在金葡菌致病机制中发挥重要作用。有报道表明在金葡菌USA300菌株导致的全身感染及肺炎中，Hla具有显著的致病作用。Hla近年多用作疫苗研发及中和性抗体开发的抗原靶点。
基于Hla的表达受基因组的调控，且大部分金葡菌都能分泌Hla，因此，将Hla作为靶点开发治疗性抗体药物，能够广泛、有效治疗多种金葡菌的感染。已经报道的针对Hla毒素的免疫制品主要有Hla无毒突变体疫苗，Hla表位疫苗，抗Hla单克隆抗体等。国内外已有多个SA治疗性抗体开展了或正在开展临床试验，但所针对的SA毒力因子和靶点单一，还未有治疗性单抗成功上市。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的单克隆抗体及其在制备诊断或治疗金黄色葡萄球菌α-溶血素感染的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3和/或SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3。
进一步，所述抗体包含与SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的轻链可变区。
进一步，所述抗体包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列所示的重链可变区和/或SEQ IDNO.8的氨基酸序列所示的轻链可变区。
进一步，所述抗体包含重链抗体、Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体。
进一步，所述抗体包含单克隆抗体或嵌合抗体。
进一步，所述抗体为单克隆抗体。
进一步，所述抗体为全人源抗体。
进一步，所述金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
本发明的第二方面提供了一种编码本发明的第一方面所述的抗体的多核苷酸。
进一步，编码H-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
进一步，编码H-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
进一步，编码H-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步，编码L-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
进一步，编码L-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
进一步，编码L-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
进一步，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明的第三方面提供了一种包含本发明的第二方面所述的多核苷酸的重组载体。
进一步，所述重组载体是将所述多核苷酸插入质粒构建而成的。
进一步，所述质粒包含pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT或pcDNA3.1。
进一步，所述质粒为pcDNA3.1。
本发明的第四方面提供了一种包含或表达本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的多核苷酸或本发明的第三方面所述的重组载体的重组细胞。
进一步，所述重组细胞包含哺乳动物细胞。
进一步，所述哺乳动物细胞包含CHO细胞、NS0细胞、HEK 293细胞、HEK 293T细胞、HEK 293E细胞、HEK 293-6E细胞、HEK 293F细胞和/或per.C6细胞。
进一步，所述哺乳动物细胞为HEK 293F细胞。
本发明的第五方面提供了一种包含可检测标记的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和/或本发明的第二方面所述的核酸分子、赋予抗生素抗性的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和/或本发明的第二方面所述的核酸分子、与治疗剂结合或偶联的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段和/或本发明的第二方面所述的核酸分子的衍生物。
进一步，所述可检测标记包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、荧光染料。
进一步，所述抗生素抗性的基因包含红霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因。
进一步，所述治疗剂包含放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂。
本发明的第六方面提供了一种包含本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的多核苷酸、本发明的第三方面所述的重组载体、本发明的第四方面所述的重组细胞或本发明的第五方面所述的衍生物的药物组合物。
进一步，所述药物组合物具有抑制生物学细胞的溶解、抑制与金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的肿瘤细胞的溶解、抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力。
进一步，所述生物学细胞包含红细胞、中性粒细胞、上皮细胞、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞。
进一步，所述生物学细胞为红细胞。
进一步，所述肿瘤包含脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、咽喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、子宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食道癌、肾癌、鼻咽癌或胆囊癌。
进一步，所述肿瘤为肺癌。
进一步，肺癌细胞包含A549、NCI-H460、HCC827或H1299细胞。
进一步，所述肺癌细胞为A549细胞。
进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
本发明的第七方面提供了一种包含本发明的第一方面所述的抗体和/或本发明的第五方面所述的衍生物的检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品。
本发明的第八方面提供了一种包含特异性结合本发明的第一方面所述的抗体的表位的疫苗。
进一步，所述表位为线性表位。
本发明的第九方面提供了如下任一项方法：
(1)一种非诊断目的的检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)将获取的样品与本发明的第一方面所述的抗体接触；
(b)检测样品与抗体的免疫反应。
(2)一种包含培养本发明的第四方面所述的重组细胞制备本发明的第一方面所述的抗体的方法。
(3)一种包含将本发明的第二方面所述的多核苷酸或本发明的第三方面所述的重组载体引入细胞中制备本发明的第四方面所述的重组细胞的方法。
进一步，所述重组载体在引入细胞前转化为DH5α感受态细菌。
进一步，所述引入细胞的方法包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂转染和原生质体融合。
进一步，所述引入细胞的方法为脂转染。
进一步，所述脂转染使用的转染试剂包括Lipofectamine2000、Lipofectamine3000或PEI。
进一步，所述转染试剂为PEI。
(4)一种包含使用本发明的第一方面所述的抗体特异性地抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素活性的方法。
本发明的第十方面提供了如下任一项应用：
(1)本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的多核苷酸、本发明的第三方面所述的重组载体、本发明的第四方面所述的重组细胞、本发明的第五方面所述的衍生物、本发明的第六方面所述的药物组合物或本发明的第八方面所述的疫苗在制备治疗金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病的药物中的应用。
(2)本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的多核苷酸、本发明的第三方面所述的重组载体、本发明的第四方面所述的重组细胞、本发明的第五方面所述的衍生物、本发明的第六方面所述的药物组合物、本发明的第七方面所述的产品或本发明的第八方面所述的疫苗在制备诊断金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病的产品中的应用。
(3)本发明的第一方面所述的抗体非诊断目的的在金黄色葡萄球菌α-溶血素免疫组织化学测定中的应用。
(4)本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的多核苷酸、本发明的第三方面所述的重组载体、本发明的第四方面所述的重组细胞、本发明的第五方面所述的衍生物在制备本发明的第六方面所述的药物组合物中的应用。
(5)本发明的第一方面所述的抗体制备本发明的第五方面所述的衍生物中的应用。
(6)本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的多核苷酸、本发明的第三方面所述的重组载体在制备本发明的第四方面所述的重组细胞中的应用。
(7)本发明的第一方面所述的抗体、本发明的第二方面所述的多核苷酸在制备本发明的第三方面所述的重组载体中的应用。
(8)本发明的第一方面所述的抗体在制备本发明的第二方面所述的多核苷酸中的应用。
进一步，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病包括肺炎、全身感染、皮肤脓肿、坏死性筋膜炎、心内膜炎、败血症、菌血症、腹膜炎或中毒性休克综合症。
进一步，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病为肺炎、全身感染。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体(被命名为Hla-38)能特异性结合野生型金黄色葡萄球菌α-溶血素和突变型金黄色葡萄球菌α-溶血素，灵敏度好；且Hla-38抗体能够限制金黄色葡萄球菌相关症状和疾病的进展；本发明还证明了Hla-38能够抵抗MRSA的全身性侵袭，由此表明Hla-38抗体可以用于制备治疗金黄色葡萄球菌感染的有效抗体药物，为金黄色葡萄球菌感染患者提供更多的用药选择。
附图说明
图1是SDS-PAGE检测wtHla和mHla蛋白的结果图；
图2是Fab文库筛选结果图，其中2A为Kappa轻链文库筛选结果图，2B为Lambda轻链文库筛选结果图；
图3是SDS-PAGE检测Hla-38抗体表达及纯化结果图；
图4是Hla-38抗体和mHla、wtHla的结合活性检测结果图，其中4A为Hla-38抗体和wtHla的结合活性结果图，4B为Hla-38抗体和mHla的结合活性结果图；
图5是WB检测Hla-38抗体的结果图；
图6是Hla-38中和wtHla裂解兔红细胞结果图，其中6A为兔红细胞悬液终浓度筛选结果图，6B为wtHla的最佳溶血浓度筛选结果图，6C为中和活性检测实验结果图；
图7是Hla-38抗体中和wtHla杀伤A549细胞结果图，其中7A为最佳孵育时间筛选结果图，7B为wtHla蛋白浓度筛选结果图，7C为中和活性检测实验结果图；
图8为Hla-38抗体中和wtHla体内保护效果结果图，其中8A为wtHla剂量摸索实验结果图，8B为Hla-38中和保护率测定结果图；
图9是MRSA全身感染模型的建立及保护性结果图，其中9A为MRSA全身感染模型感染剂量摸索实验结果图，9B为MRSA全身感染模型生存率分析实验结果图；
图10是MRSA肺炎感染模型的建立及保护性结果图，其中10A为MRSA肺炎模型感染剂量摸索实验结果图，10B为MRSA肺炎模型生存率分析实验结果图。
具体实施方式
下文提供了本说明书中使用的一些术语的定义。除非另有说明，本发明中使用的所有技术和科学用语通常具有和本发明所属领域的普通技术人员通常理解的意思相同的意思。
本发明通过广泛而深入的研究，筛选并制备了一种特异性结合金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体Hla-38，通过结合活性检测实验发现Hla-38能与mHla和wtHla结合；通过Hla-38抗体对α-溶血素溶血活性及α-溶血素裂解A549细胞的中和作用实验发现Hla-38不仅能够抑制α-溶血素对兔红细胞的损害作用，还能够抑制wtHla介导的人A549细胞的溶解；通过构建MRSA全身感染模型实验发现Hla-38治疗能够抵抗MRSA的全身性侵袭；通过构建MRSA肺炎模型实验发现Hla-38能抵抗MRSA对肺部的侵袭。
本发明所使用的术语“金黄色葡萄球菌”或“病原性金黄色葡萄球菌”应按下述方式理解。金黄色葡萄球菌通常在人和动物的皮肤上或鼻子内发现。这种细菌通常是无害的，除非它们通过切口或其它伤口进入体内。一般说来，在健康的人中，感染是微小的皮肤问题。过去，感染采用广谱抗生素治疗，如甲氧西林。然而，现在，已经出现了一些耐甲氧西林和其它β-内酰胺抗生素如青霉素和头孢菌素的菌株。它们被称为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(也称为多重耐药性金黄色葡萄球菌，或“MRSA”)。
金黄色葡萄球菌，一种重要的人类病原体，表达多种分泌毒素(外毒素)。这些毒素可以攻击各种宿主细胞类型，包括红细胞、中性粒细胞和其它免疫细胞(淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞)，以及肺或皮肤的上皮细胞。金黄色葡萄球菌毒素的主要成员是α-溶血素(Hla)，其对淋巴细胞、巨噬细胞、肺上皮细胞和肺内皮细胞有溶细胞的功能。在本发明的具体实施例中，这些毒素可以攻击红细胞。
金黄色葡萄球菌感染，包括但不限于MRSA感染，通常一开始是出现与丘疹、疖子或蜘蛛咬伤类似的红色小肿块。这些肿块或疤痕会迅速转为需要手术引流的痛苦的深度脓肿。有时候，细菌停留只限于皮肤上。有时候，它们会深入到体内，在广泛的人体组织，包括皮肤、软组织、骨、关节、手术伤口、血流、心瓣膜、肺或其它器官中引发可能威胁生命的感染。因此，金黄色葡萄球菌感染会引起与其有关的病症，这些病症可能是致命的疾病，如坏死性筋膜炎、心内膜炎、败血症、菌血症、腹膜炎、中毒性休克综合症、甚至全身感染，及各种形式的肺炎，包括坏死性肺炎，及疖病和痈病中的毒素产生。MRSA感染在医院或疗养院环境中尤其麻烦，在那里的病人存在开放性伤口、侵入器械及免疫系统弱化的风险或倾向于发生这些情况，因此，比普通大众存在更大的感染风险。
中和金黄色葡萄球菌毒素的抗体干扰病原体和致病性反应，因此能够限制或防止感染和/或减轻由这种感染引起的病症，或抑制金黄色葡萄球菌发病，特别是肺炎、全身感染。在这一点上，此处的“抗体”理解为负责在主动或被动免疫中对观察到的传染物免疫的中和抗体。特别是，此处描述的抗体能够中和分泌的毒力因子(外毒素)的毒性效应(如溶细胞、靶细胞的促炎性细胞因子表达的诱导)并因此干扰金黄色葡萄球菌的致病潜力。
本发明所使用的术语“α-溶血素”或“α-毒素”可互换使用，都指具有金黄色葡萄球菌α-溶血素氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含有信号肽的溶血素。
本发明中使用的术语“抗体”指的是由抗体域组成或包括抗体域的多肽或蛋白质，所述抗体域理解为具有或不具有连接序列的免疫球蛋白的重链与/或轻链的恒定域与/或可变域。如果多肽包含β-桶状结构，所述β-桶状结构由环序列连接的抗体域结构的至少两条β条带组成，则多肽理解为抗体域。抗体域可能具有天然结构或通过突变或衍生修饰，例如，修饰抗原的结合性质或任何其它性质，如稳定性或功能性，例如，与Fc受体FcRn与/或Fcγ受体结合。
本发明使用的抗体具有结合一个或多个抗原或这些抗原的一个或多个表位的特异性结合位点，特别是包括单一可变抗体域如VH、VL(Kappa、Lambda)或VHH的CDR结合位点，或可变抗体域对如VL/VH对的结合位点，包含VL/VH域对和恒定抗体域的抗体，如Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、Fv或全长抗体。
本发明所使用的术语“抗体”特别指的是包含但不限于由以下组成的抗体形式：单一可变抗体域，如VH、VL或VHH，或可变与/或恒定抗体域的组合，带或不带连接序列或铰链区，包括可变抗体域对，如VL/VH对，包含VL/VH域对和恒定抗体域或由VL/VH域对和恒定抗体域组成的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体，例如IgG型的(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗体。术语“全长抗体”可用于指包含Fc域及其它天然抗体单体中通常发现的其它域的至少大部分的任何抗体分子。本发明使用此术语用于强调特定的抗体分子并非抗体片段。
术语“抗体”应特别包括分离形式的抗体，其基本上无其它针对不同靶抗原的抗体或包含抗体域的不同结构安排。但是，分离抗体可能包含在组合制剂中，所述组合制剂包含分离抗体，例如，与至少一种其它抗体(如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段)的组合。术语“抗体”应适用于动物来源抗体，包括人类，如哺乳动物，包括人、鼠科动物、兔子、山羊、羊驼、牛和马或禽类，如母鸡，该术语应特别包括基于动物来源序列(如人序列)的重组抗体。术语“抗体”进一步适用于具有不同物种来源序列(如鼠科动物和人源序列)的嵌合抗体。术语“抗体”进一步适用于全人源抗体。
谈到抗体时使用的术语“嵌合”指的是那些抗体，其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分，与源自特定物种的抗体或属于特定类别的抗体中的对应序列同源，而该链的其余片段与另一物种或类别的对应序列同源。一般说来，轻链和重链的可变区都模拟源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定部分与源自另一种哺乳动物的抗体序列同源。
谈及抗体时的术语“全人源”指的是具有抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点基本上源自非人类物种的免疫球蛋白，其中所述分子的其余免疫球蛋白结构是基于人免疫球蛋白的结构与/或序列。抗原结合位点可以包括融合到恒定域上的完整可变域或仅为接枝到可变域合适框架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或经修饰的，例如，被一个或多个氨基酸替换修饰，优选经修饰后更接近人免疫球蛋白。人源化抗体的某些形式保留了所有CDR序列。其它形式相对于原抗体有一个或多个CDR被更改。术语“抗体”进一步适用于人抗体。
谈及抗体时使用的术语“人”理解为包括具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括不是人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外随机或定点突变或体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中。人抗体包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体或包括从动物转基因得到的一个或多个人免疫球蛋白的分离的抗体。
术语“抗体”进一步适用于单克隆抗体，特别是重组抗体，该术语包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有抗体和抗体结构，例如，源自动物的抗体，所述动物如哺乳动物，包括人，包括来自不同来源的基因或序列，例如，嵌合、全人源抗体或杂交瘤衍生抗体。进一步的实例涉及从经转化以表达抗体的宿主细胞分离的抗体，或从重组体、抗体或抗体域组合文库分离的抗体，或通过任何其它涉及将抗体基因序列剪接到其它DNA序列上的方法制备、表达、产生或分离的抗体。
本发明所使用的术语“可检测标记”是指至少一种能够直接或间接产生可检测信号的标记。该标记的非穷举清单包括：产生可检测信号(例如通过比色法、荧光、发光)的酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶；发色团，例如荧光染料、发光染料，通过电子显微镜或通过其电学性质(例如电导率、安培法、伏安法、阻抗)被检测到的电子密度的基团；可检测基团，例如其分子大小足以在其物理和/或化学性质中诱导可检测的修饰的可检测基团，这样检测可通过光学方法(例如衍射、表面等离子体共振、表面变化、接触角变化)或物理方法(例如原子力光谱法、隧道效应)或放射性分子(例如32P、35S或125I)完成。
本发明所使用的术语“抗生素抗性的基因”包括促进或赋予重组生物抗性抗生素的序列。在一个实施方案中，抗生素抗性基因选自：cat(对氯霉素抗性)基因、tet(对四环素抗性)基因、erm(对红霉素抗性)基因、neo(对新霉素抗性)基因和spec(对壮观霉素抗性)基因。本发明的重组载体还可以包括同源重组序列(例如设计用于允许目的基因重组进入宿主生物染色体的序列)。例如，amyE序列可用作重组进入宿主染色体的同源靶标。
本发明所使用的术语“治疗剂”是指当以有效量存在时对有此需要的受试者产生所需治疗效果的化合物。治疗剂包括但不限于放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂。所述细胞因子包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、TNF-α、G-CSF、M-CSF；所述化疗剂包括但不限于顺铂、紫杉醇、长春新碱、门冬酰胺酶、奥沙利铂、草酸铂、乐沙定。
本发明所描述的衍生物在抗原结合方面是功能活性的，及与非衍生的抗体相似，优选具有中和金黄色葡萄球菌的效力和/或是保护性抗体。衍生自亲本抗体或抗体序列的抗体，如亲本CDR或FR序列，在此处应特别理解为由例如在计算机模拟中或重组工程或由化学衍生或合成而获得的突变体或变体。应当理解的是，术语“抗体”还指的是抗体的变体，包括具有亲本CDR序列的功能活性CDR变体的抗体，和亲本抗体的功能活性的变体抗体。
本发明所使用的术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与金黄色葡萄球菌毒素特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
本发明所使用的术语“CDR”或“互补决定区”意谓存在于重链多肽与轻链多肽的可变区内的非邻接抗原组合位点。CDR的方式定义包括但不限于Kabat、Chothia、Abm、Contact和IMGT。在本发明的具体实施例中，术语“CDR”使用的IMGT定义，来自于IMGT(国际ImMunoGeneTics网址imgt.org，建立者和主管：Marie-Paule Lefranc，Montpellier，France，参见，例如，Lefranc，M.-P.，1999，The Immunologist，7:132-136和Lefranc，M.-P.等，1999，NucleicRes.，27:209-212，其均在此全文引入作为参考)。对于IMGT编号系统，(i)H-CDR1通常位于重链氨基酸位点26-33，(ii)H-CDR2通常位于重链氨基酸位点51-58，(iii)H-CDR3通常位于重链氨基酸位点97-111。对于IMGT编号系统，(i)L-CDR1通常位于轻链氨基酸位点27-32，(ii)L-CDR2通常位于轻链氨基酸位点50-52，(iii)L-CDR3通常位于轻链氨基酸位点89-96。
本发明所使用的术语“同一性”与术语“同源性”等效。例如，术语同一性和同源性在本文结合分别与SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示序列，优选在所示序列整个长度内具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性或同源性的多肽/氨基酸序列使用。
本发明所使用的术语“多核苷酸”在以单数或复数形式使用时通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。因此，例如，如本文定义的多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA、包括单链和双链区的DNA、单链和双链RNA以及包括单链和双链区的RNA、包含DNA和RNA的杂合分子(这类杂合分子可以是单链的，或者更典型地是双链的，或者包括单链区和双链区)。多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上，优选90％以上，更优选95％、96％、97％、98％、995以上、特别优选100％的同源性。另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。
本发明所使用的术语“重组载体”是指能够转移或转运插入载体中的另一种多核苷酸的多核苷酸分子。插入的多核苷酸可以是表达盒。在一些实施方案中，重组载体可以是病毒载体或非病毒载体(例如质粒)。质粒的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)、pCRTOPO(Invitrogen)、pJOE、pBACKBONE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027pCAG Kosak-Cherry(L45a)载体系统、pREP(Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1(Stratagene)、pSG5(Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE(Promega)、pLXIN、pSIR(Clontech)、pIRES-EGFP(Clontech)、pEAK-10(EdgeBiosystems)、pTriEx-Hygro、pCINeo(Promega)、pUC19、pMB1、pSC101、pBEU1、pBEU2、pDF41、pDF42、pBR322、ptdTomato-N1、pGP、pEF、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pSVK3、pMSG或pSVL或pcDNA3.4。在本发明的具体实施例中，质粒为pcDNA3.4。
本文所用的术语“重组细胞”指这样一种细胞，该细胞中导入了本发明的核酸分子(如本发明的重组载体)。术语“重组细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应当理解，这些术语不仅指特定的对象细胞，还指该细胞的后代或潜在的后代。由于后代可能会因突变或环境影响而发生某些变化从而使后代可能实际上与母细胞不同，但是它们仍然包括在本文所用术语的范围内。较佳的重组细胞是哺乳动物细胞。在一个实施例中，所述载体于哺乳动物细胞中表达。许多适合的哺乳动物重组细胞为所属领域中已知。适合哺乳动物细胞的实例包括(但不限于)中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells，CHO)(ATCC第CCL61号)、CHO DHFR细胞(乌尔劳布(Urlaub)等人,美国国家科学院院刊,97:4216-4220(1980))、人类胚肾(human embryonic kidney，HEK)293、HEK 293E、HEK 293-6E、HEK 293F或293T细胞(ATCC第CRL1573号)和3T3细胞(ATCC第CCL92号)。其它适合的哺乳动物细胞系为猴COS-1(ATCC第CRL1650号)和COS-7细胞系(ATCC第CRL1651号)、per.C6细胞、CV-1细胞系(ATCC第CCL70号)、骨髓瘤细胞、杂交瘤细胞以及NS0细胞。哺乳动物细胞理想为人类细胞。在本发明的具体实施例中，重组细胞为HEK 293F细胞。
本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包括本发明所描述的抗体及药学上可接受的载体。这些药物组合物可以依照本发明以推注或输液或持续输液的方式施用。适合辅助这些施用手段的药物载体是本领域所熟知的。
药学上可接受的载体通常包括但不限于与本发明提供的抗体或相关组合物或组合在生理学上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂。药学上可接受的载体的其它实例包括但不限于无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇，也可以是它们的任何组合。
在这一方面，抗体可与适合要求给药途径的一种或多种载体组合，抗体可以，例如，与任何的乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯树胶、明胶、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇和任选进一步的片剂化或胶囊化用于传统给药。或者，抗体可以溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧基甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、芝麻油、黄蓍胶和/或各种缓冲剂。其它载体、佐剂和给药方式是药学领域所熟知的。载体可以包括控释材料或时间延迟材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯单独使用或与蜡一起使用，或本领域熟悉的其它材料。
其它药学上可接受的载体是本领域所熟知的，而且，例如，在REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES中有描述。液体配方可以是溶液、乳液或悬浮液，并可以包括赋形剂，如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。
药物组合物是预期的，其中配制了本发明的抗体或抗原及一种或多种治疗活性剂。将具所需纯度的所述免疫球蛋白与任选的药学上可接受的载体混合，配制本发明抗体或抗原的稳定制剂，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。体内给药使用的配方特别地是无菌的，优选是无菌水溶液形式。通过无菌过滤膜或其它方法过滤，很容易完成。本发明公开的抗体和其它治疗活性剂也可以配制为免疫脂质体，和/或装在微胶囊中。
包含本发明抗体或抗原的药物组合物可以采用各种方式进行给药，包括口服、皮下、静脉内、鼻内、囊内(intraotically)、经皮、粘膜、局部给药，例如，凝胶、软膏、洗液、乳膏等，腹膜内、肌肉内、肺内给药，例如，采用可吸入技术或肺部递送系统，阴道、肠胃外、直肠或眼内给药。
用于肠胃外给药的示例性配方包括那些适合皮下、肌肉内或静脉注射的配方，例如，无菌溶液、乳液或悬浮液。在一个实施例中，本发明的抗体或抗原是给主体施用的唯一的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或预防单药治疗。在另一个实施例中，本发明的抗体或抗原与其它混合的抗体或抗原组合，例如，组合成混合物或各部分的试剂盒，以靶向金黄色葡萄球菌，使得这样的混合物含有多于一种施用于主体的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或预防组合治疗。或者，本发明的抗体或抗原与一种或多种其它治疗剂或预防剂组合施用，包括但不限于标准处理，例如，抗生素、炎症的类固醇和非类固醇抑制剂，和/或基于其它抗体的疗法，如采用抗菌剂或消炎剂。一种组合疗法特别地采用标准方案，例如，用于治疗MRSA感染。这种方案可包括抗生素，例如替加环素(tygecycline)、利奈唑胺、甲氧西林和/或万古霉素。在组合疗法中，抗体作为混合物施用，或伴随一种或多种其它治疗方案施用，例如，在伴随疗法之前、同时或之后施用。在某些情况下，抗原的预防性给药可以采用包括本发明抗原的疫苗，即单价疫苗。然而，可以采用包括不同抗原的多价疫苗，以诱导针对相同或不同靶标病原体的免疫应答。
本发明所使用的术语“肿瘤”是指由金黄色葡萄球菌α-溶血素引起的异常组织团块，并且包括良性和恶性团块，包括但不限于白血病、脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、咽喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、子宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食道癌、神经胶质瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、胰癌、恶性体癌、肾癌、鼻咽癌、胆囊癌。进一步，肿瘤为肺癌。在本发明中，“肺癌细胞”的非限制性实例包括非小细胞肺癌细胞、小细胞肺癌细胞或肺腺癌细胞。在一些实施方案中，肺癌细胞是人的肺癌细胞。肺癌细胞包括但不限于肺癌细胞系A549、NCI-H460、CL1-0、CL1-5、DMS11、HCC827或H12994。在本发明的具体实施方案中，肺癌细胞为A549细胞。
本发明所使用的术语“表位”、“抗原”在本文中可互换使用，是指由抗体结合的生物分子。抗体表位可包括蛋白质、碳水化合物、核酸、激素、受体、肿瘤标记物等及其混合物。抗体表位也可以是一组抗体表位，例如从体积排阻层析柱上洗脱的蛋白质的特定部分。此外，抗体表位也可以识别为来自表达文库或随机表位文库的指定克隆。
本发明所使用的术语“引入”指代将包含编码单克隆抗体的多核苷酸的载体递送到重组细胞中的方法。这种引入可通过本领域已知的不同方法进行，包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂转染和原生质体融合。另外，转染指代利用病毒颗粒通过感染将期望的材料递送到细胞中。另外，载体可通过基因轰击被引入宿主细胞。在本发明的具体实施例中，使用脂转染将重组载体引入重组细胞中。脂转染使用的转染试剂包括Lipofectamine2000或3000、PEI；进一步，转染试剂为PEI。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1Hla的表达及纯化
1、野生型金黄色葡萄球菌α-溶血素(wtHla)的表达及纯化
以金黄色葡萄球菌菌株MRSA 252基因组(BX571856.1，GI:49240382)SAR1136基因为模板，去掉SAR1136基因前端的信号肽序列，将终止密码子TAG突变为CAG(编码谷氨酰胺Gln，成熟肽第87位)使得Hla基因完整表达，并根据大肠杆菌密码子偏好进行了密码子优化，同时N端加入BamHⅠ位点，C端加入NotI位点。目的基因交由上海捷瑞生物技术有限公司合成，构建于pGEX-6P-2载体上，将其在XL1-Blue大肠杆菌中表达。取wtHla工程菌在含有氨苄青霉素的LB培养基内37℃培养过夜，次日进行扩大培养及IPTG诱导表达，离心收集并裂解菌体，利用谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B(美国GE Healthcare公司)纯化获得wtHla-GST融合蛋白，再使用PP酶(Prescission蛋白酶，美国GE Healthcare公司)进行酶切洗脱切除GST标签，通过Q HP(美国GE Healthcare公司)阴离子交换层析获得野生型wtHla蛋白。使用SDS-PAGE检测蛋白纯度。
2、突变型金黄色葡萄球菌α-溶血素(mHla)的表达及纯化
以金黄色葡萄球菌菌株MRSA 252基因组(BX571856.1GI:49240382)SAR1136基因为模板，进行Hla(H35L)的突变改造。去掉SAR1136基因前端的信号肽序列，将编码成熟肽的第35位组氨酸活性位点的密码子CAC突变为CTG(编码亮氨酸)去除Hla毒性，并将终止密码子TAG突变为CAG(编码谷氨酰胺Gln，成熟肽第87位)使得Hla基因完整表达，同时N端加入NcoI酶切位点，C端加入XhoI酶切位点。目的基因交由上海捷瑞生物技术有限公司合成，构建于pET22b载体上，将其在BL21(DE3)大肠杆菌中表达。取mHla工程菌在含有氨苄青霉素的LB培养基内37℃培养过夜，次日进行扩大培养及IPTG诱导表达，离心收集并裂解菌体，利用Ni-TED柱(中科森辉微球技术(苏州)有限公司)纯化、G25(博格隆(上海)生物技术有限公司)脱盐、SPHP(美国GE Healthcare公司)阳离子交换层析、Q HP(美国GE Healthcare公司)阴离子交换层析获得突变型mHla蛋白。使用SDS-PAGE检测蛋白纯度。
3、实验结果
Hla的表达及纯化结果如图1所示，结果显示wtHla蛋白分子量约33.0kDa，SDS-PAGE检测纯度为92.2％；mHla蛋白分子量约35.5kDa，SDS-PAGE检测纯度为100.0％。
实施例2人源特异性抗金黄色葡萄球菌Fab抗体文库的建立
1、PBMC细胞的来源
成都欧林生物科技股份有限公司和中国人民解放军陆军军医大学联合研制的“重组金黄色葡萄球菌疫苗(大肠杆菌)”，用于预防金黄色葡萄球菌感染，于2015年6月18日获批国家药监局“预防用生物制品1类”Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床研究批件(批件号：2015L01247)，2016.5～2017.9开展并完成174例健康受试者的Ia期临床试验，2019.5～2019.12开展并完成144例健康受试者的Ib期临床试验，2018.10～2021.7开展并完成了348例骨创伤高危医院感染人群的II期临床试验，并于2022.06在55家临床中心启动了约6000例闭合性骨折择期手术患者的Ⅲ期临床试验。
本发明单位重庆原伦生物科技有限公司是成都欧林生物科技股份有限公司(股票代码：688319)的全资子公司，基于该金黄色葡萄球菌疫苗的Hla保护性抗原，通过江苏省疾病预防控制中心的伦理审查委员会批准取得伦理审查批件，从重组金黄色葡萄球菌疫苗(大肠杆菌)Ia期临床试验中心，获得冻存于液氮中的Ia期受试者外周血淋巴细胞样本。
2、噬菌体表面展示技术构建人源特异性抗金黄色葡萄球菌Fab抗体文库
根据体液免疫原性(以mHla蛋白(HPLC纯度＞95％)为抗原进行Luminex检测)及有效性(OPKA检测)评价结果，选择Luminex及OPKA结果值显著高于安慰剂组平均值和疫苗注射前的9个受试者的PBMC，提取总RNA(QIAGEN，RNeasy Plus Mini Kit(250))，使用SuperScriptTMIII反转录酶(Invitrogen，SuperScriptTMIII Reverse Transcriptase)和随机引物合成cDNA，反转cDNA混合后作为基因模板，使用Ig引物组通过PCR分别扩增人轻链(VL+CL)Kappa/Lambda、重链Fd段基因序列。轻链VL+CL基因PCR回收产物通过SacI-HF酶与XbaI-HF酶双酶切后，连接到pComb3XSS噬菌体展示载体中，VL+CL(Kappa)和VL+CL(Lambda)轻链库分别构建成功后，再将重链Fd段通过XhoI-HF和SpeI-HF限制性酶切位点分别克隆入已经连有轻链基因片段的pComb3XSS载体，构成Fab噬菌粒。连接产物转化入TG1感受态细胞，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，收集菌体计算库容量，并且挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR鉴定，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。取5μL PCR产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
3、实验结果
Fab文库筛选结果如图2所示，结果显示Fab(Kappa轻链)文库和Fab(Lambda轻链)文库的阳性克隆率均超过80％，并且文库的库容量超过108。
实施例3人源特异性抗金黄色葡萄球菌Fab抗体文库筛选
1、细菌纯化及抗体噬菌体制备
将冻存的文库菌液按照1:100的比列接种LB-青霉素培养基进行复苏，待OD600读值在0.5～0.6之间时取出菌液并按照1:1000的比列加入辅助噬菌体M13。37℃静置30min后继续震荡培养30min，离心收集菌体并且用含有氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养基30℃恒温摇床过夜培养。将菌液4℃3000g离心10min收集上清噬菌体，加入PEG/NaCl溶液充分混合，置于冰上静置30min后，4℃3000g离心20min，去除上清，沉淀加入PEG/NaCl溶液充分混合，置于冰上30min后，4℃11000g离心2min，去除上清，沉淀使用1mLPBS重悬并加入甘油-80℃保存备用。
2、抗原包被
wtHla蛋白按100μL 5×1011μg/mL4℃包被过夜；除去上清后使用PBS洗1次，拍干，用3％脱脂奶粉封闭，于37℃孵育2h，去除封闭液使用PBST洗涤3次，存4℃备用。
3、噬菌体文库淘选
将抗体噬菌体加入抗原包被的ELISA板，37℃孵育20min，依次使用PBST和PBS溶液洗涤10次去除不结合的噬菌体；使用胰酶消化下结合的噬菌体之后，加入培养至OD600在0.5～0.6的TG1细菌侵染30min。离心收集菌体并涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上37℃过夜培养。次日通过梯度稀释确定淘选的噬菌体子文库的滴度并收集菌体，将噬菌体子文库使用上述的方法重新进行噬菌体包装作为下一轮淘选的输入噬菌体文库。淘选过程重复三轮以最大限度的富集高亲和力的抗体。
4、噬菌体文库筛选
经过淘选富集的噬菌体通过含有氨苄青霉素的LB平板涂布产生细菌单克隆，挑取单克隆到96孔培养板中培养并包装噬菌体，以进行噬菌体ELISA的筛选。将抗体噬菌体加入抗原包被的ELISA板，37℃孵育20min，使用PBST溶液洗涤3次以去除没有结合的噬菌体；加入荧光标记抗体，37℃孵育20min，使用PBST洗涤3次；检测ELISA荧光信号强度筛选特异性抗体，扩增对应阳性孔抗体噬菌粒，并进行测序分析。
实施例4抗Hla全人源抗体的克隆、表达和纯化
1、实验方法
实施例3中筛选出的阳性Fab展示载体作为模板，使用载体引物通过PCR分别扩增人Ig VH和VK/L，产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
抗体基因序列测定与生物信息学分析：将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体基因PCR产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒进行纯化，并分别从正向与反向进行序列测定，用IMGT在线服务器(http：//imgt.cines.fr/)来分析抗体基因家族、突变率及CDR区。
将凝胶电泳鉴定为阳性、且重链与轻链可匹配成对的抗体可变区基因的PCR产物利用TA克隆的方法连接到含有重链恒定区或者轻链恒定区的pcDNA3.4载体上，构建全人源抗Hla抗体的表达载体，然后将表达载体转化DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素的平板上37℃培养过夜，挑取10个单菌落用特异性引物进行PCR，反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸100s，28个循环；72℃延伸5min。取5μLPCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。
将所得阳性转化子中的载体质粒转化DH5α进行大量扩增，快速提取重组质粒后，与转染试剂PEI 37℃共孵育15～20min后转染HEK 293F细胞，并在37℃摇床，5％CO2培养箱中125rpm/min震荡培养。5d后3000g，4℃离心30min收集细胞上清，利用蛋白A亲和层析法进行纯化；利用SDS-PAGE检验抗体的表达及纯化情况。
2、实验结果
该方案成功构建了一系列抗体的重链和轻链表达载体。并将其中一种抗体克隆命名为全人源Hla单克隆抗体Hla-38(简称Hla-38抗体或Hla-38单克隆抗体)。
SDS-PAGE检测结果如图3所示，结果显示转染细胞中Hla-30抗体的相对分子量约160～180kDa，重链约55kDa，轻链约25kDa，表明转染细胞能成功表达抗体。
Hla-38抗体序列如下：
1)氨基酸序列
1.1)H-CDR1(SEQ ID NO.1)：GFDLNSFA。
1.2)H-CDR2(SEQ ID NO.2)：IWHDGSER。
1.3)H-CDR3(SEQ ID NO.3)：KSGDYYENSGYFGS。
1.4)L-CDR1(SEQ ID NO.4)：QSVGND。
1.5)L-CDR2(SEQ ID NO.5)：GAS。
1.6)L-CDR3(SEQ ID NO.6)：QQYNNWWT。
1.7)重链可变区(SEQ ID NO.7)：
QVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCIVSGFDLNSFAMHWVRQPPGKGLEWVAVIWHDGSERFYAASVKGRFTISRDTSRNTLFLQMNSLRVEDTAVYYCAKSGDYYENSGYFGSWGQGALVTVSS。
1.8)轻链可变区(SEQ ID NO.8)：
ELVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNDLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGFGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWWTFGQGTKVDIK。
2)核苷酸序列
2.1)H-CDR1(SEQ ID NO.9)：GGATTCGACCTCAATAGCTTTGCT。
2.2)H-CDR2(SEQ ID NO.10)：ATCTGGCATGATGGAAGTGAGAGG。
2.3)H-CDR3(SEQ ID NO.11)：
GCGAAATCGGGAGATTATTATGAAAATAGCGGTTATTTTGGCTCC。
2.4)L-CDR1(SEQ ID NO.12)：CAGAGTGTTGGCAACGAC。
2.5)L-CDR2(SEQ ID NO.13)：GGTGCATCC。
2.6)L-CDR3(SEQ ID NO.14)：CAGCAATATAATAACTGGTGGACG。
2.7)重链可变区(SEQ ID NO.15)：
CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTATAGTGTCTGGATTCGACCTCAATAGCTTTGCTATGCACTGGGTCCGCCAGCCTCCAGGCAAGGGTCTGGAGTGGGTGGCAGTTATCTGGCATGATGGAAGTGAGAGGTTCTATGCAGCCTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCTAGAGATACCTCCCGGAACACGTTGTTTCTCCAAATGAATAGTCTGAGAGTCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAATCGGGAGATTATTATGAAAATAGCGGTTATTTTGGCTCCTGGGGCCAGGGAGCCCTCGTCACCGTCTCTTCA。
2.8)轻链可变区(SEQ ID NO.16)：
GAGCTCGTGTTGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGAGCCAGTCAGAGTGTTGGCAACGACTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTTTGGGACAGAGTTCACTCTCACAATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTATTGTCAGCAATATAATAACTGGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAAGTGGATATCAAA。
实施例5 Hla-38抗体的结合活性检测
1、实验方法
以野生型wtHla(2μg/mL)和重组表达的mHla(2μg/mL)蛋白分别为抗原包被ELISA96孔板，每孔100μL，4℃过夜包被，用封闭液常温封闭2h。实施例6中转染表达的Hla-38抗体(300μg/mL)倍比稀释后，每个稀释度每孔100μL；阳性对照为疫苗血清(1:1000倍稀释)每孔100μL，阴性对照为阴性血清(1:50倍稀释)和阴性对照无关抗体IgG1(0.5μg/mL)每孔100μL，空白加100μL封闭液，均为3个复孔，37℃孵育1h。
用PBST缓冲液洗板一次(3个循环)，每孔加100μL用封闭液按1:5000进行稀释的Goat-Anti-Human-IgG-Fab-HRP(二抗)，37℃孵育1h。PBST缓冲液洗板一次(5个循环)，避光，每孔加TMB 100μL，37℃放置5～10min，立即用50μL的2M H2SO4终止。双波长450/650nm检测OD值。计算阴性对照无关抗体IgG1的均值，算出阈值(均值的3倍)，大于阈值为阳性抗体，并计算EC50。
2、实验结果
结合活性检测实验结果如图4所示，结果表明全人源Hla单克隆抗体Hla-38能与mHla和wtHla结合。wtHla和mHla的EC50计算结果分别为0.330μg/mL和0.849μg/mL。
实施例6Hla-38抗体的表位类型确定
1、实验方法
1)蛋白样品制备：0.8μg mHla和wtHla蛋白样品中加入2.5μL还原型LoadingBuffer(含β－巯基乙醇)，用PBS补足10μL并在沸水浴中煮5min。安装电泳槽和预制胶，加入电泳缓冲液，拔掉梳子后上样。设定电泳仪电压为140V电泳时间1～2h。电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳。电泳胶用水冲洗后，与转膜试剂盒一起组装后放入转膜仪，使用自动转膜仪转膜；转膜后的PVDF膜用含5％脱脂奶粉的TBST溶液完全覆盖后封闭，放在摇床上室温封闭1h。PVDF膜用TBST溶液洗3次，每次5min；然后用TBST配制含有1％脱脂奶粉的溶液，随后按照1:7500加入抗人IgG-AP，将PVDF膜放入上述溶液中，置于水平摇床上室温孵育1h。
2)TBST液：50mL 20×TBS，5mL Tween20，945mL水补足1L，混匀后使用。
3)使用免疫蛋白印迹(WB)检测抗体抗原结合反应。PVDF膜用TBST溶液洗3次，每次5min；将PVDF膜放入干净的平皿中，每块膜避光滴加约1mL的AP显色液，观察条带显色，至条带明显时，加入水终止反应。
2、实验结果
WB检测结果如图5所示，结果显示Hla-38抗体能够和变性后的mHla和wtHla结合，表明Hla-38抗体的表位为线性表位。
实施例7Hla-38抗体对α-溶血素溶血活性的中和作用
1、实验方法
将10％兔红细胞(RBC)悬液进行2倍倍比稀释，分别加入150μL 0.25％Triton X-100，考察兔红细胞(RBC)悬液浓度以确保在540nm处OD值约为1。将wtHla蛋白做2倍倍比稀释，于37℃预孵育0.5h，分别加入150μL的1.5％兔红细胞(RBC)，37℃溶血1h，确定wtHla的最佳溶血浓度(≥90％溶血)；将75μL 5.0μg/mL的wtHla分别与75μL不同浓度的Hla-38及对照抗体(不与wtHla反应的抗体，即IgG1)在37℃预孵育0.5h，加入1.5％兔红细胞(RBC)37℃溶血1h后，将完整的细胞通过离心而沉淀。将200μL的上清液转移至新的96孔平底板，并且用分光光度计测量A540。中和活性是相对于仅使用RBC和wtHla的溶解度来计算的，计算公式为：中和率％＝[1-(试验孔A540-PBS对照孔A540)/(wtHla对照孔A540-PBS对照孔A540)]×100％。在恒定数量的wtHla和兔RBC的存在下，将纯化的Hla-38抗体逐步提高剂量，通过上清液中的血红蛋白释放来测量溶血。计算EC50。
2、实验结果
实验结果如图6所示，结果显示兔红细胞(RBC)悬液浓度为0.75％，wtHla的最佳溶血浓度为5.0μg/mL(149.70nM)，中和活性EC50为5.95μg/mL(39.69nM)，以上表明Hla-38抗体可以有效地抑制a-溶血素对兔红细胞的损害作用。
实施例8Hla-38抗体对a-溶血素裂解A549细胞的中和作用
1、实验方法
在wtHla介导的人细胞系A549(肺泡上皮细胞系)的溶解中检查纯化抗体的活性，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的抑制率％来量化细胞溶解。从每个孔减去背景LDH，对LDH释放的抑制率％＝[1-(试验孔A450-PBS对照孔A450)/(wtHla对照孔A450-PBS对照孔A450)]×100％。
将A549细胞悬液调至1.5×105/mL，维持在补充有非必需氨基酸谷氨酰胺和10％的胎牛血清的DMEM中，100μL/孔加入到96孔U形板在5％CO2、37℃培养箱中培养2～4h使细胞贴壁；将100μL野生型wtHla(100μg/mL)蛋白加入A549细胞孵育6h、9h、12h，每100μL培养基加10μL CCK-8试剂，37℃孵育1h后，测定450nm吸光度，确定最佳孵育时间。不同浓度wtHla在37℃预孵育0.5h后、加入A549细胞孵育6h裂解A549细胞，测定wtHla蛋白浓度及杀伤率；将50μLwtHla蛋白和不同浓度的Hla-38抗体及阴性对照抗体(不与wtHla反应的抗体，即IgG1)在37℃预孵育0.5h，随后添加A549细胞培养6h，按照CCK8试剂盒说明书，测定细胞溶解后测量乳酸脱氢酶(LDH)的释放量，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的抑制率％来量化细胞溶解。
2、实验结果
实验结果如图7所示，结果显示最佳孵育时间为6h，wtHla蛋白浓度为85.50μg/mL(2559.88nM)时杀伤率为59.3％，Hla-38抗体的中和活性EC50为145.39μg/mL(968.92nM)。以上结果表明抑制兔RBC溶解的Hla-38抗体也抑制wtHla介导的人A549细胞的溶解，体现了Hla-38抗体在感染期间抑制金黄色葡萄球菌溶血素的潜在效用，由此限制金黄色葡萄球菌相关症状和疾病的进展。
实施例9Hla-38抗体体内中和保护性评价试验
1、实验方法
1)wtHla剂量摸索：将wtHla用生理盐水稀释成200、150、100及50μg/mL，用于腹腔攻毒，以200μg/mL的mHla作为阴性对照，取以上各浓度的wtHla及mHla各100μL，置于37℃水浴锅中温浴30min后，对小鼠进行腹腔注射，100μL/只。小鼠分为5组，每组6只小鼠。试验周期为7天，腹腔注射后，每12h记录小鼠生存情况并计算生存率。
2)Hla-38中和保护率测定
将50μL分别含有2.5μg、5μg、10μg、20μg Hla-38抗体的抗体溶液分别与50μL含有15μg wtHla的抗原溶液混合，于37℃孵育30min后，每组6只小鼠，每只老鼠进行腹腔注射。试验周期为7天，每12h记录小鼠生存情况并计算生存率。
2、实验结果
实验结果如图8所示，剂量摸索实验结果显示20μg wtHla能够导致小鼠100％死亡，15μg wtHla可致死＞80％的小鼠(N＝6)，5μg wtHla及20μg mHla腹腔注射后，不引起小鼠死亡。中和保护性评价实验结果显示20μg Hla-38抗体组小鼠生存率＞80％，10μg Hla-38抗体保护率为50％，5μg及2.5μg Hla-38抗体保护率＜30％(N＝6)，以上四组小鼠生存率明显高于阴性对照组生存率，差异具有统计学意义(p<0.05)。此结果表明有效抑制性抗体被动给予是用于疾病预防的有效途径。总之，该试验结果说明金黄色葡萄球菌α-溶血素在致病菌中的作用，并且提供了能抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素功能以及限制金黄色葡萄球菌感染导致严重致病甚至死亡的抗体的用途和证据。
实施例10MRSA全身感染模型的建立及保护性评价
1、实验方法
1)MRSA全身感染模型(菌血症模型)感染剂量摸索：试验共分为6组，每组10只BALB/c小鼠。生理盐水对照组：每只小鼠静脉注射100μL生理盐水；3×108CFU组：每只小鼠静脉注射3×109CUFs/mL的USA 300菌液100μL(3×108CFU/只)；4×108CFUs组：每只小鼠静脉注射4×109CUFs/mL的USA 300菌液100μL(4×108CFUs/只)；5×108CFUs组：每只小鼠静脉注射5×109CUFs/mL的USA300菌液100μL(5×108CFUs/只)；6×108CFUs组：每只小鼠静脉注射6×109CUFs/mL的USA300菌液100μL(6×108CFUs/只)；7×108CFUs组：每只小鼠静脉注射7×109CUFs/mL的USA 300菌液100μL(7×108CFUs/只)。试验周期为7天，攻毒后每12h观察并记录小鼠生存情况并计算生存率。
2)MRSA全身感染模型生存率分析：取40只BALB/c小鼠(20g±1g)，分为四组，每组10只。每只小鼠静脉注射6.0×108CFUs的USA 300菌液100μL(6×108CFUs/只)。2h后，对四组小鼠按如下分组进行抗体注射，20mg/kg组：尾静脉注射400μg Hla-38，体积100μL；10mg/kg组：尾静脉注射200μg Hla-38，体积100μL；无关抗体对照组：尾静脉注射400μg IgG1，体积100μL；生理盐水对照组：尾静脉注射100μL生理盐水。试验周期为7天，每12h观察小鼠生存时间及计算生存率。
2、实验结果
实验结果如图9所示，MRSA全身感染模型感染剂量摸索结果显示，6×108CFUs/只可以导致90％小鼠死亡，故选择此剂量作为生存率分析试验感染剂量；MRSA全身感染模型生存率分析结果显示，20mg/kg体重的Hla-38组小鼠生存率为90％，10mg/kg Hla-38组小鼠生存率为70％，两组小鼠生存率明显高于阴性对照组(0％)，差异具有统计学意义(p<0.05)，无关抗体对照组小鼠生存率为10％。表明全人源抗Hla抗体Hla-38能抵抗MRSA的全身性侵袭。
实施例11MRSA肺炎模型
1、实验方法
1)MRSA肺炎模型感染剂量摸索：试验共分为6组，每组10只BALB/c小鼠。生理盐水对照组：每只小鼠气管注射20μL生理盐水；0.7×108CFUs组：每只小鼠静脉注射3.5×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(0.7×108CFUs/只)；0.8×108CFUs组：每只小鼠静脉注射4.0×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(0.8×108CFUs/只)；0.9×108CFUs组：每只小鼠静脉注射4.5×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(0.9×108CFUs/只)；1.0×108CFUs组：每只小鼠静脉注射5.0×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(1.0×108CFUs/只)；1.1×108CFUs组：每只小鼠静脉注射5.5×109CUFs/mL的USA 300菌液20μL(1.1×108CFUs/只)。试验周期为7天，攻毒后每12h观察小鼠生存时间及计算生存率。
2)MRSA肺炎模型生存率分析：取40只BALB/c小鼠(20g±1g)，分为四组，每组10只。对所有小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉(30mg/kg)后，通过气管注射20μL USA300菌液对小鼠攻毒(1.0×108CFUs/只)。攻毒2h后，对四组小鼠按如下分组进行抗体注射，20mg/kg组：尾静脉注射400μg Hla-38，体积100μL；10mg/kg组：尾静脉注射200μg Hla-38，体积100μL；无关抗体对照组：尾静脉注射400μg IgG1，体积100μL；生理盐水对照组：尾静脉注射100μL生理盐水。试验周期为7天，每12h观察小鼠生存时间及计算生存率。
2、实验结果
实验结果如图10所示，MRSA肺炎模型感染剂量摸索实验结果显示，1×108CFUs/只可以导致90％小鼠死亡，故选择此剂量作为生存率分析试验感染剂量。MRSA肺炎模型生存率分析结果显示，20mg/kg体重的Hla-38组小鼠生存率为70％，10mg/kg Hla-38组小鼠生存率为50％，两组小鼠生存率明显高于阴性对照组(0％)，差异具有统计学意义(p<0.05)，无关抗体对照组小鼠生存率为10％。以上表明全人源抗Hla抗体Hla-38能抵抗MRSA的肺部感染，抑制疾病进展。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.一种抗金黄色葡萄球菌α-溶血素的抗体，其特征在于，所述抗体包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3和/或SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3；
优选地，所述抗体包含与SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的重链可变区和/或与SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的轻链可变区；
优选地，所述抗体包含SEQ ID NO.7的氨基酸序列所示的重链可变区和/或SEQ IDNO.8的氨基酸序列所示的轻链可变区；
优选地，所述抗体包含重链抗体、Fab、F(ab’)、(Fab)2、scFv、Fd、Fv或全长抗体；
优选地，所述抗体包含单克隆抗体或嵌合抗体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体；
优选地，所述抗体为全人源抗体；
优选地，所述金黄色葡萄球菌为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
2.一种编码权利要求1所述的抗体的多核苷酸；
优选地，编码H-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
优选地，编码H-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
优选地，编码H-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；
优选地，编码L-CDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
优选地，编码L-CDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；
优选地，编码L-CDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
优选地，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
优选地，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
3.一种包含权利要求2所述的多核苷酸的重组载体。
优选地，所述重组载体是将所述多核苷酸插入质粒构建而成的；
优选地，所述质粒包含pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT或pcDNA3.4；
优选地，所述质粒为pcDNA3.4。
4.一种包含或表达权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的重组载体的重组细胞；
优选地，所述重组细胞包含哺乳动物细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞包含CHO细胞、NS0细胞、HEK 293细胞、HEK 293T细胞、HEK293E细胞、HEK 293-6E细胞、HEK 293F细胞和/或per.C6细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞为HEK 293F细胞。
5.一种包含可检测标记的权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求2所述的核酸分子、赋予抗生素抗性的权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求2所述的核酸分子、与治疗剂结合或偶联的权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段和/或权利要求2所述的核酸分子的衍生物；
优选地，所述可检测标记包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、荧光染料；
优选地，所述抗生素抗性的基因包含红霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、新霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因；
优选地，所述治疗剂包含放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂。
6.一种包含权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞或权利要求5所述的衍生物的药物组合物；
优选地，所述药物组合物具有抑制生物学细胞的溶解、抑制与金黄色葡萄球菌α-溶血素介导的肿瘤细胞的溶解、抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力；
优选地，所述生物学细胞包含红细胞、中性粒细胞、上皮细胞、淋巴细胞、单核细胞或巨噬细胞；
优选地，所述生物学细胞为红细胞；
优选地，所述肿瘤包含脑癌、前列腺癌、肝癌、卵巢癌、胃癌、结直肠癌、咽喉癌、乳腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、肺癌、肉瘤、子宫颈癌、睾丸癌、膀胱癌、内分泌癌、子宫内膜癌、食道癌、肾癌、鼻咽癌或胆囊癌；
优选地，所述肿瘤为肺癌；
优选地，肺癌细胞包含A549、NCI-H460、HCC827或H1299细胞；
优选地，所述肺癌细胞为A549细胞；
优选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
7.一种包含权利要求1所述的抗体和/或权利要求5所述的衍生物的检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的产品。
8.一种包含特异性结合权利要求1所述的抗体的表位的疫苗；
优选地，所述表位为线性表位。
9.如下任一项方法：
(1)一种非诊断目的的检测金黄色葡萄球菌α-溶血素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(a)将获取的样品与权利要求1所述的抗体接触；
(b)检测样品与抗体的免疫反应；
(2)一种包含培养权利要求4所述的重组细胞制备权利要求1所述的抗体的方法；
(3)一种包含将权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的重组载体引入细胞中制备权利要求4所述的重组细胞的方法；
优选地，所述重组载体在引入细胞前转化为DH5α感受态细菌；
优选地，所述引入细胞的方法包括磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射、脂质体融合、脂转染和原生质体融合；
优选地，所述引入细胞的方法为脂转染；
优选地，所述脂转染使用的转染试剂包括Lipofectamine2000、Lipofectamine3000或PEI；
优选地，所述转染试剂为PEI；
(4)一种包含使用权利要求1所述的抗体特异性地抑制金黄色葡萄球菌α-溶血素活性的方法。
10.如下任一项应用：
(1)权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞、权利要求5所述的衍生物、权利要求6所述的药物组合物或权利要求8所述的疫苗在制备治疗金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病的药物中的应用；
(2)权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞、权利要求5所述的衍生物、权利要求6所述的药物组合物、权利要求7所述的产品或权利要求8所述的疫苗在制备诊断金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病的产品中的应用；
(3)权利要求1所述的抗体非诊断目的的在金黄色葡萄球菌α-溶血素免疫组织化学测定中的应用；
(4)权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的重组载体、权利要求4所述的重组细胞、权利要求5所述的衍生物在制备权利要求6所述的药物组合物中的应用；
(5)权利要求1所述的抗体制备权利要求5所述的衍生物中的应用；
(6)权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的重组载体在制备权利要求4所述的重组细胞中的应用；
(7)权利要求1所述的抗体、权利要求2所述的多核苷酸在制备权利要求3所述的重组载体中的应用；
(8)权利要求1所述的抗体在制备权利要求2所述的多核苷酸中的应用；
优选地，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病包括肺炎、全身感染、皮肤脓肿、坏死性筋膜炎、心内膜炎、败血症、菌血症、腹膜炎或中毒性休克综合症；
优选地，所述金黄色葡萄球菌α-溶血素感染引起的疾病为肺炎、全身感染。
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