CN106596934A

CN106596934A - 一种检测o型口蹄疫病毒的试剂盒

Info

Publication number: CN106596934A
Application number: CN201611178974.4A
Authority: CN
Inventors: 程海卫; 郑其升; 陈瑾; 徐海; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-12-19
Also published as: CN106596934B

Abstract

本发明提供一种检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，属于生物技术领域。检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，包括O型口蹄疫病毒纳米抗体6和辣根过氧化酶标记的O型口蹄疫病毒纳米抗体24；所述O型口蹄疫病毒纳米抗体6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述O型口蹄疫病毒纳米抗体24的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本发明试剂盒制备方法简单、成本低，特异性较强、灵敏度较高、稳定性好。

Description

一种检测O型口蹄疫病毒的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测O型口蹄疫病毒的试剂盒。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起的一种烈性传染病，是世界范围内对畜牧业发展威胁最大的一种动物传染病。口蹄疫传染性极强、发病率极高，被世界动物卫生组织(OIE)列为动物14种A类传染病之首，我国动物卫生部门也将其列为一类传染病。

口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，目前已经发现有7个血清型，即O、A、C，SAT1、SAT2、SAT2、和AsiaI型，不同血清型之间不存在交叉反应和保护。现阶段我国主要流行O型、A型和亚洲1型。其中，O型是临床发病最多，破坏力最大的血清型之一，近年来先后几十个国家都出现O型口蹄疫的疫情。口蹄疫的爆发往往引起巨大的经济损失，因此被世界各国列为影响养殖业安全的最重要的传染病之首。当爆发口蹄疫疫情时，发展中国家主要通过接种灭活疫苗作为防止疫病发生的唯一手段控制口蹄疫的流行，发达国家通过疫苗免疫和捕杀病原阳性动物的方式达到无口蹄疫疫情状态。

建立快速、敏感、特异的病原诊断方法对于监测O型口蹄疫病毒来说尤为重要。其中酶联免疫检测方法是一种常用的方法，但是现有技术中检测O型口蹄疫病毒的酶联免疫试剂盒多采用多克隆抗体，不仅制备方法复杂、成本高，而且灵敏度、特异性和稳定性仍然不能满足满足实际检测的需要。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，该试剂盒制备方法简单、成本低，特异性较强、灵敏度较高、稳定性好。

本发明的第二个目的在于提供检测O型口蹄疫病毒的试剂盒的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，包括O型口蹄疫病毒纳米抗体6和辣根过氧化酶标记的O型口蹄疫病毒纳米抗体24；所述O型口蹄疫病毒纳米抗体6的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述O型口蹄疫病毒纳米抗体24的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

优选的技术方案中，所述O型口蹄疫病毒纳米抗体6的浓度为0.5-1.5mg/mL，辣根过氧化酶标记的O型口蹄疫病毒纳米抗体24的浓度为40-60μg/mL。

优选的技术方案中，所述O型口蹄疫病毒纳米抗体6采用如下方法制备：将O型口蹄疫病毒纳米抗体6的编码基因插入pMESC载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌A；诱导重组菌A表达目的蛋白，裂解重组菌A后纯化获得纳米抗体6。

优选的技术方案中，O型口蹄疫病毒纳米抗体6的编码基因序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的技术方案中，所述辣根过氧化酶标记的O型口蹄疫病毒纳米抗体24采用如下方法制备：将O型口蹄疫病毒纳米抗体24的编码基因插入pMESC载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌B；诱导重组菌B表达目的蛋白，裂解重组菌B后纯化获得纳米抗体24；采用辣根过氧化酶标记纳米抗体24。

优选的技术方案中，O型口蹄疫病毒纳米抗体24的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明中，所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶底物显色液、O型口蹄疫病毒标准品、牛血清白蛋白溶液、包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、终止液和酶标板。

本发明的有益效果在于：本发明通过噬菌体展示技术进行纳米抗体的筛选，得到了两个可以识别不同表位、高灵敏度、高特异性、高稳定性的纳米抗体，分别可以作为检测O型口蹄疫病毒的包被抗体和检测抗体。本发明利用所获得的两株纳米抗体建立的双抗夹心ELISA检测试剂盒，是国内外首次利用纳米抗体研制的O型口蹄疫病毒双抗夹心ELISA检测试剂盒，可以实现对O型口蹄疫病毒高灵敏度的检测，检测下限达到了0.01μg/mL，另外该试剂盒特异性好、稳定性高、操作简单、省时省力，适合临床样品的批量检测。本发明所获得的纳米抗体可以通过培养重组菌，原核诱导表达的简单方法制备，缩短试剂盒生产周期、降低成本。由于本发明纳米单抗具有较高的稳定性，因此与其他同类型抗体相比时，本发明获得的纳米抗体可以显著延长试剂盒的有效期、降低成本。

附图说明

图1 VHH基因文库PCR扩增结果，其中M：DL2000bp DNA marker，另一泳道为VHH基因片段扩增产物。

图2是噬菌体基因文库单克隆的鉴定电泳图，其中泳道1-24分别表示随机挑选构建的噬菌体基因文库单克隆，M：DL2000bp DNA marker。

图3显示了噬菌体3轮亲和筛选富集过程，first round、second round、thirdround分别表示第一、第二、第三轮筛选；每轮筛选中，左侧为：O型口蹄疫病毒；右侧为：空白对照组。

图4间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性，Nb表示纳米抗体。

图5间接ELISA方法检测纳米抗体的特异性，Nb表示纳米抗体。

图6纯化后的纳米抗体6和24的SDS-PAGE电泳图和Western Blot鉴定结果。泳道1，2:分别是纯化后的纳米抗体6、24的Western Blot鉴定结果；泳道3、4:分别是纯化后的纳米抗体24、6的SDS-PAGE鉴定结果；M:protein standards。

图7纳米抗体热稳定性鉴定结果，横坐标表示处理时间，纵坐标表示相对活力。

图8间接ELISA方法检测HRP标记后的Nb6、Nb24与O型口蹄疫病毒的结合活性。

图9双抗体夹心法鉴定纳米抗体敏感性，横坐标为O型口蹄疫病毒的浓度。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1 针对O型口蹄疫病毒纳米抗体文库的构建

1.RNA的提取与cDNA的合成

将1mg O型口蹄疫灭活病毒与弗氏完全佐剂等体积混合，对一只新疆双峰驼进行免疫；1周之后，将1mg O型口蹄疫灭活病毒与弗氏不完全佐剂等体积混合，免疫该双峰驼，每周一次，共免疫6次，刺激机体产生针对抗原的特异性抗体；免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞，提取淋巴细胞的总RNA，按照反转录试剂盒(购自TAKARA公司)说明操作，合成cDNA。

2.引物的设计与合成

根据参考文献(Beta-lactamase inhibitors derived from single-domainantibody fragments elicited in the camelidae，Conrath Katja et.al，Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2001，45,2807-2812.)设计用于扩增骆驼重链抗体可变区基因VHH片段(350bp)的PCR引物C1F、C1R、V_HHF和V_HHR。各引物的具体序列如表1。

表1 PCR扩增引物

引物	序列(5’-3’)
		C1F	GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
C1R	GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
		V_HHF	GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG(下划线为PstⅠ酶切位点)
V_HHR	CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT(下划线为NotⅠ酶切位点)

注：表1中的简并碱基R＝A或G。

3.VHH片段的扩增

利用本实施例标题1中合成的骆驼cDNA为模板，PCR扩增VHH片段。首先，以cDNA为模板，利用C1F和C1R为上下游引物，扩增获得大小约为750bp的基因片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，59℃1min，72℃1min，共30个循环；72℃10min。反应结束后，回收大小约为750bp的基因片段。然后，以该大小约为750bp的基因片段为模板，利用V_HHF和V_HHR为上下游引物，扩增VHH片段，反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃1min，72℃30s，共30个循环；72℃10min。反应结束后，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，紫外灯下观察目的条带，如图1所示，可见大约350bp的VHH基因片段，与预期大小一致。利用凝胶回收试剂盒(购自TAKARA公司)说明书进行操作，对目的条带进行纯化和回收。

4.噬菌体展示基因文库的构建

纯化回收的VHH基因片段采用Pst I和Not I酶切后，连入pMESC载体(购自Novagen公司)。将连接产物转化至E.coli TG1感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃培养1h，将菌液离心浓缩后涂在含有氨苄抗性的LB平板培养基上，37℃过夜生长之后随机挑选24个单克隆菌落，利用V_HHF和V_HHR为上下游引物进行菌落PCR鉴定。结果如图2，24个单克隆菌落经菌落PCR鉴定，有22个单克隆菌落含有大小约为350bp的目的片段，说明该文库的插入率达到了91.7％。将上述平板中的菌落刮入LB液体培养基中，然后加入终浓度为30％的甘油，分装保存于-80℃备用，此即为O型口蹄疫病毒噬菌体展示文库。

实施例2 针对O型口蹄疫病毒纳米抗体的筛选过程

1.噬菌体展示文库的扩增

取200μL于-80℃冻存的噬菌体文库，接种至500mL 2×TY培养基中，37℃、摇床转速为200rpm条件下培养3-5h后，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)，37℃孵育1h，随后37℃、摇床转速为200rpm条件下培养过夜。次日，加入80g的PEG6000(购自上海生工公司)沉淀噬菌体，该沉淀即为扩增后的噬菌体文库。将噬菌体文库重悬于5mL 0.1M PBS中，得到其悬液。

2.亲和筛选

将10μg O型口蹄疫病毒加入到10mL、100mM的NaHCO₃溶液(pH8.2)中，混合均匀，取100μL加入96孔酶标板的每孔中，在4℃包被过夜，设立无抗原包被的空白组作为对照；次日，每孔加入100μL、1％脱脂乳溶液，室温封闭2h；然后，每孔加入100μL扩增后的噬菌体文库悬液，室温作用1h，用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，洗掉不结合的噬菌体，随后用100μL、100mM的三乙胺(购自上海生工公司)溶液将与O型口蹄疫病毒特异性结合的噬菌体洗脱下，并感染5倍体积处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，加入50μL辅助噬菌体VCSM13(购自Novagen公司)侵染TG1细胞，离心取上清液，即得第一轮筛选到的噬菌体，用于下一轮的筛选。相同筛选过程共进行3轮。每一轮筛选获得的噬菌体各取10μL涂于LB固体培养基上，均在37℃过夜培养，用于观察亲和筛选富集过程。如图3所示，文库经三轮亲和筛选后，每一轮筛选富集到的噬菌体均较上一轮要多。

实施例3 酶联免疫方法(ELISA)筛选特异性阳性克隆

1.纳米抗体的表达

从实施例2中第三轮筛选后富集在LB平板上的菌落中，挑选95个单菌落分别接种于添加有TB培养基(含有100μg/mL氨苄青霉素)的96孔板中，并设置一个仅加入了TB培养基的空白对照，在37℃、摇床转速为200rpm条件下培养至对数生长期，各孔均加入终浓度为1mM的IPTG，在28℃、摇床转速为200rpm条件下过夜培养。次日，利用超声破碎法分别获得各重组菌表达的纳米抗体，各纳米抗体编号依次为1～96。

2.间接ELISA方法检测纳米抗体的结合活性

采用间接ELISA反应鉴定各纳米抗体与O型口蹄疫病毒的结合活性。将10μg O型口蹄疫病毒加入到10mL 100mM的NaHCO₃溶液(pH8.2)中，混合均匀，取100μL加入到96孔酶标板的每孔中，在4℃包被过夜；次日，弃掉板内液体，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，拍干，每孔加入100μL、5％脱脂乳溶液，室温封闭2h；利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗5遍，将各纳米抗体依次加入ELISA板的各孔中，室温下孵育1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的纳米抗体，加入100μL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪公司)，室温放置1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的HRP labeled goatanti-mouse IgG(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体，购自艾美捷公司)，室温放置1h，利用含有0.05％Tween-20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液(购自上海生工公司)，37℃孵育15min，每孔各加50μL、2M的硫酸溶液终止反应，使用酶标仪测定各孔在450nm波长处的吸光值OD₄₅₀。当样品孔OD₄₅₀值大于对照孔OD₄₅₀值2.5倍以上时，判为阳性克隆孔。结果如图4所示，纳米抗体6和24可与O型口蹄疫病毒发生结合反应，且不与对照孔发生反应。

3.特异性的鉴定

按照本实施例标题2中间接ELISA检测方法，分别检测纳米抗体6和纳米抗体24与A型、Asia1型口蹄疫病毒之间的交叉反应性，利用酶标仪测定相应OD₄₅₀，不同之处在于ELISA板的包被抗原采用A型、Asia1型口蹄疫病毒替代O型口蹄疫病毒。结果如图5所示，本发明获得的纳米抗体6和纳米抗体24对A型、Asia1型口蹄疫病毒交叉反应性极低，说明纳米抗体6和纳米抗体24是针对O型口蹄疫病毒的特异性纳米抗体。分别抽提表达纳米抗体6和纳米抗体24重组菌的质粒，送上海生工公司进行序列测定，分别获得纳米抗体6、纳米抗体24的基因序列和氨基酸序列。纳米抗体6的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示，纳米抗体24的氨基酸序列和基因序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

实施例4 O型口蹄疫病毒纳米抗体的纯化

分别抽提表达纳米抗体6和24的重组菌中的质粒，42℃分别转化到大肠杆菌WK6感受态细胞(购自Novagen公司)中，37℃、摇床转速为200rpm的条件下培养1h，离心浓缩菌液，并将其涂布在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12～16小时；挑选单个菌落，分别获得表达纳米抗体6的重组菌A和表达纳米抗体24的重组菌B；或者将纳米抗体6和24的基因序列送至华大、生工等生物技术公司进行合成，然后插入pMESC载体(购自Novagen公司)的Pst I和Not I酶切位点之间，随后分别在42℃转化到大肠杆菌WK6感受态细胞(购自Novagen公司)，也可以得到重组菌A和重组菌B。

分别采用重组菌A和重组菌B制备纳米抗体6和纳米抗体24。具体方法如下：将重组菌接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，在37℃摇床中培养至OD₆₀₀＝0.6～0.9，取1mL菌液转接至500mL TB培养液中，在37℃摇床中培养，当OD₆₀₀值达到0.6～0.9时，加入终浓度为1M的IPTG，在28℃摇床中培养12～16小时诱导重组菌表达目的蛋白，离心收集菌体沉淀，利用超声破碎获得纳米抗体粗提液，采用镍柱(购自GE Healthcare公司)亲和层析法纯化纳米抗体。取纯化后的纳米抗体进行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。从如图6可以看到纳米抗体6、24在大约16kD处均有明显条带，与目的片段预期大小相一致，纯度达90％以上。

实施例5 O型口蹄疫病毒纳米抗体热稳定性鉴定

用PBS缓冲液将纳米抗体6、24均稀释到1mg/mL，37℃分别静置0、4、8、12、24和48h；将处理后的纳米抗体分别转移至采用O型口蹄疫病毒包被过夜的ELISA板中，室温下孵育1h，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的Mouse anti-HA tag antibody(鼠抗HA抗体，购自北京康为世纪公司)，室温放置1h，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入100μL经1:2000稀释后的HRPlabeled goat anti-mouse IgG(辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体，购自艾美捷公司)，室温放置1h，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗去未结合的抗体，加入辣根过氧化物酶显色液，37℃孵育15min，每孔各加50μL 2M的硫酸溶液终止反应，使用酶标仪测定450nm波长处的吸光值。如图7所示，两株纳米抗体在37℃处理不同时间后，仍保持较好的反应活性，说明本发明所获得的纳米抗体具有较好的热稳定性，与传统抗体相比，本发明所获得的纳米抗体用作诊断试剂盒的检测试剂可以延长试剂盒的有效期。

实施例6 纳米抗体敏感性的鉴定

1.制备HRP标记的纳米抗体：

制备HRP标记的纳米抗体6或HRP标记的纳米抗体24。称取10mg HRP(辣根过氧化酶，购自上海生工公司)溶于2mL双蒸水中，加入1mL新鲜配制的0.1M的偏高碘酸钠溶液，4℃放置30min；加入2.5％的乙二醇水溶液2mL，室温放置1h；加入1mg待标记的纳米抗体6或纳米抗体24，调节pH至9.0，4℃放置12-16h，加入0.1mL浓度为5mg/mL的硼氢化钠溶液，混匀后在4℃放置3h；3000rpm离心30min，去除沉淀物，上清即为HRP标记的纳米抗体。利用间接ELISA方法(实施例3中标题2)检测酶标纳米抗体反应能力。如图8所示，HRP标记后的纳米抗体6、纳米抗体24仍具有较强的与O型口蹄疫病毒的结合能力，且结合能力几乎等同未标记的纳米抗体。纳米抗体6、纳米抗体24分别缩写为Nb6和Nb24。

2.纳米抗体识别表位的鉴定

Nb6和Nb24分别作为捕获抗体直接包被96孔酶标板，每孔1μg，4℃包被过夜；次日，弃掉板内液体，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，加入O型口蹄疫病毒(10μg/mL)作为中间抗原，每孔100μL，室温孵育1h；用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，以Nb6包被的酶标板中加入HRP标记的Nb24(缩写为HRP-Nb24)，以Nb24包被的酶标板中加入HRP标记的Nb6(缩写为HRP-Nb6)，每孔0.5μg，室温孵育1h；用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，加入100μL辣根过氧化物酶显色液，37℃孵育15min，每孔各加50μL、2M的硫酸溶液终止反应，使用酶标仪测定450nm波长处的吸光值。结果如表2，分别利用两株纳米抗体进行双抗体夹心ELISA鉴定，两株纳米抗体分别识别不同的抗原表位。

表2 双抗体夹心ELISA鉴定纳米抗体识别表位(OD₄₅₀)

包被抗原	HRP-Nb6	HRP-Nb24
			Nb6	-	1.63
Nb24	1.58	-

3.纳米抗体敏感性的鉴定

取Nb6作为捕获抗体包被酶标板，每孔1μg，4℃包被过夜；次日，弃掉板内液体，用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，分别加入0μg/mL、0.001μg/mL、0.01μg/mL、0.1μg/mL、1μg/mL、10μg/mL的O型口蹄疫病毒液作为中间抗原进行孵育，每孔100μL，室温孵育1h；用含有0.05％Tween 20的PBS缓冲液洗5遍，加入HRP-Nb24，每孔0.5μg，室温孵育1h；用含有0.05％Tween20的PBS缓冲液洗5遍，加入100μL辣根过氧化物酶显色液，37℃孵育15min，每孔各加50μL 2M硫酸溶液终止反应，使用酶标仪测定450nm波长处的吸光值。如图9所示，利用Nb6、Nb24建立的双抗体夹心ELISA，可以有效地对O型口蹄疫病毒抗原进行检测，检测下限可达0.01μg/mL。

实施例7 O型口蹄疫病毒检测试剂盒的组装

1.O型口蹄疫病毒检测试剂盒的组成

试剂盒的组成包括：

(1)Nb6溶液：Nb6的浓度为1mg/mL，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)。0.1M PBS缓冲液(pH7.4)配制方法：取8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸二氢钾溶于水，定容至1L，调pH至7.4，高压灭菌之后室温保存。

(2)HRP标记的Nb24溶液：50μg/mL，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)。

(3)辣根过氧化物酶显色液：称取100mg TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，购自上海生工公司)溶于50mL无水乙醇中制成TMB储存液。待使用时取0.5mL TMB储存液加到10mL磷酸-柠檬酸底物缓冲液中(含有0.2M磷酸氢二钠和0.1M柠檬酸的水溶液)，再加入50μL双氧水，混匀，即为辣根过氧化物酶显色液；

(4)O型口蹄疫病毒标准品：O型口蹄疫病毒的浓度为100μg/mL，0.1M PBS缓冲液(pH7.4)。O型口蹄疫病毒标准品通过国际公认的蔗糖密度梯度离心法制备而来，具体操作方法参考文献(A simple method for the quantification of140S particles of foot-and-mouth disease virus(FMDV)，Barteling SJ et.al，Arch Gesamte Virusforsch，1974，45，362–4)。

(5)阴性对照样品：100μg/mL的BSA水溶液。

(6)包被液：100mM的NaHCO₃水溶液，pH8.2。

(7)封闭液：溶质为脱脂乳，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)，脱脂乳的浓度为5％(质量百分浓度)。

(8)洗涤液：溶质为Tween20，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)，Tween20的浓度为0.05％(质量百分浓度)。

(9)样品稀释液：溶质为BSA(牛血清白蛋白)，溶剂为0.1M PBS缓冲液(pH7.4)，BSA的浓度为1％(质量百分浓度)。

(10)终止液：2M硫酸溶液，溶剂为水。

(11)酶标板：购自NUNC公司，5块、96孔、未包被抗原。

2.O型口蹄疫病毒检测试剂盒的使用方法：

(1)利用包被液将Nb6溶液稀释至10μg/mL，96孔酶标板中每孔加入100μL，在4℃包被12～16小时；

(2)次日，弃掉板内液体，利用洗涤液洗5遍，拍干，每孔加入200μL封闭液，室温封闭1小时；

(3)弃掉板内液体，利用洗涤液洗5遍，拍干；利用样品稀释液将待检样品稀释2-10倍，加入到96孔酶标板内，每孔100μL，室温孵育1小时；同时设置O型口蹄疫病毒标准品用于标准曲线的制备，利用稀释液将标准品倍比稀释(浓度依次为10μg/mL，1μg/mL，0.1μg/mL，0.01μg/mL，0.001μg/mL，0μg/mL)，每孔加入100μL，同时设立100μg/mL BSA溶液作为阴性对照，样品稀释液作为空白对照，每个稀释度设立3个重复孔；

(4)弃掉板内液体，利用洗涤液洗5遍，拍干，每孔加入100μL利用样品稀释液1:1000稀释的HRP标记的Nb24溶液，室温孵育1小时；

(5)弃掉板内液体，利用洗涤液洗5遍，拍干，每孔加入100μL辣根过氧化物酶显色液，室温孵育15分钟，每孔加入50μL终止液终止反应，利用酶标仪测定其OD₄₅₀；

(6)结果判定：当待检样品的OD₄₅₀大于阴性孔OD₄₅₀数值2倍以上时，即为阳性，待检样品中O型口蹄疫病毒的具体浓度根据标准品制作的标准曲线确定。

实施例8O型口蹄疫病毒检测试剂盒的应用

1.O型口蹄疫病毒检测试剂盒灵敏度的测定

按照实施例7中方法进行检测标准品，操作结束后，利用各标准品的浓度和相应的OD450数值制作非线性回归方程式作为标准曲线(方程式为y＝-0.058x²+0.711x+0.279，R²＝0.947，其中y为所测定的OD₄₅₀数值，x为样品中病毒的浓度，R²属于统计学范畴，代表决定系数)。利用待检样品的OD450数值可计算出样品中病毒的浓度。检测结果如表3所示：

表3标准品检测结果

标准品浓度(μg/mL)	10	1	0.1	0.01	0.001	0	空白孔	阴性孔
									OD₄₅₀	1.56	0.91	0.55	0.35	0.21	0.11	0.13	0.12

从表3还可以看出，本发明试剂盒的检测灵敏度可达0.01μg/mL，即当待检样品中O型口蹄疫病毒的含量大于等于0.01μg/mL时，能够被本试剂盒检出。

2.O型口蹄疫病毒检测试剂盒特异性的测定

分别检测实施例7中试剂盒与A型、Asia1型口蹄疫病毒之间的交叉反应性，试剂盒的使用方法如实施例7所示，检测结果如表4所示：

表4本发明试剂盒特异性的检测结果

待检样品	O-FMDV	A-FMDV	Asia-1FMDV	空白孔	阴性孔
						OD450	1.57	0.12	0.13	0.12	0.12

检测结果表明，本发明试剂盒具有较好的特异性，能够准确鉴别O型口蹄疫病毒。

3.本发明试剂盒在检测猪血清中O型口蹄疫病毒含量中的应用

取正常猪血清，分别加入不同体积的标准品使猪血清中O型口蹄疫病毒浓度分别达到0.008μg/mL、0.08μg/mL、0.8μg/mL和8μg/mL，充分混匀，按照实施例7所示检测方法进行操作，同时设置未混合标准品的猪血清作为阴性对照，未混合猪血清的标准品(10μg/mL)作为阳性对照，样品稀释液为空白对照，检测结果如表5所示：

表5猪血清中不同浓度口蹄疫病毒的检测结果

检测结果表明，本发明试剂盒具有较好的特异性和较高的灵敏度，能够准确鉴别O型口蹄疫病毒。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种检测O型口蹄疫病毒的试剂盒

<130> 20161219

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 纳米抗体6

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Ala Thr Tyr Ser Lys Tyr

20 25 30

His Ser Ser Leu Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

35 40 45

Arg Phe Ala Ile Ser Lys Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln

50 55 60

Met Asn Ser Leu Lys His Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Ala

65 70 75 80

Gly Thr Ile Asn Cys Pro Val Thr Ala Asp Thr Gly Tyr Trp Gly His

85 90 95

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Arg Ile

100 105

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 纳米抗体6编码基因

<400> 2

caggtgcagc tgcaggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctgaggc cacctacagt aagtaccaca gcagtttgtg catgggctgg 120

ttccgccagg ctccagggaa gggccgattc gccatctcca aagacaacgc caagaacatt 180

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaacat gaggacactg ccatgtacta ctgtgcggcg 240

ggaacgatca actgccccgt taccgccgat accggctact ggggccacgg gacccaggtc 300

accgtctcca gcggccgcat a 321

<210> 3

<211> 122

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> 纳米抗体24

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser His Tyr

20 25 30

Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Arg Asp Gly Asp Ile Thr Ser Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu His

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Thr Met Gly Trp Thr Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Tyr

115 120

<210> 4

<211> 366

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> 纳米抗体24编码基因

<400> 4

caggtgcagc tgcaggagtc tggaggaggc ttggtgcagc ctgggggatc tctgagactc 60

tcctgtgccg cctctggatt cgccttcagt cactatccca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg aactcgagtg ggtctcagct attaaccgtg atggtgatat cacgtcctac 180

gcagagtccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacgctgcat 240

ctgcaattga acagcctgaa aactgaggac acggccatgt attactgcgc cacaactatg 300

ggttggaccc cgtcggatta ttggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctcagcggcc 360

gcatac 366

Claims

1.检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，包括O型口蹄疫病毒纳米抗体6和辣根过氧化酶标记的O型口蹄疫病毒纳米抗体24；所述O型口蹄疫病毒纳米抗体6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述O型口蹄疫病毒纳米抗体24的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于所述O型口蹄疫病毒纳米抗体6的浓度为0.5-1.5mg/mL，辣根过氧化酶标记的O型口蹄疫病毒纳米抗体24的浓度为40-60µg/mL。

3.根据权利要求1所述检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于所述O型口蹄疫病毒纳米抗体6采用如下方法制备：将O型口蹄疫病毒纳米抗体6的编码基因插入pMESC载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌A；诱导重组菌A表达目的蛋白，裂解重组菌A后纯化获得纳米抗体6。

4.根据权利要求3所述检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于O型口蹄疫病毒纳米抗体6的编码基因序列如SEQ ID NO:2所示。

5.根据权利要求1-4之一所述检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于所述辣根过氧化酶标记的O型口蹄疫病毒纳米抗体24采用如下方法制备：将O型口蹄疫病毒纳米抗体24的编码基因插入pMESC载体，然后导入大肠杆菌WK6感受态细胞，获得重组菌B；诱导重组菌B表达目的蛋白，裂解重组菌B后纯化获得纳米抗体24；采用辣根过氧化酶标记纳米抗体24。

6.根据权利要求5所述检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于O型口蹄疫病毒纳米抗体24的编码基因序列如SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求6所述检测O型口蹄疫病毒的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括辣根过氧化物酶底物显色液、O型口蹄疫病毒标准品、牛血清白蛋白溶液、包被液、封闭液、洗涤液、样品稀释液、终止液和酶标板。