CN113087790B - 抗非洲猪瘟p72蛋白单域抗体及应用 - Google Patents

抗非洲猪瘟p72蛋白单域抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医学或生物制药技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体及应用。首先，本发明提供了一种抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，所述单域抗体能够与天然抗原很好的反应，且能够显著抑制非洲猪瘟病毒P72蛋白的表达，进而实现对非洲猪瘟病毒的复制的抑制，具有显著的抗非洲猪瘟病毒的功效；其次，本发明提供了一种表达所述抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体的重组载体，所述重组载体经诱导纯化后能够获得抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体。

Description

抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体及应用
技术领域
本发明属于生物医学或生物制药技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体及应用。
背景技术
非洲猪瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)感染引起的一种以猪发热和猪全身脏器出血为特征的急性烈性传染病，对于家猪的病死率高达100％。该病首先于1921在肯尼亚爆发，随后在整个非洲的家猪和野猪中广泛流行。当前没有商品化的有效疫苗，非洲猪瘟疫情一旦发生，只能通过扑杀手段进行控制，但是这种方式不仅导致经济损失，无法满足我国规模化养猪的需要。因此，疫苗作为预防和控制病毒传染病最有效、最经济的手段，对于我国规模养猪模式下的非洲猪瘟的防治至关重要。但非洲猪瘟病毒(ASFV)结构复杂、基因组庞大，大部分功能未知，感染与致病机制不清，疫苗创制的理论认知有限，其流行已逾百年，但仍未有商品化的疫苗问世。
抗体是机体免疫系统中重要的免疫分子，抗体的研发对非洲猪瘟的治疗起着至关重要的推动作用。但ASFV的基因组复杂，目前我们对其各功能蛋白的作用机制知之甚少，故传统抗体的研发也显得尤为困难。其中，中国专利(公布号CN110078819A)一种抗非洲猪瘟的抗体及其制备方法，通过用非洲猪瘟病毒免疫健康雌性禽类动物，当被免疫的所述禽类动物卵黄内非洲猪瘟抗体含量超过40ng/mL时收集卵黄，提取所述卵黄中的水溶性组分，纯化后得到。所述的抗体为禽源非洲猪瘟抗体，存在异源性反应，且没有克服常规抗体分子量较大的问题。
其中，单域抗体(single domain antibody，sdAb)仅有一个重链可变区结构域(VHH)，该结构域最初发现于骆驼科动物和鲨鱼的血清中分离出的一种抗体HCAb，通过基因手段，扩增出其中的VHH片段。单独克隆并表达出来的VHH区和完整的抗体一样，具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及同等的抗原结合活性。但是与完整抗体相比，单域抗体具有以下优点：①单域抗体的分子质量更低，这使其更容易渗透到组织中；②由于单域抗体更容易通过肾脏清除，因此其药代动力学半衰期也更短；③由于单域抗体没有可结晶区，因此无法通过补体系统引发细胞毒性；④单域抗体在极端温度和pH环境中具有良好的稳定性，其水溶性和构象稳定性是常规抗体无法比拟的，且这种单体结构域能高特异性、高亲和力地与抗原结合，从而中和或封闭相对隐蔽的抗原表位。综上，单域抗体是目前可以得到的具有完整功能、稳定、可结合抗原的最小单元，由于相对分子质量小、稳定性强、可溶性好、抗原结合性能好、易于表达及免疫原性低等特点，其具有广阔的应用前景，尤其在疾病的治疗和诊断中具有很大的价值。
p72蛋白是ASFV中的关键结构蛋白，是一种衣壳蛋白，能保护病毒核酸免受环境中核酸酶或其他理化因素破坏，同时参与病毒的感染过程且具有良好的免疫原性，该蛋白产生于病毒感染晚期，p72作为ASFV的重要抗原蛋白，是病毒二十面体的主要成分，对于病毒衣壳的形成至关重要，参与病毒结合细胞。因此，开发一种新型抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，使其具有较好的特异性、阻断活性，更佳的临床药效，并且生产简便，能够降低生产成本，减轻患者用药负担，已经成为亟待解决的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种新型抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体及其应用。具体地，本发明的目的在于提供一种对非洲猪瘟具有抑制效果的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体。具体方案包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，所述抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-7任一所示。
优选地，所述抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
第二方面，本发明提供了一种抗体，所述抗体包括一条或多条上述第一方面所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体。
优选地，所述抗体包括单体、二价抗体、多价抗体。
第三方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体的基因片段。
优选地，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8-14任一所示。
优选地，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述第三方面所述的基因片段。
第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述第四方面的表达载体，或其基因组中整合有上述第三方面所述的基因片段。
第六方面，本发明提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：
(i)上述第一方面所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，或上述第二方面所述的抗体；
(ii)和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
第七方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，或上述第二方面所述的抗体，或上述第六方面所述的免疫偶联物在制备抑制非洲猪瘟病毒感染药物中的应用。
第八方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，或上述第二方面所述的抗体，或上述第六方面所述的免疫偶联物在制备非洲猪瘟P72蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。
第九方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括：
(i)上述第一方面所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，或上述第二方面所述的抗体，或上述第六方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
第十方面，本发明提供了一种上述第九方面所述的药物组合物在制备抑制非洲猪瘟病毒感染药物中的应用。
第十一方面，本发明提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)上述第一方面所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，或上述第二方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
第十二方面，本发明提供了一种非洲猪瘟P72蛋白检测试剂，所述的检测试剂包含：
(i)上述第一方面所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，或上述第二方面所述的抗体，或上述第六方面所述的免疫偶联物；以及
(ii)检测学上可接受的载体。
第十三方面，本发明提供了一种检测非洲猪瘟P72蛋白的试剂盒，所述试剂盒含有上述第六方面所述的免疫偶联物或上述第十二方面所述的检测试剂，以及说明书。
第十四方面，本发明提供了一种产生上述第一方面所述抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)在适合产生单域抗体的条件下，培养上述第五方面所述的宿主细胞，从而获得含上述第一方面所述抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体的培养物；
(2)从所述培养物中分离或回收所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体；
(3)任选地，纯化和/或修饰步骤(2)中获得的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，所述单域抗体能够与天然抗原很好的反应，能够显著抑制非洲猪瘟病毒P72蛋白表达，进而抑制非洲猪瘟病毒的复制；而且所述P72蛋白单域抗体具有较好的特异性、阻断活性，更佳的临床药效，生产简便，能够降低生产成本。
附图说明
图1酶切鉴定和菌液PCR鉴定结果，其中1为重组载体pET-28a-P72-6，2为重组载体pET-28a-P72-8，3为重组载体pET-28a-P72-10，4为重组载体pET-28a-P72-13，5为重组载体pET-28a-P72-16，6为重组载体pET-28a-P72-23，7为重组载体pET-28a-P72-25；8-9为载体PET-28a；
图2重组载体的验证表达结果图，其中1-4为重组载体PET-28a-P72-6，5-8为重组载体PET-28a-P72-8，9-12为重组载体PET-28a-P72-10，13-16为重组载体PET-28a-P72-13，17-20为重组载体PET-28a-P72-16，21-24为重组载体PET-28a-P72-25，25-27为重组载体PET-28a-P72-23；
图3重组载体诱导表达的验证结果图，其中1为重组载体pET-28a-P72-6，2为重组载体pET-28a-P72-8，3为重组载体pET-28a-P72-10，4为重组载体pET-28a-P72-13，5为重组载体pET-28a-P72-23，6为重组载体pET-28a-P72-25；
图4重组载体在20℃和37℃诱导表达的可溶性分析结果；
图5重组载体在不同IPTG诱导浓度下的SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中1-6分别表示IPTG的诱导浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM；
图6重组载体在不同诱导时间下的SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中1-4分别表示诱导时间为3h、5h、7h、9h；
图7重组载体诱导表达的纯化结果，其中1为重组载体pET-28a-P72-6，2为重组载体pET-28a-P72-8，3为重组载体pET-28a-P72-10，4为重组载体pET-28a-P72-13，5为重组载体pET-28a-P72-23，6为重组载体pET-28a-P72-25；
图8 ELISA鉴定单域抗体与重组蛋白的反应性结果图，其中P/N表示阳性血清OD450/阴性血清OD450；
图9 ELISA鉴定单域抗体与天然抗原的反应性结果图，其中P/N表示阳性血清OD450/阴性血清OD450；
图10 Western blot鉴定单域抗体P72-25与天然抗原的反应性结果图；
图11中和实验结果。
具体实施方式
本申请发明人经过广泛而深入地研究即大量的筛选，首次意外地发现了一类抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单域抗体，实验结果表明，本发明所述单域抗体能够特异性识别P72蛋白，具有良好的特异性；同时能够有效与天然抗原反应；并且能够显著抑制P72蛋白的表达，抑制非洲猪瘟病毒复制。可用于非洲猪瘟的预防或治疗。
具体地，本发明利用噬菌体展示技术筛选免疫单域抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了非洲猪瘟病毒P72蛋白特异性的单域抗体基因。再将此基因转至哺乳动物细胞中，从而获得了能在哺乳动物细胞中高效表达的、且特异性高的单域抗体重组株。然后通过ELISA等方法鉴定出具有阻断活性的抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单域抗体。
其中，所述抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单域抗体分别表示为P72-6(氨基酸序列如SEQID NO.1所示)，P72-8(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)，P72-10(氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示)，P72-13(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)，P72-16(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，P72-23(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)，P72-25(氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示)。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒来源：猪肺泡巨噬细胞(PAMs)、ASFV CN/GS/2018毒株、非洲猪瘟阴阳性血清由国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)提供；原核表达载体pET-28a(+)由本实验室提供；引物由上海生工生物科技有限公司合成；Q5 Hot startHigh-Fidelity 2×Master Mix、限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ和T4 DNA连接酶购自NEB公司；胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；IPTG购自上海生工生物科技有限公司；BL(21)感受态细胞购自北京全式金生物科技有限公司；HRP标记兔抗6×His标签抗体购自艾搏抗(上海)贸易有限公司。
实验中其他试剂如果没有特别说明均为常见的市售试剂；实验中的操作如果没有特别说明均是本领域知晓的操作方法。
实施例1抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单域抗体的表达纯化
1.抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单域抗体的基因扩增与纯化
合成编码抗非洲猪瘟病毒P72蛋白单域抗体的基因序列，具有包括：P72-6(基因序列如SEQ ID NO.8所示)，P72-8(基因序列如SEQ ID NO.9所示)，P72-10(基因序列如SEQ IDNO.10所示)，P72-13(基因序列如SEQ ID NO.11所示)，P72-16(基因序列如SEQ ID NO.12所示)P72-23(基因序列如SEQ ID NO.13所示)，P72-25(基因序列如SEQ ID NO.14所示)。
针对上述基因序列设计通用扩增引物，并在上下游引物的5′端分别引入EcoRI和XholI酶切位点。其中通用引物为：
上游引物F:CGGAATTCGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO.15所示)；
下游引物R:CGGAATTCGTGCAGCTGGTGGAG(SEQ ID NO.16所示)。
扩增体系为：Q5 Hot start High-Fidelity 2×Master Mix，25μL；上游引物F，2.5μL；下游引物R，2.5μL；模板DNA，2μL；ddH2O，18μL。
纯化过程：将PCR扩增产物转移到1.5mLEP管中，加入6倍体积的CP Buffer，涡旋震荡混匀，瞬时离心收集全部混合液；将混合液转移到DNA吸附柱中，1000rpm室温离心1min，倒掉废液；向DNA吸附柱中加入700μL的DNA Wash Buffer，1000rpm室温离心1min，倒掉废液；重复前一步骤，12000rpm室温离心2min，甩干DNA吸附柱；将DNA吸附柱套入新的1.5mLEP管中，向DNA吸附柱的结合膜正中央加入25μL的Elution Buffer，室温放置2min，12000rpm离心1min；最后将EP管中洗脱液重新加入到DNA吸附柱结合膜正中央，室温放置2min，12000rpm离心2min。
2.重组载体的构建
以pET-28a为载体，将上述1中纯化后的目的基因和pET-28a载体分别用EcoR I和Xho I进行双酶切，然后将酶切产物进行纯化，之后将目的基因和载体以3：1的比例，16℃过夜连接，连接产物转化到BL21感受态细胞中，在不加抗性的LB培养基中37℃、220rpm培养1h，3500rpm离心，弃掉上层培养基留下100μL培养基重悬菌液，并均匀的涂布至含卡那抗性的LB培养皿上，37℃培养12h-16h。次日挑取5个单菌落进行扩大培养，然后做菌液PCR鉴定，选择目的条带大小正确的菌液送生物公司进行测序。
酶切鉴定和菌液PCR鉴定结果如图1所示，其中1为重组载体pET-28a-P72-6，2为重组载体pET-28a-P72-8，3为重组载体pET-28a-P72-10，4为重组载体pET-28a-P72-13，5为重组载体pET-28a-P72-16，6为重组载体pET-28a-P72-23，7为重组载体pET-28a-P72-25；8-9为载体PET-28a。
将菌液PCR鉴定正确的菌液的测序结果进行序列比对，结果如图2所示，其中1-4为重组载体pET-28a-P72-6，5-8为重组载体pET-28a-P72-8，9-12为重组载体pET-28a-P72-10，13-16为重组载体pET-28a-P72-13，17-20为重组载体pET-28a-P72-16，21-24为重组载体pET-28a-P72-25，25-27为重组载体pET-28a-P72-23。说明构建的7株重组载体(pET-28a-P72-6、pET-28a-P72-8、pET-28a-P72-10、pET-28a-P72-13、pET-28a-P72-16、pET-28a-P72-23、pET-28a-P72-25)中除均pET-28a-P72-16外，均能够大量表达对应的单域抗体(P72-6、P72-8、P72-10、P72-13、P72-23和P72-25)，即除pET-28a-P72-16外，其他表达单域抗体(P72-6、P72-8、P72-10、P72-13、P72-23和P72-25)的重组载体构建成功。
3.利用原核表达系统进行蛋白表达
3.1验证表达
将测序正确的菌液重新摇起活化，按照1:100的接种量接种到10mL的含卡那的TB液体培养基中，37℃摇床培养至OD600值为0.6-0.8时，向培养基中加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，37℃诱导表达8h。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳结果如图3所示，其中1为重组载体pET-28a-P72-6，2为重组载体pET-28a-P72-8，3为重组载体pET-28a-P72-10，4为重组载体pET-28a-P72-13，5为重组载体pET-28a-P72-23，6为重组载体pET-28a-P72-25。结果表明上述2中建成功的6株构重组载体(pET-28a-P72-6、pET-28a-P72-8、pET-28a-P72-10、pET-28a-P72-13、pET-28a-P72-23、pET-28a-P72-25)均能够在37℃诱导条件下，诱导大量表达对应的单域抗体(P72-6、P72-8、P72-10、P72-13、P72-23和P72-25)。
3.2 20℃和37℃诱导表达及可溶性分析
按照3.1所述步骤，37℃摇床培养至OD600值为0.6-0.8时，加入IPTG后，20℃和37℃诱导表达8h，之后菌液进行离心弃上清，菌体加入1mL的PBS重悬，置于冰上进行超声破碎，离心，分离上清和沉淀，沉底用100μLPBS重悬，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE凝胶电泳结果如图4所示，在20℃和37℃诱导条件下，6株蛋白都以包涵体的形式存在。
3.3诱导条件优化
在37℃条件下进行诱导表达，当培养到OD600值为0.6-0.8时，每个蛋白在终浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM的条件下分别进行诱导表达，然后SDS-PAGE凝胶电泳分析。
在37℃条件下进行诱导表达，当培养到OD600的值为0.6-0.8时，每个蛋白在最优IPTG浓度下，进行诱导表达，在表达时间为3h,5h,7h,9h进行取样，然后SDS-PAGE凝胶电泳分析。
其中以pET-28a为载体构建的重组载体的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图5所示，其中1-6分别表示IPTG的诱导浓度为0mM、0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM；以pET-30a为载体构建的重组载体的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图6所示，其中1-4分别表示诱导时间为3h、5h、7h、9h。结果表明，P72-6诱导表达条件为IPTG终浓度0.8mM，诱导9h；P72-8诱导表达条件为IPTG终浓度0.2mM，诱导9h；P72-10诱导表达条件为IPTG终浓度0.4mM，诱导7h；P72-13诱导表达条件为IPTG终浓度0.4mM，诱导7h；P72-23诱导表达条件为IPTG终浓度0.2mM，诱导9h；P72-25诱导表达条件为IPTG终浓度1.0mM，诱导9h。
4.蛋白的纯化
缓冲液的配方：Binding Buffer(20mM Tris-HCl PH7.9，20mM咪唑，0.5M NaCl，8M尿素)。Elution Buffer(20mM Tris-HCl PH7.9，500mM咪唑，0.5M NaCl，8M尿素)
蛋白纯化步骤：收集超声破碎之后的包涵体沉淀，用1×PBS洗涤沉淀三次之后，4000rpm4℃离心20min收集包涵体沉淀；将包涵体沉淀用Binding Buffer重悬，冰浴1h，尽量使包涵体充分溶解；平衡柱子：将镍柱填料加入到层析柱中，在重力作用下使乙醇缓慢流出，然后向柱子中加入5倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净，再用8倍柱体积的BindingBuffer平衡柱子；将溶解完成的包涵体4000rpm 4℃离心20min收集上清，用22μm的滤膜过滤到平衡好的柱子中，4℃过夜结合；打开柱子阀门收集流穿液，加入15倍柱体积的BindingBuffer洗涤杂蛋白，吹打混匀后打开柱子阀门，收集流出的液体，此步骤重复三次；加入5倍柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白，吹打混匀后打开柱子阀门，收集流出的液体，此步骤重复三次；最后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白纯化情况。
收集裂解后的沉淀，纯化后进行SDS-PAGE分析，结果如图7所示，其中1为重组载体pET-28a-P72-6，2为重组载体pET-28a-P72-8，3为重组载体pET-28a-P72-10，4为重组载体pET-28a-P72-13，5为重组载体pET-28a-P72-23，6为重组载体pET-28a-P72-25。结果表明，上述重组载体诱导表达后，纯化获得了6株单域抗体。
5.ELISA鉴定单域抗体与重组蛋白的反应性
实验过程：(1)将上述纯化好的抗P72蛋白的单域抗体以1μg/mL的浓度，100μL/孔加入到酶标板中，进行4℃过夜包被；(2)用PBST溶液进行洗涤酶标板，每次300μL/孔，共洗三次，拍干；(3)将实验室纯化好的P72重组蛋白以5μg/mL的浓度，100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h；(4)洗板步骤同(2)；(5)用1％BSA封闭液，100μL/孔加入到酶标板中，37℃封闭1h；(6)用PBST溶液进行洗涤酶标板，每次300μL/孔，洗一次，拍干；(7)待检阴阳性血清1：100倍稀释，100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h；洗板步骤同(2)；(8)HRP标记的抗猪二抗1：20000倍稀释，100μL/孔加入带酶标板中，37℃孵育1h；洗板步骤同(2)；(9)100μL/孔加入TMB底物溶液，37℃显色10min；(10)100μL/孔加入2mol/LH2SO4溶液终止反应；(11)使用酶标仪测定OD450值。
结果如图8所示，其中P/N表示阳性血清OD450/阴性血清OD450。结果表明，6株单域抗体都能够很好的捕获P72重组蛋白。
实施例2单域抗体与天然抗原的反应性鉴定
1.ELISA鉴定单域抗体P72-25与天然抗原的反应性
实验过程：(1)将康复猪纯化的抗体1：1000倍稀释，100μL/孔加入到酶标板中，进行4℃过夜包被；(2)用PBST溶液进行洗涤酶标板，每次300μL/孔，共洗三次，拍干；(3)将天然抗原1：20倍稀释，100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h；(4)洗板步骤同(2)；(5)用1％BSA封闭液，100μL/孔加入到酶标板中，37℃封闭1h；(6)用PBST溶液进行洗涤酶标板，每次300μL/孔，洗一次，拍干；(7)将单域抗体以1μg/mL的浓度，100μL/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h；洗板步骤同(2)；(8)HRP标记的抗His二抗1：15000倍稀释，100μL/孔加入带酶标板中，37℃孵育1h；洗板步骤同(2)；(9)100μL/孔加入TMB底物溶液，37℃显色10min；(10)100μL/孔加入2mol/LH2SO4溶液终止反应；(11)使用酶标仪测定OD450值。
结果如图9所示，其中P/N表示阳性血清OD450/阴性血清OD450。结果表明上述单域抗体能够与天然抗原很好的进行反应，其中单域抗体P72-25反应显著。
2.Western blot鉴定单域抗体P72-25与天然抗原的反应性
实验过程：(1)制样：取20μLASFV全病毒抗原，加入20μL 2×Loading Buffer，100℃金属浴煮沸10min，使蛋白变性；(2)蛋白电泳：将变性后的蛋白加入蛋白胶孔中，恒压80V跑30min，然后将电压调至120V跑50min；(3)转膜：剪一块大小相等的PVDF膜，在甲醇中浸泡1min，将相等大小的滤纸侵泡在转膜液中，按照滤纸→膜→胶→滤纸的顺序放置后，除去气泡，盖好盖子，连接电源，转膜30min；(4)封闭：转膜完成后，取出PVDF膜，放置在5％脱脂乳中，4℃封闭过夜；(5)孵一抗：用PBST洗膜洗3次，每次加10mL，摇床洗15min，洗去封闭液，用1:200倍稀释的P72-25单域抗体孵育PVDF膜，放置在摇床上室温孵育1h；(6)孵二抗：洗膜步骤同(5)，用1:2000倍稀释的HRP标记抗His抗体孵育PVDF膜，放置在摇床上室温孵育1h；(7)显色：洗膜步骤同(5)，将HRP化学发光底物A液和B液分别1mL加入暗盒中，充分结合30s，将PVDF膜放入暗盒中，放在扫膜仪上进行扫描。
结果如图10所示，单域抗体P72-25能够识别全病毒抗原中的P72抗原，在预期条带处有单一明显的条带，表明该抗体具有很好的反应性。
3.中和实验
猪肺泡巨噬细胞以4×106/孔铺于6孔板，置于37℃，5％CO2细胞培养箱过夜培养。2μLASFV病毒与2μg抗ASFV P72-25的单域抗体混匀后，4℃孵育1h，将共同孵育后的混合物和2μL ASFV病毒分别加入6孔板中，37℃继续培养24h后，Trizol法提取RNA，反转录后应用qPCR测定ASFV P72基因的copy number。
结果如图11所示，加入单域抗体P72-25后，P72基因的拷贝数明显下降，说明单域抗体P72-25能够显著抑制P72的表达，具有显著的抗ASFV的效果。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体及应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Arg Cys
20 25 30
Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ile Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Lys Arg Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ile Val Leu Ser Lys Thr Pro Asn Cys Arg Ile Ser Glu Trp Asp Leu
100 105 110
Asn Arg Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 2
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Arg Cys
20 25 30
Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ile Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Lys Arg Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asp Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ile Val Leu Ser Lys Thr Pro Asn Cys Arg Ile Ser Glu Trp Asp Leu
100 105 110
Asn Arg Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 3
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr
20 25 30
Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Ser Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ala Phe Ile His Ser Gly Gly Gly Ala Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Ile Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Ala Asp Ser Gly Pro Cys Val Arg Pro Arg Thr Val Gly Thr Met
100 105 110
Met Asn Phe Arg Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Phe Gly Ile Thr Tyr Ile Ser Cys
20 25 30
Ser Arg Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Thr Ile Ile Pro Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Asp Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys His
85 90 95
Thr Arg Thr Asn Arg Gly Leu Gly Cys Gly Glu Glu Ala Leu Asp Thr
100 105 110
Trp Gly Arg Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 5
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Met Cys
20 25 30
Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ile Ser Ala Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Asp Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ile Val Leu Ser Thr Thr Pro Asn Cys Arg Ile Ser Asp Cys Asp Leu
100 105 110
His Arg Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 6
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Arg Leu Thr Gly Ser Phe Cys
20 25 30
Ser Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ile Ser Gly Asp Arg Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Arg Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Asp Asp Thr Gly Met Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ile Val Leu Ser Ala Thr Ala Val Cys Arg Ile Ser Asp Tyr Asp Leu
100 105 110
His Arg Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 7
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
His Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ala Thr Tyr Ser Thr Cys
20 25 30
Ser Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ile Ser Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gln Asp Asn Ala Lys Asn Thr Ala Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Asn
85 90 95
Val Val Thr Pro Gly Lys Tyr Leu Arg Cys Arg Thr Cys Tyr Ala Glu
100 105 110
Gly Ser Cys Tyr Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 8
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
gcctgtgcag cctctggata cacctacacg aggtgtagta tggcctggta ccgccaggtt 120
ccagggaagg agcgcgaatt ggtctcaagt attattagtt ctggtaggac atattatgca 180
gaatccgcga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaagag ggtgtatctg 240
caaatggaca acctgaaacc tgaggacacg gccatgtatt actgtaatat tgtgctgagc 300
aagacaccga attgccgcat tagcgagtgg gacctgaatc ggacctactg gggccagggg 360
acccaggtca ctgtctcctc a 381
<210> 9
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
gcctgtgcag cctctggata cacctacacg aggtgtagta tggcctggta ccgccaggtt 120
ccagggaagg agcgcgaatt ggtctcaagt attattagtt ctggtaggac atattatgca 180
gaatccgcga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaagag ggtgtatctg 240
caaatggaca acctgaaacc tgaggacacg gccatgtatt actgtaatat tgtgctgagc 300
aagacaccga attgccgcat tagcgagtgg gacctgaatc ggacctactg gggccagggg 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 10
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
catgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata cacgtacagt agctactgca tgggctggtt ccgccaggcc 120
tcagggaagg agcgcgaggg ggtcgcattt attcatagtg gtggtggtgc ggcatactat 180
gccgactccg tgaagggccg attcaccatc tcccagatca acgccaagaa cacactgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac actgccatgt actactgtgt ggcagactcc 300
ggcccctgcg tgcgcccccg tactgtcggg actatgatga actttcgtta ctggggccag 360
gggacccagg tcaccgtctc ctca 384
<210> 11
<211> 369
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag gctttggaat cacctacatt agctgcagca ggggctggta ccgccaggcg 120
ccagggaagg agcgcgagtt ggtctcaact attattcctg gtgataggac atactatgca 180
gattccgtga agggtcgatt caccatctcc cgagacaagg acaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccatgtatt actgtcacac ccggacaaac 300
cgcggattgg gttgcgggga ggaggcttta gacacatggg gccgggggac acaggtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 12
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggata cacctacacg atgtgcagca tggcctggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgaatt ggtctcaagt attattagtg ctgataggac atattatgca 180
ggatccgcga agggccgatt caccgtctcc cgagacaaag ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca acctgaaacc tgacgacacg ggcatgtatt actgtaatat tgtgctgagc 300
acgacaccga attgccgcat tagcgactgt gacctgcatc ggacctactg gggccagggg 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 13
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gatgtgcagc tggtggagtc tgggggaggc tcggtgcagg ctggagggtc tctgagactc 60
tcctgtgtag cctctagatt aaccggcagt ttctgcagca tggcctggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgagtt ggtctcaagt attattagtg gtgataggac acactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc cgagacagag ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgacgacacg ggcatgtact attgtaacat tgtactgagc 300
gcaacagcgg tttgccgcat tagcgactat gacctacatc ggagctactg gggccagggg 360
accctggtca ccgtctcctc a 381
<210> 14
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catgtgcagc tggtggagtc tgggggaggg tcggtgcagg ctggagggtc tctgaggctc 60
tcctgtgcag cctctggagc cacctacagt acctgcagta tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagg agcgcgagtt ggtctcaagt attattagtg gtgggcgcac atactatgcg 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc caagacaacg ccaagaacac ggcctatctc 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacacg gccatgtatt tctgtaacgt agtcactcca 300
ggtaaatact tacgttgtcg aacctgctac gccgaaggat cctgctataa caactggggc 360
caggggaccc aggtcactgt ctcctca 387
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cggaattcgt gcagctggtg gag 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggaattcgt gcagctggtg gag 23

Claims (10)

1.一种抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，其特征在于，所述抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.一种抗体，其特征在于，所述抗体包括如权利要求1所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体。
3. 一种编码权利要求1所述抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体的基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO. 14所示。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求3所述的基因片段。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求3所述的基因片段。
6.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：
（i）如权利要求1所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，或如权利要求2所述的抗体；
（ii）和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。
7.如权利要求1所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体或权利要求2所述的抗体或权利要求6所述的免疫偶联物在制备抑制非洲猪瘟病毒感染药物中的应用。
8.如权利要求1所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体或权利要求2所述的抗体或权利要求6所述的免疫偶联物在制备非洲猪瘟P72蛋白检测试剂或试剂盒中的应用。
9. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：
（i）如权利要求1所述的抗非洲猪瘟P72蛋白单域抗体，或如权利要求2所述的抗体，或如权利要求6所述的免疫偶联物；以及
（ii）药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的药物组合物在制备抑制非洲猪瘟病毒感染药物中的应用。
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基于非洲猪瘟病毒p72蛋白纳米抗体的竞争ELISA检测方法的建立;朱家宏;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑》;20210215;A006-1014 *

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