CN114195899B - 抗可卡因特异性抗体、质粒载体及方法 - Google Patents

抗可卡因特异性抗体、质粒载体及方法 Download PDF

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Abstract

抗可卡因特异性抗体、质粒载体及方法。本发明用COC‑BSA偶联物免疫小鼠，分离鼠脾脏淋巴细胞并通过流式细胞仪分选出特异性B淋巴细胞，利用单细胞PCR扩增B淋巴细胞抗体重链及轻链可变区序列，将得到的序列构建完整鼠IgG抗体序列重组表达载体，并瞬转HEK293F细胞，纯化单克隆抗体后，通过胶体金层析实验筛选出优势单抗。该方法制备的单克隆抗体与用传统方法制备单克隆抗体相比，优点在于大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小了批间差异。

Description

抗可卡因特异性抗体、质粒载体及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及可卡因特异性抗体、质粒载体及方法。
背景技术
可卡因(Cocaine)，又称古柯碱。在医疗中，它被用作局部麻醉药或血管收缩剂，由于其麻醉效果好，穿透力强，主要用于表面麻醉，但因毒性强，不宜注射。可卡因对消化系统、免疫系统、心血管系统和泌尿生殖系统都有损伤作用，尤其作为剂量依赖性肝毒素，可导致肝细胞坏死。可卡因滥用造成急性中毒表现为极度激动、不安、精神异常、视物不清、四肢震颤，严重者可诱发心律紊乱、全身抽搐、呼吸衰竭而致死。吸食者往往表现出焦虑、倦怠和极度兴奋等症状，酷似妄想精神分裂症。由于可卡因对中枢神经系统有高度毒性，可刺激大脑皮层，产生视、听、触等幻觉，导致他们的触觉致幻尤为强烈，仿佛皮肤上总是有昆虫附着，以致发生自残行为。1985年起成为世界性主要毒品之一。所以，抗可卡因的特异性抗体尤为重要。
发明内容
为实现上述设计目的，本发明的第一方面，提供了一种抗可卡因特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗可卡因特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链的可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
进一步的，编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码如SEQ ID NO.4所示的所述重链的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第五方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。
本发明的第六方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
本发明的第七方面，提供了一种抗可卡因特异性抗体真核表达质粒载体的方法，包括以下步骤：
a)通过PCR将轻链的可变区核苷酸序列和重链的可变区核苷酸序列分别与鼠IgG轻链恒定区核苷酸序列和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
b)将步骤(a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到抗可卡因单克隆抗体；
c)纯化单克隆抗体，通过胶体金层析实验确定优势单抗；
所述轻链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.7所示；
所述重链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.8所示。
本申请的有益之处在于：提供了一种抗可卡因特异性抗体。
具体实施方案：
以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
可卡因(COC)单克隆抗体制备
实验小鼠为4-6周龄雌性Balb/c小鼠。第一次基础免疫：每只小鼠皮下多点注射100μg弗氏完全佐剂乳化的COC-BSA，共400μl/只。第二次加强免疫：在第一次基础免疫的20天后，每只小鼠皮皮下多点注射80μg弗氏不完全佐剂乳化的COC-BSA，共400μl/只。第三次加强免疫：在第二次加强免疫的15天后，每只小鼠皮皮下多点注射80μg弗氏不完全佐剂乳化的COC-BSA，共400μl/只。第三次加强免疫的20天后，取120μg生理盐水稀释的COC-BSA加强注射于小鼠腹腔，72小时后处死小鼠，取出小鼠脾脏并用小鼠淋巴细胞分离液试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)分离出鼠脾脏淋巴细胞，加入已用COC-BSA制备的荧光标记探针对目标B淋巴细胞进行染色，再借助流式细胞仪从中分离出能表达特异性抗体的单个B细胞。提取单个B细胞的mRNA，进行RT-PCR合成cDNA，以cDNA为模板，利用鼠源抗体可变区通用简并引物分别扩增出编码抗体轻重链的核苷酸序列，测序无误后，将重链可变区和轻链可变区序列分别与恒定区连接后再插入pcDNA3.1(+)载体，构建出能表达特定抗体轻重链的重组质粒。将同一抗体的轻链质粒与重链质粒按1：1质量比混合后转染进HEK293F细胞中进行单克隆抗体轻重链的表达和组装。培养条件为37℃、5％CO2、120rpm摇床培养7天,收集细胞培养液并用Protein A层析柱亲和纯化出单克隆抗体。再用SDS-PAGE电泳后染色检测其纯度。第二天进行ELISA筛选，筛选步骤如下：包被：用包被液分别稀释COC-BSA偶联物和BSA至浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃过夜后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；
封闭：以200μL/孔加入封闭液，37℃封闭2h，通过洗板机用洗涤液洗涤1次；加样：在COC-BSA偶联物和BSA包被孔，分别加入按一定比例稀释的已纯化的抗体，100μL/孔，37℃孵育1h，通过洗板机用洗涤液洗涤3次；
加酶标抗体：在COC-BSA偶联物和BSA包被孔，以100μL/孔加入新鲜稀释HRP酶标二抗，37℃孵育30分钟后，通过洗板机用洗涤液洗涤4次；
加显色液：每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟；
终止反应：以50μL/孔加入终止液；
结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取OD值。结果显示，在COC-BSA偶联物孔，有4个阳性克隆OD值较高，在BSA孔不显色，经测序得到4株序列，分别为3B2，2C3，5E4，4F1。
相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO31.5g，NaHCO32.9g，加ddH2O定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加ddH2O定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加ddH2O定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加ddH2O定容至1000mL。
制备胶体金垫
取5ml 0.01％胶体金溶液加入0.2mol/L碳酸钾溶液10μL，充分混匀后加入50μg单抗，混匀，室温静置2小时后，加入500μl 10％BSA(牛血清白蛋白)溶液进行封闭，封闭处理2小时后，离心(10000rpm/min、20min)，弃上清后，沉淀用500μl复溶液充分溶解。溶解后的金溶液采用喷金划膜仪(杭州唯赞科技有限公司)按照6μl/cm均匀喷涂于6mm宽的玻纤上，后置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃鼓风干燥2小时。
相关溶液配方如下:0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。
1％氯金酸溶液：AuCL3.HCl.4H2O粉末1g加超纯水溶解并定容至100ml。
1％柠檬酸溶液：柠檬酸晶体1g加超纯水溶解并定容至100ml。
0.2mol/L碳酸钾溶液：碳酸钾27.64g，加超纯水溶解并定容至1000ml。
复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml超纯水中，用适量HCL调节pH至8.0，加超纯水定容至1000ml。
硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
COC-BSA经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(杭州唯赞科技有限公司)按照1μl/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius)，此为T线。通过喷金划膜仪(杭州唯赞科技有限公司)将羊抗鼠溶液(终浓度为1mg/ml)按照1μl/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃干燥12小时。
胶体金免疫检测卡的制备
组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)包被有COC-BSA作为检测区和羊抗鼠IgG作为质控区的NC膜；(2)喷涂有胶体金标记可卡因(COC)单克隆抗体(3B2，，2C3，5E4，4F1)的金垫；(3)样本垫为一种经过2％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即得胶体金免疫层析检测卡。
单抗筛选
阳性尿液样本和正常人尿液样本，80μL/孔上样，室温放置15min后，通过胶体金比色卡分别读数，结果详见表1。
表1胶体金比色卡数值统计
通过上表可知3B2单抗与4F1单抗为检测可卡因(COC)的2株优势单抗。
综上，本申请：(1)用COC-BSA偶联物多次免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，用淋巴细胞分离液试剂盒分离出小鼠脾淋巴细胞，利用流式细胞仪对B淋巴细胞悬液进行特异性分选，并收集在含适量细胞裂解液、RNA酶抑制剂和PCR反应试剂的96孔PCR板中，针对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物的混合物，反向引物特异性互补于抗体恒定区，将mRNA逆转录为cDNA，通过RT-PCR克隆出对应的抗体可变区核苷酸序列，凝胶电泳分析纯化、测序，最终得到能与COC-BSA偶联物结合的抗体核苷酸序列。
(2)将重链和轻链可变区序列构建成完整鼠IgG表达载体并使用HEK293F细胞表达单克隆抗体，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。
(3)利用胶体金层析筛选平台显示3B2单抗和4F1单抗为两株检测可卡因的优势单抗。
本申请用COC-BSA偶联物免疫小鼠，通过流式细胞仪分选出与COC-BSA偶联物特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR扩增B淋巴细胞中抗体的重链及轻链可变区序列，将得到的序列构建成完整鼠IgG抗体重组表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体，通过胶体金层析实验筛选出优势单抗，并应用于毒品检测领域。通过本申请所述方法制备可卡因(COC)单克隆抗体，大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小了批间差异。
本专利所述通过胶体金层析实验筛选出优势单抗的方法是金标免疫层析技术，即在试剂条的结合垫上固定的是筛选出的金标抗体，NC膜上固定的是COC-BSA偶联物，C线上固定的是能与金标抗体特异性结合的二抗。金标免疫层析技术快速、简便、稳定性好，目前已广泛应用于病毒、细菌、毒品及各种蛋白质的检测，常见的毒品快检产品包括尿液检测卡、唾液检测卡等，检测时间只需5-10分钟，大大促进了该方法的普及应用。
SEQ ID NO1：抗可卡因(COC)特异性抗体3B2轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO2：抗可卡因(COC)特异性抗体3B2重链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO3：抗可卡因(COC)特异性抗体4F1轻链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO4：抗可卡因(COC)特异性抗体4F1重链可变区氨基酸序列；SEQ ID NO5：抗可卡因(COC)特异性抗体3B2轻链可变区核苷酸序列；SEQ IDNO6：抗可卡因(COC)特异性抗体3B2重链可变区核苷酸序列；SEQ ID NO7：抗可卡因(COC)特异性抗体4F1轻链可变区核苷酸序列；SEQ ID NO8：抗可卡因(COC)特异性抗体4F1重链可变区核苷酸序列。
序列表
序列表
<110> 杭州贤至生物科技有限公司
<120> 抗可卡因特异性抗体、质粒载体及方法
<130> 20211203
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Cys Trp Leu Gln Arg Lys Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
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50 55 60
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Thr Arg Gly His Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val
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<211> 324
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ctgacctgta gagctagcca agagatctcc ggctacctgt gctggctgca gcggaagcct 120
gatggcacat tcaagagact gatctacgct gcttctaccc tggactccgg cgtccctaaa 180
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaagttcagc tgcagcagtc cggacctgaa ctggaaaagc caggcgcttc cgtgaagatc 60
tcctgcaagg cttctggcta tagcttcacc ggctacaacc tgaattgggt gaagcaatct 120
aatggcaagt ccctggaatg gatcggcaat atcgaccccg actacggcta ctccacctac 180
aaccagaagt tcaaaggtaa ggccaccctg accgtggata agagcagcac cacagcctac 240
atgcagctga agtctctgac ctccgaagat tctgccgtgt acttctgcac aagaggccat 300
ctgggctact ggggccaggg aacaaccgtg accgtgtctt ct 342
<210> 7
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatgtgctga tgacccagac ccctctgtct ctgcctgtgt ccctgggcga ccaggcctct 60
atctcctgca gatctagcca atccatcgtg cattccaacg gcaacaccta tctggaatgg 120
tacctgcaga aacctggcca gtctccaaag ctgctgatct acaaggtgtc taatcggttt 180
agcggagttc ctgacagatt ctctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240
tccagagtgg aagccgagga cctgggcgtg tactactgct tccagggctc tcatgtgcct 300
tggaccttcg gcggaggcac catgctggag atcaagaga 339
<210> 8
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagatccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggagcttc tgtcaaggtg 60
tcgtgcaagg cctccggcta cgccttcacc agatacaaca tgtactgggt gaagcagtct 120
cacggcaagt ccctggaatg gatcggctac aaggaccctt acaatggcga taccagcttc 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctc accgtggata agtcttcctc tacagcctac 240
atgctgctga acagcctgac ctctgaggac tccgctgtgt actactgcgc ctactacaac 300
gtgtacaact acgactggta cttccatgtg tggggcgctg ggaccaccgt gactgtgtcc 360
tca 363

Claims (7)

1.一种抗可卡因特异性抗体，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗可卡因特异性抗体，其特征在于：
编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；
编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。
3.一种质粒载体组合，其特征在于：该质粒载体组合含有如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示的核苷酸序列。
4.一种抗可卡因特异性抗体，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述重链的可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的一种抗可卡因特异性抗体，其特征在于：
编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；
编码如SEQ ID NO.4所示的所述重链的可变区的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示。
6.一种质粒载体组合，其特征在于：该质粒载体组合含有如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列。
7.一种如权利要求1-2和4-5中任一所述的抗可卡因特异性抗体的生产方法，包括以下步骤：
a)通过PCR将轻链的可变区核苷酸序列和重链的可变区核苷酸序列分别与鼠IgG轻链恒定区核苷酸序列和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
b)将步骤a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到抗可卡因单克隆抗体；
c)纯化单克隆抗体，通过胶体金层析实验确定优势单抗；
所述轻链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.7所示；
所述重链的可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.8所示。
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