CN114057881B - 抗氯胺酮特异性抗体、质粒载体及方法 - Google Patents

抗氯胺酮特异性抗体、质粒载体及方法 Download PDF

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CN114057881B CN202111626212.7A CN202111626212A CN114057881B CN 114057881 B CN114057881 B CN 114057881B CN 202111626212 A CN202111626212 A CN 202111626212A CN 114057881 B CN114057881 B CN 114057881B
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Abstract

本发明用KET‑BSA偶联物免疫小鼠，分离鼠脾脏淋巴细胞并通过流式细胞仪分选出与KET‑BSA偶联物特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR扩增出B淋巴细胞中的抗体重链及轻链可变区序列，将得到的序列构建成完整鼠IgG抗体序列表达载体，通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体，通过胶体金层析实验筛选出优势单抗，比传统单克隆抗体制备大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小批间差异。

Description

抗氯胺酮特异性抗体、质粒载体及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种抗氯胺酮特异性抗体、质粒载体及方法。
背景技术
氯胺酮即K粉，它具有严重的依赖性，成瘾性较传统毒品更为隐蔽，其娱乐性往往掩盖其成瘾性，随着频率及接触次数的递增后，逐渐形成初步的心理依赖。长期滥用氯胺酮会伤害泌尿系统、中枢神经系统、心血管系统、呼吸系统、消化系统，以及记忆缺失、认知功能损害和精神病。氯胺酮就像猛虎一样吞噬着人们的健康，氯胺酮被世界大多数国家列入管制药物，我国也于2004年将其列为第一类精神管制药品。所以，能用于氯胺酮检测的特异性抗体的研究尤为重要。
发明内容
为实现上述设计目的，本发明的第一方面，提供了一种抗氯胺酮特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第二方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.5所示的轻链可变区核苷酸序列。
本发明的第三方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.6所示的重链可变区核苷酸序列。
本发明的第四方面，提供了一种抗氯胺酮特异性抗体，包括轻链和重链，所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；编码如SEQ ID NO.4所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明的第五方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.7所示的轻链可变区核苷酸序列。
本发明的第六方面，提供了一种质粒载体，该质粒载体含有如SEQ ID NO.8所示的重链可变区核苷酸序列。
本发明的第七方面，提供了一种抗氯胺酮特异性抗体真核表达质粒载体的方法，包括以下步骤:
a)通过PCR将轻链可变区核苷酸序列和重链可变区核苷酸序列分别与鼠IgG轻链恒定区核苷酸序列和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
b)将步骤a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到抗氯胺酮(KET)单克隆抗体；
c)纯化单克隆抗体，通过胶体金层析实验确定优势单抗；
所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.7所示；
所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.8所示。
本申请的有益之处在于：提供了一种抗氯胺酮特异性抗体。
具体实施方案：
以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
氯胺酮(KET)单克隆抗体制备
取4-6周龄雌性Balb/c小鼠，基础免疫每只小鼠皮下多点注射弗氏完全佐剂乳化的100μg KET-BSA，共400μl/只。20天后进行加强免疫，方法为取80μg重组蛋白用弗氏不完全佐剂乳化后，共400μl/只，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法与第二次加强免疫相同。20天后，取120μg KET-BSA腹腔加强注射，于72小时后处死小鼠，取出小鼠脾脏并用小鼠淋巴细胞分离液试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)分离出鼠脾脏淋巴细胞，加入KET-BSA制备的荧光标记探针对目标B淋巴细胞进行染色，借助流式细胞分选技术从中分离出能表达特异性抗体的单个B细胞。提取单个B细胞的mRNA，进行RT-PCR合成cDNA，以cDNA为模板，采用鼠源抗体可变区通用简并引物分别扩增出编码抗体轻、重链可变区核苷酸序列，分别与恒定区连接后再插入pcDNA3.1(+)载体中构建出表达特定抗体轻、重链的重组质粒。将同一抗体的轻链质粒与重链质粒按1：1质量比混合后转染进HEK293F细胞中进行单克隆抗体轻、重链的表达和组装,收集细胞培养液并用Protein A亲和纯化出单克隆抗体。SDS-PAGE电泳检测其纯度。第二天进行单克隆ELISA筛选，筛选步骤如下：
包被：用包被液分别稀释KET-BSA偶联物和BSA至浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板(深圳金灿华实业有限公司)，4℃过夜后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；
封闭：以200μL/孔加入封闭液，37℃封闭2h，通过洗板机用洗涤液洗涤1次；
加样：将纯化好的抗体按一定比例稀释后，分别加入KET-BSA偶联物和BSA包被孔，100μL/孔，37℃孵育1h，通过洗板机用洗涤液洗涤3次；
加酶标抗体：在KET-BSA偶联物和BSA包被孔，以100μL/孔加入新鲜稀释的HRP酶标二抗(购自北京义翘神州生物技术有限公司)，37℃孵育30分钟后，通过洗板机用洗涤液洗涤4次；
加显色液：每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟；
终止反应：以50μL/孔加入终止液；
结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠血清作为阳性对照。结果显示，在KET-BSA偶联物孔，有4个阳性克隆OD值较高，在BSA孔不显色，经测序得到4株序列，分别为4A1，6B2，7C3，6D4。
相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，加ddH2O定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加ddH2O定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加ddH2O定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加ddH2O定容至1000mL。
制备胶体金垫
取5ml 0.01％胶体金溶液加入0.2mol/L碳酸钾溶液10μL，充分混匀后加入50μg单抗，混匀，室温静置2小时后，加入500μl 10％BSA(牛血清白蛋白)溶液进行封闭，封闭处理2小时后，离心(10000rpm/min、20min)，弃上清后，沉淀用500μl复溶液充分溶解。溶解后的金溶液采用喷金划膜仪(杭州唯赞科技有限公司)按照6μl/cm均匀喷涂于6mm宽的玻纤上，后置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃鼓风干燥2小时。
相关溶液配方如下:
0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。
1％氯金酸溶液：AuCL3.HCl.4H2O粉末1g加超纯水溶解并定容至100ml。
1％柠檬酸溶液：柠檬酸晶体1g加超纯水溶解并定容至100ml。
0.2mol/L碳酸钾溶液：碳酸钾27.64g，加超纯水溶解并定容至1000ml。
复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml超纯水中，用适量HCL调节pH至8.0，加超纯水定容至1000ml。
硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
氯胺酮-BSA经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(杭州唯赞科技有限公司)按照1μl/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius)，此为T线；将羊抗鼠溶液(终浓度为1mg/ml)按照1μl/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)中37℃干燥12小时。
胶体金免疫检测卡的制备
组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)包被有KET-BSA作为检测区和羊抗鼠IgG作为质控区的NC膜；(2)喷涂有胶体金标记氯胺酮(KET)单克隆抗体(4A1，6B2，7C3，6D4)的金垫；(3)样本垫为一种经过2％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即得胶体金免疫层析检测卡。
单抗筛选
阳性尿液样本和正常人尿液样本，80μL/孔上样，室温放置15min后，通过胶体金比色卡分别读数，结果详见表1。
表1胶体金比色卡数值统计
通过上表可知4A1单抗与6B2单抗为检测氯胺酮(KET)的2株优势单抗。
本申请用KET-BSA偶联物免疫小鼠，通过流式细胞仪分选出与KET-BSA偶联物特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR将淋巴细胞中的抗体重链及轻链可变区序列扩增出来，将得到的序列构建成完整鼠IgG抗体表达载体表达抗氯胺酮(KET)的单克隆抗体，并应用于毒品检测领域。
本申请为解决传统制备单克隆抗体的不足之处，用KET-BSA偶联物免疫小鼠，通过流式细胞仪分选出与KET-BSA偶联物特异性结合的B淋巴细胞，利用单细胞PCR将淋巴细胞中的抗体重链及轻链核苷酸序列扩增出来，将得到的序列构建成完整鼠IgG抗体表达载体通过瞬转HEK293F细胞表达单克隆抗体，纯化单克隆抗体。比传统单克隆抗体制备大大缩短了时间，并且得到的单克隆抗体稳定性高，均一性好，大大减小了批间差异。
本申请：(1)用KET-BSA偶联物多次免疫Balb/c小鼠后取其脾脏，用淋巴细胞分离液试剂盒分离出脾淋巴细胞，利用BD FACS流式细胞仪对B淋巴细胞悬液进行分选，并收集在含有适量细胞裂解液、RNA酶抑制剂和PCR反应试剂的96孔PCR板中，针对抗体重链轻链可变区不同前导序列设计前向引物的混合物，反向引物特异性互补于抗体恒定区，将mRNA逆转录为cDNA，通过RT-PCR克隆出对应的抗体可变区核苷酸序列，凝胶电泳分析纯化、测序，最终得到能与KET-BSA偶联物结合的抗体核苷酸序列。
(2)将重链和轻链可变区序列构建成完整鼠IgG表达载体并使用HEK293F细胞表达单克隆抗体，使用Protein A亲和层析法纯化单克隆抗体，并分别标记胶体金颗粒。
(3)利用胶体金层析筛选平台显示4A1单抗和6B2单抗为两株检测氯胺酮的优势单抗。
SEQ ID NO1：抗氯胺酮(KET)特异性抗体4A1轻链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO2：抗氯胺酮(KET)特异性抗体4A1重链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO3：抗氯胺酮(KET)特异性抗体6B2轻链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO4：抗氯胺酮(KET)特异性抗体6B2重链可变区氨基酸序列；
SEQ ID NO5：抗氯胺酮(KET)特异性抗体4A1轻链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO6：抗氯胺酮(KET)特异性抗体4A1重链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO7：抗氯胺酮(KET)特异性抗体6B2轻链可变区核苷酸序列；
SEQ ID NO8：抗氯胺酮(KET)特异性抗体6B2重链可变区核苷酸序列；
/>
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序列表
<110> 杭州贤至生物科技有限公司
<120> 抗氯胺酮特异性抗体、质粒载体及方法
<130> 20211207
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Lys Ser Ile Arg Lys Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Arg Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Arg Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Asp Glu Ile Lys Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Glu Thr His Cys Val Glu
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Val Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly His Thr Tyr Tyr Asp Pro Gln Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Gly Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala
<210> 5
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacgtgcaga tcacccagtc cccttcttac ctggctgcca gccctggcga gacaattacc 60
atcaactgca gagcctccaa gtccatccgg aagtacctgg cctggtacca agagaagccc 120
ggcaagacca acaagctgct gatctacagc ggcagcacac tgagatctgg aaccccttcc 180
agattctccg gttccggctc tggcaccgat ttcaccctga ccatctcctc tctggaacct 240
gaggactttg ccatgtacta ctgccagcag cacaacgaat atccttacac cttcggcgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa acgg 324
<210> 6
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaggtgcggc tggaagagtc tggaggaggc ctagtgcaac ccggcggctc tatgaaactg 60
tcctgcgtgg cctctggctt cacattctcc aattactgga tgaactgggt gcggcagtct 120
cctgaaaaag gcctcgagtg ggtcgatgag atcaagctga agtctaacaa ctacgagaca 180
cactgcgtgg aatccgtgaa gggaagattc accatctctc gggacgactc caagtcctcc 240
gtgtacctgc agatgaacaa cctgagagcc gaggacaccg gcatctacta ctgcgccaga 300
agaggctacg gcacctacta cgccatggac tactggggcc agggcacctc tgtgatcgtg 360
tcttcc 366
<210> 7
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacatcgtga tgtcccaaag cccttccagc ctggctgtgt ctgtgggcga gaaggtgacc 60
gtgacctgta aatcttctca gagcctgctg tactcttcca accagaaaaa ctacctggct 120
tggtaccagc agcggcctgg ccagtctcct aagctgctga tctactgggc ctccaccaga 180
gaatccggag tccccgacag attcaccggc tcaggatctg gcacagattt taccctgacc 240
atctccagcg tcaaggccga ggacctggcc gtgtactact gccagcaata ctacagctac 300
ccttggacct tcggcggcgg caccaagctg gaaatcaaga ga 342
<210> 8
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaggtgcagc tgcagcagtc tggtgccgag ctgctgaagc ccggcgcttc tgtgaagctg 60
tcttgtaccg cttccggctt caacatcaag gacacctaca tccactgggt caagcagaga 120
cctgagcagg gcctggaatg gatcggccgg atcgaccctg ccaacggcca cacctactac 180
gacccacagt tccagggcaa ggctaccctg acagctgata cctcctctaa caccgcctac 240
ctgcaactgt cctccctgac ctctgaggat tctgccatct actactgcgc cagattcggc 300
gaggactggg gccaaggcac cctggtcacc gtgtccgcc 339

Claims (7)

1.一种抗氯胺酮特异性抗体，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的抗氯胺酮特异性抗体，其特征在于：
编码如SEQ ID NO.1所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示；编码如SEQ ID NO.2所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。
3.一种质粒载体组合，其特征在于：该质粒载体组合含有如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。
4.一种抗氯胺酮特异性抗体，包括轻链和重链，其特征在于：
所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求4所述的抗氯胺酮特异性抗体，其特征在于：
编码如SEQ ID NO.3所示的所述轻链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示；编码如SEQ ID NO.4所示的所述重链的可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
6.一种质粒载体组合，其特征在于：该质粒载体组合含有如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示的核苷酸序列。
7.一种如权利要求1-2和4-5中任一所述的抗氯胺酮特异性抗体的生产方法，包括以下步骤:
a)通过PCR将轻链可变区核苷酸序列和重链可变区核苷酸序列分别与鼠IgG轻链恒定区核苷酸序列和重链恒定区核苷酸序列桥接后酶切，并分别连接质粒载体，构建真核细胞表达载体；
b)将步骤a)中真核表达载体转染至HEK293F细胞表达得到抗氯胺酮(KET)单克隆抗体；
c)纯化单克隆抗体，通过胶体金层析实验确定优势单抗；
所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或如SEQ ID NO.7所示；
所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示或如SEQ ID NO.8所示。
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