CN103060275A

CN103060275A - 一种抗氯胺酮杂交瘤细胞株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103060275A
Application number: CN2012105885318A
Authority: CN
Inventors: 陈东; 邵越水; 郑孝君
Original assignee: HANGZHOU AORUI BIOMEDICINE TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: HANGZHOU AORUI BIOMEDICINE TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2012-12-29
Filing date: 2012-12-29
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2032-12-29
Also published as: CN103060275B

Abstract

本发明公开一种抗氯胺酮杂交瘤细胞株及其制备方法和应用。现有氯胺酮胶体金试纸条检测阈值为1000ng/ml。该杂交瘤细胞株命名杂交瘤细胞株3E7.1，保藏号为CCTCCNO:C2012157。杂交瘤细胞株3E7.1作为分泌抗氯胺酮单克隆抗体的应用。杂交瘤细胞株3E7.1分泌抗氯胺酮单克隆抗体的方法是制备氯胺酮人工抗原；小鼠免疫；细胞融合；筛选出杂交瘤细胞株3E7，克隆化培养得到杂交瘤细胞株3E7.1，并纯化得到抗氯胺酮单克隆抗体。本发明制得氯胺酮人工抗原利于氯胺酮抗体产生，且制备抗体周期短；杂交瘤细胞株3E7.1分泌的抗氯胺酮单克隆抗体具有高灵敏度特点，适用于100ng/ml阈值检测。

Description

一种抗氯胺酮杂交瘤细胞株及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗氯胺酮杂交瘤细胞株、该抗氯胺酮杂交瘤细胞株作为分泌抗氯胺酮单克隆抗体的应用，以及制备该抗氯胺酮杂交瘤细胞株并分泌抗氯胺酮单克隆抗体的方法。

背景技术

氯胺酮（Ketamine，KET）,化学名为2-邻氯苯基-2-甲胺基-环己酮，其结构式为：

Figure 2012105885318100002DEST_PATH_IMAGE002

氯胺酮（Ketamine）是一种非巴比妥类静脉麻醉剂，主要用于手术麻醉剂或者麻醉诱导剂。氯胺酮具有一定的兴奋、致幻和依赖性，服用后产生意识与感觉的分离状态, 导致神经中毒反应﹑幻觉和精神分裂状态, 表现为头晕﹑精神错乱﹑过度兴奋﹑幻觉﹑幻视﹑幻听﹑运动功能障碍﹑抑郁以及出现怪异和危险行为, 对记忆和思维能力都制造成严重损害, 以及心力﹑呼吸衰竭。吸食过量或长期吸食,可以对心﹑肺﹑神经都造成致命损伤甚至死亡。固体氯胺酮，其形状通常呈白色粉末，俗称“K粉”，是娱乐场所的常用毒品。近年来，其滥用现象日益严重，具有极大的社会危害性，2001年5月9日, K粉被中华人民共和国国家药品监督局列入第二类精神药品加以管理,2007年,升为第一类精神药品。

氯胺酮胶体金试纸条产品具有快速，操作简单等优点，提供了一种有效的现场检测手段，由于其核心原料氯胺酮单抗的灵敏度所限，现有商业化产品的检测阈值在1000ng/ml左右，已经不能满足检测阈值100ng/ml的要求，所以亟待开发出高灵敏度的氯胺酮抗体，以适应检测需要。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种抗氯胺酮杂交瘤细胞株。

本发明抗氯胺酮杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株3E7.1，于2012年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:C2012157；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

本发明的另一个目的是提供该杂交瘤细胞株3E7.1作为分泌抗氯胺酮单克隆抗体的应用，分泌出的抗氯胺酮单克隆抗体属于IgG1亚型，轻链是kappa链，。

本发明的又一个目的是提供制备该杂交瘤细胞株3E7.1并分泌抗氯胺酮单克隆抗体的方法，该方法包括步骤如下：

步骤(1).氯胺酮人工抗原的制备

1-1.氯胺酮半抗原的制备：以盐酸氯胺酮为原料，游离后与溴乙酸乙酯进行取代反应引入酯基，得到氯胺酮的酯，然后在碱性条件下水解得到含羧基的氯胺酮半抗原：

将200mg盐酸氯胺酮溶于10ml去离子水中，加入氨水调PH值至10，加入90ml二氯甲烷萃取3次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到游离态氯胺酮；将游离态氯胺酮溶于10ml丙酮中，加入121μl溴乙酸乙酯和300mg碳酸钾,70℃下回流反应16h，冷却至常温，过滤，得到滤液；滤液减压蒸馏得到氯胺酮的酯；取100mg氯胺酮的酯、2ml四氢呋喃、2.5ml甲醇混合均匀，加入10ml浓度为1M的氢氧化钠溶液,常温反应16h；加入盐酸调PH值至7，用乙酸乙酯萃取1次，收集有机相，减压蒸馏得到氯胺酮半抗原。经高效液相色谱纯化，纯度≥99.8﹪。

1-2.氯胺酮人工抗原的制备：通过碳二亚胺法使氯胺酮半抗原与牛血清蛋白(BSA)结合制备氯胺酮人工抗原，即氯胺酮-牛血清蛋白：

将100mg氯胺酮半抗原、5ml N,N-甲基甲酰胺(DMF)、59mg N-基琥珀酰亚胺(NHS)、105mg环己基碳酰二亚胺(DCC)混合均匀，常温反应16h,反应结束后离心取上清液，得到A液；将150mg牛血清蛋白加入到30ml PBS缓冲液混合均匀，得到B液；将A液和B液按体积比为1:5混合均匀，4℃下反应16h，得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液移入透析袋中，用PBS缓冲液透析5次，透析结束后离心取上清液，得到氯胺酮人工抗原；

步骤(1)的反应过程如下：

Figure 2012105885318100002DEST_PATH_IMAGE004

步骤(2).小鼠免疫

选择8周龄的BALB/c雌鼠用氯胺酮人工抗原注射靠近淋巴结皮下部位进行免疫，具体步骤是取8周龄的BALB/c雌鼠，氯胺酮人工抗原注射靠近淋巴结皮下部位，每隔1天注射一次，共注射7次：第一次氯胺酮人工抗原免疫量为30μg/只，第一次氯胺酮人工抗原免疫量进行抗原乳化步骤，抗原乳化步骤是将氯胺酮人工抗原免疫量稀释于200ulPBS缓冲液中，得到稀释抗原,取总量二分之一的稀释抗原与等体积量的弗氏完全佐剂乳化，剩余二分之一的稀释抗原与等体积量的RIBI佐剂系统混合；第二次氯胺酮人工抗原免疫量改为15ug/只，抗原乳化步骤与第一次相同；后续5次氯胺酮人工抗原免疫量改为8ug/只，抗原乳化步骤与第一次相同；

所述的靠近淋巴结皮下部位为四肢腋下、四肢前臂或颈部；

步骤(3).淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合

3-1.饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75﹪酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；离心，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。

3-2.小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10﹪FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合。

3-3.淋巴细胞制备：取经步骤(2)处理的BALB/c雌鼠靠近淋巴结皮下部位的淋巴结，研磨淋巴细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入IMDM培养基，调整淋巴细胞的浓度至1×10⁷个/mL。

3-4.淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法。将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入1mL 37℃预温的PEG 1450，再加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤3-1的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO₂培养箱中培养。

步骤(4).杂交瘤细胞的筛选

4-1.初筛：

融合细胞在5﹪CO₂培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇（在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野）时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。

所述的1×HT的IMDM培养液含有体积分数为15﹪的FBS。

4-2.复筛：

将筛选到的阳性克隆进一步用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株3E7做克隆培养。

4-3.杂交瘤细胞株3E7的克隆化：

杂交瘤细胞株3E7的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15﹪FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200ul稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，做再次克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100﹪；然后挑取单克隆细胞，命名为3E7.1，扩大培养后进行抗氯胺酮单克隆抗体纯化。

步骤(5).抗氯胺酮单克隆抗体纯化

将筛选到的单克隆细胞株3E7.1用含体积分数为10﹪FBS的IMDM培养基接种到24孔细胞培养板中，第二天接种到细胞培养瓶中，培养1天后，接种到细胞滚瓶中，滚瓶培养4天后，收集培养上清液，将培养上清液浓缩后得到含有抗氯胺酮单克隆抗体的细胞培养浓缩液，然后用HiTrap PROTEIN G HP亲和柱纯化，得到纯化后的抗氯胺酮单克隆抗体。

所述的PBS缓冲液为含有0.008M十二水磷酸氢二钠、0.15M氯化钠、0.002M二水磷酸二氢钠的水溶液，pH为7.4；

所述的1×HAT的IMDM培养液含有体积分数为15﹪的FBS。

本发明抗氯胺酮杂交瘤细胞株于2012年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，命名为杂交瘤细胞株3E7.1，保藏号为CCTCC NO:C2012157；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072。

本发明所具有的有益效果：

1.本发明在制备氯胺酮人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在氯胺酮半抗原和牛血清蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的氯胺酮人工抗原保持了氯胺酮的结构特异性，有利于相应氯胺酮抗体的产生。

2.本发明在制备抗氯胺酮单克隆抗体过程中，采用多点小剂量快速免疫方法，使免疫周期缩短到2周。

3. 本发明杂交瘤细胞株3E7.1可分泌的抗氯胺酮单克隆抗体具有高灵敏度特点，适用于100ng/ml阈值的检测。

附图说明

图1是氯胺酮人工半抗原的液相色谱图；

图2是氯胺酮人工半抗原的质谱图；

图3是氯胺酮人工抗原制备嵌合的紫外扫描图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的分析（下面实施例中PBS缓冲液为含有0.008M十二水磷酸氢二钠、0.15M氯化钠、0.002M二水磷酸二氢钠的水溶液，pH为7.4；靠近淋巴结皮下部位为四肢腋下、四肢前臂或颈部；1×HAT的IMDM培养液含有体积分数15﹪的FBS；1×HT的IMDM培养液含有体积分数为15﹪的FBS）。

本发明抗氯胺酮杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株3E7.1，于2012年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:C2012157；中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)。

本发明涉及的杂交瘤细胞株3E7.1可分泌一种抗氯胺酮单克隆抗体。

制备本发明涉及的杂交瘤细胞株3E7.1并分泌抗氯胺酮单克隆抗体的方法，包括步骤如下：

步骤(1).氯胺酮人工抗原的制备：

1-1.氯胺酮半抗原的制备及检测：以盐酸氯胺酮为原料，游离后与溴乙酸乙酯进行取代反应引入酯基，得到氯胺酮的酯；在碱性条件下水解得到含羧基的氯胺酮半抗原：

将200mg盐酸氯胺酮溶于10ml去离子水，加入氨水调PH值至10，加入90ml二氯甲烷萃取3次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到游离态氯胺酮；游离态氯胺酮用薄层色谱法检测：层析液为石油醚：乙酸乙酯=1:1，产物R_f=0.3～0.4。

将游离态氯胺酮溶于10ml丙酮中，加入121μl溴乙酸乙酯和300mg碳酸钾,70℃下回流反应16h；冷却至常温，过滤，得到滤液；滤液减压蒸馏得到氯胺酮的酯；氯胺酮的酯用薄层色谱法检测：层析液为石油醚：乙酸乙酯=1:1，产物R_f=0.7～0.8。

取100mg氯胺酮的酯、2ml四氢呋喃、2.5ml甲醇混合均匀，加入10ml浓度为1M的氢氧化钠溶液,常温反应16h；加入盐酸调PH值至7，用乙酸乙酯萃取1次，收集有机相，减压蒸馏得氯胺酮半抗原；氯胺酮半抗原用薄层色谱法检测：层析液为95﹪乙醇，产物R_f=0.3～0.4。

图1是氯胺酮人工半抗原的液相色谱图，从图中可以看出氯胺酮人工半抗原得到很好的分离，纯度可以达到99.8﹪。图2是氯胺酮人工半抗原的质谱图，从质谱数据可以确定得到的化合物是我们所设计的氯胺酮人工半抗原。

1-2.氯胺酮人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使氯胺酮半抗原与牛血清蛋白(BSA)结合制备氯胺酮人工抗原，即氯胺酮-牛血清蛋白：

将100mg上述步骤1得到的氯胺酮半抗原、5ml N,N-甲基甲酰胺(DMF)、59mg N-基琥珀酰亚胺(NHS)、105mg环己基碳酰二亚胺(DCC)混合均匀，常温反应16h,反应结束后离心取上清液，得到A液；将150mg牛血清蛋白加入到30ml PBS缓冲液混合均匀，得到B液；将A液和B液按体积比为1:5混合均匀，4℃反应16h，得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液移入透析袋中，用PBS缓冲液透析5次，透析结束后离心取上清液，得到氯胺酮人工抗原。

图3是氯胺酮人工抗原制备嵌合的紫外扫描图，从图中可以看出牛血清蛋白最大吸收峰所在的紫外波长为278nm, 氯胺酮半抗原最大吸收峰所在的紫外波长为286nm, 氯胺酮人工抗原最大吸收峰所在的紫外波长为277nm,氯胺酮人工抗原在最大吸收峰的波长与氯胺酮人工抗原及牛血清蛋白有明显不同，从而可以认为成功合成了氯胺酮人工抗原。

步骤(2).小鼠免疫：

取8周龄的BALB/c雌鼠，氯胺酮人工抗原注射靠近淋巴结皮下部位，每隔1天注射一次，共注射7次：第一次氯胺酮人工抗原免疫量为30μg/只，第一次氯胺酮人工抗原免疫量进行抗原乳化步骤，抗原乳化步骤是将氯胺酮人工抗原免疫量稀释于200ulPBS缓冲液中，得到稀释抗原,取总量二分之一的稀释抗原与等体积量的弗氏完全佐剂(sigma F5881)乳化，剩余二分之一的稀释抗原与等体积量的RIBI佐剂系统(sigma S6322)混合；第二次氯胺酮人工抗原免疫量改为15ug/只，抗原乳化步骤与第一次相同；后续5次氯胺酮人工抗原免疫量改为8ug/只，抗原乳化步骤与第一次相同。

步骤(3).淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合：

3-1.饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75﹪酒精中消毒10min，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，用无菌注射器注入8mL 37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；1500rpm下离心3min，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液。

3-3.淋巴细胞制备：取经步骤(2)处理的BALB/c雌鼠靠近淋巴结皮下部位的淋巴结，研磨淋巴细胞至悬液，将淋巴细胞悬液1500rpm下离心5min，取沉淀，然后用IMDM培养基调整研磨后淋巴细胞的浓度至1×10⁷个/mL。

3-4.淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，1500rpm下离心洗涤细胞1次，去除上清液，轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀松动，置于37℃水浴，在90s内缓缓加入1mL 37℃预温的1mL PEG 1450，边加边轻微摇动；加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；1000rpm下离心5min，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤3-1制备的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO₂培养箱中培养。

步骤(4).杂交瘤细胞的融合筛选：

4-1.初筛：

步骤3-4中融合细胞在5﹪CO₂培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液，继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇（在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小以占满1/3视野为宜）时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆。间接ELISA方法的操作步骤是：①用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释氯胺酮人工抗原至1ug/mL，96孔酶标板每孔中分别加入100ul稀释后的氯胺酮人工抗原，4℃包被过夜，用含0.05﹪tween20的PBS缓冲液洗板3次；②将PBS缓冲液加入到融合细胞培养上清液稀释至25倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的融合细胞培养上清液，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05﹪tween20的PBS缓冲液洗板1次；③将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟后，用含0.05﹪tween20的PBS缓冲液洗板3次；④每孔加入50ul底物TMB ，37℃下反应8分钟；⑤加入50ul浓度为2M的H₂SO₄终止反应，在450nm下测定其OD值，以融合细胞培养上清液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性克隆，将筛选到的阳性克隆进一步的用竞争抑制ELISA方法进行复筛。

4-2.复筛：

竞争抑制ELISA方法的操作步骤是：①取50ul浓度为100ng/ml的氯胺酮标准品和50ul上述步骤4-1得到的阳性克隆培养上清液混合后，加入到用氯胺酮人工抗原包被的酶标孔中，同时设计空白对照，即50ulPBS缓冲液和50ul阳性克隆培养上清液混合加入到酶标孔中，37℃孵育60分钟后，用含0.05﹪tween20的PBS缓冲液洗板1次；②将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃下孵育30分钟，用含0.05﹪tween20的PBS缓冲液洗板3次；③每孔加入50ul底物TMB，37℃下反应8分钟；④加入50ul 浓度为2M的H₂SO₄终止反应，在450nm下测定其OD值，挑取竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株3E7做克隆培养。

表一竞争抑制ELISA

细胞株	对照OD值	竞争抑制OD值	竞争抑制率	细胞株	对照OD值	竞争抑制OD值	竞争抑制率
								1A2	2.196	0.595	72.9﹪	2F8	1.928	0.717	62.8﹪
1B3	2.130	0.690	67.6﹪	3A5	2.121	1.134	46.5﹪
								1D6	2.365	0.802	66.0﹪	3E7	2.339	0.289	87.6﹪
1F5	2.088	0.684	67.2﹪	4C2	2.221	0.764	65.6﹪
								1H6	2.047	1.658	19.0﹪	4F6	2.259	1.030	54.4﹪
2A6	2.516	0.748	70.2﹪	4F8	2.156	0.704	67.3﹪
								2C5	1.972	0.946	52.0﹪	4H8	2.192	0.828	62.2﹪

4-3.杂交瘤细胞株3E7的克隆化：

杂交瘤细胞株3E7的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15﹪FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200ul接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，做再次克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100﹪；然后挑取单克隆细胞，命名为3E7.1，扩大培养后进行抗氯胺酮单克隆抗体纯化。

步骤(5).抗氯胺酮单克隆抗体纯化

将筛选到的单克隆细胞株3E7.1用含体积分数为10﹪FBS的IMDM培养基接种到24孔细胞培养板中，第二天接种到细胞培养瓶中，培养1天后，接种到细胞滚瓶中，滚瓶培养4天后，收集培养上清液，将培养上清液浓缩后得到含有抗氯胺酮单克隆抗体的细胞培养浓缩液，然后用HiTrap PROTEIN G HP亲和柱纯化，得到纯化后的抗氯胺酮单克隆抗体。HiTrap PROTEIN G HP亲和柱纯化的操作步骤是：将HiTrap PROTEIN G HP亲和柱先用5倍柱床体积的平衡缓冲液Binding Buffer充分洗涤，直至流穿液A280吸光值小于0.1；然后将细胞培养浓缩液上柱，控制上流速为1滴/2秒；上样完毕后，用5倍柱床体积的平衡缓冲液Binding Buffer充分洗涤，直至流穿液A280吸光值小于0.1；然后用洗脱液Elution Buffer洗脱结合的单克隆抗体，控制洗脱速度为1滴/2秒，收集A280吸光值大于0.2的洗脱液，在收集的洗脱液中滴加1M pH9.0的Tris溶液调节pH值至7；将调节pH值后的洗脱液置于透析袋中，用PBS缓冲液透析，每8小时更换透析液1次，共透析3次；将透析后的抗体溶液于280nm测定蛋白含量。

实施例2 抗氯胺酮单克隆抗体的性能检测

2.1 抗氯胺酮单克隆抗体亚型鉴定

参照Monoclonal antibody Isotyping Kits(pierce #37501)对实施例1制备的抗氯胺酮单克隆抗体进行亚型鉴定，抗氯胺酮单克隆抗体属于IgG1亚型，轻链是kappa链。

2.2 抗氯胺酮单克隆抗体反应活性测试

间接ELISA方法检测实施例1制备的抗氯胺酮单克隆抗体：用pH9.6浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液稀释氯胺酮人工抗原（KET-BSA）至1ug/mL，然后在96孔酶标板每孔中分别加入100ul稀释后的氯胺酮人工抗原，4℃包被过夜；然后用含0.05﹪tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后加入100ul浓度为1ug/ml的抗氯胺酮单克隆抗体溶液，做倍比稀释，同时设立阴性对照，37℃反应60分钟后，用含0.05﹪tween20的PBS缓冲液洗板1次；将PBS缓冲液加入到羊抗鼠IgG-HRP稀释到5000倍体积，然后在96孔细胞培养板中每孔加入100μl稀释后的羊抗鼠IgG-HRP，37℃反应30分钟，用含0.05﹪tween20的PBS缓冲液洗板3次；然后每孔加入50ul底物TMB 37℃反应8分钟后，浓度为2M 的H₂SO₄终止反应，450nm测定其OD值，以抗氯胺酮单克隆抗体溶液OD450值/阴性对照OD450值>2.5为阳性值。从表二可以看到，实施例1制备的抗氯胺酮单克隆抗体反应活性可以到达0.001ug/ml。

表二不同浓度下实施例1制备的抗氯胺酮单克隆抗体的OD450值

抗体浓度	OD450值	抗体浓度	OD450值
				1ug/ml	2.675	0.008ug/ml	0.671
0.5ug/ml	2.473	0.004ug/ml	0.584
				0.25ug/ml	2.021	0.002ug/ml	0.344
0.125ug/ml	1.962	0.001ug/ml	0.287
				0.0625ug/ml	1.773	0.0005ug/ml	0.198
0.032ug/ml	1.193	0.00025ug/ml	0.136
				0.016ug/ml	0.926	PBS（空白对照）	0.084

实施例3 氯胺酮胶体金试纸条方法的建立和评估

1. 胶体金制备

首先配制0.1g/L的氯金酸溶液20ml，用恒温电磁搅拌器加热到沸腾，加入1﹪柠檬酸三钠溶液0.4ml，继续加热搅拌10min，冷却至常温后用蒸馏水补充到原体积，得到胶体金溶液；

2. 胶体金标记抗体蛋白

用0.1mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液PH值至9.0，滴加0.5mg抗氯胺酮单克隆抗体蛋白；继续搅拌3min后，滴加质量体积比为5﹪BSA溶液，直至BSA溶液质量体积比为1﹪，继续搅拌10min，得到抗体溶液；其中抗氯胺酮单克隆抗体蛋白是抗氯胺酮单克隆抗体预先脱盐，稀释到1mg/ml后得到的抗体蛋白；

3. 金标抗体的纯化

将标记好的抗体溶液2000r/min下离心15min，弃去沉淀；上清再经10000r/min离心15min，弃去上清液；沉淀用PH9.0的硼酸缓冲液洗涤2次，最后重悬于2ml PH9.0的硼酸缓冲液中；

4. 试纸条组装

按常规方法将氯胺酮人工抗原（KET-BSA）点于膜上检测线位置，羊抗鼠二抗点于膜上C线位置，金标抗体点于金标垫上，然后组装成金标检测试纸条；

5. 氯胺酮试纸条灵敏度测试

用PBS缓冲液将氯胺酮标准品配制成300ng/ml、150ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、0ng/ml，将金标检测试纸条分别插入上述配制好的溶液中，5min后观察结果。

表三氯胺酮试纸条检测不同浓度标准品的结果判定

标准品浓度	300ng/ml	150ng/ml	100ng/ml	50ng/ml	0ng/ml
						结果强弱	-	-	+/-	++	+++
结果判定	阳性	阳性	阳性	阴性	阴性

Claims

1. 一种抗氯胺酮杂交瘤细胞株，其特征在于该抗氯胺酮杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株3E7.1，于2012年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)，保藏号为CCTCC NO:C2012157；中国典型培养物保藏中心的地址为：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心。

2.如权利要求1所述的抗氯胺酮杂交瘤细胞株作为分泌抗氯胺酮单克隆抗体的应用，分泌出的抗氯胺酮单克隆抗体属于IgG1亚型，轻链是kappa链。

3.制备如权利要求1所述的抗氯胺酮杂交瘤细胞株并分泌抗氯胺酮单克隆抗体方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

步骤(1).氯胺酮人工抗原的制备：

步骤(1)的反应过程如下：

Figure 2012105885318100001DEST_PATH_IMAGE002

；

步骤(2).小鼠免疫：

选择8周龄的BALB/c雌鼠用氯胺酮人工抗原注射靠近淋巴结皮下部位进行免疫；

所述的靠近淋巴结皮下部位为四肢腋下、四肢前臂或颈部；

步骤(3).淋巴细胞与骨髓瘤细胞的融合：

3-1.饲养细胞制备：小鼠摘眼球处死，浸泡于75﹪酒精中消毒，撕开小鼠腹外皮肤，暴露其腹膜，注入37℃预热的IMDM无血清培养基，轻揉小鼠腹腔，悬浮腹腔细胞，吸出腹腔液；离心，沉淀物用1×HAT的IMDM培养液重悬，得到饲养细胞悬液；

3-2.小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用含体积分数为10﹪FBS的IMDM培养基进行传代培养，细胞融合前一天进行传代以保证小鼠骨髓瘤细胞SP2/0适合生长状态良好用于细胞融合；

3-3.淋巴细胞制备：取经步骤(2)处理的BALB/c雌鼠靠近淋巴结皮下部位的淋巴结，研磨淋巴细胞至悬液；淋巴细胞悬液离心，取沉淀；在沉淀中加入IMDM培养基，调整淋巴细胞的浓度至1×10⁷个/mL；

3-4.淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合：采用聚乙二醇融合法；将调整浓度后的淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按细胞个数比为2：1混合均匀，离心洗涤细胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入1mL 37℃预温的PEG 1450，加入25ml 37℃预温的IMDM无血清培养基终止PEG作用；离心，取沉淀；然后在沉淀中加入步骤3-1的饲养细胞悬液，接种到96孔细胞培养板中，置于37℃，5﹪CO₂培养箱中培养；

步骤(4).杂交瘤细胞的筛选：

4-1.初筛：

融合细胞在5﹪CO₂培养箱中培养3天后，换用1×HT的IMDM培养液继续培养4天后，观察96孔细胞培养板里的融合细胞生长情况，在细胞生长到细胞团簇时，吸取融合细胞培养上清液，采用间接ELISA方法筛选阳性克隆；

所述的细胞团簇在16倍物镜和10倍目镜下观察，细胞大小占满1/3视野；

所述的1×HT的IMDM培养液含有体积分数为15﹪的FBS；

4-2.复筛：

将筛选到的阳性克隆进一步的用竞争抑制ELISA方法进行复筛，筛选出竞争抑制率最高的杂交瘤细胞株3E7做克隆培养；

4-3.杂交瘤细胞株3E7的克隆化：

杂交瘤细胞株3E7的克隆化培养按有限稀释法进行，准确计数细胞，用含体积分数为15﹪FBS的IMDM培养基稀释成4个/mL的细胞悬液，然后以每孔200ul稀释后的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，7天后观察细胞生长情况，并检测细胞培养板中细胞培养上清液的抗体水平，选择3个抗体效价最高的单克隆，做再次克隆化培养，直至单克隆孔抗体检测阳性率达到100﹪；然后挑取单克隆细胞，命名为3E7.1，扩大培养后进行抗氯胺酮单克隆抗体纯化；

步骤(5).抗氯胺酮单克隆抗体纯化：

将筛选到的单克隆细胞株3E7.1用含体积分数为10﹪FBS的IMDM培养基接种到24孔细胞培养板中，第二天接种到细胞培养瓶中，培养1天后，接种到细胞滚瓶中，滚瓶培养4天后，收集培养上清液，将培养上清液浓缩后得到含有抗氯胺酮单克隆抗体的细胞培养浓缩液，然后用HiTrap PROTEIN G HP亲和柱纯化，得到纯化后的抗氯胺酮单克隆抗体；

所述的1×HAT的IMDM培养液含有体积分数为15﹪的FBS。

4.如权利要求3所述的制备该抗氯胺酮杂交瘤细胞株并分泌抗氯胺酮单克隆抗体方法，其特征在于步骤1-1的具体步骤是：

将200mg盐酸氯胺酮溶于10ml的去离子水中，加入氨水调PH值至10，加入90ml二氯甲烷萃取3次，收集有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，减压蒸干溶剂，得到游离态氯胺酮；将游离态氯胺酮溶于10ml丙酮中，加入121μl溴乙酸乙酯和300mg碳酸钾,70℃下回流反应16h，冷却至常温，过滤，得到滤液；滤液减压蒸馏得到氯胺酮的酯；取100mg氯胺酮的酯、2ml四氢呋喃、2.5ml甲醇混合均匀，加入10ml浓度为1M的氢氧化钠溶液,常温反应16h；加入盐酸调PH值至7，用乙酸乙酯萃取1次，收集有机相，减压蒸馏得到氯胺酮半抗原；经高效液相色谱纯化，纯度≥99.8﹪。

5.如权利要求3所述的制备该抗氯胺酮杂交瘤细胞株并分泌抗氯胺酮单克隆抗体方法，其特征在于步骤1-2的具体步骤是：

将100mg氯胺酮半抗原、5ml N,N-甲基甲酰胺、59mg N-基琥珀酰亚胺、105mg环己基碳酰二亚胺混合均匀，常温反应16h,反应结束后离心取上清液，得到A液；将150mg牛血清蛋白加入到30ml PBS缓冲液混合均匀，得到B液；将A液和B液按体积比为1:5混合均匀，4℃下反应16h，得到人工抗原混合液；将人工抗原混合液移入透析袋中，用PBS缓冲液透析5次，透析结束后离心取上清液，得到氯胺酮人工抗原。

6.如权利要求3所述的制备该抗氯胺酮杂交瘤细胞株并分泌抗氯胺酮单克隆抗体方法，其特征在于步骤(2)的具体步骤是：

取8周龄的BALB/c雌鼠，用氯胺酮人工抗原注射靠近淋巴结皮下部位，每隔1天注射一次，共注射7次；第一次氯胺酮人工抗原免疫量为30μg/只，第一次氯胺酮人工抗原免疫量进行抗原乳化步骤，抗原乳化步骤是将氯胺酮人工抗原免疫量稀释于200ulPBS缓冲液中，得到稀释抗原,取总量二分之一的稀释抗原与等体积量的弗氏完全佐剂乳化，剩余二分之一的稀释抗原与等体积量的RIBI佐剂系统混合；第二次氯胺酮人工抗原免疫量改为15ug/只，抗原乳化步骤与第一次相同；后续5次氯胺酮人工抗原免疫量改为8ug/只，抗原乳化步骤与第一次相同。