CN104558140A - 一种氯胺酮人工抗原的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种氯胺酮人工抗原的制备方法，第一步为半抗原的制备及检测：以盐酸氯胺酮与溴乙酸乙酯为原料通过游离，接臂，水解，反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备氯胺酮的人工抗原即氯胺酮-牛丙种球蛋白。所制备的氯胺酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的氯胺酮抗体，可用于各种氯胺酮类免疫分析法的研究，为氯胺酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
Description
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种氯胺酮人工抗原的制备方法。
背景技术
氯胺酮（KET）是苯环己哌啶（phencyclidine）的衍生物，属于非鸦片系麻醉科药物，临床上用作手术麻醉剂或麻醉诱导剂，具有一定的精神依赖性潜力。由韦恩州立大学克雷格教授研发。于1962年交由派克-戴维斯药厂开发，作为较安全的麻醉药，以取代当年副作用大的的天使尘（phencyclidine，PCP），除了麻醉作用外，氯胺酮亦因其镇痛作用强，直至目前仍广泛应用。目前本药也被兽医广泛使用，并在发展中国家被用作麻醉剂，其结构式为：
氯胺酮可以产生一种分离麻醉状态，其特征是僵直状、浅镇静、遗忘与显著镇痛，并能进入梦境、出现幻觉，成为了狂野派对及其他类似活动里常用的迷幻药物。各国开始收紧对其的应用，并将其列为危险精神科药物等名录以加强监控。当中包括美国、英国及加拿大、中国等。
目前，对氯胺酮的检测主要依靠高效液相色谱法（HPLC）,气相色谱（GC），薄层色谱（TLC），质朴（MS)等，但是存在仪器昂贵，检测费时，并且需要专业技术人员进行操作，不能达到现代检测对快速，准确的要求。而免疫分析法可以弥补以上所有缺点，免疫分析法是一种利用抗原抗体特异性结合反应检测各种物质（药物、激素、蛋白质、微生物等）的分析方法,该方法的前提就是需要提供特异性的抗原和抗体。因此有必要提供一种有效的氯胺酮人工抗原的制备方法,制备的氯胺酮人工抗原可用于免疫制备具有特异性的氯胺酮抗体,进一步用于检测。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供一种氯胺酮人工抗原的制备方法，所制备的氯胺酮人工抗原可进行动物免疫，取得相应的氯胺酮抗体，可用于各种氯胺酮类免疫分析法的研究，为氯胺酮的检测提供更加方便快速准确的途径。
一种氯胺酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备人工半抗原：
(a)将盐酸氯胺酮溶于纯化水，滴加氨水，使之变混；用二氯甲烷萃取，转干，得到白色固体产物Ⅰ；TLC：层析液为乙酸乙酯：石油醚=1:1（v/v），产物Rf=0.8；
(b)将产物Ⅰ溶于无水丙酮中，加入300mg无水碳酸钾、363ul溴乙酸乙酯，加热至70-75℃回流搅拌反应22小时以上；反应结束后，过滤，将滤液减压蒸馏，转干得黄色油状液体Ⅱ；TLC：石油醚=1:1（v/v），产物Rf==0.9；
(c)加入的四氢呋喃，油状液体Ⅱ溶解，然后再加入甲醇、1N氢氧化钠，（反应比例为油状液体Ⅱ：四氢呋喃：甲醇：1N氢氧化钠=100mg：1.93ml：2.43ml：9.65ml），室温反应16小时以上。反应结束后用1N盐酸调pH=3.57-3.59。用乙酸乙酯萃取，合并所有有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤入圆底烧瓶中，转干，得黄色油状氯胺酮半抗原Ⅱ；TLC：层析液为95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4-二氧六环=8:1:10:1（v/v），产物Rf=0.4～0.5；
(2)制备氯胺酮人工抗原：
(d)将氯胺酮半抗原Ⅱ溶于N,N-二甲基甲酰胺中(DMF)，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、环己基碳酰二亚胺(DCC)，（反应比例为氯胺酮半抗原Ⅱ：DMF:NHS:DCC=20mg:1ml:11mg:19mg），室温搅拌反应18小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；
(e)将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2～7.4；
(f)将牛丙种球蛋白（BGG）溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
(g)将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2-8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(h)将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：氯胺酮-牛丙种球蛋白。
由于氯胺酮的分子量较小，单独作用时不具有免疫原性或免疫原性较弱，因此必须将其与大分子载体比如牛丙种球蛋白连接形成氯胺酮抗原后，才能刺激机体产生相应的氯胺酮抗体。本发明在制备氯胺酮人工抗原过程中，所选的位点和交联方法都没有明显改变其结构，保留了抗原决定簇。在氯胺酮半抗原和牛丙种球蛋白之间引入桥结构，暴露抗原决定簇，所获得的氯胺酮人工抗原保持了氯胺酮的结构特异性，有利于相应氯胺酮抗体的产生。
本发明的技术方案分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以盐酸氯胺酮为原料通过游离，和丁二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备氯胺酮的人工抗原即氯胺酮-牛丙种球蛋白。其反应方程式如下：
本发明制备得到的氯胺酮人工抗原可通过以下方法进行鉴定：
偶联物蛋白浓度的测定：精确量取Protein standard（BGG）分别配制成浓度为0.2，0.4，0.6，,0.8,1.0,1.2,1.6mg/ml的标准系列浓度，混匀，取50ul各浓度标准蛋白溶液加入到一次性比色杯中，加入250ul reagent A，混匀，再加入2.0ml reagent B,反应10分钟后以分光光度计测得吸光度。空白液为reagent A250ul加reagent B2.0ml。以OD值为横坐标，浓度为纵坐标作标准曲线，得出标准曲线线性方程。精确量取样品量为50ul，加入到一次性比色杯中，加入250ul reagent A，摇匀，再加入2.0ml reagent B,反应10分钟后以分光光度计测得吸光度。通过已得出的标准曲线求得样品浓度。本发明计算得氯胺酮抗原的蛋白浓度为2.35mg/ml。
有益效果
通过本发明的方法制备的抗原的产率高，纯度高，为下一步免疫抗体提供了必要的条件，为之别高纯度和高特异性的抗体提供了可能。
附图说明
图1是氯胺酮人工抗原的液相色谱图。
图2是氯胺酮人工抗原制备前后的紫外扫描图。
具体实施方式
氯胺酮人工抗原制备分为两步，第一步为半抗原的制备及检测：以盐酸氯胺酮为原料通过游离，和丁二酸酐反应得到含羧基的半抗原；第二步为人工抗原的制备与检测：通过碳二亚胺法使之与牛丙种球蛋白(BGG)结合制备氯胺酮的人工抗原即氯胺酮-牛丙种球蛋白。
实施例1
(1)人工半抗原的制备：
(a)称取盐酸氯胺酮200mg于50ml锥形瓶中,加入10mL纯化水充分溶解，然后滴加6滴氨水，有白色混浊物产生，用3×10ml二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤于50ml单口圆底烧瓶中，转干，得白色产物Ⅰ166mg，TLC：层析液为乙酸乙酯：石油醚=1:1（v/v），产物Rf=0.8。
(b)加入10ml无水丙酮溶液，产物Ⅰ溶解，加入300mg无水碳酸钾、363ul溴乙酸乙酯加热至70-75℃，回流反应23小时；停止反应，冷却至室温，将反应液过滤入单口圆底烧瓶中，减压蒸干溶剂，得一黄色油状液体Ⅱ310mg。TLC：层析液为乙酸乙酯：石油醚=1:1（v/v），产物Rf=0.9
(c)加入5.98ml四氢呋喃，油状液体Ⅱ溶解，然后再加入7.53ml甲醇、29.92ml1N氢氧化钠，室温反应16小时。反应结束后用1N盐酸调pH=3.58。用200ml乙酸乙酯分6次萃取，合并所有有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤入已知重量的50mL圆底烧瓶中，转干，得黄色油状氯胺酮半抗原Ⅱ90mg；TLC：层析液为95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4-二氧六环=8:1:10:1（v/v），产物Rf=0.4；
(2)氯胺酮人工抗原的制备：
(d)将90mg氯胺酮半抗原Ⅱ溶于4.5ml N,N-二甲基甲酰胺中（DMF），加入50mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、86mg环己基碳酰二亚胺(DCC)，室温搅拌反应19小时，反应结束离心取上清液记为A液。
(e)称取14.5g十二水磷酸氢二钠，43.875g氯化钠，1.495g二水磷酸二氢钠用双蒸水溶解定容至5.0L，得到PBS缓冲液，pH为7.2～7.4。
(f)称取0.1125g牛丙种球蛋白溶于22.5mlPBS缓冲液中，得到的溶液记为B液。
(g)在快速搅拌下，将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2-8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液。
(h)将人工抗原混合液移入透析袋中，用上述PBS缓冲液透析9次，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：氯胺酮-牛丙种球蛋白。
图1是氯胺酮人工抗原的液相色谱图，图2是氯胺酮人工抗原制备前后的紫外扫描图，注：氯胺酮抗原1、氯胺酮抗原2、氯胺酮抗原3表示3个批号。
(3)氯胺酮人工抗原的鉴定：
偶联物蛋白浓度的测定：精确量取Protein standard（BGG）分别配制成浓度为0.2，0.4，0.6，,0.8,1.0,1.2,1.6mg/ml的标准系列浓度，混匀，取50ul各浓度标准蛋白溶液加入到一次性比色杯中，加入250ul reagent A，混匀，再加入2.0ml reagent B,反应10分钟后以分光光度计测得吸光度。空白液为reagent A250ul加reagent B2.0ml。以OD值为横坐标，浓度为纵坐标作标准曲线，得出标准曲线线性方程。精确量取样品量为50ul，加入到一次性比色杯中，加入250ul reagent A，摇匀，再加入2.0ml reagent B,反应10分钟后以分光光度计测得吸光度。通过已得出的标准曲线求得样品浓度。本发明计算得氯胺酮抗原的蛋白浓度为2.35mg/ml。获得的抗原浓度和产量以及纯度（98.5%）显著高于采用传统的方法制备的抗原。
Claims (1)
1.一种氯胺酮人工抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1) 制备人工半抗原：
(a) 将盐酸氯胺酮溶于纯化水，滴加氨水，使之变混；用二氯甲烷萃取，转干，得到白色固体产物Ⅰ；TLC：层析液为乙酸乙酯：石油醚= 1: 1（v/v），产物Rf =0.8；
(b) 将产物Ⅰ溶于无水丙酮中，加入300mg无水碳酸钾、363ul溴乙酸乙酯，加热至70-75℃回流搅拌反应22小时以上；反应结束后，过滤，将滤液减压蒸馏，转干得黄色油状液体Ⅱ；TLC：石油醚= 1: 1（v/v），产物Rf ==0.9；
(c) 加入的四氢呋喃，油状液体Ⅱ溶解，然后再加入甲醇、1N氢氧化钠，（反应比例为油状液体Ⅱ：四氢呋喃：甲醇：1N氢氧化钠=100mg：1.93ml：2.43ml：9.65ml），室温反应16小时以上；反应结束后用1N盐酸调pH=3.57-3.59；用乙酸乙酯萃取，合并所有有机相，用无水硫酸镁干燥，过滤，滤入圆底烧瓶中，转干，得黄色油状氯胺酮半抗原Ⅱ；TLC：层析液为95%乙醇：氨水：二氯甲烷：1，4-二氧六环=8: 1: 10: 1（v/v），产物Rf =0.4~0.5；
(2) 制备氯胺酮人工抗原：
(d) 将氯胺酮半抗原Ⅱ溶于N,N-二甲基甲酰胺中(DMF)，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、环己基碳酰二亚胺(DCC)，（反应比例为氯胺酮半抗原Ⅱ：DMF:NHS:DCC= 20mg:1ml: 11mg:19mg），室温搅拌反应18小时以上，反应结束后离心取上清液记为A液；
(e) 将氯化钠与十二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠以摩尔比为78.3:4.2:1溶于双蒸水中，制备钠离子浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，pH为7.2~7.4；
(f) 将牛丙种球蛋白（BGG）溶于PBS缓冲液中，得到浓度为5mg/ml的B液；
(g) 将A液缓慢滴加到B液，A液与B液的体积比为1:5，得到的混合液在2-8℃条件下静置保存过夜，得到人工抗原混合液；
(h) 将人工抗原混合液于PBS缓冲液中透析，透析结束后离心取上清液即得到人工抗原：氯胺酮-牛丙种球蛋白。
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