CN106995697A - 一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用 - Google Patents
一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106995697A CN106995697A CN201710150982.6A CN201710150982A CN106995697A CN 106995697 A CN106995697 A CN 106995697A CN 201710150982 A CN201710150982 A CN 201710150982A CN 106995697 A CN106995697 A CN 106995697A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glycan molecule
- fluorescence labeling
- molecule
- fluorescence
- glycan
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 94
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 title claims abstract description 81
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 title claims abstract description 80
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 25
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 28
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 21
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N Formic acid Chemical compound OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 10
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 10
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N N-Methylmorpholine Chemical compound CN1CCOCC1 SJRJJKPEHAURKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 8
- 229920001542 oligosaccharide Chemical group 0.000 claims description 8
- 150000002482 oligosaccharides Chemical group 0.000 claims description 8
- 229910000085 borane Inorganic materials 0.000 claims description 7
- -1 imide ester Chemical class 0.000 claims description 7
- UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N trihydridoboron Substances B UORVGPXVDQYIDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 claims description 6
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 claims description 6
- XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N carbonyl dihydrazine Chemical compound NNC(=O)NN XEVRDFDBXJMZFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N heptamethylene Natural products C1CCCCCC1 DMEGYFMYUHOHGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 5
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 claims description 5
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(4-bromopyrazol-1-yl)ethyl]isoindole-1,3-dione Chemical compound C1=C(Br)C=NN1CCN1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O WFIYPADYPQQLNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012448 Lithium borohydride Substances 0.000 claims description 4
- VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N cadaverine Chemical group NCCCCCN VHRGRCVQAFMJIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WVMHLYQJPRXKLC-UHFFFAOYSA-N borane;n,n-dimethylmethanamine Chemical compound B.CN(C)C WVMHLYQJPRXKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- VEWFZHAHZPVQES-UHFFFAOYSA-N boron;n,n-diethylethanamine Chemical compound [B].CCN(CC)CC VEWFZHAHZPVQES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 claims description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 13
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 abstract description 13
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 abstract description 12
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 abstract description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 abstract description 6
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 abstract description 5
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 abstract description 4
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 abstract 1
- 229920001543 Laminarin Polymers 0.000 description 26
- DBTMGCOVALSLOR-VPNXCSTESA-N laminarin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)OC1O[C@@H]1[C@@H](O)C(O[C@H]2[C@@H]([C@@H](CO)OC(O)[C@@H]2O)O)O[C@H](CO)[C@H]1O DBTMGCOVALSLOR-VPNXCSTESA-N 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 7
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 6
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N curcumin Chemical compound C1=C(O)C(OC)=CC(\C=C\C(=O)CC(=O)\C=C\C=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-FCXRPNKRSA-N 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M (4z)-1-(3-methylbutyl)-4-[[1-(3-methylbutyl)quinolin-1-ium-4-yl]methylidene]quinoline;iodide Chemical compound [I-].C12=CC=CC=C2N(CCC(C)C)C=CC1=CC1=CC=[N+](CCC(C)C)C2=CC=CC=C12 QGKMIGUHVLGJBR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- PWGJDPKCLMLPJW-UHFFFAOYSA-N 1,8-diaminooctane Chemical compound NCCCCCCCCN PWGJDPKCLMLPJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- JDGPQNJYYADFKP-UHFFFAOYSA-N aniline;n-phenylaniline Chemical class NC1=CC=CC=C1.C=1C=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 JDGPQNJYYADFKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 2
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 229940109262 curcumin Drugs 0.000 description 2
- 235000012754 curcumin Nutrition 0.000 description 2
- 239000004148 curcumin Substances 0.000 description 2
- VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N diferuloylmethane Natural products C1=C(O)C(OC)=CC(C=CC(=O)CC(=O)C=CC=2C=C(OC)C(O)=CC=2)=C1 VFLDPWHFBUODDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 2
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 2
- LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4-difluorophenoxy)pyridin-3-amine Chemical compound NC1=CC=CN=C1OC1=CC=C(F)C=C1F LCPVQAHEFVXVKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 3,6-diamino-10-methylacridinium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(N)C=C2[N+](C)=C(C=C(N)C=C3)C3=CC2=C1 KKAJSJJFBSOMGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000234314 Zingiber Species 0.000 description 1
- 235000006886 Zingiber officinale Nutrition 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000001949 anaesthesia Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000008397 ginger Nutrition 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L sodium persulfate Substances [Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O CHQMHPLRPQMAMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
- C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
- A61K49/0013—Luminescence
- A61K49/0017—Fluorescence in vivo
- A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
- A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
- A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B31/00—Preparation of derivatives of starch
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
- C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
- C09K2211/14—Macromolecular compounds
- C09K2211/1441—Heterocyclic
- C09K2211/1466—Heterocyclic containing nitrogen as the only heteroatom
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明涉及一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用。本发明采用还原胺化法在糖分子的还原端引入含氨基分子，再将含有氨基的糖分子与含有羧基的荧光分子偶联，分别采用透析和凝胶过滤方法对还原胺化及荧光标记后产物进行纯化，最终获得荧光标记的糖分子。本发明制备的荧光标记糖分子在活体动物中用于糖分子的代谢动力学及组织和器官分布研究。本发明提供的糖分子荧光标记方法操作简单，具有重复性好，适用范围广，成本低廉等优点，可用于任何含有还原末端的糖分子的标记，并采用活体成像仪研究其在动物体内的代谢和组织器官分布。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用。
背景技术
糖类化合物尤其是多糖由于结构复杂，没有特定的紫外吸收光谱，使得糖类药物的微量检测成为难点，进而限制了糖类分子体内药代动力学研究并成为糖药物开发的瓶颈。传统的糖类药物代谢动力学研究方法有同位素标记法、免疫学法、色谱分析法等，由于过程繁琐，灵敏度低，结果重复性差而受到限制。
荧光标记及活体成像检测技术由于灵敏度高，检测结果直观，已广泛用于生命科学研究及药物开发中。研究表明，Cy7可对姜黄素进行荧光标记，并利用活体成像技术对姜黄素在小鼠体内分布情况进行实时检测，表明该技术可对姜黄素在小鼠体内代谢进行研究(孙永等，南京中医药大学学报，2011，27(6): 539-541)。但是，对于糖类化合物是否能采用类似技术进行荧光标记，并研究其在活体内的药代动力学特点及组织和器官分布尚无专利或文献报道。
发明内容
针对糖类分子体内代谢和组织器官分布研究方法不灵敏问题，本发明的目的在于提供一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用，本发明为糖类分子提供了简单的荧光标记技术，并利用活体成像技术检测荧光标记糖分子在活体动物体内的代谢动力学及组织器官分布，弥补了现有技术存在的不足之处。所提供的荧光标记及纯化方法简单，效率高，荧光信号强，检测灵敏度高，并且结果直观可视性好，尤其是对于未知结构的糖分子代谢研究更具有明显的优势，易在糖类药物开发及临床研究中应用。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
本发明提供了一种荧光标记的糖分子，所述荧光标记的糖分子经过如下标记过程获得：
其中所述R为多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，n=2-10，所述荧光分子为N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的花青染料Cy3、Cy5和Cy7中的至少一种。
本发明还提供了所述的荧光标记的糖分子的制备方法，它包括以下步骤：
(1)还原胺化：将糖分子溶解在含有二氨基试剂的乙酸溶液中，再加入还原剂，形成反应体系，搅拌反应5h～24h，反应结束后用1kDa～10kDa透析袋透析，透析液减压浓缩后冷冻干燥，得到糖分子还原胺化产物；
(2)荧光标记：将步骤(1)糖分子还原胺化产物用磷酸盐缓冲液溶解后加入荧光标记试剂形成总反应溶液，避光反应，对糖分子进行荧光标记，获得所述荧光标记的糖分子。
进一步的：所述步骤(1)中二氨基试剂为1,5-戊二胺、1,6-己二胺、1,7-庚二胺、1,8-辛二胺、1,9-辛二胺和1,10-壬二胺中的至少一种，所述二氨基试剂在反应体系中的摩尔浓度为糖分子在反应体系中摩尔浓度的10～200倍。
进一步的：所述步骤(1)中加入的还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化锂、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、吗啉硼烷和4-甲基吗啉硼烷中的至少一种，所述还原剂在反应体系中的摩尔浓度为糖分子在反应体系中摩尔浓度的10～200倍。
进一步的：所述步骤(2)中荧光标记试剂在总反应溶液的最终摩尔浓度为糖分子在总反应溶液摩尔浓度的2～10倍。
进一步的：将步骤(2)所述荧光标记的糖分子进行如下纯化步骤：取所述荧光标记的糖分子用凝胶色谱柱纯化，以蒸馏水为流动相，收集示差检测器和荧光检测器重合的检测信号峰，减压浓缩干燥，得纯化后的荧光标记的糖分子。
进一步的：所述凝胶色谱柱填料为Sephadex G-10、Sephadex G-15、Sephadex G-25或Bio Gel P2、P4、P6。
本发明还提供了所述的荧光标记的糖分子在制备用于检测糖分子在体内代谢的检测剂中的应用。
本发明还提供了所述的荧光标记的糖分子在制备用于检测糖分子在组织器官中分布的检测剂中的应用。
进一步的：所述荧光标记的糖分子的检测时间为0.01～24h。
与现有技术相比，本发明的优点及积极效果是：本发明提供的糖分子的荧光标记技术操作简单，适用于任一具有还原端的多糖、低聚糖、寡糖及其衍生物分子，具有普遍适用性，且标记产物纯度高，标记后保持分子原型。本发明制备的荧光标记糖分子经动物活体成像技术检测在动物体内的组织及器官分布证实具有荧光信号强，检测灵敏度高，可视性强等优点，容易说明糖分子在动物体内的代谢时间及代谢类型、组织及器官分布特点，为糖类药物活体代谢研究提供了新的途径，在糖药物的开发中具有广阔的应用前景。
结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其它优点和特点将变得更加清晰。
附图说明
图1为本发明低聚褐藻淀粉还原胺化产物高效薄层硅胶层析分析图，其中a、己二胺；b、还原胺化产物；c、荧光标记产物。
图2为本发明荧光标记的低聚褐藻淀粉纯化与高效液相色谱分析图。
图3为本发明低聚褐藻淀粉还原胺化及荧光标记产物分子量分析图。
图4为本发明荧光标记低聚褐藻淀粉在小鼠体内不同时间的组织器官分布图。
图5为本发明荧光标记灰树花多糖在小鼠体内不同时间的组织器官分布图。
图6位本发明荧光标记的灰树花多糖在小鼠器官的分布图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的详细说明。
本发明采用还原胺化的方法在糖分子还原端引入含氨基分子，再与含羧基荧光试剂偶联，获得荧光标记糖分子。具体标记过程如下所示：
其中所述R为具有还原端的多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，所述n=2-10，所述荧光分子为N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的花青染料Cy3、Cy5和Cy7中的至少一种。
实施例1：低聚褐藻淀粉的荧光标记
1、取100mg低聚褐藻淀粉溶解在5mL 含有2mol/L 1,6-己二胺的5%-20%（体积比）乙酸溶液中，再加入5mL 4mol/L氰基硼氢化钠搅拌反应5h，反应结束后用3kDa透析袋透析24h，透析内液经减压浓缩后冷冻干燥得低聚褐藻淀粉还原胺化产物。
2、取步骤1的还原胺化产物1mg，加入0.1mL蒸馏水溶解，分别取0.2µL溶液分别点在2块高效薄层硅胶板上，在正丙醇/H2O=3/1(体积/体积)的体系中层析，层析结束后分别用茚三酮(0.2%茚三酮乙醇溶液)和苯胺-二苯胺液显色，两种显色方法均呈现阳性反应，表明还原胺化成功。
3、取步骤1所述的还原胺化产物用pH7.2磷酸盐缓冲液溶解，加入占低聚褐藻淀粉还原胺化产物3倍摩尔质量的N-羟基琥珀酰亚胺活化的Cy7，在37℃恒温摇床中避光反应12h，反应结束后对产物进行冷冻干燥，获得荧光标记的低聚褐藻淀粉。
4、取步骤3所述荧光标记的低聚褐藻淀粉用2mL蒸馏水溶解，用Sephadex G-10凝胶凝胶色谱柱纯化，以蒸馏水为流动相，示差检测器和荧光检测器同时检测，收集示差检测器和荧光检测器重合的检测信号峰，减压浓缩干燥，得纯化后的荧光标记的低聚褐藻淀粉。
5、取步骤1所述的低聚褐藻淀粉及其还原胺化产物，以及步骤4所述荧光标记产物进行分子量分析，色谱柱为OHpak SB-802HQ凝胶色谱柱，以0.1mol/L硫酸钠水溶液为流动相，采用示差检测器-多角激光散射仪联用在线检测，计算多糖标记过程中的重均分子量(Mw)和数均分子量(Mn)。
本实施例所述的1,6-己二胺可改用1,5-戊二胺、1,7-庚二胺，1,8-辛二胺，1,9-辛二胺或1,10-壬二胺。所述的氰基硼氢化钠可改用硼氢化钠、硼氢化锂、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、吗啉硼烷或4-甲基吗啉硼烷。所述的N-羟基琥珀酰亚胺活化Cy7可改用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的Cy3、Cy5或其它可用于动物成像检测的荧光试剂。所述的纯化用凝胶色谱柱填料可改用Sephadex G-15、Sephadex G-25或Bio Gel P2、P4、P6。所述分子量测定用的凝胶色谱柱可改用OHpak SB-802.5HQ、OHpak SB-804HQ、OHpak SB-806HQ、TSK-GEL G3000PW/G3000PWXL或SPL aquagel-OH mixed中的一种或两种串联。
本发明利用糖分子还原端通过还原胺化反应与二氨基化合物反应引入游离氨基，进一步通过氨基与荧光试剂分子中的羧基发生缩合反应，从而将荧光分子引入糖分子实现糖分子的荧光标记，由于反应产物水溶性强，可以通过透析对还原胺化产物进行纯化，利用凝胶柱层析对荧光标记多糖进行纯化和检测，反应效率高，操作简单。
本发明中低聚褐藻淀粉还原胺化产物高效薄层色谱检测图如图1所示。其中，采用苯胺-二苯胺对糖显色时，低聚褐藻淀粉和其还原胺化产物均呈阳性反应，而采用茚三酮显色时，还原胺化产物显色呈阳性反应，表明分子中成功引入了氨基基团，同时以己二胺为对照，表明采用的透析技术可以成功的除去反应中多余的己二胺。
本发明中低聚褐藻淀粉荧光标记产物纯化及检测图如图2所示。其中，示差检测器信号只出现产物荧光标记多糖的信号，虽然糖分子中荧光标记物的含量较少，但荧光检测器可以同时检测到荧光标记糖分子与残留的荧光试剂信号，说明通过Sephadex G-10柱可以成功的将荧光标记低聚褐藻淀粉与残留的荧光试剂及其它杂质去除。根据色谱图中出峰的顺序对产物进行回收，冻干后可获得目标产物荧光标记低聚褐藻淀粉。
本发明中低聚褐藻淀粉荧光标记过程中分子量分析图如图3所示。其中，低聚褐藻淀粉、其还原胺化产物及荧光标记低聚褐藻淀粉的激光检测器信号和示差检测器信号重叠性好，表明低聚褐藻淀粉在标记过程中未发生降解，保持了分子原型。
本发明中低聚褐藻淀粉荧光标记过程中分子量测定结果如表1所示。低聚褐藻淀粉分子量为5.54kDa，分散指数为1.15，还原胺化产物的分子量为5.83kDa，分散指数为1.15，荧光标记低聚褐藻淀粉分子量为6.23kDa，分散指数为1.16，表明标记过程中分子量有少量增加，这是由于引入含有氨基的连接臂和荧光分子的缘故，由于分散指数未发生明显的变化，进一步表明本发明方法标记过程中糖分子未发生降解，保持了分子原型，适合糖类分子的荧光标记。
表1 荧光标记过程中糖分子量及分子量分散指数
实施例2：荧光标记的低聚褐藻淀粉在检测糖分子代谢动力学和组织及器官分布中的应用
1、将所述荧光标记的低聚褐藻淀粉用生理盐水配制为1 mg/mL溶液，生理盐水作为空白组，按照0.1 mL/10 g体重剂量裸鼠尾静脉注射。
2、步骤1注射后分别于0、0.5、1、2、4和8 h麻醉实验鼠，使用小动物活体成像系统对各实验组受试药在小鼠体内的组织分布情况进行观察，分别拍照记录裸鼠腹部和背部不同时间的荧光信号。
本发明中荧光标记的低聚褐藻淀粉不同时间在实验鼠体内分布情况如图4所示，从图4可以看出标记的糖分子静脉注射进入小鼠体内后，0.5h~8h内均可以检测到荧光信号，0.5h时主要分布于肺部和肾脏，随着作用时间的增加，在1h~2h时逐渐向肾脏和膀胱聚集，呈现肾排泄的特点，4h后逐渐排出体外，8h在膀胱处有微弱的荧光信号。同时发现在标记的低聚褐藻淀粉在体内8h以内，糖分子与荧光分子未发生脱离，表明该荧光标记方法适合代谢过程中药物分子的示踪检测。根据需要，标记糖分子的代谢和组织器官分布情况可以连续检测24h。
实施例3：灰树花多糖的荧光标记及其在组织和器官分布检测中的应用
1、取50mg灰树花多糖溶解在2mL 含有1mol/L 1,7-庚二胺的10%（体积比）乙酸溶液中，再加入2mL 2mol/L硼氢化钠搅拌反应8h，反应结束后用7kDa透析袋透析36h，透析内液经减压浓缩后冷冻干燥得灰树花多糖还原胺化产物。
2、取步骤1所述灰树花多糖还原胺化产物用pH7.2磷酸盐缓冲液溶解，加入占灰树花多糖还原胺化产物5倍摩尔质量的N-羟基琥珀酰亚胺活化的Cy7分子，在37℃恒温摇床中避光反应10h，反应结束后转移至截留分子量为10 kDa的透析袋中透析36h，透析内液经减压浓缩后冷冻干燥得灰树花多糖Cy7荧光标记产物。
3、将步骤2所述灰树花多糖荧光标记产物用生理盐水溶解为5 mg/mL溶液，以生理盐水作为空白对照组，按照0.05 mL/10 g体重剂量裸鼠尾静脉注射。
4、步骤3注射后分别于0、15min、30min、45min、60min、1.5h、2h、2.5h和3 h麻醉实验鼠，使用小动物活体成像系统对各实验组受试药在小鼠体内的组织分布情况进行观察，分别拍照记录裸鼠腹部和背部不同时间的荧光信号。
5、将步骤4的实验鼠处死后解剖，分别取脑、心脏、肺脏、肝脏和肾脏采用活体成像系统观察拍照，记录不同器官荧光信号。
本实施例所述的1,7-庚二胺可改用1,5-戊二胺、1,6-己二胺、，1,8-辛二胺，1,9-辛二胺或1,10-壬二胺。所述的硼氢化钠可改用氰基硼氢化钠、硼氢化锂、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、吗啉硼烷或4-甲基吗啉硼烷。所述的N-羟基琥珀酰亚胺活化Cy5可改用N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的Cy3、Cy7或其它可用于动物成像检测的荧光试剂。
本实施例中荧光标记灰树花多糖静脉注射进入小鼠体内后，组织和器官分布检测结果如图5所示。15min~3h内均可以检测到荧光信号，30 min时主要在肝脏和肾脏分布，随着时间的延长，60min以后逐渐向肾脏和膀胱聚集，呈现出神代谢的特诊。同时观察到标记的灰树花多糖在体内3h以内，多糖与荧光分子没有发生脱离，表明该荧光标记方法适合用于糖分子药物的体内代谢检测。
本发明标记灰树花多糖在各器官的荧光信号分布检测结果如图6所示。从图6结果可进一步说明标记灰树花多糖主要分布于小鼠的肝脏和肾脏，3h以后主要集中于肾脏和膀胱部位。根据需要，标记糖分子的代谢和组织器官分布情况可以连续检测24小时。
综上，本发明所述方法通过还原胺化反应在糖分子的还原端引入游离氨基，通过氨基与荧光分子中的羧基偶联反应，并通过透析及凝胶柱层析纯化，实现了对糖分子的快速荧光标记，利用动物活体成像技术检测了糖分子在活体动物中的药代动力学特征及组织和器官分布。
本发明建立的糖分子荧光标记方法适用于任何具有还原端的糖分子，具有普适性，利用糖分子的荧光标记技术实现了糖分子在活体动物中的代谢动力学及组织和器官分布研究，具有灵敏度高，结果直观可靠等特点，具有广阔的应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例中所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种荧光标记的糖分子，其特征在于所述荧光标记的糖分子经过如下标记过程获得：
其中所述R为多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，n=2-10，所述荧光分子为N-羟基琥珀酰亚胺酯活化的花青染料Cy3、Cy5和Cy7中的至少一种。
2.权利要求1所述的荧光标记的糖分子的制备方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)还原胺化：将糖分子溶解在含有二氨基试剂的乙酸溶液中，再加入还原剂，形成反应体系，搅拌反应5h～24h，反应结束后用1kDa～10kDa透析袋透析，透析液减压浓缩后冷冻干燥，得到糖分子还原胺化产物；
(2)荧光标记：将步骤(1)糖分子还原胺化产物用磷酸盐缓冲液溶解后加入荧光标记试剂形成总反应溶液，避光反应，对糖分子进行荧光标记，获得所述荧光标记的糖分子。
3.根据权利要求书2所述的荧光标记的糖分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中二氨基试剂为1,5-戊二胺、1,6-己二胺、1,7-庚二胺、1,8-辛二胺、1,9-辛二胺和1,10-壬二胺中的至少一种，所述二氨基试剂在反应体系中的摩尔浓度为糖分子在反应体系中摩尔浓度的10～200倍。
4.根据权利要求书2所述的荧光标记的糖分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中加入的还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠、硼氢化锂、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、吗啉硼烷和4-甲基吗啉硼烷中的至少一种，所述还原剂在反应体系中的摩尔浓度为糖分子在反应体系中摩尔浓度的10～200倍。
5.根据权利要求书2所述的荧光标记的糖分子的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中荧光标记试剂在总反应溶液的最终摩尔浓度为糖分子在总反应溶液摩尔浓度的2～10倍。
6.根据权利要求书2所述的荧光标记的糖分子的制备方法，其特征在于：将步骤(2)所述荧光标记的糖分子进行如下纯化步骤：取所述荧光标记的糖分子用凝胶色谱柱纯化，以蒸馏水为流动相，收集示差检测器和荧光检测器重合的检测信号峰，减压浓缩干燥，得纯化后的荧光标记的糖分子。
7.根据权利要求书6所述的荧光标记的糖分子的制备方法，其特征在于：所述凝胶色谱柱填料为Sephadex G-10、Sephadex G-15、Sephadex G-25或Bio Gel P2、P4或P6。
8.权利要求书1所述的荧光标记的糖分子在制备用于检测糖分子在体内代谢的检测剂中的应用。
9.权利要求书1所述的荧光标记的糖分子在制备用于检测糖分子在组织器官中分布的检测剂中的应用。
10.根据权利要求书9所述的荧光标记的糖分子在制备用于检测糖分子在组织器官中分布的检测剂中的应用，其特征在于：所述荧光标记的糖分子的检测时间为0.01～24h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710150982.6A CN106995697B (zh) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | 一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710150982.6A CN106995697B (zh) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | 一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106995697A true CN106995697A (zh) | 2017-08-01 |
| CN106995697B CN106995697B (zh) | 2021-11-02 |
Family
ID=59431064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710150982.6A Active CN106995697B (zh) | 2017-03-14 | 2017-03-14 | 一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106995697B (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108796044A (zh) * | 2018-06-12 | 2018-11-13 | 苏州百源基因技术有限公司 | 基于荧光标记多糖的染料编码方法 |
| CN109265573A (zh) * | 2018-08-20 | 2019-01-25 | 华中科技大学 | 一种用于近红外成像的石斛多糖荧光标记物及其合成方法 |
| CN112986193A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-18 | 华中科技大学 | 一种铁皮石斛多糖特异性荧光标记物及其合成方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1402006A (zh) * | 2001-11-22 | 2003-03-12 | 青岛海洋大学 | 糖的荧光探针的合成方法 |
| CN101503478A (zh) * | 2009-03-05 | 2009-08-12 | 中国药科大学 | 一种具有荧光性质的虫草多糖及其制备方法 |
-
2017
- 2017-03-14 CN CN201710150982.6A patent/CN106995697B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1402006A (zh) * | 2001-11-22 | 2003-03-12 | 青岛海洋大学 | 糖的荧光探针的合成方法 |
| CN101503478A (zh) * | 2009-03-05 | 2009-08-12 | 中国药科大学 | 一种具有荧光性质的虫草多糖及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 孙永等，: ""利用活体成像技术检测姜黄素药物组织分布的方法探索"", 《南京中医药大学学报》 * |
| 李福川等，: ""一种糖生物传感芯片制备的新方法"", 《分析化学研究报告》 * |
| 陈智毅等，: "《分子影像学：基础与应用》", 31 January 2013, 广东高等教育出版社， * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108796044A (zh) * | 2018-06-12 | 2018-11-13 | 苏州百源基因技术有限公司 | 基于荧光标记多糖的染料编码方法 |
| CN108796044B (zh) * | 2018-06-12 | 2020-10-09 | 苏州百源基因技术有限公司 | 基于荧光标记多糖的染料编码方法 |
| CN109265573A (zh) * | 2018-08-20 | 2019-01-25 | 华中科技大学 | 一种用于近红外成像的石斛多糖荧光标记物及其合成方法 |
| CN112986193A (zh) * | 2021-01-29 | 2021-06-18 | 华中科技大学 | 一种铁皮石斛多糖特异性荧光标记物及其合成方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106995697B (zh) | 2021-11-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Choi et al. | Synthesis and in vivo fate of zwitterionic near‐infrared fluorophores | |
| US9517278B2 (en) | Compound and photoacoustic imaging contrast medium containing the compound | |
| US20190302026A1 (en) | Uniform, Functionalized, Cross-Linked Nanostructures for Monitoring pH | |
| CN108117612B (zh) | 一种具有还原响应性的水溶性壳聚糖基聚集诱导发光荧光探针的制备方法 | |
| EP2863957B1 (en) | Compound and photoacoustic imaging contrast medium containing the compound | |
| CN106995697A (zh) | 一种荧光标记的糖分子及其制备方法和应用 | |
| CN106573076A (zh) | pH响应聚合物库及其纳米探针 | |
| CN103239737B (zh) | 荧光造影剂及其制备方法 | |
| CN109054807B (zh) | 一种双细胞器靶向的纳米探针及其制备及应用 | |
| CN106420611B (zh) | 一种兼具靶向性和荧光特性的pH敏感壳聚糖载药胶束及其制备方法 | |
| CN106147755A (zh) | 抗体修饰的荧光纳米粒子及在癌细胞靶向成像中的应用 | |
| Huang et al. | Light‐emitting agents for noninvasive assessment of kidney function | |
| WO2010128787A2 (ko) | 가돌리늄 착물, 그 제조방법, 및 그것을 포함하는 ｍｒｉ 조영제 | |
| CN113616803A (zh) | 一种gsh响应型吉西他滨纳米粒子及其制备方法与应用 | |
| CN107033252A (zh) | 一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用 | |
| CN107343961A (zh) | 一种基于rgd多肽修饰的超支化聚乙烯亚胺纳米探针的制备方法 | |
| CN108904801A (zh) | 一种多功能纳米囊泡及其制备方法 | |
| Chen et al. | Bioorthogonal chemistry in metal clusters: a general strategy for the construction of multifunctional probes for bioimaging in living cells and in vivo | |
| JP2017066355A (ja) | 重合体、前記重合体を有する光音響イメージング用造影剤 | |
| JP6300460B2 (ja) | 化合物、および前記化合物を有する光音響イメージング用造影剤 | |
| CN114588277A (zh) | 装载有替莫唑胺和Pep-1的聚多巴胺纳米颗粒的构建方法 | |
| CN110568184B (zh) | 一种负载抗癌药物喜树碱的纳米药物载体的荧光免疫定量检测方法 | |
| CN105251028B (zh) | 具有fa靶向功能的基于低代树状大分子的spect/ct双模态成像造影剂的制备方法 | |
| Guo et al. | Analysis of the Interaction Mechanisms of Polysaccharide Homologs Binding with Serum Albumin Using Capillary Electrophorsis | |
| CN109908874A (zh) | 一种新型MoS2 QDs@MIPs分子印迹聚合物及制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |