JP6300460B2

JP6300460B2 - 化合物、および前記化合物を有する光音響イメージング用造影剤

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Publication number: JP6300460B2
Application number: JP2013150763A
Authority: JP
Inventors: 淳 ▲高▼橋; 健吾金崎; 文生山内; 南　昌人; 昌人南; 賢史小河; 湯浅　聡; 聡湯浅
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2013-07-19
Publication date: 2018-03-28
Anticipated expiration: 2033-07-19
Also published as: JP2014185138A

Description

本発明は、化合物、および前記化合物を有する光音響イメージング用造影剤に関する。

生体内部の情報を可視化する装置の１つとして、光音響トモグラフィー（Ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ、以下ＰＡＴと略すことがある）装置が知られている。ＰＡＴ装置を用いる測定においては、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質（光吸収体）が発する光音響信号の強度と発生時刻を測定することにより、被測定体内部の物質分布を演算した画像を得ることができる。

ここで、光吸収体としては、生体内で光を吸収して音響波を発するものであればいかなるものをも用いることができる。例えば人体内の血管や悪性腫瘍などを光吸収体とすることが可能である。その他にも、インドシアニングリーン（ＩｎｄｏｃｙａｎｉｎｅＧｒｅｅｎ、以下ＩＣＧと略すことがある）などの分子を体内に投与し、造影剤として利用することもできる。ＩＣＧは、人体に照射した際の影響が少なくかつ生体への透過性が高い近赤外波長領域の光をよく吸収することから、ＰＡＴ装置における造影剤として好適に用いることができる。なお、本明細書において、ＩＣＧとは下記の構造で示される化合物を指す。

ただし、対イオンはＮａ^＋でなくてもよく、Ｈ^＋あるいはＫ^＋など任意の対イオンをもちいることができる。

しかし、ＩＣＧは血中での半減期が数分程度と非常に短いことが知られている。

非特許文献１では、単独のＩＣＧを用いてラットの脳血管の光音響イメージングを行った例が報告されている。この報告によると、単独のＩＣＧを血中に投与してから数十分後に、光音響信号強度が血液と同じレベルにまで低下しており、投与した物質が投与後速やかに血中から消失することが示唆されている。

このように、単独のＩＣＧは血中に投与してから数十分後に血中から消失してしまうことから、投与後時間がたったときの腫瘍への集積性が低いと考えられる。

ＯｐｔｉｃｓＬｅｔｔｅｒｓ，２９（７），７３０（２００４）

そこで本発明では、投与後時間がたったときでも、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい、化合物を提供することを目的とする。

本発明に係る化合物は下記式（１）乃至（６）のいずれかで示されることを特徴とする。

上記式（１）において、Ａ^１は近赤外波長領域の光を吸収する有機色素であり、Ｌ^１は−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるか、または−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｑは１乃至５のいずれかの整数であり、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

上記式（２）において、Ａ^１は近赤外波長領域の光を吸収する有機色素であり、Ｌ^１は−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるか、または−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

上記式（３）において、Ａ^１は近赤外波長領域の光を吸収する有機色素であり、Ｌ^１は−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるか、または−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｑは１乃至５の整数であり、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

式（４）において、Ａ^１、Ａ^２はそれぞれ独立に近赤外波長領域の光を吸収する有機色素であり、Ｌ^１、Ｌ^２はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

式（５）において、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４はそれぞれ独立に近赤外波長領域の光を吸収する有機色素であり、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるか、またはそれぞれ独立に−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｎは１０以上２５００以下のいずれかの整数である。

式（６）において、Ａ^１は近赤外波長領域の光を吸収する有機色素であり、Ｌ^１は−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるか、または−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位である。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｎは１０以上２５００以下のいずれかの整数である。

別の本発明に係る化合物は、近赤外波長領域の光を吸収する有機色素と、分岐を有するポリエチレングリコールとが共有結合した化合物であって、前記分岐を有するポリエチレングリコールが、下記式（９）乃至（１４）のいずれかで表わされることを特徴とする。

上記式（９）において、Ｌ^１は−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｑは１乃至５のいずれかの整数であり、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

上記式（１０）において、Ｌ^１は−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５の整数であり、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

上記式（１１）において、Ｌ^１は−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｑは１乃至５のいずれかの整数であり、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

上記式（１２）において、Ｌ^１、Ｌ^２はそれぞれ独立に−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ独立に１乃至５の整数であり、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

上記式（１３）において、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４はそれぞれ独立に−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｎは１０以上２５００以下のいずれかの整数である。

上記式（１４）において、Ｌ^１は−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。

本発明に係る化合物によれば、分岐を有するポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ、以下ＰＥＧと略すことがある）と、ＩＣＧなどの近赤外波長領域に吸収がある有機色素とが共有結合した構造であるため、ＩＣＧを単独で生体に投与した場合に比べて、腫瘍への集積性が高く、腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい。

近赤外波長領域の光を吸収する有機色素と分岐を有するＰＥＧとが共有結合した化合物の模式図である。本発明の実施例で行われた腫瘍集積性および血液中の存在量の評価実験で得られた結果を示すグラフである。

本発明の実施形態に係る化合物について説明する。本実施形態に係る化合物は、分岐を有するＰＥＧ１０２と、近赤外波長領域の光を吸収する有機色素１０１（以下、近赤外有機色素と略すことがある）とが、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれかであるか、または−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位１０３に共有結合していることを特徴とする。

ここで、ＩＣＧなどの近赤外有機色素は、血中に投与した場合、血中のタンパク質と吸着した上で体外へと排出されやすい。また、近赤外有機色素は血中の水分子と反応して分解してしまう可能性がある。その結果、単独の近赤外有機色素を生体の血中に投与しても、血中滞留性が低く、腫瘍への集積性が低いため、腫瘍から発せられる光音響信号強度は小さい。

一方、本実施形態に係る化合物は、近赤外有機色素が分岐を有するＰＥＧと共有結合しているため、ＰＥＧが、近赤外有機色素への血中のタンパク質の吸着を抑制する。そのため、本実施形態に係る化合物を生体の血中に投与しても、体外へと排出されにくい性質（ステルス効果）が得られる。このステルス効果により本発明の化合物は高い血中滞留性、腫瘍集積性を獲得する。さらに近赤外有機色素とＰＥＧが共有結合していることで、血中の水分子が近赤外有機色素に接近しにくく、近赤外有機色素は分解しにくい。

さらに、本実施形態に係る分岐を有するＰＥＧは、分子内に少なくとも１つの分岐鎖構造を有する複数のＰＥＧユニットから構成されていることを特徴とする（以下、分岐鎖ＰＥＧと呼ぶことがある）。分岐鎖ＰＥＧの一本鎖ＰＥＧに対する特徴として次のようなことが挙げられる。分岐鎖ＰＥＧは一本鎖ＰＥＧに比べてＰＥＧの分子量当たりの粘性が低いため拡散しやすい。そのために血中滞留性および組織浸透性が一本鎖ＰＥＧに比べて向上することが期待される。また、粘性が低いために調製時のハンドリングが容易となることが期待される。さらに、分岐鎖ＰＥＧにおいては、分岐点にＰＥＧユニットが結合している分子構造であるため、ＰＥＧ分子量当たりの分子運動が一本鎖ＰＥＧに比べて制限される結果、相対的に分子の占有体積が小さくなることで組織浸透性が向上することが期待される。また、分岐を有するＰＥＧでは近赤外有機色素などの光音響発生源の結合点を複数持たせる分子を選択することで、一本鎖ＰＥＧに比べて化合物あたりの光音響信号を高めることもできる。このような理由から本実施形態に係る化合物は腫瘍から発せられる光音響信号強度が大きい。

本実施形態に係る化合物において、分岐鎖ＰＥＧと、少なくとも１つの近赤外有機色素とが式（１）乃至（６）におけるＬ^１乃至Ｌ^４のいずれかと共有結合していればよく、分岐鎖ＰＥＧに対して複数の近赤外有機色素とが結合していてもよい。また、本実施形態に係る化合物が、分岐鎖ＰＥＧと複数の近赤外有機色素を有する場合、少なくとも１つの近赤外有機色素が、分岐鎖ＰＥＧと共有結合していればよく、それ以外の近赤外有機色素は非共有結合であってもよい。同様に、近赤外有機色素と複数の、分岐鎖ＰＥＧを有する場合、少なくとも１つの、分岐鎖ＰＥＧが近赤外有機色素と共有結合していればよく、それ以外の、分岐鎖ＰＥＧは非共有結合であってもよい。また、Ｌ^１乃至Ｌ^４はそれぞれ独立に−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−のいずれか１つ以上を含むリンカー部位であってもよい。ここでリンカー部位とは、分岐鎖ＰＥＧと、近赤外有機色素とを結合させる機能を有する部位である。例えば、１，６−ＢｉｓｍａｌｅｉｍｉｄｏｈｅｘａｎｅやＳｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｔｒａｎｓ−４−（Ｎ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌｍｅｔｈｙｌ）−Ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅなどの２官能性の化合物が挙げられる。別の例では、カルボニル基、アミド基、エステル基、ピペラジル基などを含んでなるアルキル基を挙げることができる。更に別の例では任意の鎖長のポリペプチドを使用することもでき、該ポリペプチドが後述の捕捉分子であってもよい。ポリペプチドは、鎖中のカルボニル基、アミノ基、チオール基のいずれかを使用して共有結合を形成することができる。例えば、Ｎ−ＰＥＧマレイミド基とチオール基は中性条件下、室温においてマレイミド−チオール結合を形成することができる。

また、本実施形態おける化合物は標的部位に特異的に結合する捕捉分子を有していてもよい。

本実施形態に係る化合物は具体的には下記式（１）乃至（６）のいずれかで示されることを特徴とする化合物である。

上記式（１）乃至（６）において、Ａ^１、Ａ^２、Ａ^３、Ａ^４はそれぞれ独立に下記式（７）または式（８）のいずれかで表わされることが好ましい。

上記式（７）および式（８）の＊は、前記式（１）乃至（６）のＬ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｌ^４のいずれかに結合する。

なお、本明細書において、＊は構造式中の

と同義である。

上記式（７）および式（８）において、Ｚは水素原子、スルホン酸基、またはＺに結合したインドール環と共にベンズ［ｅ］インドール環、ベンズ［ｆ］インドール環、またはベンズ［ｇ］インドール環からなる環状芳香族環を形成し、さらに該環状芳香族環の水素原子は炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、スルホン酸基で置換されていてもよい。

上記式（７）および式（８）において、Ｒ^３は、炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ_２）_ｂ−ＳＯ_３ ⁻（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）のいずれかである。Ｒ^３がアルキル基である場合、ハロゲンイオン、または有機酸イオンが対イオンとして含まれていても良い。

Ｒ^４、Ｒ^５はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１乃至１０のアルキル基、炭素数１乃至１０のアルコキシ基、−（ＣＨ_２）_ｂ−ＳＯ_３ ⁻（ｂは１乃至１０のいずれかの整数）、−（ＣＨ_２）_ｂ−ＳＯ_３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。

上記式（７）および式（８）において、ａは１乃至１０のいずれかの整数であり、ｓは２または３である。

上記式（８）において、Ｒ^６は炭素数１乃至１０のアルキル基、−（ＣＨ_２）_ｂ−ＳＯ_３ ⁻（ｂは１乃至１０の整数）、−（ＣＨ_２）_ｂ−ＳＯ_３Ｘ（ｂは１乃至１０のいずれかの整数であり、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである）のいずれかである。

本実施形態において、式（７）におけるａは２乃至６のいずれかの整数であることが好ましく、式（７）のＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５におけるｂは２乃至６のいずれかの整数であることが好ましい。

本実施形態において、式（８）におけるａは２乃至６のいずれかの整数であることが好ましく、式（８）のＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５におけるｂは２乃至６のいずれかの整数であることが好ましい。

上記のａおよびｂが、６以下である場合、疎水性が高くならないため、生体中において非特異吸着しにくい。

本実施形態において、上記式（７）が下記式（２１）乃至（２６）のいずれかで表わされることが好ましい。

（２１）

（２２）

式（２２）において、Ｙ⁻は塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン等のハロゲンイオン、または酢酸イオン、酒石酸イオン、コハク酸イオン等の有機酸イオンのいずれかである。

（２３）

（２４）

（２５）

（２６）

上記式（２３）乃至（２６）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。

本実施形態において、上記式（８）が、下記式（２７）または（２８）のいずれかで表されることが好ましい。

（２７）

（２８）

上記式（２７）または（２８）において、Ｘはナトリウム、カリウム、アンモニウム、トリエチルアンモニウム、リジン、アルギニンのいずれかである。

上記式（１）乃至（６）においてＬ^１乃至Ｌ^４のうち１つ以上のリンカー部分がポリペプチド、または一本鎖抗体であってもよい。

また、上記式（１）乃至（６）においてＬ^１乃至Ｌ^４のうち１つ以上が下記式（４６）で表わされてもよい。

ここで、Ｌ^５はポリペプチド、または一本鎖抗体であり、―ＮＨ―はポリペプチドまたは一本鎖抗体中のアミノ酸のアミノ基を介した結合を、−Ｓ−はポリペプチドまたは一本鎖抗体中のアミノ酸のチオール基を介した結合を表わす。Ｌ^６はカルボニル基、アミド基、エステル基、ピペラジル基などを含む炭素数１乃至１０のアルキル鎖である。＊＊はＡ^１乃至Ａ^４のうち１つ以上へ結合し、＊＊＊は式（１）乃至（６）のアルキル鎖側またはエチレングリコール鎖側に結合する。

上記式（４６）において、Ｌ^６が−（ＣＨ_２）_２−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−であってもよい。ここで、エチレン基側がマレイミド基の窒素原子へ結合し、アミド基側が＊＊＊へ結合する。

（分岐を有するＰＥＧ）
本実施形態に係る分岐を有するＰＥＧは、水溶性の高分子であり、タンパク質の血清半減期の増加や免疫原性の低下などの効果を奏する。ＰＥＧの分子量は、４００以上１０００００以下の範囲であることが好ましく、２００００以上であることがさらに好ましい。分子量が２００００以上であれば、ＥＰＲ（ＥｎｈａｎｃｅｄＰｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙａｎｄＲｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果により、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多くのＰＥＧを集積させることができると考えられる。また、分子量が２００００以上において腎臓からの排泄が抑制されるため、低分子量のＰＥＧに比較して、血中滞留性が長くなることが期待できる。また、ＰＥＧの分子量増大に伴い、溶液粘性が増大するため、ＰＥＧの分子量は１０００００以下であることが好ましい。

また、本実施形態において、近赤外有機色素と共有結合できる反応性の官能基がＰＥＧ１分子に少なくとも１つ以上有するＰＥＧを用いることが好ましい。ここで反応性の官能基とは、結合させる色素の有する官能基によって適宜選択することができる。反応性官能基とは例えば、アミノ基、水酸基、チオール基、カルボニル基、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基等であることが好ましい。

近赤外有機色素と反応する、分岐を有するＰＥＧは、下記式（９）乃至（１４）のいずれかで表わされることが好ましい。

上記式（１０）において、Ｌ^１は−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｌ、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

上記式（１２）において、Ｌ^１、Ｌ^２はそれぞれ独立に−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｐ、ｑ、ｒはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｍ、ｎはそれぞれ独立に１０以上２５００以下のいずれかの整数である。Ｒ^１、Ｒ^２はそれぞれ独立に炭素数１乃至５のアルキル基である。

上記式（１４）において、Ｌ^１は−ＮＨ_２、−ＣＯＯＨ、−ＯＨ、−ＳＨ、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、およびＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を含む。ｐ、ｑはそれぞれ独立に１乃至５のいずれかの整数であり、ｎは１０以上２５００以下のいずれかの整数である。

本実施形態に係る近赤外有機色素と反応する分岐を有するＰＥＧの例として、下記式（１５）乃至下記式（２０）および式（４０）のいずれかで示される各化合物が挙げられる。

（１５）

（１６）

（１７）

（１８）

（１９）

（２０）

（４０）

上記式（１５）で示される化合物のうち、分子量が２００００、４００００、６００００のものとして、それぞれＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ２−２００ＰＡ（日油製）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ２−４００ＰＡ（日油製）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ２−６００ＰＡ（日油製）が挙げられる。

上記式（１６）で示される化合物のうち、分子量が５００００のものとして、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ３−４００ＰＡ１００Ｕ（日油製）が挙げられる。

上記式（１７）で示される化合物のうち、分子量が６００００、８００００のものとして、それぞれＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ４−６００ＰＡ（日油製）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ４−８００ＰＡ（日油製）が挙げられる。

上記式（１８）で示される化合物のうち、分子量が４００００のものとして、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＰＴＥ−４００ＥＡ（日油製）が挙げられる。

上記式（１９）で示される化合物のうち、分子量が４００００のものとして、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＰＴＥ−４００ＰＡ（日油製）が挙げられる。

上記式（２０）で示される化合物のうち、分子量が１５０００、４００００のものとして、それぞれＳＵＮＢＲＩＧＨＴＨＧＥＯ−１５０ＰＡ（日油製）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＨＧＥＯ−４００ＰＡ（日油製）が挙げられる。

上記式（４０）で示される化合物のうち、分子量が２００００、４００００のものとして、それぞれＳＵＮＢＲＩＧＨＴＰＴＥ２−２００ＭＡ２（日油製）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＰＴＥ−４００ＭＡ２（日油製）が挙げられる。

（近赤外有機色素）
本実施形態において近赤外有機色素としては、近赤外波長領域の光を吸収して音響波を発するものであれば特に限定されない。ここで、近赤外波長領域とは、６００ｎｍ以上１３００ｎｍ以下の範囲である。

本実施形態における近赤外有機色素としては、例えば、アジン系色素、アクリジン系色素、トリフェニルメタン系色素、キサンテン系色素、ポルフィリン系色素、シアニン系色素、フタロシアニン系色素、スチリル系色素、ピリリウム系色素、アゾ系色素、キノン系色素、テトラサイクリン系色素、フラボン系色素、ポリエン系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）系色素、インジゴイド系色素を挙げることが出来る。

上記シアニン系色素としては、例えば、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ａｌｅｘａ７５０などのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）系色素（インビトロジェン社製）、Ｃｙ（登録商標）系色素（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）、ＩＲ−７８３、ＩＲ−８０６、ＩＲ−８２０（シグマアルドリッチジャパン株式会社製）、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ８００ＲＳ（登録商標）（ＬＩ−ＣＯＲ社製）、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ７９５ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、ＡＤＳ８３２ＷＳ（ＡｍｅｒｉｃａｎＤｙｅＳｏｕｒｃｅ社製）を挙げることが出来る。

本実施形態において、分岐を有するＰＥＧと反応する近赤外有機色素の構造は、下記式（２９）で表される。
Ｂ−Ｂ’ （２９）

式（２９）において、Ｂは上記式（７）または式（８）で表される。

また、式（２９）において、Ｂ’は下記式（３０）乃至（３３）のいずれかで表される。

上記式（２９）の例として、下記式（３４）で示される化合物（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（ＤｏｊｉｎｄｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、登録商標））、下記式（３５）で示される化合物、下記式（３６）示される化合物、下記式（３７）で示される化合物、下記式（３８）で示される化合物、下記式（３９）で示される化合物のいずれかであることが好ましい。

（３４）

（３５）

（３６）

（３７）

（３８）

（３９）

（化合物の調製方法）
本実施形態において、化合物は分岐を有するＰＥＧと近赤外有機色素を、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、またはＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上を介して公知のカップリング反応によって結合することによって調製する。特に、アミノ基を介して結合させることが好ましい。分岐を有するＰＥＧの末端などにアミノ基が存在するようにしておき、弱アルカリ性のｐＨ領域において効率的かつ選択的に反応する。前記反応により分岐を有するＰＥＧと結合した近赤外有機色素は、限外濾過法、サイズ排除カラムクロマトグラフィー法等の公知のタンパク質精製法により洗浄、精製することができる。

分岐を有するＰＥＧと近赤外有機色素の結合はＰＥＧに存在する前記アミノ基、チオール基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル基、エポキシ基、グリシジル基、Ｎ−サクシイミジルオキシ基、Ｎ−スルホサクシイミジルオキシ基、またはＮ−マレイミドアルキル基のいずれか１つ以上と近赤外有機色素の誘導体とで直接結合されていても良いし、種々の架橋材（クロスリンカー）を介してＰＥＧと近赤外有機色素が結合されていても良い。

（添加剤）
本実施形態に係る光音響イメージング用造影剤は、凍結乾燥時に使用する添加剤を含んでいてもよい。添加剤の一例としてグルコース、ラクトース、マンニトール、ポリエチレングリコール、グリシン、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウムが挙げられる。添加剤は１種類のみを用いても、複数種類を併用してもよい。

（光音響イメージング用造影剤）
本実施形態に係る光音響イメージング（ＰｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃＩｍａｇｉｎｇ、以下ＰＡＩと略すことがある）用造影剤は、上記化合物と分散媒とを有する。なお、ＰＡＩは、光音響トモグラフィー（断層撮影法）を含む概念である。分散媒として例えば、生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖水溶液が挙げられる。また本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、必要に応じて薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤などを有していても良い。

本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、上記の分散媒に予め分散させておいてもよいし、キットにしておき、生体内に投与する前に分散媒に分散させて使用してもよい。

本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は、ＥＰＲ効果を利用することで、生体内に投与したときに、生体内の正常部位に比べて腫瘍部位により多く集積させることができる。その結果、粒子を生体内に投与した後、生体に光を照射して、生体からの音響波を検出するときに、腫瘍部位から発せられる音響波を正常部位から発せられる音響波よりも大きくすることができる。したがって、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤は腫瘍の造影に用いられることが好ましい。

また、本実施形態に係るＰＡＩ用造影剤はリンパ節の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節（ＳｅｎｔｉｎｅｌＬｙｍｐｈＮｏｄｅ、以下ＳＬＮと略すことがある）の造影剤に用いることが特に好ましい。これは色素単独と比べてもサイズが大きいためにセンチネルリンパ節により留まりやすく集積性が向上することが期待されるためである。

（捕捉分子）
本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された化合物を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。

（光音響イメージング方法）
生体内に投与された本実施形態に係る化合物を、光音響イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る化合物を検出する方法は以下の（ａ）、（ｂ）の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。
（ａ）本実施形態に係る化合物が投与された検体に６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの波長領域の光を照射する工程
（ｂ）前記検体内に存在する前記化合物から発生する音響波を検出する工程

また、本実施形態に係る化合物は、前記（ｂ）で得られた音響波の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記（ｂ）の工程で得られた光音響信号の波長、位相および時間情報を基に３次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば３次元空間上に光音響信号強度が表現されるようなもの構わないし、２次元平面上に光音響信号強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。

上記（ａ）の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係る化合物を投与された検体を用いることができる。

また、上記（ｂ）の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る化合物から発せられる光音響信号を検出する装置は特に限定されない。

上記（ｂ）の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し６００ｎｍ乃至１３００ｎｍの範囲から選択される少なくとも１つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー（ＬＴ−２２１１−ＰＣ、Ｌｏｔｉｓ社製））、ＯＰＯレーザー（ＬＴ−２２１４ＯＰＯ、Ｌｏｔｉｓ社製）、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。

音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，ＥｎｄｒａＩｎｃ．製）を用いて行うことができる。

本実施形態に係る化合物を用いたイメージング方法は、上記（ａ）、（ｂ）の工程を経ることで腫瘍、リンパ節あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。

以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。なお以下でＭｗは分子量を表す。

（光音響信号強度の計測方法）
本発明の実施例において光音響信号強度は以下のように計測した。

市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ．Ｉｎｃ．製）を用いて行い、調製した化合物を投与する前、投与後の任意のタイミングにおいて光音響信号を測定し、それぞれの３次元再構成データを得た。得られた３次元再構成データから関心領域（ＲＯＩ：ＲｅｇｉｏｎｏｆＩｎｔｅｒｅｓｔ）中の光音響強度を計測した。

（腫瘍塊への移行量評価例）
本発明の実施例において腫瘍塊への化合物の移行量の評価は腫瘍移植モデルマウスを用いて行った。腫瘍移植マウスは、マウス大腸がん細胞株（Ｃｏｌｏｎ２６）をヌードマウス皮下に移植し作製した。腫瘍移植マウスへ造影剤を投与し、光音響イメージングを行った。さらに、比較例として投与１日後における腫瘍移植マウスの蛍光イメージングも実施した。蛍光イメージングはＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍを用いて行い、腫瘍部分の関心領域（ＲＯＩ：ＲｅｇｉｏｎｏｆＩｎｔｅｒｅｓｔ）の蛍光強度を計測した。

（造影剤の腫瘍集積性評価）
ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウスに各種細胞を皮下に移植した腫瘍マウスモデルに対して各種ＩＣＧ−ＰＥＧ水溶液を、１００μＬ（ＩＣＧとして１３ｎｍｏｌ）静脈注射することにより腫瘍への集積性を評価した。投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、癌組織をそれぞれ摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートした。次いで、癌組織重量の２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて、腫瘍組織中の色素抽出液を調製した。次いで、既知濃度のＩＣＧ−ＰＥＧ溶液を前記癌組織のＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液で種々の濃度へ希釈し、この希釈溶液に対し、２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて検量用標準液を調製した。ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ２００Ｓｅｒｉｅｓ（Ｃａｌｉｐｅｒ社製）を用いて、プラスチックチューブの状態で、腫瘍組織中の色素抽出液および検量用標準液の蛍光強度を測定することで癌組織中の色素量（％ＩＤ／ｇ）を定量した。

（実施例１）
（近赤外有機色素と分岐を有するＰＥＧとが共有結合した化合物の調製）
近赤外有機色素はＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ（ＤｏｊｉｎｄｏＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ｃｏｄｅ：Ｉ２５４、上記式（３４）で示される化合物）を用いた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ１ｍｇ（１．２５μｍｏｌ）をＤＭＳＯ１００μＬで溶解させた。一方で、１．５ｍＬプラスチックチューブに各種のＰＥＧを秤量した。５０ｍＭカーボネートバッファー（ｐＨ９．０）でＰＥＧを溶解させ、ＮＨ_２濃度を０．６２５ｍＭとした（表１）。

本実施例で用いた分岐鎖ＰＥＧは、モノアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ２−２００ＰＡ（日油製，Ｍｗ２００００）、モノアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ２−４００ＰＡ（日油製，Ｍｗ４００００）、モノアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ２−６００ＰＡ（日油製，Ｍｗ６００００）、モノアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ３−４００ＰＡ１００Ｕ（日油製，Ｍｗ５００００）、モノアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ４−６００ＰＡ（日油製，Ｍｗ６００００）、モノアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＧＬ４−８００ＰＡ（日油製，Ｍｗ８００００）、ジアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＰＴＥ２−４００ＥＡ（日油製，Ｍｗ４００００）、テトラアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＰＴＥ−４００ＰＡ（日油製，Ｍｗ４００００）、オクタアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＨＧＥＯ−１５０ＰＡ（日油製，Ｍｗ１５０００）、オクタアミン分岐鎖状ＳＵＮＢＲＩＧＨＴＨＧＥＯ−４００ＰＡ（日油製，Ｍｗ４００００）である。

ＰＥＧのカーボネートバッファー溶液（４００μＬ）に、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液２０μＬ（［ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ］＝０．２５μｍｏｌ）を加えた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕはＮＨ_２残基の２倍のモル数で反応させた。ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕの反応時の濃度は０．６ｍＭとした。遮光下、室温で２４時間回転かくはんした後、０．２２μｍシリンジフィルターで反応溶液をろ過し近赤外有機色素とＰＥＧが結合した化合物を得た。モノアミン分岐鎖状ＰＥＧ、ジアミン分岐鎖状ＰＥＧ、テトラアミン分岐鎖状ＰＥＧ、オクタアミン分岐鎖状ＰＥＧとＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕの結合体を、表２に示す。トリカルボシアニン色素とＰＥＧの結合体のことを本明細書中では造影剤ということがある。また、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕをグリシンとモル比１０で反応させたＩＣＧ−Ｇｌｙも合成し、対照サンプルとした（表２）。本実施例において調製した各サンプル、ＭＢ２＿２０ｋ−ＩＣＧ、ＭＢ２＿４０ｋ−ＩＣＧ、ＭＢ２＿６０ｋ−ＩＣＧの代表的な構造は式４０で表され、分子量がそれぞれ２０ｋ、４０ｋ、６０ｋである。ＭＢ３＿３０ｋ−ＩＣＧの構造は式４１で表され、分子量が５０ｋである。ＭＢ４＿６０ｋ−ＩＣＧ、ＭＢ４＿８０ｋ−ＩＣＧの構造は式４２で表され、分子量がそれぞれ６０ｋ、８０ｋである。ＤＢ＿４０ｋ−ＩＣＧ２の構造は式４３（式中ｑ＝３）で表され、分子量が４０ｋである。ＴＢ＿４０ｋ−ＩＣＧ４の構造は式４４（式中ｑ＝３）で表され、分子量が４０ｋである。ＯＢ＿１５ｋ−ＩＣＧ８、ＯＢ＿４０ｋ−ＩＣＧ８の構造は式４５（式中ｑ＝３）で表され、分子量がそれぞれ１５ｋ、４０ｋである。

（実施例２）
（化合物の吸収測定）
ＭＢ２＿４０ｋ−ＩＣＧ、ＭＢ３＿５０ｋ−ＩＣＧ、ＭＢ４＿８０ｋ−ＩＣＧ、ＴＢ＿４０ｋ−ＩＣＧ４、ＯＢ＿１５ｋ−ＩＣＧ８、ＯＢ＿４０ｋ−ＩＣＧ８ならびにＩＣＧ−Ｇｌｙの溶液中での吸光スペクトル測定を行った。５０ｍＭの４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ（ＨＥＰＥＳ）溶液で希釈し、吸収スペクトルから極大波長（λｍａｘ）を測定した。表３にそれぞれの吸収極大波長の結果を示す。

７００ｎｍ付近の吸収は、会合状態にある色素の吸収であり、一方、７８５ｎｍ付近の吸収は単量体として存在する近赤外有機色素による吸収である。表３の結果から分岐鎖ＰＥＧと近赤外有機色素とが結合した化合物（は、水中で良好な分散性を示すことが明らかとなった。一方で、ＩＣＧ−Ｇｌｙは水中で凝集体が観察されたことから、水中では不安定であることが示唆された。以上のことから、ＰＥＧとの共有結合体とすることで近赤外有機色素の安定性が向上することが示唆された。

（実施例３）
（化合物の血中滞留性の評価）
化合物の血中滞留性を確認するために、各種化合物をヌードマウス尾静脈に投与し化合物の血中残存量を評価した。本実施例で用いた化合物の一覧を表４に示す。化合物の作製方法は実施例１に示した通りである。表４においてｋは１０００を表す。例えば、５ｋは５０００を表す。

化合物の血中滞留性評価は以下ように行った。投与１時間後、３時間後、１日後、２日後および、１週間後にマウスから採血し、ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ２００Ｓｅｒｉｅｓ（ＣＡＬＩＰＥＲ社製）を用いて、血液の蛍光強度を測定した。投与量は色素量として０．５ｍｇ／ｋｇをマウスに投与した。表５には投与１日後のＩＣＧの血中濃度を１とした場合の相対血中濃度を示す。さらに投与１日後のＩＣＧの血中濃度を１とした場合の相対血中濃度の経時変化を表６に示す。表５、６より、対照であるＩＣＧ、ＩＣＧ−Ｇｌｙに比べて、ＰＥＧはその分子量が増大するとともに血中滞留性が向上する傾向を示した。一方で、ＩＣＧやＩＣＧ−Ｇｌｙなどの対照サンプルは血中から速やかに消失した。これは血清タンパク質との相互作用により速やかに肝臓に集積される一方で、近赤外有機色素に分岐鎖ＰＥＧを結合させることで肝臓集積が低下した結果、血中滞留性を獲得したことが考えられる。

（実施例４）
（化合物の腫瘍集積性）
化合物の腫瘍集積性を評価するために、Ｃｏｌｏｎ２６細胞株を移植した腫瘍移植マウスに対して、造影剤を尾静脈に投与した。投与量は色素量として３２ｎｍｏｌとした。そして、腫瘍移植マウスへ造影剤を投与１日後における腫瘍集積性を光音響イメージングと蛍光により評価した。マウスの光音響イメージングは市販の光音響イメージング装置（Ｎｅｘｕｓ１２８，Ｅｎｄｒａ．Ｉｎｃ．製）を造影剤の投与前と投与１日後に実施した。測定波長は７９７ｎｍとした。そして、投与前に対する投与１日後の相対光音響信号強度を算出した。マウスの腫瘍集積量評価は蛍光を用いて次のように行った。投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、腫瘍組織を摘出した。腫瘍組織をプラスチックチューブに移し、腫瘍組織の重量に対し１．２５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートした。次いで、腫瘍組織重量の２０．２５倍量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えた。ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ２００Ｓｅｒｉｅｓ（ＣＡＬＩＰＥＲ社製）を用いて、プラスチックチューブの状態で、ホモジネート溶液の蛍光強度を測定することで腫瘍組織中の色素量を定量した。腫瘍組織の単位重量あたりの、投与量に対する腫瘍組織への色素移行量の割合（％ｉｎｊｅｃｔｅｄｄｏｓｅ：％ＩＤと略す）を、化合物の腫瘍集積量（％ＩＤ／ｇ）として算出した。表７にその結果を示した。

対照であるＩＣＧやＩＣＧ−Ｇｌｙの腫瘍集積性に比べて、分岐鎖ＰＥＧ結合ＩＣＧでは、分子量増大とともに腫瘍集積量が増加し、腫瘍集積性に対するＰＥＧ分子量と形態は重要なパラメータであることが示された。

（実施例５）
（ＰＥＧへの捕捉分子（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））の修飾）
本実施例で用いた分岐ＰＥＧは、ジマレイミド分岐状ＰＴＥ２−２００ＭＡ２（日油社製、ＭＷ２００００）、ジマレイミド分岐状ＰＴＥ２−４００ＭＡ２（日油社製、ＭＷ４００００）である。

ＨＥＲ２へ結合するＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）溶液（Ａｆｆｉｂｏｄｙ社製）へ、終濃度２０ｍＭとなるようジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶液を添加し、遮光下で２５度で２時間、還元処理した。次いで、ＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて、反応溶液からＤＴＴを除去した。次いで、１．５ｍＬプラスチックチューブに、ジマレイミド分岐状ＰＴＥ２−２００ＭＡ２（日油社製、ＭＷ２００００）または、ジマレイミド分岐状ＰＴＥ２−４００ＭＡ２（日油社製、ＭＷ４００００）を秤量した。秤量したＰＥＧを、ＥＤＴＡを含まないリン酸バッファーで各１４３μＭとなるよう希釈し、前記還元処理したＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）と混合し、２５度で１５時間以上反応させた。仕込みの反応モル比（Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）／ＰＥＧ）は、２でおこなった。次いで、ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕのＤＭＳＯ溶液（１２．５ｍＭ）と、前記Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）とＰＥＧの混合溶液とを混合し、２５度で２時間反応させた。仕込みの反応モル比（ＩＣＧ−Ｓｕｌｆｏ−ＯＳｕ／Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標））は、１でおこなった。この溶液をフィルターろ過（ポアサイズ１．２μｍ）した後、１０ｋＤａのポアサイズのアミコンウルトラ−４（日本ミリポア社）を用いた限外ろ過によりＰＥＧへ結合しなかったＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）を除去して、ＩＣＧおよびＡｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）が修飾されたＰＥＧを得た。得られたこの化合物のうち、ＰＴＥ２−２００ＭＡ２を使用したものをＡｆ−ＰＴＥＰＥＧ２０、ＰＴＥ２−４００ＭＡ２を使用したものをＡｆ− ＰＴＥＰＥＧ４０と略す。

（捕捉分子を有するＰＥＧのＨＥＲ２結合性評価）
捕捉分子を有するＰＥＧについて表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）によって、標的分子であるＨＥＲ２に対する結合性を評価した。ＳＰＲはＰｒｏｔｅｏｎ（登録商標）ＸＰＲ３６（バイオラッドラボラトリーズ社製）を用いて測定した。ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＨｕｍａｎＥｒｂＢ２／ＦｃＣｈｉｍｅｒａ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ社製）を酢酸バッファー（ｐＨ５．０）に溶解させ、ＧＬＭセンサーチップ表面のカルボキシル基へのアミンカップリングにより固定化した。固定化量は、約３０００ＲＵ（ＲｅｓｏｎａｎｃｅＵｎｉｔ）であった。次に、捕捉分子を有するＰＥＧを０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸バッファー（ｐＨ７．４）で種々の濃度へ希釈した後、流速５０μＬ／分でフローセルへ注入した。測定時間は、注入時間（結合）１２０秒、注入停止後経過時間（解離）１２０秒であった。結合速度論解析実験においては、１：１ラングミュアフィッティングモデルを用いてセンサーグラムを分析した。算出された結合解離定数（Ｋ_Ｄ）を表８にまとめた。いずれのサンプルでもＨＥＲ２に対する結合性が確認された。

（捕捉分子を有するＰＥＧの腫瘍集積性評価）
腫瘍集積性の評価においては、雌の非近交系ＢＡＬＢ／ｃＳｌｃ−ｎｕ／ｎｕマウス（購入時６週齢）（日本エスエルシー株式会社）を用いた。マウスに担癌させる前の１週間、標準的な食餌、寝床を用い、自由に食餌および飲料水を摂取できる環境下でマウスを順応させた。イメージング実験の約１週間前に１ｘ１０^６個のＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞（理化学研究所）を、マウスの右肩および右腿に、１ｘ１０^６個のＨＥＲ２遺伝子を人工的に導入したＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞をマウスの左肩および左腿にそれぞれ皮下注射した。実験時までに、腫瘍は全て定着しており、マウスの体重は１７〜２２ｇであった。担癌させたマウスに捕捉分子を有するＰＥＧまたは、ＭＢ３＿５０ｋ−ＩＣＧを、２００μＬ（ＩＣＧとして１３ｎｍｏｌ）を静脈注射した。投与２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させた後、癌組織をそれぞれ摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートした。次いで、癌組織重量の２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて、腫瘍組織中の色素抽出液を調製した。一方で、捕捉分子を有するＰＥＧを投与していない担癌させたマウスから癌組織を摘出した。癌組織をプラスチックチューブに移し、癌組織の重量に対し１．２５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液を添加し、プラスチックペッスルを用いてホモジネートすることで、癌組織のＴｒｉｔｏｎＸ―１００溶液を調製した。次いで、既知濃度の捕捉分子を有するＰＥＧ溶液を、前記癌組織のＴｒｉｔｏｎＸ―１００溶液で種々の濃度へ希釈し、この希釈溶液に対し、２０．２５倍量のＤＭＳＯを加えて検量用標準液を調製した。ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ２００Ｓｅｒｉｅｓ（ＣＡＬＩＰＥＲ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、腫瘍組織中の色素抽出液および検量用標準液の蛍光強度を測定することで癌組織中の色素量を定量した。

前記腫瘍集積性評価において、２４時間後にマウスを炭酸ガスで安楽死させる直前に、尾静脈から血液を採取した。採取した血液をプラスチックチューブに移し、血液の体積に対し４．５倍量の１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液を添加した。次いで、血液の体積の４．５倍量のＤＭＳＯを加えて、血液溶解液を作製した。ＩＶＩＳ（登録商標）ＩｍａｇｉｎｇＳｙｓｔｅｍ２００Ｓｅｒｉｅｓ（ＣＡＬＩＰＥＲ）を用いて、プラスチックチューブの状態で、血液溶解液の蛍光強度を測定した。一方で、既知の濃度の粒子溶液を、１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液で種々の濃度に希釈し、希釈した粒子溶液と、同量の未投与マウスから採取した血液とを混合した。次いで、血液の体積に対し、前述の希釈した粒子溶液と合わせて４．５倍量となるよう１％ＴｒｉｔｏｎＸ―１００水溶液を添加した。次いで、血液の体積の４．５倍量のＤＭＳＯを添加して検量線用血液粒子溶液を作製した。採取した血液サンプルと同様に、蛍光強度を測定し検量線を作成した。次に、血液溶解液の蛍光強度、作成した検量線を用いて、血中濃度を算出した。算出されたそれぞれの血中濃度を全投与量で除することで、投与量あたりの血液中の存在量の割合（％ＩＤ）を算出した。

腫瘍集積性の結果および血液中の存在量の結果を図２にまとめた。捕捉分子を有するＰＥＧはいずれもＭＢ３＿５０ｋ−ＩＣＧに比較して血液中の存在量が低下し、それに伴い腫瘍集積量が低下する傾向がみられた。更にＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞へ集積した量に対するＨＥＲ２遺伝子を人工的に導入したＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞へ集積した量を算出し、表９にまとめた。捕捉分子を有するＰＥＧはいずれもＭＢ３＿５０ｋ−ＩＣＧに比較して、ＨＥＲ２遺伝子を人工的に導入したＣｏｌｏｎ２６マウス大腸癌細胞へ多く集積しており、捕捉分子によるＨＥＲ２結合性の効果を確認した。

Claims

下記式（４０）乃至（４５）のいずれかで示される化合物。

上記式（４０）において、ｎは１０以上２５００以下の整数であり、
上記式（４１）において、ｎ、ｍはそれぞれ独立に１０以上２５００以下の整数であり、
上記式（４２）において、ｍ、ｌはそれぞれ独立に１０以上２５００以下の整数であり、
上記式（４３）において、ｎは１０以上２５００以下の整数であり、ｑは１乃至５の整数であり、
上記式（４４）において、ｎは１０以上２５００以下の整数であり、ｑは１乃至５の整数であり、
上記式（４５）において、ｎは１０以上２５００以下の整数であり、ｑは１乃至５の整数である。
腫瘍の造影に用いられることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
リンパ節の造影に用いられることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
請求項１乃至３のいずれか一項に記載の化合物と分散媒とを有する光音響イメージング用造影剤。
添加剤をさらに有することを特徴とする請求項４に記載の光音響イメージング用造影剤。