JP2017128532A - 光学イメージング用造影剤の製造方法、及び光学イメージング用造影剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】 本発明では、アルブミンに結合していない単独の有機色素の残存量が少ない、逆に言えば、アルブミンと有機色素の結合体の割合が多い光学イメージング用造影剤の製造方法を提供することを目的とする。【解決手段】 本実施形態に係る光学イメージング用造影剤の製造方法は少なくとも以下の工程を有する。(a)反応工程:水溶液中で、アルブミンと、特定の有機色素又はその塩とを反応させて、この特定の有機色素とアルブミンとの結合体を含む水溶液を得る。(b)pH調整工程:(a)で得た結合体を含む水溶液のpHを7.2以下にする。(c)分離工程:(b)で得たpHが7.2以下の水溶液に、エステル溶剤を添加して撹拌することで、エステル溶剤を含む有機溶媒の層と、水溶液の層とに分離させる。(d)抽出工程:(c)で得た、有機溶媒の層と水溶液の層(水層と言うこともできる)とに分離した溶液から、結合体を含む水溶液を抽出する。【選択図】 なし
Description
本発明は、光学イメージング用造影剤の製造方法及び光学イメージング用造影剤に関する。
非侵襲的に生体内部の情報を可視化する方法として、光学イメージング法が知られている。光学イメージング法では、被測定体に光を照射したときに被測定体内部で光を吸収した物質(光吸収体)が発する音響波や蛍光などの信号を測定して画像化する。また、Indocyanine green(以下ICGと略すことがある)などの近赤外波長領域の光を吸収する色素を生体に投与することで、生体内でその色素が発する蛍光または音響波を測定することも可能である。したがって、ICGのような有機色素は、光学イメージング用造影剤として利用できる。
ここで、有機色素を腫瘍の造影剤として、色素にポリマーや蛋白質などの高分子化合物を結合させた結合体を用いることが好ましい。なぜなら、有機色素は一般的に低分子であるため、腫瘍に集積する前に血中から速やかに排出されてしまうが、高分子化合物を結合しておくことで排出されにくくなり、血中を循環するうちに腫瘍に集積し、結果的に腫瘍集積量を高めることができるからである。
一方、造影剤には、結合体以外にも、精製してもなお残ってしまう単独の有機色素が含まれる。前述の通り単独の有機色素は、血中から速やかに排出されてしまい、腫瘍部に集積する性質を持たないため、造影剤には含まれないことが好ましい。なぜなら、人体への負担の観点から、造影剤に含まれる有機色素の合計量はなるべく少ない方が良いからである。したがって、有機色素と高分子化合物との結合体の製造過程において、有機色素と高分子化合物とを反応させた後に、結合できずに残った単独の有機色素をなるべく多く除くことが好ましい。
特許文献1には、下記式(1)で表わされる有機色素(ICG−ATT)と、蛋白質の1種であるウシ血清アルブミン(Bovine Serum Albumin、以下BSAと略すことがある)との結合体が開示されている。
特許文献1によると、この結合体を得るためにまず、ICG−ATTとウシ血清アルブミンをpH7.5のリン酸水溶液中で反応させた後、pH 7.5のリン酸水溶液を溶出液として用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行う。そして、得られたpH7.5の溶出液に酢酸エチルを添加して撹拌することで、疎水性の酢酸エチルの層と、親水性の水溶液の層とに分離させる。酢酸エチルの層には、疎水性の高いICG−ATTが移行し、水溶液の層には、結合体が残る。最後に、水溶液の層を回収することで、ICG−ATTとBSAの結合体を得ている。
Bioconjugate Chem.Volume 25, Issue 10,p.1801−1810(2014)
ここで、特許文献1で用いる有機色素(ICG−ATT)は、インドール環の窒素にエチル基が結合しているため疎水性が高く、アルブミンと結合する前に凝集しやすいため、アルブミンに結合しない単独の色素が多く残りやすい。反応後の溶液に色素が多く残ってしまうと、上記のようにその後に酢酸エチルを用いた精製を行っても除去しきれず、造影剤にも単独の色素が残ってしまう。
一方、非特許文献1では、蛋白質の一種である抗体と、後述の式(I−2)で示される色素(ICG−Sulfo−OSu)との結合体を開示する。
非特許文献1では、結合体を得るためにまず、ICG−Sulfo−OSuと抗体を反応させた後、pH6.8の溶液を溶出液として用いたゲル濾過クロマトグラフィーを行う。そして、得られた溶出液に酢酸エチルを添加して撹拌することで、酢酸エチルの層と水溶液の層とに分離させ、水溶液の層を回収することで、ICG−Sulfo−OSuと抗体の結合体を得ている。非特許文献1で用いる有機色素(ICG−Sulfo−OSu)は、インドール環の窒素に親水性のスルホン酸基で置換されたアルキル基が結合して親水性となるため、凝集しにくく、アルブミンと効率的に反応させることができる。一方、アルブミンと結合せずに残った単独の有機色素は親水性であるため、酢酸エチルを加えて層を分離する際に、水溶液の層に残ってしまう。そのため、回収された水溶液の層には、単独の有機色素が多く残ってしまうという問題があった。
そこで、本発明では、アルブミンに結合していない単独の有機色素の残存量が少ない、逆に言えば、アルブミンと有機色素の結合体の割合が多い光学イメージング用造影剤の製造方法を提供することを目的とする。
本発明に係る光学イメージング造影剤の製造方法は、アルブミンと、下記式(I)乃至(III)のいずれかで示される有機色素又はその塩とを反応させて、前記有機色素と前記アルブミンとが共有結合してなる結合体を含む水溶液を得る反応工程と、前記反応工程で得られた前記結合体を含む水溶液のpHを7.2以下にするpH調整工程と、pHを7.2以下にした前記水溶液にエステル溶剤を添加して、前記エステル溶剤を含む有機溶媒の層と水溶液の層とに分離した溶液を得る分離工程と、分離した前記溶液から、前記結合体を含む水溶液を抽出する抽出工程と、を有することを特徴とする。
上記式(I)乃至(III)において、R11乃至R22は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数1乃至3のアルキル基及びハロゲン原子のいずれかであり、
L11乃至L17は各々独立に同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよいメチン基であり、該置換基はメチル基またはハロゲン原子であり、A11及びA12は同一でも異なっていてもよく、炭素数1乃至10のアルキレン基であり、Q11は、−OH、−CO2H、−S(=O)2OH、−P(=O)(OH)2、及び−OP(=O)(OH)2、のいずれかであり、R100は、下記式(i)乃至(viii)のいずれかであり、
L11乃至L17は各々独立に同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよいメチン基であり、該置換基はメチル基またはハロゲン原子であり、A11及びA12は同一でも異なっていてもよく、炭素数1乃至10のアルキレン基であり、Q11は、−OH、−CO2H、−S(=O)2OH、−P(=O)(OH)2、及び−OP(=O)(OH)2、のいずれかであり、R100は、下記式(i)乃至(viii)のいずれかであり、
また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、アルブミンと、下記式(I)乃至(III)のいずれかで示される少なくとも1つの有機色素又はその塩とが共有結合してなる結合体を含む光学イメージング用造影剤であって、前記光学イメージング用造影剤に含まれる前記有機色素と前記アルブミンに結合している有機色素のモル数の総和に対して、前記アルブミンに結合している前記有機色素のモル数の割合が60%以上であることを特徴とする。
上記式(I)乃至(III)において、R11乃至R22は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数1乃至3のアルキル基及びハロゲン原子のいずれかであり、L11乃至L17は各々独立に同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよいメチン基であり、該置換基はメチル基またはハロゲン原子であり、A11及びA12は同一でも異なっていてもよく、炭素数1乃至10のアルキレン基であり、Q11は、−OH、−CO2H、−S(=O)2OH、−P(=O)(OH)2、及び−OP(=O)(OH)2、のいずれかであり、R100は、下記式(i)乃至(viii)のいずれかであり、
また、別の本発明に係る光学イメージング用造影剤は、アルブミンと、下記式(IV)乃至(VI)のいずれかで示される、少なくとも1つの有機色素とアルブミンとが共有結合してなる結合体又はその塩を含む光学イメージング用造影剤であって、前記光学イメージング用造影剤に含まれる前記有機色素と前記アルブミンに結合している有機色素のモル数の総和に対して、前記アルブミンに結合している前記有機色素のモル数の割合が60%以上であることを特徴とする。
本発明に係る光学イメージング用造影剤の製造方法によれば、水溶液中のアルブミンと特定の有機色素との反応後に、得られた水溶液のpHを低くし、pHを低くした水溶液と酢酸エチルを用いた分離操作を行うことで、最終的に得られる溶液に残存する単独の有機色素を少なくできる。
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限られない。
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤の製造方法(以下、単に製造方法と略すことがある)は、以下の工程を少なくとも有する。
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤の製造方法(以下、単に製造方法と略すことがある)は、以下の工程を少なくとも有する。
(a)反応工程
本工程では、水溶液中で、アルブミンと、特定の有機色素又はその塩とを反応させて、この特定の有機色素とアルブミンとの結合体を含む水溶液を得る
(b)pH調整工程
本工程では、(a)で得た結合体を含む水溶液のpHを7.2以下にする
(c)分離工程
本工程では、(b)で得たpHが7.2以下の水溶液に、エステル溶剤を添加して撹拌することで、エステル溶剤を含む有機溶媒の層と、水溶液の層とに分離させる
(d)抽出工程
本工程では、(c)で得た、有機溶媒の層と水溶液の層とに分離した溶液から、結合体を含む水溶液を抽出する。本実施形態に係る製造方法は、アルブミンに結合させる有機色素を、水溶液中において凝集しにくい親水性の高い構造とすること、及び(b)の工程を有することが特徴である。
本工程では、水溶液中で、アルブミンと、特定の有機色素又はその塩とを反応させて、この特定の有機色素とアルブミンとの結合体を含む水溶液を得る
(b)pH調整工程
本工程では、(a)で得た結合体を含む水溶液のpHを7.2以下にする
(c)分離工程
本工程では、(b)で得たpHが7.2以下の水溶液に、エステル溶剤を添加して撹拌することで、エステル溶剤を含む有機溶媒の層と、水溶液の層とに分離させる
(d)抽出工程
本工程では、(c)で得た、有機溶媒の層と水溶液の層とに分離した溶液から、結合体を含む水溶液を抽出する。本実施形態に係る製造方法は、アルブミンに結合させる有機色素を、水溶液中において凝集しにくい親水性の高い構造とすること、及び(b)の工程を有することが特徴である。
後述するように、有機色素をシアニン系の色素(典型的には2つのインドール環がメチン鎖を介して結合した構造)とし、そのインドール環の一方の窒素に、親水性の官能基を有する基が結合した構造とすることで、水溶液中で凝集しにくくなる。また、もう一方の窒素に、アルブミンに結合しやすい官能基を有する基であって、かつ、pHが低い水溶液中で疎水性が高くなる基(後述のR100)とする。有機色素をこのような構造とすることで、アルブミンに結合させやすくなるため、アルブミンと未反応の単独の有機色素が残りにくい。また、アルブミンは、pHに依存した可逆的な立体構造変化を起こすため、pHが低い水溶液中での構造変化によって、アルブミンに吸着した有機色素がアルブミンから解離しやすい。加えて、(b)のpH調整工程によって、疎水性が上がるため、(c)の分離工程で、エステル溶剤を有する有機溶媒の層に移行しやすい。言い換えると、水溶液の層に単独の有機色素が残存しにくい。以上により、抽出工程で得られる溶液における、単独の色素の残存量は少なく、結合体の割合が多くなる。
以下、上記各工程について詳細に説明する。
(a)反応工程について
(有機色素)
本工程で用いられる特定の有機色素は、下記式(I)乃至(III)のいずれかで示される。
(有機色素)
本工程で用いられる特定の有機色素は、下記式(I)乃至(III)のいずれかで示される。
上記式(I)乃至(III)において、R11乃至R22は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数1乃至3のアルキル基及びハロゲン原子のいずれかである。好ましくはR11乃至R22が水素原子の場合である。
上記式(I)乃至(III)において、L11乃至L17は各々独立に同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよいメチン基であり、該置換基はメチル基またはハロゲン原子といった疎水性の基である。置換基がメチル基またはハロゲン原子である場合、水中で分散しやすい程度で疎水性が高くなるため、アルブミンへの吸着性が高く、かつ有機溶媒の層に移行しやすくなる点では好ましい。なお、好ましくはL11乃至L17が無置換のメチン基の場合である。
上記式(I)乃至(III)において、A11及びA12は同一でも異なっていてもよく、炭素数1乃至10のアルキレン基である。A11及びA12はアルブミンへアクセスしやすい程度の疎水性をもち、かつ水中で分散しやすい炭素数2乃至5のアルキレン基であることが好ましい。なお、A11が炭素数5のアルキレン基でありA12が炭素数4のアルキレン基であることが更に好ましい。
上記式(I)乃至(III)において、Q11は、−OH、−CO2H、−S(=O)2OH、−P(=O)(OH)2、及び−OP(=O)(OH)2、のいずれかである。Q11は、水中で凝集しにくくするために、化合物に親水性を付与する基であることが好ましいため、−S(=O)2OHであることが好ましい。
上記式(I)乃至(III)において、R100は、下記式(i)乃至(viii)のいずれかである。
なお、上記式(i)乃至(viii)において、*は、上記式(I)乃至(III)におけるA11との結合する結合手を表す。上記式(i)乃至(viii)で表わされる基は、いずれもアミノ基との反応が高い。一方、水中におかれて時間が経過すると、カルボキシル基に変わる。カルボキシル基は、pHが高い環境においては、COO−の状態である確率が高い一方、pHが低い環境下(酸性条件下)では、COOHの状態である確率が高い。そのため、pHが低いほど疎水性のCOOHを有する状態の有機色素が多くなるため、疎水性の溶媒に移行しやすくなる。
また、上記式(I)から(III)の構造は、ナフチル環を有するため、Cy5(登録商標)やCy7(登録商標)といった、ベンゼン環を有する構造に比べて環が1つ多く、疎水性が高い。そのため、アルブミンへの吸着力が大きい。
なお、上記式(I)のようなベンゾ[e]インドール、上記式(II)のようなベンゾ[f]インドール、上記式(III)のようなベンゾ[g]インドールは、互いに、疎水性、凝集性およびアルブミンとの吸着能はほぼ同等である。
本実施形態における有機色素は、近赤外波長領域の光を吸収して音響波を発する有機色素であることが好ましい。なお、本明細書において近赤外波長領域の光とは600nm乃至1300nmの波長の光を意味する。
本実施形態における有機色素として、下記式(I−1)乃至(I−4)のいずれかで示される有機色素であることが好ましい。
なお、上記式(I−1)乃至(I−4)で示される有機色素のように、下記式(I−5)で示される有機色素をN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)等を用いて活性化し、アミノ基とのアミド結合を形成しやすくしても良い。
なお、明細書では、有機色素の代わりに、その塩を用いても良い。塩を形成するカチオンは、プロトン、ナトリウムイオン、カリウムイオン、ヨウ素イオンのいずれであってもよい。また、塩は医薬上許容しうる塩であることが好ましい。
(アルブミン)
本実施形態で用いられるアルブミンは、血中に多量に存在(35〜50g/L)し、分子サイズが66.5kDaであり、585個のアミノ酸からなるタンパク質である。アルブミンは生体内で局在することにより浸透圧制御などの多くの役割を果たしている。本実施形態に係るアルブミンとしては、ヒト血清アルブミン(Human Serum Albumin、以下HSAと略すことがある)、ウシ血清アルブミン(BSA)が挙げられる。しかし本実施形態はこれらに限られず、HSAまたはBSAの改変体であってもよく、HSAまたはBSAの断片であってもよい。本実施形態におけるアルブミンとしては、人体との親和性が高いと考えられる、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの改変体、ヒト血清アルブミンの断片、ヒト血清アルブミンの改変体の断片のいずれかであることが好ましい。また、本実施形態におけるアルブミンは、ヒト血液からの抽出物であってもよいし、大腸菌等からの生産物でもあっても構わない。本実施形態におけるアルブミンはHSAの全配列あるいは全配列中から取り出してきた部分配列と比較して少なくとも95%以上の相同性を有する。
本実施形態で用いられるアルブミンは、血中に多量に存在(35〜50g/L)し、分子サイズが66.5kDaであり、585個のアミノ酸からなるタンパク質である。アルブミンは生体内で局在することにより浸透圧制御などの多くの役割を果たしている。本実施形態に係るアルブミンとしては、ヒト血清アルブミン(Human Serum Albumin、以下HSAと略すことがある)、ウシ血清アルブミン(BSA)が挙げられる。しかし本実施形態はこれらに限られず、HSAまたはBSAの改変体であってもよく、HSAまたはBSAの断片であってもよい。本実施形態におけるアルブミンとしては、人体との親和性が高いと考えられる、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの改変体、ヒト血清アルブミンの断片、ヒト血清アルブミンの改変体の断片のいずれかであることが好ましい。また、本実施形態におけるアルブミンは、ヒト血液からの抽出物であってもよいし、大腸菌等からの生産物でもあっても構わない。本実施形態におけるアルブミンはHSAの全配列あるいは全配列中から取り出してきた部分配列と比較して少なくとも95%以上の相同性を有する。
アルブミンは上記有機色素がアクセスできる位置に複数のリジン残基、あるいは遊離のシステイン残基を有している。アルブミンと上記有機色素との化学結合の例として、アルブミンのリジン残基のアミノ基と有機色素の有するカルボキシル基とによるアミド結合が挙げられる。
(アルブミンと有機色素の反応)
本実施形態における結合体は、上記アルブミンと上記有機色素とを、それぞれがもつ官能基を介してカップリング反応によって結合させることで調製する。例えば、有機色素のインドール環に存在する窒素原子の置換基を介して、アルブミンを結合させる。なお、アルブミンが有するアミノ基と、有機色素が有するカルボキシル基を介してアミド結合させることが好ましい。なお、反応効率向上の観点から、通常、有機色素をアルブミンにアミド結合させる場合、上記(i)乃至(viii)で表わされる基を有する有機色素を用いる。これらの基は、アミノ基と反応するとアミド結合を形成し、反応せずに水中におかれて時間がたつとカルボキシル基となる。アミド結合は、強固な結合であるため、生体内で安定に結合を保つことが可能である。
本実施形態における結合体は、上記アルブミンと上記有機色素とを、それぞれがもつ官能基を介してカップリング反応によって結合させることで調製する。例えば、有機色素のインドール環に存在する窒素原子の置換基を介して、アルブミンを結合させる。なお、アルブミンが有するアミノ基と、有機色素が有するカルボキシル基を介してアミド結合させることが好ましい。なお、反応効率向上の観点から、通常、有機色素をアルブミンにアミド結合させる場合、上記(i)乃至(viii)で表わされる基を有する有機色素を用いる。これらの基は、アミノ基と反応するとアミド結合を形成し、反応せずに水中におかれて時間がたつとカルボキシル基となる。アミド結合は、強固な結合であるため、生体内で安定に結合を保つことが可能である。
有機色素とアルブミンとを反応させる方法としては、カルボキシル基とアミノ基の反応のために縮合剤を用いる方法、塩を形成し脱水反応により縮合を行う方法、脱水剤を用いる方法が挙げられる。また、カルボキシル基を上記(i)乃至(viii)で表わされる基に変換し、アミノ基と反応させる方法も利用が可能である。
上記縮合剤としては、カルボジイミド系縮合剤、イミダゾール系縮合剤、トリアジン系縮合剤、ウロニウム系縮合剤、リン酸系縮合剤などが利用可能である。
上記トリアジン系縮合剤の例としては下記式(3)で表わされる、4−(4,6−ジメトキシ−1,3,5−トリアジン−2−イル)−4−メチルモルホリニウム クロリド(以下DMT−MMと略すことがある)を挙げることができる。
DMT−MMは、アルブミン等の蛋白質とシアニン系化合物を結合させるための縮合剤として用いることが好ましい。なぜなら、水中における縮合反応が可能であることから、水溶媒に含まれていることが好ましい蛋白質と有機色素を水溶液中で縮合させることができるからである。
上記縮合剤の使用量は、有機色素に対して、1.0倍モル以上の範囲であることが好ましい。なぜなら、一つのアルブミンに対して、有機色素をより多く結合させることができるからである。また、縮合剤そのものを反応溶媒として用いることも可能である。
本実施形態に係る結合体を合成する際に用いられる有機色素の使用量は、アルブミンに対して、1.0倍モル以上であることが好ましい。なぜなら、有機色素の使用量が多いほど、一つのアルブミンに多くの有機色素を結合させることができるからである。
本実施形態における反応工程において使用する水溶液は有機色素と、アルブミンとを結合できれば特に限定されない。例えば、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、炭酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の無機塩緩衝液、トリス緩衝液、MES緩衝液、MOPS緩衝液、HEPES緩衝液、トリシン緩衝液、ビシン緩衝液等のグッドバッファーが挙げられる。また、これらの水溶液を2種類以上混合して使用することも可能である。
本実施形態に係る結合体を得るための合成を行う際の水溶液のpHは、特に限定されないが、pH4以上10以下の範囲であり、好ましくは、pH7以上10以下の範囲である。pH7以上10以下とすることで、アルブミンが有するリジンのアミノ基の反応性を上げることができ、上記有機色素とアルブミンとの反応効率が上がるからである。なお、化合物を製造する際に用いられる水溶液の使用量は、反応条件等に応じて、適宜定め得る。本実施形態に係る結合体を得るための反応温度は、特に限定されないが、0℃以上、かつ60℃以下の範囲の温度である。ただし、アルブミンに合わせた最適な温度で反応を行うことが望ましい。反応時間は、例えば、1時間以上120時間以下の範囲である。
(b)pH調整工程について
本工程では、上述の反応工程で得られた結合体を含む水溶液のpHを7.2以下にすることで、上記有機色素が水溶液の層から有機溶媒の層に移行しやすくできればその手段は限定されない。なお、pH調整工程は、結合体を含む水溶液のpHを6.2以下にすること工程であることが好ましく、5.8以下にすることが更に好ましく、4.8以下とするが特に好ましい。ここで、アルキルカルボキシル基の酸解離指数は約4.8であるため、pHが7.2を下回り、4.8に近づくにつれて、上記有機色素のカルボキシル基がCOO−の状態からCOOHの状態となる数が増加する。そのため、有機色素の疎水性が上がり有機溶媒の層により多くの有機色素が移行しやすくなるからである。水溶液のpHを低くする(酸性化すると言い換えることもできる)例として、(a)で得られた水溶液に酸性の水溶液及び酸性の固体塩の少なくともいずれか一方を添加することが挙げられる。酸性の水溶液の例は、塩酸、酢酸、クエン酸水溶液、塩化アンモニウム水溶液等である。また、酸性の固体塩の例は、クエン酸や塩化アンモニウム等である。また、これらの水溶液や固体を2種類以上混合して使用することができる。また、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液や炭酸緩衝液などのアルカリ性水溶液を、塩酸などの強酸性の水溶液に混合し弱酸性に調整した水溶液を使用することも可能である。
(b)pH調整工程について
本工程では、上述の反応工程で得られた結合体を含む水溶液のpHを7.2以下にすることで、上記有機色素が水溶液の層から有機溶媒の層に移行しやすくできればその手段は限定されない。なお、pH調整工程は、結合体を含む水溶液のpHを6.2以下にすること工程であることが好ましく、5.8以下にすることが更に好ましく、4.8以下とするが特に好ましい。ここで、アルキルカルボキシル基の酸解離指数は約4.8であるため、pHが7.2を下回り、4.8に近づくにつれて、上記有機色素のカルボキシル基がCOO−の状態からCOOHの状態となる数が増加する。そのため、有機色素の疎水性が上がり有機溶媒の層により多くの有機色素が移行しやすくなるからである。水溶液のpHを低くする(酸性化すると言い換えることもできる)例として、(a)で得られた水溶液に酸性の水溶液及び酸性の固体塩の少なくともいずれか一方を添加することが挙げられる。酸性の水溶液の例は、塩酸、酢酸、クエン酸水溶液、塩化アンモニウム水溶液等である。また、酸性の固体塩の例は、クエン酸や塩化アンモニウム等である。また、これらの水溶液や固体を2種類以上混合して使用することができる。また、水酸化ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液や炭酸緩衝液などのアルカリ性水溶液を、塩酸などの強酸性の水溶液に混合し弱酸性に調整した水溶液を使用することも可能である。
(c)分離工程について
本工程では、(b)の工程によって、pHが7.2以下となった水溶液にエステル溶剤を添加し、撹拌することで、エステル溶剤を含む有機溶媒の層と水溶液の層とに分離させる。
本工程では、(b)の工程によって、pHが7.2以下となった水溶液にエステル溶剤を添加し、撹拌することで、エステル溶剤を含む有機溶媒の層と水溶液の層とに分離させる。
(エステル溶剤)
本実施形態におけるエステル溶剤は、抽出工程において水溶液の層との分離ができ、疎水性の状態の上記有機色素との親和性が高い有機溶媒であればよく、脂肪酸エステルであることが好ましい。本実施形態における脂肪酸エステル溶剤としては、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸sec−ブチル、酢酸tert−ブチル、酢酸アミル、プロピオン酸エチル、酪酸エチル等が挙げられる。また、これらの溶媒を2種類以上混合して使用することも可能である。より好ましくは、酢酸エチル、酢酸ブチル等の酢酸エステル類が挙げられる。なぜなら、これらの有機溶媒は、極性の高い有機溶媒であるため、上記有機色素の有機溶媒に対する溶解性が良くなるからである。
本実施形態におけるエステル溶剤は、抽出工程において水溶液の層との分離ができ、疎水性の状態の上記有機色素との親和性が高い有機溶媒であればよく、脂肪酸エステルであることが好ましい。本実施形態における脂肪酸エステル溶剤としては、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、酢酸sec−ブチル、酢酸tert−ブチル、酢酸アミル、プロピオン酸エチル、酪酸エチル等が挙げられる。また、これらの溶媒を2種類以上混合して使用することも可能である。より好ましくは、酢酸エチル、酢酸ブチル等の酢酸エステル類が挙げられる。なぜなら、これらの有機溶媒は、極性の高い有機溶媒であるため、上記有機色素の有機溶媒に対する溶解性が良くなるからである。
(d)抽出工程について
本工程では、有機溶媒の層と水溶液の層(水層と言うこともできる)とに分離した溶液から、結合体を含む水溶液を抽出する。(c)の工程で得た分離溶液において、結合体を水溶液中に留まらせたまま、アルブミンに結合していない有機色素を有機溶媒で抽出し、水溶液の層を回収することによって結合体を得ることができる。
本工程では、有機溶媒の層と水溶液の層(水層と言うこともできる)とに分離した溶液から、結合体を含む水溶液を抽出する。(c)の工程で得た分離溶液において、結合体を水溶液中に留まらせたまま、アルブミンに結合していない有機色素を有機溶媒で抽出し、水溶液の層を回収することによって結合体を得ることができる。
本実施形態において、抽出工程が、結合体を含む溶液を乾燥させる(水分を減らす)乾燥工程を有していても良い。乾燥工程は特に限定されないが、定法のエバポレータ、真空乾燥器、凍結乾燥器等を用いた方法等が挙げられる。
(光学イメージング用造影剤)
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、上記式(I)乃至(III)で示される少なくとも1つの有機色素とアルブミンとが共有結合してなる結合体又はその塩を含む。
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、上記式(I)乃至(III)で示される少なくとも1つの有機色素とアルブミンとが共有結合してなる結合体又はその塩を含む。
また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、アルブミンと、下記式(IV)乃至(VI)のいずれかで示される、少なくとも1つの有機色素とアルブミンとが共有結合してなる結合体又はその塩を含む。
上記式(IV)乃至(VI)において、L11乃至L17は各々独立に同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよいメチン基であり、該置換基はメチル基またはハロゲン原子である。
上記式(IV)乃至(VI)において、A11及びA12は同一でも異なっていてもよく、炭素数1乃至10のアルキレン基である。
上記式(IV)乃至(VI)において、Q11は、−OH、−CO2H、−S(=O)2OH、−P(=O)(OH)2、及び−OP(=O)(OH)2、のいずれかである。
上記式(IV)乃至(VI)において、Xは、アルブミンのうち、1つのアミノ基を除いた構造を表す。
また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、光学イメージング用造影剤に含まれる有機色素のモル数に対して、結合体(アルブミンに結合している有機色素)のモル数の割合が60%以上であることが好ましく、70%以上であることが更に好ましい。アルブミンに結合している有機色素の割合が多いことで、被検体に投与する有機色素の合計量を少なくすることができ、被検体に投与される有機色素の全部のモル数のうち、腫瘍に到達する有機色素のモル数が多くなる。また、アルブミンに結合していない有機色素が血液中に残存した場合、腫瘍部位以外からも信号が得られる。そのため、アルブミンに結合している有機色素のモル数がアルブミンに結合していない有機色素に対し1.5倍以上であればよい。なぜなら、有機色素のモル数の総和に対し、結合体(アルブミンに結合している有機色素)のモル数の割合が60%以上であれば、これら有機色素の組織への分布割合が同じでも腫瘍部位と腫瘍部位以外とで少なくとも1.5倍の信号強度比が得られるからである。その結果、腫瘍の部位から大きな蛍光信号や光音響信号を得られる光学イメージング用造影剤を提供できる。
また、言い換えると、抽出工程で得られる溶液中に含まれる全ての有機色素のモル数に対し、アルブミンに結合していない有機色素のモル数の割合が40%未満であることが好ましく、30%未満であることが更に好ましい。
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、上記結合体に加えて、分散媒を有していても良い。ここで分散媒は、本実施形態に係る結合体を分散させるための液状の物質であり、例えば生理食塩水、注射用蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖水溶液などが挙げられる。本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、上記本実施形態に係る結合体をこの分散媒に予め分散させておいてもよいし、本実施形態に係る結合体と分散媒とをキットにしておき、生体内に投与する前に結合体を分散媒に分散させて使用してもよい。本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、上記結合体や分散媒の他にさらに賦形剤などの薬理上許容できる添加物、例えば血管拡張剤、pH調整剤、等張化剤、安定剤、溶解補助剤などを有していてもよい。また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、凍結乾燥時に使用する添加剤を含んでいてもよい。添加剤の一例としてグルコース、ラクトース、マンニトール、ポリエチレングリコール、グリシン、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウムが挙げられる。添加剤は1種類のみを用いても、複数種類を併用してもよい。
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、生体内に投与するときに溶液のpHが5.0以上8.0以下に調整されていることが好ましく、7.0以上7.4以下であることがより好ましい。また、その溶液の生理食塩液に対する浸透圧比は0.01から2.0であることが好ましく、1.0であることがより好ましい。
本実施形態において光学イメージングとは、光を照射することで、イメージング(画像化)することを意味する。本実施形態に係る造影剤に光を照射することで、発せられた音響波を検出することで光音響イメージングをすることができ、発せられた蛍光を検出することで蛍光イメージングをすることができる。なお、光音響イメージングは、光音響トモグラフィー(断層撮影法)を含む概念である。本実施形態に係る光学イメージング用造影剤が蛍光イメージングに用いられる場合、蛍光イメージング用造影剤、光音響イメージングに用いられる場合、光音響イメージング用造影剤と呼ぶ。
(腫瘍造影)
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、生体内に投与したときに、enhanced permeability and retention(EPR)効果により、腫瘍部位に集積する。その結果、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射し、造影剤から発せられる音響波や蛍光を検出することで、生体の腫瘍部位を造影することができる。
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、生体内に投与したときに、enhanced permeability and retention(EPR)効果により、腫瘍部位に集積する。その結果、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を生体内に投与した後、生体に光を照射し、造影剤から発せられる音響波や蛍光を検出することで、生体の腫瘍部位を造影することができる。
(リンパ節造影剤)
また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤はリンパ節の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節の造影剤に用いることが特に好ましい。上記有機色素をセンチネルリンパ節の造影剤として用いた場合、体内に投与した有機色素は速やかに血中へと移行して体外へ排出されてしまうために観察時間が制約されてしまう。しかし本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、単独の有機色素と比べて分子サイズが大きく、組織内の拡散スピードが低下する結果、センチネルリンパ節での滞留時間が長くなると期待される。したがって、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤はリンパ節の造影、特にセンチネルリンパ節の造影に用いられることが好ましい。
また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤はリンパ節の造影に用いることもできる。さらに、センチネルリンパ節の造影剤に用いることが特に好ましい。上記有機色素をセンチネルリンパ節の造影剤として用いた場合、体内に投与した有機色素は速やかに血中へと移行して体外へ排出されてしまうために観察時間が制約されてしまう。しかし本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、単独の有機色素と比べて分子サイズが大きく、組織内の拡散スピードが低下する結果、センチネルリンパ節での滞留時間が長くなると期待される。したがって、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤はリンパ節の造影、特にセンチネルリンパ節の造影に用いられることが好ましい。
(捕捉分子)
本実施形態に係る化合物にさらに、捕捉分子が結合していてもよい。本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された本実施形態に係る結合体を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
本実施形態に係る化合物にさらに、捕捉分子が結合していてもよい。本実施形態における捕捉分子とは、腫瘍などの標的部位に特異的に結合する物質、標的部位の周辺に存在する物質に特異的に結合する物質などであり、生体分子や医薬品等の化学物質などから任意に選択することができる。具体的には、抗体、抗体フラグメント、一本鎖抗体などの人工抗体、酵素、生物活性ペプチド、グリコペプチド、糖鎖、脂質、分子認識化合物などが挙げられる。これらの物質は単独で用いることもできるし、あるいは複数を組み合わせて用いることもできる。捕捉分子が化学結合された本実施形態に係る結合体を用いることで、標的部位の特異的な検出、標的物質の動態、局在、薬効、代謝等の追跡を行うことができる。
(本実施形態に係る造影剤を用いた光学イメージング方法)
生体内に投与された本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を、光音響イメージング装置または蛍光イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を検出する方法は以下の(イ)、(ロ)の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法または蛍光イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。(イ)本実施形態に係る光学イメージング用造影剤が投与された検体に600nm乃至1300nmの波長領域の光を照射する工程
(ロ)前記検体内に存在する前記光学イメージング用造影剤から発生する音響波および蛍光を検出する工程
また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、前記(ロ)で得られた音響波や蛍光の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布または蛍光信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記(ロ)の工程で得られた光音響信号や蛍光の波長、位相および時間情報を基に3次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号や蛍光の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば3次元空間上に光音響信号強度や蛍光強度が表現されるようなもの構わないし、2次元平面上に光音響信号強度や蛍光強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響信号や蛍光の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
生体内に投与された本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を、光音響イメージング装置または蛍光イメージング装置を用いて検出する方法について説明する。本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を検出する方法は以下の(イ)、(ロ)の工程を有する。但し、本実施形態に係る光音響イメージング方法または蛍光イメージング方法は、以下に示す工程以外の工程を含んでいても良い。(イ)本実施形態に係る光学イメージング用造影剤が投与された検体に600nm乃至1300nmの波長領域の光を照射する工程
(ロ)前記検体内に存在する前記光学イメージング用造影剤から発生する音響波および蛍光を検出する工程
また、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤は、前記(ロ)で得られた音響波や蛍光の波長、位相および時間情報等から空間的な光音響信号強度分布または蛍光信号強度分布を再構成する工程を有していてもよい。なお、前記(ロ)の工程で得られた光音響信号や蛍光の波長、位相および時間情報を基に3次元的な画像再構成を行うことができる。画像再構成によって得られるデータは光音響信号や蛍光の強度分布の位置情報が把握できるものであればどのような形態を取っても構わない。例えば3次元空間上に光音響信号強度や蛍光強度が表現されるようなもの構わないし、2次元平面上に光音響信号強度や蛍光強度に表現されるようなものでも構わない。また、同一の観察対象に対して異なる撮像方法で情報を取得し、それらの情報と光音響信号や蛍光の強度分布の位置的な対応関係を取得することも可能である。
上記(イ)の工程において、経口投与や注射等の方法によって本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を投与された検体を用いることができる。
また、上記(ロ)の工程において、検体に照射する光を発生させる装置、本実施形態に係る光学イメージング用造影剤から発せられる光音響信号や蛍光を検出する装置は特に限定されない。
上記(ロ)の工程において検体に光を照射する光源としては、前記検体に対し600nm乃至1300nmの範囲から選択される少なくとも1つの波長のレーザーパルス光を照射させることのできるものであれば限定されない。レーザーパルス光を照射する装置として、例えば、チタンサファイアレーザー(LT−2211−PC、Lotis社製))、OPOレーザー(LT−2214 OPO、Lotis社製)、アレキサンドライトレーザーが挙げられる。
音響波を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の光音響イメージング装置(Nexus128,Endra Inc.製)を用いて行うことができる。
蛍光を検出する装置は特に制限されず種々のものを用いることが可能である。例えば、市販の蛍光イメージング装置(IVIS Imaging System、Perkin Elmer Inc.製)を用いて行うことができる。
本実施形態に係る光学イメージング用造影剤を用いたイメージング方法は、上記(イ)、(ロ)の工程を経ることで腫瘍、リンパ節あるいは血管などの目的とする部位を造影することができる。
以下、実施例を用いて更に詳細に本発明を説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではなく、材料、組成条件、反応条件等は、同様な機能、効果が得られる範囲で自由に変えることが出来る。
(分析方法)
以下の実施例において行った吸収スペクトル測定は、紫外可視光吸収スペクトル測定装置(GEヘルスケア社製、gene quant)を用いた。
以下の実施例において行った吸収スペクトル測定は、紫外可視光吸収スペクトル測定装置(GEヘルスケア社製、gene quant)を用いた。
下記実施例において行ったpH測定は、コンパクトpHメータ(HORIBA製、twin pH)を用いた。
(実施例1)
(有機色素とアルブミンとの反応液の調整)
ヒト血清アルブミン(以下、HSAと略することがある)(400 mg、6.0μmol)を50 mM 炭酸バッファー(pH 9.6)(62.5 mL)に溶解させ、アルブミン水溶液を調整した。上記式(I−5)で表される有機色素(50 mg、68 μmol)とDMT−MM・nH2O(95 mg)にクロロホルム(15 mL)を加えた。遮光下、室温で2時間撹拌した。その結果、上記式(I−1)で示される有機色素を含む溶液が得られた。得られた溶液からエバポレータで溶媒を留去した後、エタノール(13 mL)を添加し、吸引濾過により濾液を回収した。回収した濾液(11 mL)をアルブミン水溶液(62.5 mL)に加えた。遮光下、室温で3時間撹拌し、反応液を得た。
(有機色素とアルブミンとの反応液の調整)
ヒト血清アルブミン(以下、HSAと略することがある)(400 mg、6.0μmol)を50 mM 炭酸バッファー(pH 9.6)(62.5 mL)に溶解させ、アルブミン水溶液を調整した。上記式(I−5)で表される有機色素(50 mg、68 μmol)とDMT−MM・nH2O(95 mg)にクロロホルム(15 mL)を加えた。遮光下、室温で2時間撹拌した。その結果、上記式(I−1)で示される有機色素を含む溶液が得られた。得られた溶液からエバポレータで溶媒を留去した後、エタノール(13 mL)を添加し、吸引濾過により濾液を回収した。回収した濾液(11 mL)をアルブミン水溶液(62.5 mL)に加えた。遮光下、室温で3時間撹拌し、反応液を得た。
(液液抽出における酢酸エチル層の有機色素の量の評価)
上記反応液(0.5 mL)に、1N HCl水溶液と50 mM 炭酸バッファー(pH 9.6)の混合液(液量比 HCl:CB(炭酸バッファー) = 1:8、1:9または1:10)(0.5 mL)、または、その混合液を更に蒸留水で希釈した溶液(0.5 mL)を添加してpH測定を行った。そして、混合液を更に蒸留水で希釈した溶液添加後の溶液のpHが、4.9、5.8、6.2、6.8、7.2、7.8、8.0、8.5、9.0、9.6、9.9である溶液(各1.0 mL)を調整した。上記11種のpHに調整した反応液(各1.0mL)に、酢酸エチル(各4.0mL)を添加し、振とう撹拌した。酢酸エチル層を含む有機溶媒の層と水溶液の層が分離した後、酢酸エチル層(各4.0mL)を回収した。以下では、酢酸エチル層を含む有機溶媒の層を酢酸エチル層と、水溶液の層を水層と略す。回収した11種の酢酸エチル層(各0.5mL)を各々酢酸エチル(各0.5mL)で希釈して、吸収スペクトル測定を行った。水溶液中のpHに対し、吸収波長793nmにおける酢酸エチル層の吸光度をプロットした結果を図1に記す。
上記反応液(0.5 mL)に、1N HCl水溶液と50 mM 炭酸バッファー(pH 9.6)の混合液(液量比 HCl:CB(炭酸バッファー) = 1:8、1:9または1:10)(0.5 mL)、または、その混合液を更に蒸留水で希釈した溶液(0.5 mL)を添加してpH測定を行った。そして、混合液を更に蒸留水で希釈した溶液添加後の溶液のpHが、4.9、5.8、6.2、6.8、7.2、7.8、8.0、8.5、9.0、9.6、9.9である溶液(各1.0 mL)を調整した。上記11種のpHに調整した反応液(各1.0mL)に、酢酸エチル(各4.0mL)を添加し、振とう撹拌した。酢酸エチル層を含む有機溶媒の層と水溶液の層が分離した後、酢酸エチル層(各4.0mL)を回収した。以下では、酢酸エチル層を含む有機溶媒の層を酢酸エチル層と、水溶液の層を水層と略す。回収した11種の酢酸エチル層(各0.5mL)を各々酢酸エチル(各0.5mL)で希釈して、吸収スペクトル測定を行った。水溶液中のpHに対し、吸収波長793nmにおける酢酸エチル層の吸光度をプロットした結果を図1に記す。
図1で示す結果から、反応液のpHを7.2以下にした条件では、有機色素のプロトン化による疎水性向上により、反応液中に含まれるアルブミンに結合していない有機色素が、酢酸エチルとの液液抽出によって反応液から多く除去されることが示された。
(実施例2)
HSAを50 mM 炭酸バッファー(pH 9.6)に溶解して10 mg/mL アルブミン水溶液を調整した。上記式(I−2)で示されるICG−Sulfo−OSu(Dojindo Laboratories製、登録商標)(1mg)をそれぞれ、0.1mLのDMSOに溶解し、有機色素を含む溶液を調整した。上記のアルブミン水溶液(0.40mL)に有機色素を含む溶液(0.04 mL)を添加し、遮光下、室温で3時間撹拌した。上記方法により調整した反応液(0.43 mL)に、1N HCl水溶液と50 mM 炭酸バッファー(pH 9.6)の混合液(液量比 HCl:CB = 1:10)(0.46 mL)を添加して、反応溶液を酸性化した。得られた反応溶液に、酢酸エチル(4.0 mL)を添加し、振とう撹拌した。酢酸エチル層と水層が分離した後、水層を回収した。回収した水層に新たな酢酸エチル(4.0 mL)の添加、振とう撹拌、水層の回収、という一連の操作を2回繰り返した。回収した水層を限外ろ過(30K)により、1×PBS bufferに置換することで、最終的に、ICG−Sulfo−OSuとHSAが共有結合した結合体を含む溶液を作製した。
HSAを50 mM 炭酸バッファー(pH 9.6)に溶解して10 mg/mL アルブミン水溶液を調整した。上記式(I−2)で示されるICG−Sulfo−OSu(Dojindo Laboratories製、登録商標)(1mg)をそれぞれ、0.1mLのDMSOに溶解し、有機色素を含む溶液を調整した。上記のアルブミン水溶液(0.40mL)に有機色素を含む溶液(0.04 mL)を添加し、遮光下、室温で3時間撹拌した。上記方法により調整した反応液(0.43 mL)に、1N HCl水溶液と50 mM 炭酸バッファー(pH 9.6)の混合液(液量比 HCl:CB = 1:10)(0.46 mL)を添加して、反応溶液を酸性化した。得られた反応溶液に、酢酸エチル(4.0 mL)を添加し、振とう撹拌した。酢酸エチル層と水層が分離した後、水層を回収した。回収した水層に新たな酢酸エチル(4.0 mL)の添加、振とう撹拌、水層の回収、という一連の操作を2回繰り返した。回収した水層を限外ろ過(30K)により、1×PBS bufferに置換することで、最終的に、ICG−Sulfo−OSuとHSAが共有結合した結合体を含む溶液を作製した。
(実施例3)
実施例2と同様にして、調整した反応液(0.43 mL)に、30 mM クエン酸水溶液(0.42 mL)を各々添加して、反応溶液を酸性化した。得られた反応溶液に、酢酸エチル(4.0 mL)を添加し、振とう撹拌した。酢酸エチル層と水層が分離した後、水層を回収した。回収した水層に新たな酢酸エチル(4.0 mL)の添加、振とう撹拌、水層の回収、という一連の操作を更に2回繰り返した。回収した水層を限外ろ過(30K)により、1×PBS bufferに置換することで、最終的に、ICG−Sulfo−OSuとHSAが共有結合した結合体を含む溶液を作製した。
実施例2と同様にして、調整した反応液(0.43 mL)に、30 mM クエン酸水溶液(0.42 mL)を各々添加して、反応溶液を酸性化した。得られた反応溶液に、酢酸エチル(4.0 mL)を添加し、振とう撹拌した。酢酸エチル層と水層が分離した後、水層を回収した。回収した水層に新たな酢酸エチル(4.0 mL)の添加、振とう撹拌、水層の回収、という一連の操作を更に2回繰り返した。回収した水層を限外ろ過(30K)により、1×PBS bufferに置換することで、最終的に、ICG−Sulfo−OSuとHSAが共有結合した結合体を含む溶液を作製した。
(実施例4)
実施例2と同様にして、調整した反応液(0.43 mL)に、10 mM クエン酸水溶液(0.42 mL)を各々添加して、反応溶液を酸性化した。前記3種の反応溶液に、酢酸エチル(4.0 mL)を添加し、振とう撹拌した。酢酸エチル層と水層が分離した後、水層を回収した。回収した水層に新たな酢酸エチル(4.0 mL)の添加、振とう撹拌、水層の回収、という一連の操作を更に2回繰り返した。回収した水層を限外ろ過(30K)により、1×PBS bufferに置換することで、最終的に、ICG−Sulfo−OSuとHSAが共有結合した結合体を含む溶液を作製した。
実施例2と同様にして、調整した反応液(0.43 mL)に、10 mM クエン酸水溶液(0.42 mL)を各々添加して、反応溶液を酸性化した。前記3種の反応溶液に、酢酸エチル(4.0 mL)を添加し、振とう撹拌した。酢酸エチル層と水層が分離した後、水層を回収した。回収した水層に新たな酢酸エチル(4.0 mL)の添加、振とう撹拌、水層の回収、という一連の操作を更に2回繰り返した。回収した水層を限外ろ過(30K)により、1×PBS bufferに置換することで、最終的に、ICG−Sulfo−OSuとHSAが共有結合した結合体を含む溶液を作製した。
(比較例1)
実施例2と同じ調整した反応液(0.43 mL)のpHを調製せずに、限外ろ過(50K)により、1×PBS bufferに置換することで、ICG−Sulfo−OSuとHSAが共有結合した結合体を含む溶液を作製した。
実施例2と同じ調整した反応液(0.43 mL)のpHを調製せずに、限外ろ過(50K)により、1×PBS bufferに置換することで、ICG−Sulfo−OSuとHSAが共有結合した結合体を含む溶液を作製した。
(アルブミンに結合していない有機色素の定量)
上記実施例2乃至4および比較例1において、最終的に得られる、結合体を含む溶液中に含まれている、アルブミンに結合していないICG−Sulfo−OSuの含有率を確認した。具体的には各溶液のSDS−PAGE(Sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide gel electrophoresis、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動)を行った泳動ゲルを蛍光イメ−ジャーを用いて定量した。まず、吸光度測定によって、各種溶液中に含まれている全ての有機色素のモル濃度を算出した。泳動ゲルのレーン毎に、上記溶液に含まれている全ての有機色素1.0 pmol分を溶液毎に添加し、またICG−Sulfo−OSu溶液0.125、0.25、0.5、1.0 pmol分を添加し、電気泳動を行った。ODYSSEY(登録商標)CLx Infrared Imaging System(LI−COR社製)を用いて、電気泳動後のゲルの各レーンの低分子量バンドの蛍光強度を測定した。ICG−Sulfo−OSu溶液を泳動したレーンの蛍光強度から得られる検量線を用いて、本実施例、比較例に係る、泳動ゲル中のアルブミンに結合していないICG−Sulfo−OSuのモル数を算出した。泳動ゲルに添加した全ての有機色素1.0 pmolを100%として、アルブミンに結合していないICG−Sulfo−OSuのモル数を百分率にして、表1に示した。
上記実施例2乃至4および比較例1において、最終的に得られる、結合体を含む溶液中に含まれている、アルブミンに結合していないICG−Sulfo−OSuの含有率を確認した。具体的には各溶液のSDS−PAGE(Sodium dodecyl sulfate−polyacrylamide gel electrophoresis、SDS−ポリアクリルアミド電気泳動)を行った泳動ゲルを蛍光イメ−ジャーを用いて定量した。まず、吸光度測定によって、各種溶液中に含まれている全ての有機色素のモル濃度を算出した。泳動ゲルのレーン毎に、上記溶液に含まれている全ての有機色素1.0 pmol分を溶液毎に添加し、またICG−Sulfo−OSu溶液0.125、0.25、0.5、1.0 pmol分を添加し、電気泳動を行った。ODYSSEY(登録商標)CLx Infrared Imaging System(LI−COR社製)を用いて、電気泳動後のゲルの各レーンの低分子量バンドの蛍光強度を測定した。ICG−Sulfo−OSu溶液を泳動したレーンの蛍光強度から得られる検量線を用いて、本実施例、比較例に係る、泳動ゲル中のアルブミンに結合していないICG−Sulfo−OSuのモル数を算出した。泳動ゲルに添加した全ての有機色素1.0 pmolを100%として、アルブミンに結合していないICG−Sulfo−OSuのモル数を百分率にして、表1に示した。
Claims (22)
- 水溶液中で、アルブミンと、下記式(I)乃至(III)のいずれかで示される有機色素又はその塩とを反応させて、前記有機色素と前記アルブミンとが共有結合してなる結合体を含む水溶液を得る反応工程と、
前記反応工程で得られた前記結合体を含む水溶液のpHを7.2以下にするpH調整工程と、
pHを7.2以下にした前記水溶液にエステル溶剤を添加して、前記エステル溶剤を含む有機溶媒の層と水溶液の層とに分離した溶液を得る分離工程と、
分離した前記溶液から、前記結合体を含む水溶液を抽出する抽出工程と、
を有する光学イメージング用造影剤の製造方法。
上記式(I)乃至(III)において、R11乃至R22は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数1乃至3のアルキル基及びハロゲン原子のいずれかであり、
L11乃至L17は各々独立に同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよいメチン基であり、該置換基はメチル基またはハロゲン原子であり、
A11及びA12は同一でも異なっていてもよく、炭素数1乃至10のアルキレン基であり、
Q11は、−OH、−CO2H、−S(=O)2OH、−P(=O)(OH)2、及び−OP(=O)(OH)2、のいずれかであり、
R100は、下記式(i)乃至(viii)のいずれかであり、
上記式(i)乃至(viii)において、*は、上記式(I)乃至(III)におけるA11と結合する結合手を表す。 - 前記pH調整工程は、前記反応工程で得られた前記結合体を含む水溶液のpHを6.2以下にする工程である請求項1に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記pH調整工程は、前記反応工程で得られた前記結合体を含む水溶液のpHを5.8以下にする工程である請求項1または2に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記pH調整工程は、前記反応工程で得られた前記結合体を含む水溶液に塩酸またはクエン酸を添加する工程を含む請求項1乃至3のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記エステル溶剤が酢酸エチルである請求項1乃至4のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記式(I)乃至(III)におけるR11乃至R22が水素原子である請求項1乃至5のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記式(I)乃至(III)におけるL11乃至L17は無置換のメチン基である請求項1乃至6のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記式(I)乃至(III)におけるA11及びA12が炭素数2乃至5のアルキレン基である請求項1乃至7のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記式(I)乃至(III)におけるQ11が−S(=O)2OHである請求項1乃至8のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記共有結合がアミド結合である請求項1乃至10のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記アルブミンがヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの改変体、ヒト血清アルブミンの断片、ヒト血清アルブミンの改変体の断片のいずれかである請求項1乃至11のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記抽出工程で得られる溶液中に含まれる全ての前記有機色素のモル数に対し、前記アルブミンに結合している前記有機色素のモル数の割合が60%以上である請求項1乃至12のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- 前記抽出工程で得られる溶液中に含まれる全ての前記有機色素のモル数に対し、前記アルブミンに結合している前記有機色素のモル数の割合が70%以上である請求項1乃至13のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤の製造方法。
- アルブミンと、下記式(I)乃至(III)のいずれかで示される少なくとも1つの有機色素又はその塩とが共有結合してなる結合体を含む光学イメージング用造影剤であって、
前記光学イメージング用造影剤に含まれる前記有機色素のモル数に対して、前記アルブミンに結合している前記有機色素の割合が60%以上である光学イメージング用造影剤。
上記式(I)乃至(III)において、R11乃至R22は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数1乃至3のアルキル基及びハロゲン原子のいずれかであり、
L11乃至L17は各々独立に同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよいメチン基であり、該置換基はメチル基またはハロゲン原子であり、
A11及びA12は同一でも異なっていてもよく、炭素数1乃至10のアルキレン基であり、
Q11は、−OH、−CO2H、−S(=O)2OH、−P(=O)(OH)2、及び−OP(=O)(OH)2、のいずれかであり、
R100は、下記式(i)乃至(viii)のいずれかであり、
上記式(i)乃至(viii)において、*は、上記式(I)乃至(III)におけるA11と結合する結合手を表す。 - アルブミンと、下記式(IV)乃至(VI)のいずれかで示される、少なくとも1つの有機色素とアルブミンとが共有結合してなる結合体又はその塩を含む光学イメージング用造影剤であって、
前記光学イメージング用造影剤に含まれる前記有機色素のモル数に対して、前記結合体に結合している前記有機色素のモル数の割合が60%以上である光学イメージング用造影剤。
上記式(IV)乃至(VI)において、R11乃至R22は各々独立に同一でも異なっていてもよく、水素原子、炭素数1乃至3のアルキル基及びハロゲン原子のいずれかであり、
L11乃至L17は各々独立に同一でも異なっていてもよく、置換基を有していてもよいメチン基であり、該置換基はメチル基またはハロゲン原子であり、
A11及びA12は同一でも異なっていてもよく、炭素数1乃至10のアルキレン基であり、
Q11は、−OH、−CO2H、−S(=O)2OH、−P(=O)(OH)2、及び−OP(=O)(OH)2、のいずれかであり、
Xは、アルブミンのうち、1つのアミノ基を除いた構造を表す。 - 前記光学イメージング用造影剤に含まれる前記有機色素のモル数に対して、前記結合体に結合している前記有機色素のモル数の割合が70%以上である請求項15または16に記載の光学イメージング用造影剤。
- 前記式(IV)乃至(VI)におけるR11乃至R22が水素原子である請求項15乃至17のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤。
- 前記式(IV)乃至(VI)におけるL11乃至L17は無置換のメチン基である請求項15乃至18のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤。
- 前記式(IV)乃至(VI)におけるA11及びA12が炭素数2乃至5のアルキレン基である請求項15乃至19のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤。
- 前記式(IV)乃至(VI)におけるQ11が−S(=O)2OHである請求項15乃至20のいずれか一項に記載の光学イメージング用造影剤。
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