CN103308494B - 对中药中能被吸收的蛋白进行示踪的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对中药中能被吸收的蛋白进行示踪的方法。本发明的方法包括如下步骤：(1)将中药蛋白提取物用荧光基团进行标记；(2)将标记后的中药蛋白提取物灌胃给予实验模式动物；(3)采集所述实验模式动物的血清，浓缩后进行非变性蛋白电泳，垂直电场方向将凝胶切成若干胶块，检测每个胶块的荧光强度和扩散系数；(4)将筛选得到的胶块分别用胰蛋白酶进行胶内酶解，然后将酶解产物进行实时荧光监测下的分子筛层析，回收具有荧光信号的峰并进行质谱测定；(5)根据质谱测定的结果确定能被吸收的蛋白。本发明的方法必将为揭示中药大分子作用机理做出巨大贡献，并为促进中医药学发展奠定理论基础。

Description

对中药中能被吸收的蛋白进行示踪的方法

技术领域

本发明涉及一种对中药中能被吸收的蛋白进行示踪的方法。

背景技术

中药是天然的化学宝库，不但包含各种结构的小分子化合物，而且含有蛋白、多糖、糖肽等大分子成份，在中医理论的指导下多组分共同发挥作用。但由于检测方法的限制，对于中药大分子的活性示踪十分困难，甚至有些极为有效的中药因为其主要活性成份是难于分析检测的大分子物质而不能进行现代开发，如鹿茸、蝎毒等。

同小分子化合物相比，目前对大分子中药成份的认识还不够深入，现有的技术不能完全对大分子的中药成份进行示踪和综合分析，因而不能清晰阐明以大分子为有效物质的药物作用机理及药物代谢吸收分布等方面的数据。

在检测方法上，对小分子化合物的示踪和分析主要依赖各种色谱法，尤其是高效液相色谱法，该方法可稳定、准确、灵敏地对小分子化合物进行示踪和分析。然而对于大多数蛋白，多糖等大分子中药成份，由于其分子内缺少特异的检测标志和同生物样本背景中生物大分子的高度相似性，使得分离和检测都极为困难，因此针对小分子化合物的成熟方法并不能推广到蛋白、多糖等中药大分子成份。

在现代生化药物研究中，抗体检测和同位素标记常用做生物大分子的示踪手段。不过抗体检测分析需要制备单一分子的特异抗体，成本高，工作耗时，而且在大分子活性成份未被确定前，根本不能进行抗体制备和检测，因此难以对中药大分子进行一一特异标识。同位素标记法则操作危险，特异性差，半衰期短、不稳定、不能反映中药大分子在代谢过程中发生的结构变化。

因此，中医药研究领域迫切需要一种能有效追踪中药大分子有效成份、代谢途径、作用部位及分子结构变化的可普遍推广的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种对中药中能被吸收的蛋白进行示踪的方法。

本发明提供了一种对中药中能被吸收的蛋白进行示踪的方法，包括如下步骤：

(1)将中药蛋白提取物用荧光基团进行标记；

(2)将标记后的中药蛋白提取物灌胃给予实验模式动物；

(3)采集所述实验模式动物的血清，浓缩后进行非变性蛋白电泳，垂直电场方向将凝胶切成若干胶块，检测每个胶块的荧光强度和扩散系数，然后按照如下原则筛选胶块：荧光强度属于前45％以内且扩散系数属于后36％以内；

(4)将筛选得到的胶块分别用胰蛋白酶进行胶内酶解，然后将酶解产物进行实时荧光监测下的分子筛层析，回收具有荧光信号的峰并进行质谱测定；

(5)根据质谱测定的结果确定能被吸收的蛋白。

所述荧光基团具体可为异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)。

所述实验模式动物具体可为大鼠。

所述胶块的宽度可为0.4-0.6cm(所述宽度指的是所述胶块沿电场方向的长度)，具体可为0.5cm。

所述步骤(3)中，采集所述实验模式动物的血清的时间具体可为步骤(2)中所述灌胃给药后2小时。

所述步骤(3)中，具体可断头处死所述实验模式动物后采集血清。

所述实时荧光监测下的分子筛层析的相关参数如下：

采用安捷伦1200液相，G1321A荧光检测器，FITC于495nm激发，在525nm发射荧光，呈绿色，碳18柱(Kromasil，100-5250*4.6mm)；

洗脱液为甲醇与水的混合液，洗脱速度为0.5mL/min；

洗脱过程：在40min内，甲醇占洗脱液的体积比由5％线性上升至100％。

所述中药为鹿茸或以鹿茸为原料得到的其它中药。

所述中药为蚯蚓或以蚯蚓为原料得到的其它中药(如将蚯蚓粗提得到的蚯蚓纤溶酶)。

所述中药取自动物或植物。将用于制备所述中药的动物或植物命名为中药来源物，所述步骤(5)具体可为包括如下步骤：

①查找与质谱结果匹配且获自中药来源物的肽段序列(可采用Mascot搜索软件进行)，同时在检索序列时设置N末端FITC修饰，得到与质谱结果匹配度最高的氨基酸序列；

②将步骤①得到的氨基酸序列在NCBI数据库中检索获自中药来源物的蛋白质，得到匹配度最高的蛋白，即为中药中能被吸收的蛋白。

荧光标记技术是借助荧光探测方法在分子水平上进行实时检测的重要手段，这种技术灵敏性高，可视性强，而且对所研究的生物大分子或细胞干扰少。生物光子学是以光子做为信息载体，将该载体所携带的生物体内部的信息以成像或光谱的形式表现出来的技术，是一门将光子学和生物学相互融合而成的新学科。在分析生物大分子结合或裂解的方法中，荧光关联谱学(Fluorescence Correlation Spectroscopy，简称FCS)利用探测微区内发光分子的荧光涨落，获得有关荧光分子浓度，扩散速度等信息，分析出产生涨落的有关物理机制。同传统方法相比，其主要优点在于，不破坏研究体系的平衡状态，尤其适用于低浓度分子(甚至单分子)的探测。同时，它还能有效地降低体系背景噪声的影响，实现实时监测；该方法不需分离游离和结合的示踪物，因而具有快速、简单和准确等特点。

本发明的实施例1中选用鹿茸蛋白提取物作为中药蛋白类大分子活性示踪的示范研究。选择这种蛋白质混合物作为研究对像的原因是它是临床验证有效的口服动物药，而在口服给药过程中，必然会经过消化道相关酶的降解，发生结构上的改变，而目前还没有好的检测手段对其进行活性示踪。

本研究的最大优点是将荧光标记方法与质谱联用，并应用于中医药学领域的研究中，具有传统方法不可比拟的优势，消除了生物体内同源背景的干扰，并可以实现实时动态的分析，得到的质谱数据快速、准确，可通过数据库检索直接得到蛋白质的归属，从而得知其生物学功能；解释了中药大分子蛋白质口服后的吸收情况，填补了这一领域的空白，并证实，以往普遍认为蛋白质口服后直接被分解为氨基酸，不具有生物学功能的论点是错误的；对于未知组分的蛋白质，如本研究中的鹿茸蛋白，可以通过本方法进行活性示踪，而对于已知有效成分的物质，可以先对样品进行纯化，进行MS序列分析，得到一个标准数据，再进行口服给药，使用本方法得到的吸收入血的蛋白质，再进行MS分析，将得到的谱图及序列与标准数据比对，更能直接反应出其有效物质的作用行为。本研究建立了一个中药大分子蛋白质活性示踪的方法，属于方法学的内容，还有很大的拓展空间，期望能实现对所有口服天然药物进行活性示踪；口服吸收不仅是传统中药的服用方法，也是在临床应用时最易被接受并且最方便的给药方法，故本研究的最大意义在于实现对口服吸收的药物进行活性成分示踪，具有很好的应用价值和推广意义。

本发明的方法可以在很低的检测限上实时、动态观察中药大分子在人及动物体内的变化过程，包括分子的断裂、构象变化、与体内靶分子的结合、分离，甚至于中药大分子的吸收入血的浓度及在靶器官上分布的状态等信息，该方法具有传统方法不可比拟的优点，必将为揭示中药大分子作用机理做出巨大贡献，并为促进中医药学发展奠定理论基础。

附图说明

图1为PE及FITC-PE的组分确定及分子量分析的结果。

图2为FITC-PE在人工胃液中的稳定性分析的结果。

图3为FITC-PE在人工肠液中的稳定性分析的结果。

图4为肠囊外翻实验观察FITC-PE透过肠粘膜吸收情况的结果-荧光强度。

图5为肠囊外翻实验观察FITC-PE透过肠粘膜吸收情况的结果-非变性蛋白电泳。

图6为实施例1中，药物最大吸收时间点的确定的结果。

图7为实施例1中，血中游离及结合荧光标记蛋白的确定的结果。

图8为实施例1中，边缘凝胶以及11个胶块的荧光强度及扩散系数。

图9为实施例1中，荧光实时监测下的分子筛层析图谱。

图10为实施例1中，2号荧光峰的一级质谱分析结果。

图11为质荷比1883.389的肽段的二级质谱分析图谱。

图12为质荷比1925.515(II)的肽段的二级质谱分析图谱。

图13为LK及FITC-LK的组分确定及分子量分析的结果。

图14为FITC-LK在人工胃液中的稳定性分析的结果。

图15为FITC-LK在人工肠液中的稳定性分析的结果。

图16为肠囊外翻实验观察FITC-LK透过肠粘膜吸收情况的结果-荧光强度。

图17为肠囊外翻实验观察FITC-LK透过肠粘膜吸收情况的结果-非变性蛋白电泳。

图18为实施例2中，药物最大吸收时间点的确定的结果。

图19为实施例2中，血中游离及结合荧光标记蛋白的确定的结果。

图20为实施例2中，边缘凝胶以及11个胶块的荧光强度及扩散系数。

图21为实施例2中，荧光实时监测下的分子筛层析图谱。

图22为实施例2中，1号荧光峰的一级质谱分析结果。

图23为质荷比920.705(I)的肽段的二级质谱分析图谱。

图24为质荷比936.690(II)的肽段的二级质谱分析图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。蚯蚓：为动物蚯蚓的全部身体。鹿茸：为鹿科动物尚未骨化的幼角。荧光关联谱软件：DMP(Difusion Measurement Package)(版本号：共焦专用版，olympus，日本)。异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)：Sigma，美国，产品目录号为F7250。雄性Wistar大鼠：体重250g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(动物证号：SCXK(京)2006-0009)。实施例中的非变性蛋白电泳均为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用4％的浓缩胶和12.6％的分离胶。

实施例1、对鹿茸中能被吸收的蛋白进行示踪

一、鹿茸提取物的制备

1、提取

梅花鹿鲜鹿茸500g，洗净，锯成小块，加入醋酸水溶液(0.006M，pH3.5)，4℃匀浆；然后离心(2-4℃、8500r/min、20min)取上清，在上清中加入99.9％(体积比)乙醇使其直至乙醇浓度达到65％(体积比)，4℃搅拌4h；然后离心(2-4℃、8500r/min、20min)取上清，将上清进行55℃真空旋转蒸发，得到的干物质即为鹿茸粗提物。

2、分离

将鹿茸粗提物进行分子筛层析(除去未标记的EITC和盐类小分子)，在4℃层析柜中进行，具体参数如下：

采用Sephadex G-25装填层析柱(Pharmacia，17-0360-01)，100cm×1cm；

用蒸馏水洗脱，流速为0.5ml/min；

280nm监测，收集紫外吸收值(OD280)为5000以上的过柱后溶液。

冻干，得到鹿茸提取物(用PE表示)。

采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测PE的总蛋白含量，PE的总蛋白含量为21.12％(质量百分含量)。

鹿茸蛋白粗提物为黄白色粉末，易溶于水，易潮解，故冻干后在-20℃冰箱保存。

二、荧光素标记鹿茸蛋白

1、称取鹿茸提取物120mg，用PBS缓冲液(pH9.5，0.01M)配制成蛋白浓度为20mg.ml^-1的溶液，于搅拌器上边搅拌边缓缓加入FITC，使蛋白与FITC的质量配比为1∶0.01，4℃孵育24h。

2、将完成步骤1的体系进行分子筛层析(除去未标记的FITC和盐类小分子)，参数如下：

采用Sephadex G-25装填层析柱(Pharmacia，17-0360-01)，100cm×1cm；

用PBS缓冲液(0.01M，pH7.2)洗脱，分别于495nm、280nm处测O.D.值，收集OD280大于5000且OD495大于0.6的过柱后溶液，冻干，即为荧光素标记鹿茸蛋白(用FITC-PE表示)。

根据标记率公式： $F/P=2.8\×\frac{0.D.280\mathrm{nm}-0.35\×0.D.495\mathrm{nm}}{0.D.495\mathrm{nm}}$ 计算标记率(F/P在1-2之间为充分标记)。标记率为1.11，即充分标记。

三、PE及FITC-PE的组分确定及分子量分析

分别将PE和FITC-PE进行非变性蛋白电泳，上样量均为100μg、上样体积为均为20μL。电泳结束后，先用G-box在488nm下观测荧光条带(见图1B)，再经考马斯亮蓝染色在595nm下观察蛋白条带(见图1A)。图1中，泳道1对应蛋白分子量marker，泳道2对应PE，泳道3对应FITC-PE。依据荧光条带、蛋白条带与marker条带的相对位置确定被标记荧光蛋白的分子量。

从图1A可以看出，鹿茸提取物含有5条蛋白带，依次编号为A、B、C、D、E，分子量依次约为160KD、67KD、45KD、25KD和17.8KD，标记对蛋白组分无明显影响。从图1B可以看到，FITC-PE中，A、C、D、E被标记了荧光。

四、离体实验及半离体实验

1、FITC-PE在人工胃液及人工肠液中的稳定性分析

(1)FITC-PE在人工胃液中的稳定性分析

人工胃液：将1.64mL 10％盐酸溶液和1g胃蛋白酶加入水中并用水定容至100mL。

将FITC-PE溶解于人工胃液中，使蛋白浓度为20mg·mL^-1，于37℃培养箱中反应，反应时间分别为30min、60min、120min后取样进行非变性蛋白电泳。

电泳结束后，先用G-box在488nm下观测荧光条带(见图2B)，再经考马斯亮蓝染色在595nm下观察蛋白条带(见图2A)。图2中，泳道1对应蛋白分子量marker，泳道2对应蛋白浓度为20mg·mL^-1的FITC-PE水溶液，泳道3对应反应时间为30min的样本，泳道4对应反应时间为60min的样本，泳道5对应反应时间为120min的样本，泳道6对应人工胃液。

从图2A可以看到，经人工胃液作用后FITC-PE中的蛋白含量随作用时间延长而减少，对应图2B的荧光条带强度也逐渐减弱。其中，胃蛋白酶出现的蛋白条带位置与蛋白D的位置相近，蛋白D难以从图2A上识别，但是从图2B中可观察到其存在。

(2)FITC-PE在人工肠液中的稳定性分析

人工肠液：取磷酸二氢钾0.68g，加水50mL，用0.4％氢氧化钾溶液调pH至6.8，得到A液；取胰蛋白酶1g加水适量使溶解，得到B液；将A液和B液混合后用水定容至100mL。

将FITC-PE溶解于人工肠液中，使蛋白浓度为40mg·mL^-1，于37℃培养箱中反应，反应时间分别为30min、60min、120min后取样进行非变性蛋白电泳。

电泳结束后，先用G-box在488nm下观测荧光条带(见图3B)，再经考马斯亮蓝染色在595nm下观察蛋白条带(见图3A)。图3中，泳道1对应蛋白分子量marker，泳道2对应蛋白浓度为40mg·mL^-1的FITC-PE水溶液，泳道3对应反应时间为30min的样本，泳道4对应反应时间为60min的样本，泳道5对应反应时间为120min的样本，泳道6对应人工肠液。

从图3A可以看到，经人工肠液作用后FITC-PE中的蛋白含量随作用时间延长而减少(但主要组分无明显变化)，对应图2B的荧光条带强度也逐渐减弱(减弱强度与时间关系不明显)。荧光蛋白A的荧光带消失，说明人工肠液可能淬灭了荧光蛋白A的荧光，但其所对应的蛋白依然存在。

2、肠囊外翻实验观察FITC-PE透过肠粘膜吸收情况

实验组：雄性Wistar大鼠禁食12h，乙醚麻醉后打开腹腔，Treiz韧带以下5cm取两段小肠肠段，长度均为10cm，用37℃生理盐水冲洗小肠粘膜内侧直至无污物，将小肠外翻，粘膜向外，浆膜侧向内，于37℃生理盐水中孵育20min(通95％O₂及5％CO₂)，孵育后用生理盐水冲洗数次。将小肠一端扎紧，另一端接到圆口中空玻璃管上，肠囊内加入台氏液1mL，浸泡于5mL含FITC-PE的37℃台氏液(蛋白含量为20mg·mL^-1)中(通95％O₂及5％CO₂)，分别于0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min在肠囊内取样100μL(同时回补同体积台氏液)，置于玻璃底96孔板中，激光共聚焦显微镜488nm下检测荧光强度；1h后，收集肠囊内所有台氏液。

空白对照组：不加入FITC-PE，其它同实验组，1h后，收集肠囊内所有台氏液。

实验组各个时间的样本用激光共聚焦显微镜488nm进行点扫描，荧光强度见图4(4只大鼠的平均值，与0min相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。0min时的荧光为血液的本底荧光，从20min起肠囊中台氏液有荧光出现，40min时荧光最强，60min后仍持续吸收，说明FITC-PE可透过小肠壁吸收。

将实验组1h后的样本和空白对照组1h后的样本进行非变性蛋白电泳。电泳结束后，先用G-box在488nm下观测荧光条带(见图5B)，再经考马斯亮蓝染色在595nm下观察蛋白条带(见图5A)。图5中，泳道1对应蛋白分子量marker，泳道2对应空白对照组1h后的样本，泳道3对应实验组1h后的样本，泳道4对应蛋白浓度为20mg·mL^-1的FITC-PE水溶液。从图5A中可以看出，与空白对照组相比，实验组出现三个新条带，通过与图5B比对，鉴定其为组分C、D、E，该结果提示，分子量小于45KD的蛋白可透过肠壁吸收。

五.整体实验

1、药物最大吸收时间点的确定

实验组：给每只Wistar大鼠灌胃200mg FITC-PE；

对照组：给每只Wistar大鼠灌胃200mg FITC。

于各时间点眼眶取血，用激光共聚焦显微镜488nm进行点扫描，得到各个样本的荧光强度，以确定药物的最大吸收时间点。

实验组各时间点血样的荧光强度见图6A(3只大鼠的平均值，与0min相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。灌胃给药后，最大吸收时间为2小时。

对照组各时间点血样的荧光强度见图6B(3只大鼠的平均值，与0min相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。

2、血中游离及结合荧光标记蛋白的确定

实验组和对照组的处理同步骤1。

2小时后眼眶取血，分离血清，用激光共聚焦显微镜488nm观察并用DMP软件进行点扫描，得出荧光物质的扩散系数。

结果见图7(3只大鼠的平均值，与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。实验组荧光物质的扩散系数远小于对照组荧光物质的扩散系数，即实验组的荧光物质的分子量显著大于对照组荧光物质的分子量。结果表明，吸收入血的不是单纯的FITC分子，而是FITC-PE。

3、对鹿茸中能被吸收的蛋白进行示踪

(1)将1只Wistar大鼠灌胃200mgFITC-PE，2小时后断头取血，分离血清，使用氮空一体机浓缩血清样品，浓缩后的血清命名为FITC-serum。

(2)将FITC-serum进行非变性蛋白电泳。电泳结束后将凝胶垂直电场方向由近端(近端指的是点样孔端)至远端(边缘)切成11个0.5cm宽的胶块(依次为gel-1至gel-11，11个样本)，置于共聚焦专用小皿中，用激光共聚焦显微镜488nm观察并用DMP软件进行点扫描，得到各个胶块样本的荧光强度以及荧光物质的扩散系数。

边缘凝胶以及11个胶块的荧光强度及扩散系数见图8。

选择满足如下条件的荧光物质(荧光较强且分子量较大)：荧光强度在11个样本中的排前5个(前45％)且扩散系数在11个样本中排后4个(后36％)。gel-3、gel-4、gel-8满足上述条件。

(3)分别收集满足条件的胶块，使用胶内胰酶(胰蛋白酶)消化试剂盒(Thermo，89871)进行胶内酶解，得到的产物用进行分子筛层析，并采用荧光检测器实时监测。

分子筛层析和荧光检测的相关参数如下：

采用安捷伦1200液相，G1321A荧光检测器，FITC于495nm激发，在525nm发射荧光，呈绿色，碳18柱(Kromasil，100-5250*4.6mm)；

洗脱液为甲醇与水的混合液，洗脱速度为0.5mL/min；

洗脱过程：在40min内，甲醇占洗脱液的体积比由5％线性上升至100％。

结果见图9(A为上述步骤得到的gel-3的胶内酶解产物的HPLC荧光谱，B为将Wistar大鼠代替用FITC-PE灌胃的Wistar大鼠进行以上步骤得到的与gel-3对应的胶内酶解产物的HPLC荧光谱)。gel-3的胶内酶解产物显示两个荧光峰(见图9A中的标注)。

(4)将2号荧光峰(保留时间为32min-32.5min)用飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)(布鲁克，美国)进行一级质谱分析，质谱图见图10。

选择其中信噪比大于100的两个肽段，其质荷比(m/z)分别为：1883.389(I)、1925.515(II)，对这两个峰用飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)(布鲁克，美国)进行二级质谱分析。

质荷比1883.389的肽段的二级质谱分析图谱见图11，使用Mascot搜索软件查找在动物库中与该质谱图匹配的肽段序列，同时在检索序列时设置N端FITC修饰，结果得到与质谱图匹配度最高的氨基酸序列为：MGSASEMSGECCR(序列1)。

为质荷比1925.515(II)的肽段的二级质谱分析图谱见图12，使用Mascot搜索软件查找在动物库中与该质谱图匹配的肽段序列，同时在检索序列时设置N端FITC修饰，结果得到与质谱图匹配度最高的氨基酸序列为：AMENGEIDLASEEK(序列2)。

将序列于NCBI数据库中梅花鹿(cervus nippon)的蛋白库中检索，得到匹配可能性比较高的蛋白，序列1属于成纤维细胞生长因子10(Fibroblast growth factor10)、序列2属于肌联蛋白(titin)。

实施例2、对蚯蚓中能被吸收的蛋白进行示踪

蚯蚓纤溶酶：购自上海国源生物技术有限公司，批号：20080312；纤溶酶活性大于12000U/mg，外观性状为冻干粉末。

一、荧光素标记蚯蚓蛋白

同实施例1的步骤二。

收集过柱后的洗脱液，即为含有标记的荧光蛋白(FITC-LK)的溶液。

将收集的过柱后的洗脱液冻干，-20℃保存。

二、PE及FITC-LK的组分确定及分子量分析

分别将LK和FITC-LK进行非变性蛋白电泳，上样量均为100μg、上样体积为均为20μL。电泳结束后，先用G-box在488nm下观测荧光条带(见图13B)，再经考马斯亮蓝染色在595nm下观察蛋白条带(见图13A)。图13中，泳道1对应蛋白分子量marker，泳道2对应LK，泳道3对应FITC-LK。依据荧光条带、蛋白条带与marker条带的相对位置确定被标记荧光蛋白的分子量。

从图13A可以看出，蚯蚓提取物含有10条蛋白带，依次编号为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，分子量依次约为450KD、450KD、250KD、100KD、50KD、30KD、20KD、17KD、12.4KD、小于12.4KD，标记对蛋白组分无明显影响。从图13B可以看到，FITC-LK中，A、B、G、H、I被标记了荧光。

三、离体实验及半离体实验

1、FITC-LK在人工胃液及人工肠液中的稳定性分析

(1)FITC-LK在人工胃液中的稳定性分析

同实施例1的步骤四的1的(1)。

电泳结束后，先用G-box在488nm下观测荧光条带(见图14B)，再经考马斯亮蓝染色在595nm下观察蛋白条带(见图14A)。图14中，泳道1对应蛋白分子量marker，泳道2对应蛋白浓度为20mg·mL^-1的FITC-LK水溶液，泳道3对应反应时间为30min的样本，泳道4对应反应时间为60min的样本，泳道5对应反应时间为120min的样本，泳道6对应人工胃液。

从图14A可以看到，经人工胃液作用后FITC-LK中的蛋白含量随作用时间延长而减少，但组分保持不变，对应图14B的荧光条带强度也逐渐减弱。

(2)FITC-LK在人工肠液中的稳定性分析

同实施例1的步骤四的1的(2)。

电泳结束后，先用G-box在488nm下观测荧光条带(见图15B)，再经考马斯亮蓝染色在595nm下观察蛋白条带(见图15A)。图15中，泳道1对应蛋白分子量marker，泳道2对应蛋白浓度为40mg·mL^-1的FITC-LK水溶液，泳道3对应反应时间为30min的样本，泳道4对应反应时间为60min的样本，泳道5对应反应时间为120min的样本，泳道6对应人工肠液。

从图15A可以看到，经人工肠液作用后FITC-LK中的蛋白含量随作用时间延长而减少，但主要组分保持不变，对应图15B的荧光条带强度也逐渐减弱，其减弱强度与时间关系不明显。

2、肠囊外翻实验观察FITC-LK透过肠粘膜吸收情况

同实施例1的步骤四的2。

实验组各个时间的样本通过激光共聚焦显微镜检测的荧光强度见图16(4只大鼠的平均值，与0min相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。0min时的荧光为血液的本底荧光，从20min起肠囊中台氏液有荧光出现，40min时荧光最强，60min后仍持续吸收，说明FITC-LK可透过小肠壁吸收。

将实验组1h后的样本和空白对照组1h后的样本进行非变性蛋白电泳。电泳结束后，先用G-box在488nm下观测荧光条带(见图17B)，再经考马斯亮蓝染色在595nm下观察蛋白条带(见图17A)。图17中，泳道1对应蛋白分子量marker，泳道2对应空白对照组1h后的样本，泳道3对应实验组1h后的样本，泳道4对应蛋白浓度为20mg·mL^-1的FITC-LK水溶液。从图17A中可以看出，与空白对照组相比，实验组出现三个新条带，通过与图17B比对，鉴定其为组分G、H、I，该结果提示，分子量小于45KD的蛋白可透过肠壁吸收。通过17A也可以看到J蛋白也可以透过肠壁吸收。

四、整体实验

1、药物最大吸收时间点的确定

同实施例1的步骤五的1。

实验组各时间点血样的荧光强度见图18A(3只大鼠的平均值，与0min相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。灌胃给药后，从30min起可以在血清中检测到荧光信号，2h时荧光强度达到峰值，荧光物质可以在血液中存在10h。

对照组各时间点血样的荧光强度见图18B(3只大鼠的平均值，与0min相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。

2、血中游离及结合荧光标记蛋白的确定

实验组和对照组的处理同步骤1。

2小时后眼眶取血，分离血清，使用激光共聚焦显微镜进行点扫描，并用自带的DMP软件得出荧光物质的扩散系数。

结果见图19(3只大鼠的平均值，与对照组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001)。实验组荧光物质的扩散系数远小于对照组荧光物质的扩散系数，即实验组的荧光物质的分子量显著大于对照组荧光物质的分子量。结果表明，吸收入血的不是单纯的FITC分子，而是FITC-LK。

3、对蚯蚓中能被吸收的蛋白进行示踪

同实施例1的步骤五的3。

边缘凝胶以及11个胶块的荧光强度及扩散系数见图20。gel-2、gel-3、gel-4满足上述条件。

胶内酶解产物的HPLC荧光谱见图21(A为上述步骤得到的gel-2的胶内酶解产物的HPLC荧光谱，B为将Wistar大鼠代替用FITC-PE灌胃的Wistar大鼠进行以上步骤得到的与gel-2对应的胶内酶解产物的HPLC荧光谱)。gel-2的胶内酶解产物显示一个荧光峰(见图21A中的标注)。

将1号荧光峰(保留时间为27.7min-28.2min)用飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)(布鲁克，美国)进行一级质谱分析，质谱图见图22。

选择其中信噪比大于100的两个肽段，其质荷比(m/z)分别为：920.705(I)、936.690(II)，对这两个峰用飞行时间质谱平台(MALDI-TOF)(布鲁克，美国)进行二级质谱分析。

质荷比920.705(I)的肽段的二级质谱分析图谱见图23，使用Mascot搜索软件查找在动物库中与该质谱图匹配的肽段序列，同时在检索序列时设置N端FITC修饰，结果得到与质谱图匹配度最高的氨基酸序列为：VVSSGLG(序列3)。

质荷比936.690(II)的肽段的二级质谱分析图谱见图24，使用Mascot搜索软件查找在动物库中与该质谱图匹配的肽段序列，同时在检索序列时设置N端FITC修饰，结果得到与质谱图匹配度最高的氨基酸序列为：QLSQTRG(序列4)。

将序列于NCBI数据库中赤子爱胜蚓(eisenia fetida)的蛋白库中检索，得到匹配可能性比较高的蛋白，序列1属于成纤溶酶组分A(fibrinolytic enzyme componentA)、序列2属于纤溶蛋白酶(fibrinolytic protease 1)。

Claims (5)

1.一种对中药中能被吸收的蛋白进行示踪的方法，包括如下步骤：

（1）将中药蛋白提取物用荧光基团进行标记；

（2）将标记后的中药蛋白提取物灌胃给予实验模式动物；

（3）采集所述实验模式动物的血清，浓缩后进行非变性蛋白电泳，垂直电场方向将凝胶切成若干胶块，检测每个胶块的荧光强度和扩散系数，然后按照如下原则筛选胶块：荧光强度属于前45%以内且扩散系数属于后36%以内；

（4）将筛选得到的胶块分别用胰蛋白酶进行胶内酶解，然后将酶解产物进行实时荧光监测下的分子筛层析，回收具有荧光信号的峰并进行质谱测定；

（5）根据质谱测定的结果确定能被吸收的蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光基团为异硫氰酸荧光素。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述实验模式动物为大鼠。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述中药为鹿茸或蚯蚓。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述胶块的宽度为0.4-0.6cm。