KR102096469B1

KR102096469B1 - 인도시아닌그린이 결합된 만노실 혈청알부민 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 광학영상 프로브 및 키트

Info

Publication number: KR102096469B1
Application number: KR1020140105448A
Authority: KR
Inventors: 김현구; 정재민; 이윤상
Original assignee: 주식회사 셀비온
Priority date: 2014-08-13
Filing date: 2014-08-13
Publication date: 2020-04-02
Also published as: US10159756B2; US20160045621A1; KR20160020296A

Abstract

본 발명은 수술 중에 사용되는 형광염색시약인 인도시아닌 그린의 단점 예를 들어, 외부 빛에 대한 낮은 안정성 및 생체 내 안정성 저하를 극복하고자, 만노실 혈청알부민에 인도시아닌 그린을 결합시킨 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 광학영상 프로브 및 상기 프로브를 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

인도시아닌그린이 결합된 만노실 혈청알부민 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 광학영상 프로브 및 키트 {Complex of Mannosyl Serum Albumin, Method of Preparing the Same, Optical Imaging Probe and Kit Comprising the Same}

인도시아닌 그린(Indocianin green, ICG)은 근적외선 형광 다이(NIR)로, 미국 FDA(Food and Drug Administration)에서 림프계 뿐 아니라 심장, 간 혈관 시스템의 진단에 사용 허가를 받은 물질이다. 특히, 인도시아닌 그린은 유방암의 조기 진단을 위한 전이성 림프노드의 이미징 및 감시림프절(sentinel lymph node)의 맵핑에 우수한 프로브로 알려져 있다.

감시림프절은 원발 종양에서 가장 가까이 위치한 림프절로서, 일차 종양으로부터 암세포의 전이가 가장 먼저 이루어지는 림프절이기 때문에, 감시림프절은 고형 종양의 국소적 림프절의 전이 상태를 나타내는 좋은 지표로 알려져 있다. 이에 따라, 감시림프절에 암세포 전이가 없다면 다른 림프절에도 전이가 없을 것이라는 것을 의미하여, 더 이상 수술을 진행하지 않게 된다. 즉, 흑색종이나 유방암에서 감시림프절을 찾아 수술적으로 적용하게 되면 불필요한 림프절 절제를 피할 수 있다는 것을 의미한다.

이러한 인도시아닌 그린은 친수성이 낮고, 광안정성이 낮으며, 광자 수율이 낮고, 감도가 떨어지는 단점을 가지고 있다. 또한, 인도시아닌 그린은 비특이적 응집에 취약하고, 외부 광, 용매 및 온도 변화에 의해 화학적으로 분해되는 단점이 있으며, 낮은 분자량과 소수성 특징 때문에 혈청 단백질로 잘 흡수되어 신장을 거쳐 제거된다는 문제점이 있다. 혈액 내의 인도시아닌 그린의 반감기는 대략 2~4분 정도 이기 때문에, 진단 효율을 높이기 위하여, 혈액 내에서 반감기가 긴 인도시아닌 그린 기반 프로브의 개발이 요구되고 있다.

더욱이, 인도시아닌 그린은 체내에서 쉽게 확산되어 버리기 때문에, 인도시아닌 그린 이미징을 이용한 감시림프절의 절개 시술은 30분 내에 수행되어야 하였으며, 깊은 림프절은 찾을 수 없었던 단점이 있었다. 이러한 단점을 극복하고자, 나노 물질 기반 인도시아닌 그린 프로브, 예를 들면, 나노입자, 리포솜, 마이셀 등이 연구되어 왔으며, 나노파티클에 인도시아닌 그린을 포집하거나, 폴리머, 인지질 및 칼슘 포스페이트로 구성된 마이셀 등을 이용하여, 인도시아닌 그린의 in vivo 및 in vitro에서의 안정성을 증가시킨 연구가 있어왔다(A.K Kirchherr et al. Mol Pharm. 6:480, 2009, V.B. Rodriguez et al. J Biomed Opt. 13:14, 2008: E.I. Altinoglu et al. Nano. 2:2075, 2008). 인도시아닌 그린을 나노파티클에 포집함으로써, 외부 광선 및 온도에 대한 물리화학적 안정이 현저히 증가되었으나, 인도시아닌 그린 프로브를 임상 진단에 적용하는 데 있어서, 영상화 하고자 하는 부위로 탐지하는 부위 특이성은 가지고 있지 않았다.

또 다른 림프계 영상은 대표적으로 만노실 혈청알부민 부위에 치료용 방사성 동위원소를 결합시켜 만든 림프절 영상 프로브로 핵의학분야에서 림프절을 영상화하여 진단하는데 중요하게 사용되고 있다(G. Mariani, et al. J.Nucl.Med, 42:2001). 특히, 유방암이나 흑색종 등에서 종양에 방사성 콜로이드를 주사하고 림프절에 섭취된 후 이동하는 가장 가까운 림프절인 감시 림프절을 영상화하고 이를 절제하여 생검을 하여 전이 여부를 판별함으로써, 수술시 과도한 절제를 피할 수 있는 장점을 지니고 있다. 그러나, 방사성 동위원소가 결합된 프로브는 수술 전 위치 및 방향을 결정하는 데 사용되는 프로브로서 수술 중 실시간 영상 이미지 확인에는 사용하지 못한다는 단점을 지니고 있다. 따라서, 수술 중 실시간 영상 이미지 확인에 사용되는 프로브의 개발이 필요한 시점이다.

이러한 기술적 배경하에서, 본 출원의 발명자들은 만노즈 결합 혈청알부민과의 복합체 형성을 통해 생체 내에서 안전성이 떨어지던 인도시아닌 그린의 단점을 극복하고, 림프절에 많이 존재하는 대식세포를 탐지하여 영상화함으로써 수술 중 주입을 통해 림프절 위치를 정확하게 탐지가 가능함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 종래의 체내의 안정성이 떨어지던 인도시아닌 그린의 단점을 극복하고 감시림프절 탐색용 광학영상 프로브로서 사용 가능한 만노실 혈청알부민 및 인도시아닌 그린 포함 복합체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 광학영상 프로브 및 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 만노실 혈청알부민에 인도시아닌 그린이 결합된 복합체에 관한 것이다:

[화학식 1]

(Man) m-L-SA - (ICG)n

상기 식에서, Man은 만노실기이며, L은 링커로서, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, SA는 혈청알부민이고, ICG는 인도시아닌 그린이고, m은 1∼42의 정수이며, n은 1∼34의 정수이다.

본 발명은 또한, 상기 복합체를 포함하는 감시림프절 탐색용 광학영상 프로브에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 상기 프로브를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명은 더욱이, 다음 단계를 포함하는 제1항의 만노실 인도시아닌 그린 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다:

(a) 만노즈와 혈청알부민을 반응시켜 만노실 혈청알부민을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 만노실 혈청알부민에 인도시아닌 그린을 결합시키는 단계.

본 발명에 따른 복합체는 인도시아닌 그린의 체내 안정성을 향상시키고, 인도시아닌 그린의 짧은 반감기를 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 수술 중 림프절 내의 대식세포를 탐지함으로써, 외과 분야에서 수술 중 림프절 감시 영상 프로브로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 MSA를 제조하기 위한 반응을 진행하기 위한 과정을 나타낸 도면이다.
도 2는 정제된 MSA를 코마시블루로 염색하여 MSA의 존재를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 BCA Assay를 통해 수득한 MSA를 정량하기 위해 사용된 표준 커브를 나타낸 도면이다.
도 4는 DLS(Dynamic light scattering)를 통해 측정된 HAS의 평균 크기를 나타낸 도면이다.
도 5는 DLS(Dynamic light scattering)를 통해 측정된 MSA의 평균 크기를 나타낸 도면이다.
도 6은 UV 스펙트로미터를 사용하여 MSA에 대한 UV 피크 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 도 6의 사각 표시 부분을 확대하여 나타낸 도면이다.
도 8은 ITLC-SG(Instant Thin Layer Chromatography-Silica Gel)에서 ^99mTc-MSA 제조 후 표지효율(Labeling efficiency)을 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9는 (a) PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, sigma, USA)에 활성화된 U937 세포, (b) ICG:MSA와 ICG를 각각 활성화된 U937 세포에 처리하고 세포 분포를 모니터링한 결과 및 (c) ICG:MSA와 ICG를 주입 후 체내분포를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 만노실 혈청알부민에 인도시아닌 그린이 결합된 복합체에 관한 것이다:

[화학식 1]

(Man)m-L-SA-(ICG)n

본 발명에 따른 인도시아닌 그린 및 만노실 혈청알부민 복합체는 수술 중 이미징에 사용 가능한 인도시아닌 그린이 가지던 낮은 안정성에 대한 단점을 극복하여 안정성을 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 종래 통상의 혈청알부민과 결합시 해결되지 못하였던 림프절 중 다수 존재하는 대식세포를 타겟한 이미징이 가능하도록 함으로써, 외과분야에서 수술 중 림프절 감시 영상 프로브로서 유용하게 사용 가능한 잠재성을 가지고 있다.

상기 혈청알부민(화학식 1 중 SA)은 인간 혈청알부민으로 분자량이 66,462이고, 분자의 장축이 8 nm이고 단축이 6 nm이며, 등전점 (Isoelectric Point, IEP)이 4.8인 단백질이다. 또한, 혈장단백질의 50% (4 g/dl)를 구성하고 있으며, 단일 폴리펩타이드 체인으로 구성되어 있다.

상기 혈청알부민은 환원형 또는 비환원형일 수 있으며, 바람직하게 티올기(-SH)를 포함하는 환원형 혈청알부민일 수 있다. 상기 혈청알부민은 17 개의 다이설파이드 결합을 가지고 있어서 공지의 환원제를 이용하여 환원시킬 수 있으며, 환원시 2~34개의 티올기가 생성될 수 있다. 이후, 상기 티올기는 인도시아닌 그린이 결합될 수 있는 작용기가 될 수 있다.

상기 티올기를 포함하는 환원형 혈청알부민은 산소 조건하에서 안정할 수 있고, pH 6미만의 낮은 pH에서 안정성이 증가될 수 있으며, 액체 질소 온도로 급속히 냉각시키면 티올기의 오염 또는 손실없이 장시간 보관이 가능하다.

만노실 결합 혈청알부민은 만노실과 혈청알부민이 직접 또는 링커를 이용하여 결합함으로써 수득된다. 상기 링커는 예를 들어, 치환 또는 비치환의 C₁∼C₁₀의 알킬기, C₄∼C₁₀의 아릴기, 모노펩타이드, 다이펩타이드, 올리고펩타이드, C₄∼C₁₀의 사이클로알킬기, 벤질기, 티오에테르, 에테르, 아민, 하이드라지드, 오탄당, 육탄당 및 알코올이 이루는 그룹 중 선택된 하나 또는 그 이상일 수 있으며, 바람직하게 페닐기일 수 있다.

하기 구조식 1은 페닐기를 링커로 이용한 페닐만노실과 결합한 혈청알부민을 나타낸 것이다. 1~42개의 만노실 또는 링커를 포함한 만노실이 포함될 수 있다.

[구조식 1]

구조식 1의 페닐만노실과 결합한 혈청알부민은 하기 반응식 1을 통해 제조될 수 있으며, 예를 들어 페닐기 말단의 티오시아노(SCN) 부분과 혈청알부민의 아미노기를 결합시켜 안정한 상태의 페닐만노실을 제조할 수 있다:

[반응식 1]

인도시아닌 그린은 예를 들어, 만노실 혈청알부민에 직접 결합하거나 티올기에 결합할 수 있다. 인도시아닌 그린이 결합된 만노실 혈청알부민은 대식세포의 만노실 수용체에 강력하게 결합하고 림프절에 축적이 되어 림프계 영상으로 사용할 수 있으며, 특히 혈청알부민의 크기가 6~8 nm로서 현재 사용되는 콜로이드형 방사성 의약품보다 크기가 작아 림프절내로의 섭취가 빠르다.

경우에 따라서, 상기 복합체는 금속성 방사성동위원소가 추가로 결합하여, 하기 화학식 2로 표시될 수 있다:

[화학식 2]

(Man) m-L- SA - (ICG)n-RI

상기 식에서, Man은 만노실기이며, L은 링커로서, 존재하거나 존재하지 않을 수 있으며, SA는 혈청알부민이고, ICG는 인도시아닌 그린이고, RI는 금속성 방사성동위원소이며, m은 1∼42의 정수이고, n은 1∼34의 정수이다.

이와 같이, 인도시아닌 그린 이외에 금속성 방사성동위원소를 추가로 결합한 복합체는 인도시아닌 그린을 통한 수술 중 실시간 타겟 영상 이미징 이외에도, 타겟의 위치 및 방향 역시 결정할 수 있으므로 림프계 영상 프로브로서 더욱 효과적이다.

이 때, 상기 혈청알부민은 환원형 만노실기 결합된 혈청알부민일 수 있으며, 상기 혈청알부민 중 이황화 결합 S-S이 티올기로 환원된 형태일 수 있다.

또한, 상기 금속성 방사성 동위원소는 ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ⁶⁷Cu, ²¹²Pb, ²¹²Bi 및 ¹⁰⁹Pd으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 특히 ⁹⁹mTc 또는 ¹⁸⁸Re이 바람직하다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 다음 단계 (a) 만노즈와 혈청알부민을 반응시켜 만노실 혈청알부민을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 제조된 만노실 혈청알부민에 인도시아닌 그린을 결합시키는 단계를 포함하는 만노실 인도시아닌 그린 복합체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 (a) 단계에서, 앞서 언급한 만노즈를 혈청알부민과 반응시켜 만노실 혈청알부민을 제조할 수 있다. 바람직하게, IME-티오만노즈 (2-imino-2-methoxyethyl thio mannose)와 혈청알부민을 반응시켜 만노실 혈청알부민을 제조할 수 있다.

경우에 따라서, 혈청알부민 내의 디설파이드 결합을 환원제로 환원하여 티올기를 생성함으로써 디설파이드 환원형 만노실 결합 혈청알부민을 제조할 수 있다. 혈청알부민이 티올기로 환원된 경우, 페닐기를 링커로 이용한 페닐만노실과 결합한 혈청알부민은 구조식 2로 표시되는 구조를 가질 수 있다.

[구조식 2]

상기 환원제는 주로 티올기가 포함된 환원제로서, 예를 들어 2-머캅토에탄올, 디티오쓰레이톨, 티오글리콜레이트, 시스테인 LC 글루타티온이 사용되며, 이 외에 이 분야에서 사용되는 티올기가 함유된 환원제를 사용할 수 있다. 추가로 킬레이트제를 첨가하여 잔류하는 금속 이온을 제거함으로써 생성된 화합물의 안정성을 높일 수 있다.

구체적 반응식은 다음과 같다.

[반응식 2]

이후, 상기 단계 (b)에서 만노실 혈청알부민에 인도시아닌 그린을 결합시킨다. 상기 단계 (b)에서, 혈청알부민과 인도시아닌 그린을 약 10mM의 포스페이트 버퍼 중에서 1:5 내지 1:15, 바람직하게 1:5 내지 1:10의 몰비로 반응시켜 만노실 혈청알부민에 인도시아닌 그린이 결합된 복합체를 제조할 수 있다. 전술한 범위 내의 만노실 혈청알부민 및 인도시아닌 그린을 포함하는 경우 안정적으로 결합된 만노실 혈청알부민-인도시아닌 그린 복합체를 제조할 수 있고, 범위를 벗어나는 경우 만노실 혈청알부민의 결합이 안정적이지 못하여 만노실 혈청알부민이 결합되지 않은 인도시아닌 그린이 얻어질 수 있다.

경우에 따라서, 금속성 방사성 동위원소가 포함되는 복합체의 경우 인도시아닌 그린이 결합된 만노실 혈청알부민에 금속성 방사성 동위원소를 결합시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 실온에서 인도시아닌 그린이 결합된 만노실 혈청알부민에 ㎎ 당 0.1∼500 mCi의 방사성 동위원소를 첨가하여 0.1∼30 분 동안 반응을 시킴으로써 금속성 방사성 동위원소가 추가로 결합된 복합체를 제조할 수 있다.

이 때, 상기 혈청알부민은 환원형 만노실기 결합된 혈청알부민일 수 있으며, 상기 혈청알부민 중 이황화 결합 S-S이 티올기로 환원된 형태일 수 있다. 이를 위해, 본 발명에 따른 제조방법은 혈청알부민 내의 디설파이드 결합을 환원제로 환원하여 티올기를 생성함으로써 디설파이드 환원형 만노실 결합 혈청알부민을 제조하는 과정을 추가로 포함할 수 있다.

이를 기반으로, 다른 관점에서 본 발명은 상기 복합체를 포함하는 감시림프절 탐색용 광학영상 프로브에 관한 것이다. 이를 통해, 림프절에 존재하는 세포를 정확하게 감지할 수 있고, 경우에 따라 금속성 방사선 동위원소가 추가 결합된 복합체를 프로브로 사용하는 경우, 수술 전 뿐 아니라 수술 중 타겟 영상 이미징화가 가능하다.

본 발명에 따른 프로브는 감시림프절 에 대한 높은 결합 친화도와 특이성을 보인다. 결합 친화도는 나노몰 또는 그보다 더 높은 친화도를 의미하며, 확인된 이미징 프로브는 최적의 생체내분포, 대사, 약물동력학 및 제거 성질을 보인다.

본 발명은 또 다른 관점에서 상기 프로브를 포함하는 키트에 관한 것이다.

경우에 따라서, 키트의 구동을 위해 약킬레이트제, 산화방지제 또는 이외에도 키트 구동에 필요한 물질이 제한없이 선택적으로 포함될 수 있다.

상기 약킬레이트제는 만노즈 결합 알부민의 약한 결합 부위에 표지가 되는 현상 및 콜로이드가 생성되는 현상을 방지하는 역할을 하는 것으로, 포스포네이트, 글루코헵토네이트, 글루코네이트, 글루카레이트, 타타레이트, 석시네이트 및 구연산으로 이루어진 그룹 중 하나 또는 둘 이상으로 이루어지며, 본 발명의 키트에는 단위 투여량당 0.1∼500 ㎎ 이 바람직하다.

상기 산화방지제는 혈청알부민의 티올기가 산화되어 서로 결합함으로써 생길 수 있는 중합체 생성을 방지하는 것으로, 비타민 C 또는 겐티식산 등이 바람직하며, 본 발명의 키트에는 단위 투여량당 500 ㎎ 이하가 바람직하다.

상기 키트는 임상 병리사 또는 기술자가 사용하기 위한 주사 조제를 제조하기 위해 완충액 멸균 바이얼, 식염수, 주사기, 필터, 칼럼 및 기타 보조 장치를 보충할 수 있다. 상기 키트가 환자 개인적인 필요 또는 식이요법에 따라 변화 및 변형될 뿐 아니라 방사성 동위원소가 제공되거나 얻어질 수 있는 형태에서의 변화도 가능하다는 것은 본 기술 분야의 통상적인 지식을 가진 당업자에 공지되어 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 만노실 혈청알부민(MSA)의 제조

[MSA 제조]

하기 표 1 및 표 2의 성분을 잘 혼합한 다음 도 1에서와 같이 교반기를 교정하여 오버나이트로 반응을 진행하였다. 차광을 위해 알루미늄 호일로 커버하였다. HAS 268mg을 25ml, 0.1Mdml Na₂CO₃버퍼(pH 9.5)에 용해하고, a-L-만노피라노실페닐이소티오시아네이트(a-L-mannopyranosylphenylisothiocyanate) 25 mg을 첨가하였다. 반응 혼합물을 반응기에 20시간 동안 실온에서 연속 교반시키고, 동결( -70℃)하였다.

[표 1] 0.1M, pH9.5 버퍼 50mL 제조

[표 2]

[MSA 정제]

PD-10 탈염 컬럼을 통해 phosphate-buffered saline (pH 6.0)을 용출액으로 이용하여 MSA를 정제하였다. MSA 반응 후 총 부피가 5 mL이기 때문에 PD-10 컬럼의 로딩 용량을 초과하므로, 1.5 mL씩 총 3 세트의 컬럼을 이용하여 정제를 진행하였다. 정제 실시 전 컬럼을 Saline으로 충진하고, 이 때 1 % HSA로 미리 컬럼을 코팅하여 MSA가 컬럼에 비특이적으로 결합하는 것을 방지하였다. 컬럼을 통해 정제된 각각의 분획에 대하여, 코마시블루로 염색하여 MSA의 존재를 확인 후 모아주었으며, 총 8 mL MSA 용액을 수득하였다 (도 2). 용액을 1mg의 단백질이 포함된 당량으로 바이알에 분주하고, 0.25 mg의 sodium medronate, 80μg의 sodium p-aminobenzoate 및 13.6 μg의 stannous fluoride을 첨가하였다.

실시예 2: 만노실 혈청알부민(MSA)의 정량

[함량 확인]

실시예 1에서 수득한 MSA를 BCA Assay를 통해 정량하였다. BCA 키트에 포함된 표준용액을 통해 도 3에서와 같은 표준 커브를 수득하고, BCA 키트에서 동일한 과정으로 발색하여 570 nm의 흡광도를 측정한 결과, 실시예 1의 MSA가 2.36 mg/mL의 농도임을 확인하였다.

[크기 확인]

DLS(Dynamic light scattering)를 통해 HAS 및 MSA의 크기를 측정하였다. 균일도 확인을 위해 5회 측정하였으며, 그 결과 HAS는 평균 크기가 6.80±1.3 nm임을 확인하였으며 (도 4), MSA는 평균 크기가 7.8±1.1 nm임을 확인하였다 (도 5).

[물성 확인]

MSA의 물성을 확인하였다. HAS와 a-L-만노피라노실페닐이소티오시아네이트의 접합 수율이 약알칼리 조건 (pH 9.5) 에서 가장 높았다. 실온에서 20시간 동안 인큐베이션 후, MSA의 ultraviolet assay (λmax=282 nm)를 HSA에 도입된 만노스의 개수를 확인한 결과, HSA 분자당 15.9 만노스 분자가 결합되어 있음을 확인하였다.

실시예 3: 만노실 혈청알부민(MSA)과 인도시아닌 그린(ICG) 복합체 제조

실시예 1에서와 같이 합성된 MSA를 10mM 포스페이트 버퍼(pH=3.1) 중에서 ICG와 반응시켰다. 이 때, MSA와 ICG의 몰비를 각각 1:1, 1:5, 1:10, 1:15 및 1:20으로 하였다. MSA 및 ICG 각각의 분자량 약 67kDa, 774.96g/mol을 고려하면, 1mg의 MSA를 사용하는 경우 0.01156mg의 ICG를 사용하여야 1:1의 몰비를 맞출 수 있다. 0.1mg/12.5μL (= 0.119mM)의 MSA 농도를 기준으로 하여 1:1의 몰비의 경우 ICG 농도는 0.001156mg/0.46μL, 1:5의 몰비에서 ICG 농도는 0.00578mg/2.3μL, 1:10의 몰비에서 ICG 농도는 0.01156mg/4.6μL, 1:15의 몰비에서 ICG 농도는 0.01734 mg/6.9μL, 1:20의 몰비에서 ICG 농도는 0.02312mg/9.2μL로 하여 MSA와 섞었다. 이 때, 각 혼합 용액에 10mM 포스페이트 버퍼(pH=3.1)를 50μL씩 넣어주었다.

UV 스펙트로미터를 사용하여 UV 피크의 이동을 체크함으로써, 반응을 모니터링하였다. 실시예 2에서 정량된 MSA를 ICG와 특정 몰비로 반응시키는 것이 중요하며, 그 결과를 도 6의 피크 중 사각 표시 부분을 도 7에 확대하여 나타내었다. 도 6 및 7을 참조하면, ICG 단독 피크는 1번이고, MSA:ICG 혼합 몰비가 1:5인 경우의 피크는 2번으로 표시하였다. 혼합시 ICG 비율이 증가할수록 피크가 원래의 ICG 피크로 회귀하는것을 확인할 수 있으며, 1:5 내지 1:10의 적정 비율로 혼합할 경우 ICG가 아닌 ICG-MSA가 제조될 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: ^99m Tc-MSA-ICG 복합체 제조

[환원 MSA의 제조]

^99mTc-MSA-ICG 복합체 제조시, 실시예 1에서 제조된 MSA를 추가로 환원시키는 단계를 수행하여야 한다 (Jeong JM, Nuclear Medicine Communications 2004, 25:1211-1217 참조). 10 mg/1mL의 MSA 당 40μL의 0.3M EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) (pH 8.0), 40μL의 1M sodium bicarbonate 및 50 μL 의 1.5M β-mercaptoethanol을 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 환원된 MSA는 PBS (Phosphate buffered saline, pH 6.0)으로 충진된 PD-10 컬럼을 이용하여 정제를 실시하였다.

정제된 환원 MSA는 각 vial 당 1 mg의 단백질과 0.25 mg의 sodium medronate, 80 μg의 sodium p-aminobenzoate 및 13.6 μg의 stannous fluoride가 포함 되도록 분주하였다. 각 vial은 동결건조 후 냉동고에 보관하였다.

Ellman's reagent를 이용하여 β-mercaptoethanol을 통해 수득되고, PD10 컬럼을 통해 후속 정제된 환원 MSA의 분자당 자유 티올기의 개수가 19.4개임을 확인하였다. 이 때, 흡광 파장은 410 nm 이고, 표준곡선은 시스테인 용액을 통해 얻었다.

[^99mTc-MSA 제조]

Vial 하나당 약 20~30mCi/mL의 ^99mTc-pertechnetate를 넣어주고 실온에서 30 분간 반응시켰다. ITLC-SG(Instant Thin Layer Chromatography-Silica Gel)에서 ethanol:10% ammonium acetate=1:1 로 전개하고, 5% BSA를 흡수시킨 paper를 Saline 으로 전개한 것을 사용하여 표지효율(Labeling efficiency)을 측정하였다.

ITLC-SG를 ethanol:10% ammonium acetate=1:1로 전개시킨 경우 표지되지 않은 ^99mTc-pertechnetate는 용매를 따라 올라가고, MSA-bound ^99mTc의 경우 origin(시작지점) 에 나타났다.

또한, 5% BSA-impregnated paper chromatography/saline에서는 표지된 MSA가 용매를 따라 위쪽에 나타남을 확인하였다 (도 8).

[ICG 혼합]

실시예 3에서와 동일하게, UV peak 의 shift를 관찰하였다. 기기의 방사선 오염을 방지하기 위해 표지 후 충분한 시간이 경과한 이후에 UV 를 확인하여야 한다. UV peak 의 shift 관찰 결과, 표지된 MSA를 ICG와 1:5 내지 1:10의 적정 비율로 혼합할 경우, 표지 전 ICG:MSA와 비교하여 물성에 변화가 없음을 확인하였다.

시험예 1: ICG:MSA의 분산(biodistribution) 및 이미징

실시예 3에서 ICG: MSA와 ICG를 각각 PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate, sigma, USA)에 활성화된 U937세포 (한국세포주은행, KCLB No.21593.1)에 처리하고 (도 9a), 이들의 세포분포를 모니터링 한 결과, ICG: MSA가 U937세포에 더 많이 분포됨을 확인하였다 (도 9b). 또한, ICG: MSA와 ICG를 발바닥에 주입 후 체내 분포를 확인한 결과 ICG:MSA는 림프절(popliteal)과 간에 주로 분포되는데 반하여, ICG는 오금(popliteal) 뿐만 아니라 빠른 시간 내에 액와 (axillary) 림프절까지 분포됨을 확인하였다 (도 9c).

본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 내용을 바탕으로 본 발명의 범주내에서 다양한 응용 및 변형을 행하는 것이 가능할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 만노실 혈청알부민에 인도시아닌 그린이 결합된 복합체를 포함하는 감시림프절 탐색용 광학영상 프로브:

화학식 1

- (ICG)n

상기 식에서, SA는 혈청알부민이고, ICG는 인도시아닌 그린이고, n은 1∼34의 정수이며,
상기 만노실 혈청알부민과 인도시아닌 그린은 1:5 내지 1:10의 몰비를 가진다.
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제1항에 있어서, 상기 혈청알부민 (SA)는 티올기를 포함하는 환원형 혈청알부민인 것을 특징으로 하는 프로브.
제1항에 있어서, 금속성 방사성동위원소가 추가로 결합된 것을 특징으로 하는 프로브.
제5항에 있어서, 상기 금속성 방사성 동위원소는 ^99mTc, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁶Re, ⁶⁷Cu, ²¹²Pb, ²¹²Bi 및 ¹⁰⁹Pd으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 프로브.
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제1항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 프로브를 포함하는 감시림프절 탐색용 광학영상 키트.
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