CN109721651B - 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其临床应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种视黄醇结合蛋白的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，及其在临床检测血清中视黄醇结合蛋白(RBP4)含量的应用，属于医学免疫体外诊断领域。本发明提供了的RBP胶乳增强免疫比浊检测试剂盒采用重组表达的rhRBP4作为校准品、质控品和相关兔多抗免疫抗原，将上述兔多抗及rhRBP4校准品、质控品用于胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的制备中，能够准确检测出血液中RBP4的含量，与市售产品相比，具有更好的特异性和更高的准确度，显现出较好的临床应用前景。且本发明rhRBP的重组表达方法具有周期短、表达量大、成本低的特点，在很大程度上提高了相关产品的质量均一性。

Description

一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其临床应用

技术领域

本发明属于医学免疫体外诊断领域，尤其是一种重组视黄醇结合蛋白及其在检测血液样本中视黄醇结合蛋白(Retinol-Binding Protein，RBP4)含量的检测试剂盒中的应用。

背景技术

视黄醇结合蛋白(RBP4)，分子量为21kDa，是血液中维生素A的转运蛋白，广泛分布于血液、脑脊液、尿液及其他体液中。在血液中，RBP4与视黄醇、前白蛋白以1:1:1(摩尔比)的复合物形式存在，转运体内90％的视黄醇至机体组织。当RBP4与细胞表面的RBP受体结合时，视黄醇进入细胞内，复合物解体，游离的RBP4从肾小球滤出，其中绝大部分被近端肾小管上皮细胞重吸收并被分解，供组织利用，仅少量从尿中排出。体内锌、铁缺乏及严重感染等疾病能降低RBP4的生物合成。当肾脏疾病或感染等导致肾小管重吸收功能障碍时，由于肾脏滤过及清除小分子量蛋白的能力下降，使各种形式的RBP4进一步蓄积，导致其在血清中的含量明显增加。因此RBP4测定是诊断早期肾功能损伤和疗效判定的敏感指标。又因RBP4可特异性的反映机体的营养状态，因此也是一项诊断早期营养不良的敏感指标。综上所述，RBP4的定量检测产品将具有重要的临床意义和较强的市场需求。

目前临床对RBP4的检测方法主要都是基于免疫学，利用抗原抗体的特异性结合，定量检测血液中RBP4含量，比如酶联免疫吸附测定法、化学发光法、免疫比浊法。随着检测技术的进步以及临床检测需求的增大，前两种方法由于费用高或操作繁琐、周期长等劣势，逐渐淡出临床市场。而伴随着全自动生化分析仪的普及，生化比浊法凭借反应时间短，精密度好，易于自动化等优点，成为临床上主流检测方法。常规的免疫比浊法缺乏级联放大效应，使得灵敏度较低，但是本发明采用胶乳增强免疫比浊法，借助包被了特异性兔多抗包被的“胶乳”介质，显著增大抗原抗体反应物的粒径，提高了检测灵敏度和精密度。而其中配套本发明的RBP4作为校准品和质控品，以及用以制备抗体的抗原蛋白，在整个产品开发中尤为重要。天然的RBP4获取困难，且质量难以控制。因此，本发明考虑采用基因工程途径制备重组RBP4蛋白，基因工程途径主要有原核和真核表达方法。真核表达存在成本比较高，制备工序比较复杂的劣势，导致其不适合用于RBP4的大批量制备。而原核表达相对而言，却比较简单。众所周知，大肠杆菌的遗传背景清楚，培养方法简单，生长周期短，成本低，是一种表达蛋白质的理想工具，但也存在天然编码序列不易克隆的操作困难。

发明内容

本发明提供了一种重组人视黄醇结合蛋白蛋白(以下简称rhRBP4)，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。

本发明提供了编码上述所述rhRBP4的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。该序列是专为大肠杆菌表达系统进行密码子优化得到的序列，能够显著提高异源基因在宿主菌中的表达效率。

本发明还提供了包含了上述所述编码rhRBP4的基因的载体，所述的载体优选为原核表达载体pET21b、pET28a、pTWIN1，特别优选为pET21b作为rhRBP4高效可溶表达的载体。

本发明还提供了包含有上述所述载体的大肠杆菌宿主菌株，优选地，所述宿主菌株选自大肠杆菌BL21(DE3)或BL21(AI)菌株，特别优选为BL21(DE3)作为rhRBP4高效表达的宿主菌株。

本发明还提供了rhRBP4在大肠杆菌中高效表达方法，包括如下步骤：

1.挑取一个含有上述所述的重组大肠杆菌单菌落，接入LB培养液，于37℃培养过夜；

2.取过夜培养物按照1％接种量接入LB培养液中，扩大培养2L，于37℃震荡培养至对数中期(OD₆₀₀＝0.8～1.0)；

3.向培养物中加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，于37℃继续诱导表达4-8h，7000rpm，4℃，15min离心收集rhRBP4大肠杆菌菌体沉淀。

所述LB培养液中均含氨苄青霉素50-100μg/mL。

本发明还提供了rhRBP4的包涵体变性和复性方法，包括如下步骤：

1.将收集得到的rhRBP4大肠杆菌菌体沉淀，用预冷的20mM PBS缓冲液重悬，至浓度50-100g/L，然后于冰水混合物中预冷10min后，进行超声波裂解破碎，破碎条件为：50％功率(200W)、工作3s间歇4s共30min。超声破碎结束后，12000rpm，4℃，15min，收集裂解物沉淀。

2.包涵体洗涤：将上述菌体裂解物沉淀使用200ml 20mM PBS+1％TritonX-100，pH7.4,彻底重悬，室温搅拌2h，离心收集沉淀，丢弃上清，沉淀即为洗涤后包涵体。

3.包涵体变性：将洗涤后的包涵体沉淀使用200ml变性液(20mM Tris 8M脲1-10mMDTTpH8-11)彻底重悬，室温搅拌变性2h，离心收集上清，上清使用0.22μm膜过滤，即得到变性液。

4.包涵体复性：将上述包涵体变性液使用缓慢加入到2L复性液中(20mM Tris 3mM还原型谷胱甘肽1mM氧化性谷胱甘肽5％甘油，pH8.0)，加入过程中应快速混匀放置变性液局部浓度过高，变性液加入完毕后，于2-20℃复性40h以上即可。

本发明还提供了rhRBP4包涵体复性液的纯化方法，包括如下步骤：

1.将复性结束的rhRBP4包涵体复性液使用0.22μm膜过滤，然后超滤换液为20mMTrisHCl，pH8.0，换液后再次使用0.22μm膜过滤。

2.将换液后的rhRBP4复性液使用Q sepharose high performance填料纯化(30ml柱体积)，上样前先使用结合缓冲液平衡柱床，然后上样，上样结束后使用结合缓冲液再平衡柱床至UV和电导率到基线，然后洗脱，洗脱方法为：在10个柱体积内使得经过柱床的洗脱缓冲液比例占50％。

3.所述结合缓冲液优选为：20mM Tris pH8.0；所述洗脱缓冲液优选为20mM Tris1M氯化钠pH8.0，缓冲液配制完成后使用0.22μm膜过滤备用。

本发明还提供了由上述重组人RBP4作为免疫原制备的兔抗人RBP4多克隆抗体。

本发明还提供了由上述兔抗人RBP4多克隆抗体制备的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒。

本发明的一种视黄醇结合蛋白免疫胶乳增强比浊检测试剂盒，包含R1试剂、R2试剂和标准品，所述R1试剂包括：缓冲液1、稳定剂、增凝剂、保护剂、防腐剂、螯合剂；所述R2试剂包括：缓冲液2、防腐剂、稳定剂、保护剂；所述标准品包括：缓冲液3、保护剂、稳定剂。

优选的，所述R1试剂中：缓冲液为0.01M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；稳定剂为40g/L-60g/L的NaCl；增凝剂为0-30g/L的PEG6000，保护剂为10g/L-20g/L的BSA，防腐剂为0.05-0.1g/L的Proclin300，螯合剂为5g/L-10g/L的EDTA。

优选的，所述R2试剂中：缓冲液为0.01M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；防腐剂为0.1-0.2g/L的Proclin300；稳定剂为10g/L-20g/L的NaCl，和50-100g/L的蔗糖或葡萄糖，保护剂为10g/L-20g/L的BSA；另外有标记有视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微球(质量浓度为≤0.1％-0.5％)。

优选的，所述标准品包括4支不同浓度的重组人RBP4的溶液，其中：缓冲液为0.01M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；保护剂为1g/L-10g/L的BSA，稳定剂9-13g/L的NaCl。

优选的，标记有视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微球制备方法包括如下步骤：

用磷酸盐缓冲液将兔抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体稀释至0.5-2mg/mL，制备成抗体稀释液；用MES缓冲液将胶乳微球(聚苯乙烯胶乳，购自日本JSR公司，粒径80-300nm)稀释至1％(质量浓度)，再加入0.5％-2％(质量浓度)的EDC，在30℃下搅拌反应30min，反应结束后通过离心去除未反应的EDC，然后加入兔抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体稀释液，在30℃下搅拌反应30-60min，反应结束后通过离心去除未反应的抗体，再加入终止反应液终止反应即得。

本发明采用大肠杆菌作为表达系统制备重组人RBP4，该方法具有周期短、表达量大、成本低的特点，且通过该方法制备出的RBP4蛋白可以作为一种有效的免疫原，用于兔多抗的制备；通过该种方法制备出的RBP4蛋白可以作为RBP4定量检测试剂盒中的校准品和质控品。将上述多抗及校准品、质控品用于胶乳增强免疫比浊检测试剂盒的制备中，能够准确检测出血液中RBP4的含量，与市售产品相比，具有更好的特异性和更高的准确度，显现出较好的临床应用前景。

附图说明

图1为rhRBP4基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

其中，泳道1为500bp DNA Ladder；泳道2为两端含有NdeI和XhoI酶切位点的rhRBP4基因PCR产物。

图2为rhRBP4构建到表达质粒pET21b过程图；

图3为rhRBP4重组菌株PCR鉴定图。

其中，泳道1为500bp DNA Ladder；泳道2-3为含有不同的含有rhRBP4的重组大肠杆菌菌株。

图4为QHP纯化rhRBP4样品的SDS-PAGE分析。泳道1为蛋白上样Marker；泳道2-5为纯化后rhRBP4蛋白非还原电泳分析。

图5试剂盒的标准曲线绘制图，图中横坐标为RBP4校准品浓度，纵坐标为吸光度△A。

图6比对试验性能评价结果。

具体实施方式

下面通过实施例进一步详细描述本发明，但本发明不局限于这些实施例。

实施例1rhRBP4蛋白的制备

1、rhRBP4基因的表达载体构建

发明人根据NCBI已公开的hRBP4的cDNA序列(GenBank登录号：NM_006744.3)，对该基因进行密码子优化后得到本发明的rhRBP4基因，如SEQ ID No：2所示。

将优化后的rhRBP4全基因在5’端引入NdeI酶切位点序列，在3’端引入XhoI切位点序列，并进行全基因合成，将合成的基因片段，构建到pUC57质粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-rhRBP4质粒。以pUC57-rhRBP4质粒为模板，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

上游引物：

M13F:TGT AAA ACG ACG GCC AGT

下游引物：

M13R:CAG GAA ACA GCT ATG AC

反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶为Q5(#M0491L，购自New England Biolabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃30秒预变性，热循环30次(98℃10秒、55℃15秒、72℃30秒)，72℃延伸2分钟，4℃保存，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小(380bp)一致(结果如图1所示)。

将得到的基因产物用通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214-02，购自北京天根生化科技有限公司)纯化。纯化后，用NdeI(#R0111S，购自New England Biolabs公司)和XhoI(#R0146S，购自New England Biolabs公司)双酶切，用T4连接酶(#M0202S，购自New EnglandBiolabs公司)连接到pET21b载体中，转化到Top10感受态细胞(CB104-02，购自北京天根生化科技有限公司)中，在含有100μg/mL的氨苄青霉素(0339，购自Amresco公司)的LB平板中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，比对，与预期序列完全一致，即得到rhRBP4一种形式的表达载体，记为pET21b-rhRBP4(质粒构建流程如图2所示)。

2、rhRBP4重组大肠杆菌鉴定

具体步骤如下：

1、配制鉴定用LB培养基(0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％氯化钠)，将上述步骤中测序比对正确的pET21b-rhRBP4质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中(CB105-02，购自北京天根生化科技有限公司)中，37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。

2、第二天从步骤1中的平板上挑取2个单菌落接种到含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml新鲜LB培养基中(使用前使用高压灭菌锅进行湿热灭菌，冷却后备用)，然后放入到恒温摇床中，设定培养条件为：37℃、220rpm、6h。然后使用T7通用引物对培养物进行鉴定。PCR反应结束后使用1％琼脂糖电泳凝胶检测PCR产物，鉴定结果见图3，挑取2个单菌落均为阳性。

3、rhRBP4扩大培养

具体步骤如下：

1、配制扩大培养用LB培养基(0.5％酵母粉，1％蛋白胨，1％氯化钠)，称取2L量的上述三种成分倒入2L烧杯中，随后加入1.5L量的去离子水，搅拌至成分充分溶解，并将上述培养基定溶至2L。

2、将步骤1中的2L培养基分装至2L的无挡板锥形瓶中，每瓶500mL，121℃，灭菌处理20min，冷却后备用。

3、rhRBP4一级种子液制备：从-80℃冰箱中取出一管BL21(DE3)-pET21b-rhRBP4甘油管，溶化后使用接种针沾取少量的菌液在LB固体培养基(LB液体培养基+2％琼脂粉，121℃，灭菌处理20min，冷却至50-60℃加入终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素，混匀后倒入无菌培养皿中，凝固后备用)上使用三区划线法进行活化，接种完毕后于37℃培养箱培养12-16h。

4、从上述步骤3中的培养皿中挑取一个大小适中的rhRBP4单菌落接种于含氨苄青霉素10ml无菌LB培养基，37℃220rpm培养12-15h，即可得到一级种子液。

5、rhRBP4重组菌株扩大培养：将上述步骤4中的rhRBP4一级种子液分别转接到已灭菌备用的100μg/mL的氨苄青霉素LB培养基中，接种量为1％，37℃220rpm培养。

6、rhRBP4重组菌株诱导表达：将上述步骤5中rhRBP4的培养物，培养3h后，在超净工作台中取出3ml测定OD₆₀₀吸收值，当OD₆₀₀＝0.8-1.0之间时在超净工作太重加入终浓度0.5mMIPTG，继续培养4h。

7、rhRBP4重组菌体的收集：使用高速冷冻离心机将上述步骤6中rhRBP4培养物7000rpm，4℃，15min进行离心。离心结束后丢弃上清，收集菌体沉淀。

4、rhRBP4包涵体变性和复性

具体步骤如下：

1.将表达后的菌体沉淀使用20mM PBS pH7.4 200ml重悬，重悬过程中保证菌体被均匀分散。将悬浮均匀的菌体转移到干净的200ml烧杯中，然后在冰水浴降温。降温10min后将悬浮物使用探针式超声波细胞破碎仪进行破碎，破碎条件：10号探头工作3s、停止4s、功率为100W、总计工作时间为30min。超声破碎的过程中菌体重悬物要在冰水浴条件下降温。超声波破碎结束后将菌体裂解物转移至离心管中，使用托盘天平对离心杯配平，然后将菌体培养物使用型日立高速冷冻离心机R15A号转子进行离心，离心条件为：15min 4℃12000rpm，离心结束后收集沉淀，沉淀即为rhRBP4包涵体。

2.配制包涵体变性液：20mM Tris 8M脲2mM DTT pH10.0,300ml。复性液：20mMTris3mM还原型谷胱甘肽1mM氧化型谷胱甘肽5％甘油，pH8.0，2L。

3.将步骤1中的rhRBP4包涵体使用200ml PBS(含有1％TritonX-100)，彻底重悬，室温搅拌2h，离心收集(方法同步骤1)沉淀，即获得洗涤后的包涵体。

4.将步骤3中洗涤后的包涵体使用200ml变性液重悬，室温搅拌2.5h变性，离心收集变性液上清，上清使用0.22μm孔径的膜过滤获得变性液淸液；

5.将步骤4中的变性液淸液使用蠕动泵缓慢的加入到2L复性液中，加入过程中体系要快速混匀，防止出现局部浓度过高，加入完毕后将复性液放入到2-8℃冰箱中复性，复性40h。

5、rhRBP4包涵体复性液层析纯化

具体步骤如下：

1.将复性结束后的复性液使用0.22μm膜过滤，然后使用PALL台式超滤系统，10KDa膜包超滤浓缩，使用20mM Tris pH8.0换液10次，最终获得的样品使用0..22μm膜过滤。

2.配制层析结合缓冲液：20mM Tris，pH8.0；层析洗脱缓冲液：20mM Tris 1000mM氯化钠pH8.0；

3.开启AKTAUPC900纯化仪，使用新鲜的单蒸水冲洗系统使得管路中的旧溶液被去除，将QHP(Q sepharose high performance GEhealthcare产，30ml自装柱，柱材为XK26/20)接入到纯化仪上，设定系统压力上限为0.3MPa，流速为10ml/min。使用单蒸水冲洗柱床10CVs(柱床体积)，然后使用结合缓冲液冲洗柱床10CVs(B泵冲洗)，将步骤1待纯化样品使用A泵上样，流速为10ml/min，上样结束后使用A泵平衡，平衡10CVs以上，至电导率和UV至基线。然后使用洗脱缓冲液洗脱，洗脱流速10ml/min，洗脱方法：在10CVs内使得经过柱床的B液浓度达到50％，根据UV收集样品。

4.将洗脱收集样品使用SDS-PAGE分析检测，具体见图4，由图可知，纯度达到95％以上。

实施例2兔多抗的制备

1、免疫前3天，于耳缘静脉采血留作阴性对照(500ul/只，于37℃静置l小时，1500rpm离心15分钟，吸取血清置于-20℃保存)；

2、3天后将重组人RBP4蛋白(1mg/只兔子)与完全弗氏佐剂等体积充分混匀，形成“油包水”形态，于家兔脊柱两旁多点皮下注射；

3、2周后进行第二次免疫：将重组人RBP4蛋白(1mg/只兔子)与不完全弗氏佐剂等体积充分混匀，形成“油包水”形态，注射部位脊柱两旁皮下(注射部位应区别于第一次)；该次免疫一周后于耳缘静脉采血(血液处理方式同步骤1)；

4、2周后进行第三次免疫：将重组人RBP4蛋白4(1mg/只兔子)与不完全弗氏佐剂等体积充分混匀，形成“油包水”形态，注射部位脊柱两旁皮下(注射部位应区别于第二次)；该次免疫一周后于耳缘静脉采血(血液处理方式同步骤1)；

5、2周后进行第四次免疫，将重组人RBP4蛋白(1mg/只兔子)与不完全弗氏佐剂等体积充分混匀，形成“油包水”形态，注射部位脊柱两旁皮下(注射部位应区别于第三次)；该次免疫一周后于耳缘静脉采血(血液处理方式同步骤1)；

6、待免疫兔血清的效价符合要求时，采用颈动脉采血方式进行血清的收集，血液处理方式同步骤1。

7、抗体纯化：①将免疫兔血清与饱和硫酸铵等体积混匀，4℃静置1h后，离心(8000rpm，15min，4℃)弃去上清，用0.2M磷酸氢二钠重悬沉淀，将重悬液用0.22μm的滤器过滤，即为血清预处理物，于4℃备用；②用0.2M磷酸氢二钠平衡Protein A纯化柱，再将血清预处理物上柱进行纯化，最后用70％柠檬酸洗脱，收集洗脱液；③将洗脱液于0.02M磷酸盐缓冲液中透析24小时；④将纯化的抗体进行纯度和特异性的鉴定。

8、抗体鉴定：①采用SDS-PAGE进行抗体纯度的鉴定，具体方法参照《中国药典》，结果显示抗体纯度达到90％以上；②采用双抗体夹心ELISA法进行抗体灵敏度的鉴定(表1)，具体操作：以兔抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体为捕获抗体(浓度：4μg/mL)，HRP标记的兔多抗人视黄醇结合蛋白抗体为检测抗体(浓度：1μg/mL)，根据灵敏度判定方法(OD_待检样本/OD_blank≥2.1时对应的最低浓度为检测灵敏度)可知检测灵敏度达到0.049ng/mL。

表1兔抗人视黄醇结合蛋白抗体的灵敏度评价结果

实施例3检测试剂盒的制备及使用方法

本发明的检测试剂盒是液体双试剂，其中包括试剂R1、试剂R2和校准品，具体见下：

1、试剂R1：在缓冲液1中加入稳定剂(例如：NaCl)、增凝剂(例如：PEG6000)、保护剂(例如：BSA)、防腐剂(例如：Proclin 300)、螯合剂(例如：EDTA)，搅拌混匀，即为R1试剂。

2、R2试剂：将兔抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体用磷酸盐缓冲液将抗体稀释至2mg/mL，制备成抗体稀释液；用MES缓冲液将胶乳微球(聚苯乙烯胶乳，购自日本JSR公司，粒径80-300nm)稀释至1％(质量浓度)，再加入0.5％-2％(质量浓度)的EDC，在30℃下搅拌反应30min，反应结束后通过离心去除未反应的EDC，然后加入兔抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体稀释液，在30℃下搅拌反应30-60min，反应结束后通过离心去除未反应的抗体，再加入终止反应液终止反应，离心，最后加入由缓冲液2、防腐剂(例如：Proclin 300)、稳定剂(例如：NaCl，蔗糖)、保护剂(例如：BSA)组成的缓冲液搅拌混匀，即为R2试剂(其中标记有视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微球质量浓度为≤0.1％)。

3、校准品：RBP4标准品具体制备见实施例1，将RBP4标准品分别加入由缓冲液3、保护剂(例如：BSA)稳定剂(例如：NaCl)、防腐剂(例如：Proclin 300)组成的缓冲液中，制备得到终浓度为140、70、35、17.5mg/L的一组校准品。

优选地，为了提高试剂盒的准确度，制备了不同的R1、R2、校准品试剂进行准确度(回收率)、分析灵敏度的性能检测和比对，具体评价结果见下表2。选择本发明的各种缓冲液、稳定剂、保护剂、防腐剂、螯合剂等制备的试剂盒有更好的检测性能。

分析灵敏度：以已知视黄醇结合蛋白(或简称RBP4)含量为(50.0±5.0)mg/L的人源血清作为样本，重复测定3次，记录试剂盒在规定参数下的吸光度差值。换算为50.0mg/LRBP4所引起的吸光度差值。

准确度(添加回收)：选择合适浓度的人血清样本(简称：常规样本)中加入一定体积的校准品(RBP4理论浓度为C_理论)制作成回收样本，在常规样本中加入相同体积的去离子水制作成基础样本，其中加入的校准品量不超过总体积的1/10，每个回收样本和基础样本检测3次，测定平均浓度对应为C₁和C₀。根据计算公式：回收率＝(C₁-C₀)/C_理论*100％计算出各自的回收率。

表2试剂盒的制备比对结果

实施例4检测试剂盒的性能测试

对照试剂盒1：试剂R2中所使用的抗体替换为A厂家商品化兔抗人RBP4多克隆抗体，其他试剂及实验方案均同实施例3制备例；

对照试剂盒2：试剂R2中所使用的抗体替换为B厂家商品化兔抗人RBP4多克隆抗体，其他试剂及实验方案均同实施例3制备例；

本发明试剂盒：具体见实施例3制备例制备的RBP4检测试剂盒；

商品化试剂盒：购买于知名C公司的临床用RBP4胶乳增强比浊试剂盒；

对上述试剂盒关键性能进行比较。

1、线性范围

采用贝克曼全自动生化分析仪AU480测定4个不同浓度的RBP4标准品在600nm处的吸光度，绘制校准品的工作曲线(见图5)。结果可以看出，本发明试剂盒的检测范围较对照试剂盒1和对照试剂盒2具有更宽的线性范围，更加有利于高浓度的病理样本直接检测，而不需要进行样本的稀释，操作简易化。

因对照试剂盒1和对照试剂盒2的线性范围均无法满足临床应用需求，遂未对其进行进一步研究。下述性能评价仅针对本发明试剂盒及商品化试剂盒展开。

2、精密度

重复性：用本发明试剂盒分别检测浓度在(80.0±8.0)mg/L、(50.0±5.0)mg/L的2份样本，重复测试10次，分别计算变异系数(CV)。检测结果可见，本发明试剂盒和商品化试剂盒的重复性完全达到CV≤10％的行业标准，且本发明试剂盒CV值更低，优于商品化试剂盒(见表3)。

批间差：分别用四个不同批号的本发明的检测试剂，测定RBP4浓度在(80.0±8.0)mg/L、(50.0±5.0)mg/L的样本，每个批号重复测试3次，计算试剂(盒)批间差R。检测结果可见，本发明试剂盒批间差完全可满足行业标准(见表3)。

3、准确度

添加回收：选择合适浓度的人血清样本(简称：常规样本)中加入一定体积的校准品(RBP4理论浓度为C_理论)制作成回收样本，在常规样本中加入相同体积的去离子水制作成基础样本，其中加入的校准品量不超过总体积的1/10，每个回收样本和基础样本检测3次，测定平均浓度对应为C₁和C₀。根据计算公式：回收率＝(C₁-C₀)/C_理论*100％计算出各自的回收率。结果表明本发明试剂盒的回收率均能满足80％-120％的要求，而商品化试剂盒的准确度显著超过120％，显示本发明试剂盒具有更好的的特异性和准确度(见表3)。

表3准确度和精密度性能评价结果

4、比对试验

分别用本发明试剂盒、同类产品商品化试剂盒检测89份人血清，在贝克曼AU480生化分析仪同时测定，本发明试剂盒的参数设置见实施例3，商品化试剂盒参照说明书进行。将测定值与商品化试剂盒测定值进行相关性分析，图6显示本发明试剂盒与商品化试剂盒(即对照试剂盒)具有良好的相关性(R²＝0.989)，可达到临床使用的标准。

实施例5检测试剂盒的适用性

本发明的检测试剂盒应用于全自动生化仪，但不局限于此，其中主要参数设置及检测方法如下(举例贝克曼全自动生化分析仪AU5800)：

检测波长：主波长600nm，副波长无；检测温度：37℃；

检测方法：取100μL试剂R1与1.5μL样本混匀，孵育5min后，加入50μL试剂R2，立即读取吸光度A1，孵育5min后读取吸光度A2，计算吸光度变化△A＝A2-A1。使用多点非线性校准，绘制校准品的工作曲线，样品中RBP4含量可根据△A变化值在工作曲线上计算获得。

本发明试剂盒在贝克曼AU5800生化分析仪上进行精密度、准确度等性能评价(具体见实施例4，其中准确度采用相对偏差法)，结果见表4。结果显示本发明试剂盒精密度和准确度满足要求，表明本发明试剂盒也可以应用于贝克曼生化分析仪其他机型，具有较广的适用性。

表4本发明试剂盒在AU5800上的性能

序列表

<110> 江苏众红生物工程创药研究院有限公司

<120> 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其临床应用

<130> 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒及其临床应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 555

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atggaacgtg actgccgtgt gagcagcttt cgtgtgaaag aaaactttga taaagcacgc 60

ttcagcggca cgtggtatgc gatggcgaag aaagatccgg aaggtctgtt tctgcaggat 120

aatattgtcg cggaatttag cgtggatgaa acgggccaaa tgtctgcaac cgctaaaggt 180

cgtgttcgcc tgctgaacaa ttgggacgtt tgtgcggata tggtcggcac ctttacggac 240

accgaagatc cggcgaaatt caaaatgaaa tactggggcg tcgcctcctt cctgcagaaa 300

ggtaatgatg accattggat cgtggatacg gactatgata cctacgcggt tcaatatagt 360

tgccgtctgc tgaacctgga cggcacctgt gccgatagtt actcctttgt cttctcacgc 420

gatccgaatg gtctgccgcc ggaagcacag aaaattgtgc gtcagcgcca agaagaactg 480

tgcctggctc gtcaatatcg cctgatcgtg cataacggct actgtgatgg tcgttcagaa 540

cgcaatctgc tgtaa 555

<210> 2

<211> 184

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Glu Arg Asp Cys Arg Val Ser Ser Phe Arg Val Lys Glu Asn Phe

1 5 10 15

Asp Lys Ala Arg Phe Ser Gly Thr Trp Tyr Ala Met Ala Lys Lys Asp

20 25 30

Pro Glu Gly Leu Phe Leu Gln Asp Asn Ile Val Ala Glu Phe Ser Val

35 40 45

Asp Glu Thr Gly Gln Met Ser Ala Thr Ala Lys Gly Arg Val Arg Leu

50 55 60

Leu Asn Asn Trp Asp Val Cys Ala Asp Met Val Gly Thr Phe Thr Asp

65 70 75 80

Thr Glu Asp Pro Ala Lys Phe Lys Met Lys Tyr Trp Gly Val Ala Ser

85 90 95

Phe Leu Gln Lys Gly Asn Asp Asp His Trp Ile Val Asp Thr Asp Tyr

100 105 110

Asp Thr Tyr Ala Val Gln Tyr Ser Cys Arg Leu Leu Asn Leu Asp Gly

115 120 125

Thr Cys Ala Asp Ser Tyr Ser Phe Val Phe Ser Arg Asp Pro Asn Gly

130 135 140

Leu Pro Pro Glu Ala Gln Lys Ile Val Arg Gln Arg Gln Glu Glu Leu

145 150 155 160

Cys Leu Ala Arg Gln Tyr Arg Leu Ile Val His Asn Gly Tyr Cys Asp

165 170 175

Gly Arg Ser Glu Arg Asn Leu Leu

180

Claims (2)

1.一种检测人视黄醇结合蛋白含量的胶乳增强免疫比浊检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含R1试剂、R2试剂和标准品，所述R1试剂包括：缓冲液1、稳定剂、增凝剂、保护剂、防腐剂、螯合剂；所述R2试剂包括：缓冲液2、防腐剂、稳定剂、保护剂；所述标准品包括：缓冲液3、保护剂、稳定剂；

所述R1试剂中：缓冲液1为0.01M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；稳定剂为40g/L-60g/L的NaCl；增凝剂为0-30g/L的PEG6000，保护剂为10g/L-20g/L的BSA，防腐剂为0.05-0.1g/L的Proclin300，螯合剂为5g/L-10g/L的EDTA；

所述R2试剂中：缓冲液2为0.01M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；防腐剂为0.1-0.2g/L的Proclin300；稳定剂为10g/L-20g/L的NaCl，和50-100g/L的蔗糖或葡萄糖，保护剂为10g/L-20g/L的BSA；另外有标记有视黄醇结合蛋白抗体的胶乳微球(质量浓度为≤0.1％-0.5％)；

所述标准品包括4支不同浓度的重组人RBP4的溶液，其中：缓冲液3为0.01M-0.05M、pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液；保护剂为1g/L-10g/L的BSA，稳定剂9-13g/L的NaCl。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，标记有视黄醇结合蛋白抗体的乳胶微球制备方法包括如下步骤：

将视黄醇结合蛋白抗体用磷酸盐缓冲液稀释至0.5-2mg/mL，制备成抗体稀释液；用MES缓冲液将胶乳微球(聚苯乙烯胶乳，购自日本JSR公司，粒径80-300nm)稀释至1％(质量浓度)，再加入0.5％-2％(质量浓度)的EDC，在30℃下搅拌反应30min，反应结束后通过离心去除未反应的EDC，然后加入兔抗人视黄醇结合蛋白多克隆抗体稀释液，在30℃下搅拌反应30-60min，反应结束后通过离心去除未反应的抗体，再加入终止反应液终止反应即得。

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