CN100523173C - 一种检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的elisa试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌学与动物传染病学检测技术领域，具体涉及一种检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的ELISA试剂盒及其在防治猪进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，PAR)中的应用。该试剂盒包括盒体、盒体内包被有以纯化的表达毒素toxA基因C’端rPMT-C蛋白作为抗原的酶标板、阴、阳性标准血清、兔抗猪IgG酶标二抗、样品稀释液、底物显色A液、底物显色B液、终止液和洗涤液。还公开了一种表达猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端rPMT-C蛋白的重组大肠菌BL21/pET28b-C2115(保藏号为CCTCC NO：M207012)的制备和rPMT-C蛋白的表达与纯化方法。本发明的试剂盒具有操作简便，诊断快速、准确，费用低等优点，适合于临床大规模对T⁺Pm进行血清学调查，可为PAR在猪群中的净化提供技术支撑。

Description

一种检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的ELISA试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及动物细菌学与动物传染病学检测技术领域。具体地说，本发明涉及一种检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的ELISA试剂盒及应用。

背景技术

猪产毒多杀性巴氏杆菌(toxigenic Pasteurella multocida，简称T⁺Pm)是引起猪进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis，简称PAR)的主要病原菌。该菌分泌产生一种约146kD的皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxin，PMT)，由toxA基因编码，可直接引起猪鼻炎、鼻梁变形、鼻甲骨萎缩甚至消失，全身代谢障碍，生产性能下降，同时可诱发其它病原微生物感染，甚至导致死亡(Chanter，N等，Interactions betweenBordetella bronchiseptica and toxigenic Pasteurella multocida in atrophic rhinitisof pigs[J].Res.Vet.Sci，1989，47(1)：48-53；斯特劳等主编[美]，赵德明等译，猪病学(第八版)[M]，北京，中国农业大学出版社，2000.9：369-406)。PAR于1830年最早发现于德国，现已分布于世界养猪业发达的各个国家和地区。1964年，我国首次从英国进口的“约克”种猪中发现本病，目前该病在我国发病率高达50％-60％(吴斌等，应用乳胶凝集实验进行猪传染性萎缩性鼻炎血清流行病学调查[J]。中国兽医科技，2001，31(6)：21-22)。因此，PAR每年给养猪业带来巨大的经济损失，被誉为世界规模化养猪五大传染病之一，并被国际兽疫局(OIE)定为B类动物传染病。

目前，世界上许多养猪业发达的国家和地区已启动了PAR的根除计划，并投入了大量的人力和物力对T⁺Pm开展研究。研究表明，T⁺Pm及其所分泌的PMT在PAR中发挥着重要的作用，因此对PAR的检测关键在于是否有PMT或产生PMT的T⁺Pm的检测(Foged.N等，Pasteurellamultocida toxin：the characterization of the toxin and its significance in the diagnosis andprevention of progressive atrophic rhinitis in pigs.Acta Pathol.Microbiol[J].Immunol，Scand，1992，100(25)：1-56)。目前，该病临床感染的诊断主要依靠对T⁺Pm进行病原的分离和产毒能力的鉴定。但一般的细菌形态观察、生化试验(唐先春等，猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究[J]，畜牧兽医学报，2005，36(6)：590-595)及毒素的豚鼠皮肤坏死实验(DominickM A等，Turbinate arophy in gnotobiotic pigs intranasally inoculated with protein toxin isolatedfrom type D Pasteurella multocida[J].Am J Vet Res，1986，47(7)：1532-1536)、小鼠致死实验(Rutter J M等，Verulence of Pasteurella multocida in atrophic rhinis of gnotobiotic pigsinfected with Bordetella brochiseptica[J].Res Vet Sci，1983，34(2)：287-295)、细胞促生长实验(Pennings A M等，A test in Vero cell monolayers for toxin production by strains of Pasteurellamultocida isolated from pigs suspected of having atrophic rhinitis[J].Vet.Microbiol，1984，9(3)：503-508)、胎牛肺细胞毒性实验(Rutter  JM等，Cell culture assay for toxigenic Pasteurellamultocida from atrophic rhinitis of pigs[J].Vet Rec，1984，114(2)：393-396)、猫科胎儿肺细胞检测实验(Amigot J A等，Evaluation of techniques for the detection of toxigenic Pasteurellamultocida strains from pigs[J].J Vet Diagn Invest，1998，10(2)：169—173)等操作繁琐、费时耗材，不适用于临床快速检测。Forged(1988)等最先使用单克隆抗体检测初代分离培养基中细菌混合物所产生的毒素，同时以P3F51和P3F37两种不同的鼠抗Pm毒素单克隆抗体为基础，建立了检测毒素PMT的夹心ELISA方法，可以很好的区分T^-Pm和T⁺Pm，其结果与EBL细胞实验完全符合(Foged N T等，Differention of toxigenic Pasteurella multocida from nontoxigenic isolatesof Pasteurella multocida by Enzyme-linked Immunosorbent Assay[J].J Clin Microbiol，1988，26(7)：1419～1420)。Bowersock、Weber、Matschullat等先后报道使用夹心ELISA方法检测猪鼻拭子和扁桃体拭子中PMT毒素。自从发现并测序了T⁺Pm的毒素基因后，人们开始探索应用PCR的方法来鉴定T⁺Pm。1994年Nagai S.等首次根据毒素toxA基因序列设计了特异性引物，应用PCR方法来扩增toxA基因中的特定片段，以区分产毒和不产毒Pm。研究发现只有T⁺Pm才能扩增出目的片段，不产毒的Pm则没有此片段，且A、D型T⁺Pm扩增产物相同，这就提示人们应用PCR方法可能同时检测A、D型T⁺Pm。这些检测病原和毒素的方法已比较成熟，但技术多较为繁琐，设备要求较高，且费用昂贵，临床应用还存在一定的难度，具有很大的局限性，仅适合于实验室进行病原学检测。

猪产毒多杀性巴氏杆菌主要致病因子toxA基因存在于引起PAR的A型、D型产毒多杀性巴氏杆菌。研究发现：PMT的C’端片段能发挥酶的催化作用，且表达的缺失毒素蛋白虽然已经丧失酶活性，但仍可刺激机体产生能保护猪的毒素抗体(Petersen S K等，Recombinantderivatives of Pasteurella multocida toxin：candidates for a vaccine against progressive atrophicrhinitis[J].Infect.Immun，Apr.1991，p.1387-1393)，具有良好的免疫原性。因此，选择同源性高的C’端保守序列，重新构建表达工程菌株，用表达的缺失毒素蛋白作为抗原，可建立检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的间接ELISA诊断方法。

迄今为止，还没有检索到检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的ELISA试剂盒，特别是核心试剂制备方法的公开文献，也不能得到制备该核心试剂的生物材料。

发明内容

本发明目的之一是提供一种快速检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的ELISA试剂盒。

本发明目的之二是提供一种重组大肠杆菌菌株，该菌株可以特异性表达猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端rPMT-C蛋白。

本发明目的之三是重组大肠杆菌菌株在制备猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体试剂盒中的应用。

本发明通过以下技术方案实施：

(1)克隆猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端的DNA片段：以分离的猪产毒多杀性巴氏杆菌基因组为模板DNA，通过PCR方法扩增得到toxA基因C’端2557bp片段(含可表达的2115bp)，经测序分析确定该序列碱基无误配，该DNA序列见Genebank中toxA基因(登录号：AY864768)1755～4007碱基序列。

(2)构建原核表达载体pET28b-C2115：将含猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端片段与克隆载体pMD18-T(购于宝生物工程(大连)有限公司)连接，经限制性内切酶酶切鉴定无误后，将该序列定向插入原核表达载体pET28b(购于宝生物工程(大连)有限公司)的BamHI和SalI多克隆位点。

(3)重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET28b-C2115的构建：将步骤(2)所述的原核表达载体pET28b-C2115转化至大肠杆菌BL21感受态细胞(Escherichia coli BL21购自Novagen公司)，经卡那霉素抗性筛选得到阳性重组菌株。该菌株已于2007年1月31日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。其保藏编号为CCTCC NO：M207012。

(4)猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端编码区2115bp片段在大肠杆菌BL21中的表达：将步骤(3)所述的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET28b-C2115在含25μg/ml卡那霉素(Kan)抗性的LB液体培养基中培养，经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，Western-blot分析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端蛋白，表达的蛋白以分泌上清的形式存在于大肠杆菌BL21中，且具有免疫学活性。

(5)猪产毒多杀性巴氏杆菌阴、阳性标准血清的制备：选择阴性健康长白猪作为免疫动物。用0.8％甲醛分别灭活T⁺Pm和经超声波(频率30kHz，100％振幅，间歇频率0.6，超声时间12min)破碎的T⁺Pm菌液，将两者等体积混合作为抗原，首免用弗氏完全佐剂乳化，二免、三免用弗氏不完全佐剂乳化，通过颈部肌肉注射进行免疫；后两次免疫直接静脉注射T⁺Pm和经超声波(频率30kHz，100％振幅，间歇频率0.6，超声时间12min)破碎的T⁺Pm菌液的混合物，免疫10天后采血，用琼脂扩散试验(陶义训主编，免疫学和免疫学检验。第二版.北京：人民卫生出版社，1999.)检测毒素抗体效价达1:32，同时ELISA检测毒素抗体效价达1:1280，OD₆₃₀≥1.0，即为合格的标准阳性血清。将健康阴性猪经颈动脉采血，即为标准阴性血清。在所制备的阴、阳性标准血清中加入0.01％叠氮钠防腐。

(6)猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测方法的建立：以上述步骤(4)中提纯的rPMT-C表达蛋白为抗原，用步骤(5)制备的阴、阳性标准血清为抗体，通过方阵滴定实验(黄红亮等，胸膜肺炎放线杆菌毒素apxIVA基因的克隆与表达及间接ELISA方法的建立[J]。生物工程学报，2005，(02)：251—257)确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。以方阵滴定确定的抗原最佳浓度包被酶标板，进行该ELISA检测方法各最适反应条件的确定：封闭液的确定、样品稀释液的确定、血清最佳反应时间的确定、酶标抗体反应时间的确定、底物最佳反应时间的确定。

(7)猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒的组装应用：将上述ELISA毒素抗体检测方法相关试剂组装成试剂盒，并进行该试剂盒的敏感性、特异性、符合率和重复性试验。应用该试剂盒对临床采集的血清进行检测，以确定该试剂盒的适用性及准确性。

本发明的有益效果：

1、本发明的有益效果之一是生物安全性高。本发明所涉及到的原核表达载体pET28b是分子生物学中常用表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表达载体pET28b-C2115也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET28b-C2115是将原核表达载体pET28b-C2115转化至大肠杆菌BL21感受态细胞后经卡那霉素抗性筛选获得，不具生物危险性。本发明所用的抗原酶标板是用猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端表达蛋白rPMT-C包被的，制备过程中不涉及猪产毒多杀性巴氏杆菌，因此没有猪产毒多杀性巴氏杆菌逃逸、扩散的潜在危险。

2、本发明的有益效果之二是生产成本低。本发明所提供的猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒所需抗原是猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因C’端表达蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET28b-C2115在体外大量表达，适合大规模的生产。而且目前国内外还没有应用间接ELISA方法检测PMT抗体的相关报道，该试剂盒具有广泛的应用前景。

3、本发明的有益效果之三是提供猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒。目前我国临床上检测猪产毒多杀性巴氏杆菌多采用常规的细菌分离鉴定和毒素活性试验，不但步骤较为繁琐，且试验结果可重复性不高。而本发明从血清学方面检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体，能快速、准确、安全地诊断猪产毒多杀性巴氏杆菌感染。可用于临床大规模的检测T⁺Pm，有利于猪进行性萎缩性鼻炎在规模化猪场的净化。

附图说明

图1：是本发明的技术路线。

图2：是猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因C’端表达载体pET28b-C2115物理图谱及构建流程。

图3：是猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因C’端酶切检测的电泳图谱。

图中：泳道1示BamH I和Sal I对质粒pET28b-C2115的双酶切鉴定；

泳道2示Hind III对质粒pET28b-C2115的单酶切鉴定；

泳道M示DNA Marker DL 15,000。

图4：是猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因C’端蛋白的SDS-PAGE图谱。

图中：泳道1示经诱导的BL21/pET-28b转化子；

泳道2示提取的BL21/pET28b-C2115转化子诱导上清蛋白；

泳道3是未诱导的BL21/pET28b-C2115转化子；

泳道4示未经诱导的BL21/pET-28b转化子；

泳道M示Protein Marker。

图5：是纯化的猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因C’端蛋白的SDS—PAGE和Western-blot分析图谱。

图A中：泳道1～2是经纯化的toxA基因C’端蛋白；

泳道M示Protein Marker。

图B中：泳道1是BL21/pET-28b转化子；

泳道2示BL21/pET28b-C2115转化子；

泳道M示Protein Marker。

图6：是本发明制备的标准阳性血清抗体效价的测定。

图中Ag示抗原，1～6分别示将所制备的标准阳性血清进行2⁰～2⁵倍比递进稀释。图7：是本发明最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定(方阵滴定)。

图中抗体(Ab)从1：20起始倍比递进稀释，抗原(Ag)从1：160起始倍比递进稀释。试验表明血清1：40稀释，抗原蛋白1：1280倍稀释时，P/N值最大，即蛋白最佳包被浓度为20.4ng/孔，血清最佳稀释度为1：40。

图8：猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测方法各反应条件的优化。

图A中：血清最佳反应时间的确定；

图B中：酶标抗体最佳反应时间的确定；

图C中：底物最佳反应时间的确定。

图9：猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒的重复性试验。

图中示不同批次的3批ELISA试剂盒分别检测12份阳、阴标准血清，结果表明所测OD630值变化不显著，可见该方法具有很好的重复性。

图10：是猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒的临床应用。

具体实施方式

实施例1 猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因C’端的克隆

1.引物的设计参考GenBank上公布的toxA基因序列(登录号：Z28388)自行设计了一对C’端亚克隆引物，引物序列如下：

P₁：5’-TAG GAT CCT TTC CGT ATT GGA TTA G-3’

P₂：5’-AAG TCG ACT TAA GAA AGT TGT ATT GG-3’

其中，P1和P2所带下划线部分表示BamH I和Sal I酶切位点，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。该引物扩增的序列为2257bp，其中toxA基因C’端编码区为2115bp，编码毒素r-PMT蛋白为第580个氨基酸到终止子，共705个氨基酸。

2.猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端的克隆

从中国海南省海口市某发病猪场采集的鼻拭子中分离出猪产毒多杀性巴氏杆菌，命名为HN-13(王大鹏等，猪源D型产毒素多杀性巴氏杆菌toxA基因的克隆与表达[J]。中国兽医学报，2006，26(03)：271-274)。将该T⁺Pm菌株培养后，参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法进行基因组的提取及模板DNA的制备。PCR扩增反应体系为：10×Taq Buffer 5.0μl，25mmol/LMgCl₂ 1.0μl，2mmol/L dNTPs 1.5μl，20μmol/L上、下游引物各1.0μl，TaqDNA聚合酶1.0μl，模板3μl，无菌双蒸水加至50μl。PCR反应条件：94℃变性5min，进入30个循环(94℃变性30sec，56复性30sec，72℃延伸2min)，最后72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小2257bp条带为toxA基因C’端目的片段。

实施例2 猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端表达载体的构建

将实施例1中得到的PCR产物进行回收，与克隆载体pMD18-T(购于宝生物工程(大连)有限公司)连接，转化至大肠杆菌DH5α(购自Novagen公司)，筛选阳性克隆，小量提取质粒，用限制性内切酶BamH I和Sal I对重组质粒进行双酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，证实其大小与预期目的片段大小符合；经测序证实该片段无碱基误配，含toxA基因C’端2115bp序列。该重组质粒被命名为pT toxA-C2115。

用BamH I和Sal1分别酶切pT toxA-C2115和载体pET28b，回收toxA基因C’端和载体pET28b；然后用T4ligase连接，16℃水浴过夜，转化至DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，提取重组质粒，酶切鉴定。该重组表达质粒被命名为pET28b-C2115，其BamH I和Sal I双酶切及用Hind III单酶切鉴定结果如图3所示。

实施例3 质粒pET28b-C2115的大量制备

(1)挑取含有质粒pET28b-C2115的DH5α菌落接种于75mL LB培养液，37℃ 300r/min培养过夜，6000rpm 5min，收集细胞沉淀，用3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L乙二胺四乙酸四钠(EDTA)，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0))悬浮；

(2)加6mL溶液II(0.2mol/L NaOH，1％十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate，SDS)，现配现用)，冰浴7-10min；

(3)加4.5mL溶液III(3mol/L乙酸钾，用冰醋酸调pH值至4.8)，冰浴7-10min。4℃10000r/min 10-15min；

(4)取上清，加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温5min后10000r/min 6-15min；

(5)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加1.5mL TE(10.0mmol/LTris-HCl，1.0mmol/L EDTA)悬浮(洗壁20min左右)；

(6)加1.5ml冰预冷的5mol/L NHAc，混匀。4℃ 10000r/min 10min；

(7)将上清转移至7mL的离心管，加1倍体积(3mL)的异丙醇混匀，-20℃作用30min。12000r/m 15min；

(8)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干或自然干燥，加500μL TE悬浮(洗壁20min左右)，并转移至1.5mL的离心管；加入适量的RNase(RNA酶)，37℃ 1h，去RNA；

(9)加1倍体积的13％的聚乙二醇8000(含1.6mol/L NaCl)，混匀，-20℃ 30mmin(可以过夜)，离心，弃上清，用400μL TE重溶；

(10)加等体积酚∶氯仿∶异戊醇抽提2次，氯仿∶异戊醇抽提1次；

(11)加100μl 10mol/L NH₄Ac，充分混匀后，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，4℃ 12000r/min离心5-10min；

(12)弃上清，用75％乙醇漂洗一次，真空抽干，加50μL TE或H₂O重溶，置-20℃备用。

实施例4 重组大肠杆菌菌株的构建

将实施例2中鉴定正确的重组表达质粒pET28b-C2115转化至用CaCl₂法(J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版)制备的大肠杆菌BL21(又称DE3)感受态细胞，涂布含25μg/ml卡那霉素(Kan)的LB平皿，挑选单个BL21/pET28b-C2115阳性克隆，用0.8mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)作诱导剂诱导3.5小时，进行SDS-PAGE和Western-blot检测、分析。同时，将空载体pET-28b(购于宝生物工程(大连)有限公司)转化至大肠杆菌BL21(购自Novagen公司)细胞，作为空白对照菌(BL21/pET-28b)。

由图4可见构建的重组大肠杆菌(BL21/pET28b-C2115)经诱导后在上清中能特异性表达toxA基因C’端78KD蛋白，且从图5B的Western-blot分析可见该蛋白具有良好的免疫原性。

实施例5 最佳诱导物浓度及最佳诱导时间的确定

从平皿上挑取单个重组大肠杆菌菌落至5mL LB培养基，加卡那霉素(Kan)至终浓度为25μg/mL，37℃摇床培养至混浊(约8小时)，放4℃冰箱过夜。取该菌液按体积比1:100于液体LB培养基中扩大培养，同时加卡那霉素(Kan)至终浓度为25μg/mL。分装至5支细菌培养瓶中(5mL/瓶)，置37℃摇床培养约3h至OD₆₀₀

0.6，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L，继续培养3.5h后，等量取样进行SDS-PAGE分析。确定诱导剂IPTG的最佳浓度为0.8mmol/L。

以0.8mmol/L IPTG诱导重组大肠杆菌进行表达，每30分钟取样100μl，共诱导5h，进行SDS-PAGE分析，确定最佳诱导时间为3.5h。

实施例6 toxA基因C’端蛋白rPMT-C的大量诱导及纯化

从平皿上挑取单个菌落至5mL LB培养基，卡那霉素(Kan)至终浓度为25μg/mL，37℃摇床培养至混浊(约8小时)，放4℃冰箱过夜。取该菌液2mL加入200mLLB/Kan培养基中，置37℃摇床培养约3h至OD₆₀₀

0.6，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.8mmol/L，继续诱导培养3.5h。

将诱导的菌体离心收集(4℃，8000rpm×10min)后，以PBS(pH 7.2)洗涤菌体一次。然后根据德国Novagen公司His.Band Purification Kit试剂盒说明书提取毒素C’端rPMT-C蛋白。其中在用1×Binding buffer重悬菌体时加入溶菌酶(购自北京天为时代科技公司)至终浓度为100μg/mL，加1/100体积的10％ Trition X-100，置室温摇床培养30min，再将样品置冰上进行超声波(频率30kHz，100％振幅，间歇频率0.6，超声时间12min)破碎至溶液不再粘稠；在用1×Elute buffer洗脱后，需转至处理好的透析袋中，于TE溶液(pH8.0)透析2-3d(每天换3次)，取出立即使用或分装至1.5mL管，—20℃或—80℃保存备用。

实施例7 表达蛋白rPMT-C的SDS-PAGE检测和Western-blot分析

1.SDS-PAGE检测：取实施例6所纯化的蛋白rPMT-C 100.0μL，加入80.0μL的2×SDS加缓冲液(100mmol/L Tris.HCl(pH 6.8)，4％ SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油)和10.0μL二硫苏糖醇(DTT)，充分重悬，水浴煮沸3-5min，然后置冰浴上5min，上样电泳。参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版介绍的方法制备分离胶和集层胶，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，取处理好的样品上样，80V电泳3h。取下凝胶，考马斯亮蓝R250染色液染色，然后用SDS-PAGE脱色液脱色，观察照相，如图5A所示，可见78KD大小的纯化蛋白。

2.Western-blot分析：为分析表达物rPMT-C的免疫学活性，按上所述方法进行SDS-PAGE电泳，电泳后的凝胶，不经染色，直接用Bio-RAD公司Mini Trans-Blot Electrophoretic Cell转印装置将经纯化的蛋白转印到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，以0.65mA/cm²电转印2h。转印结束后，将NC膜于TBST(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，150mmol/L氯化钠，0.05％土温-20)中漂洗，再将NC膜转入可加热密封的塑料袋中，按0.1-0.15mL/cm²(NC膜面积)加入封闭液(1％牛血清白蛋白，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，150mmol/L氯化钠，0.05％土温-20)，室温平缓摇动1-2h或4℃过夜。然后弃封闭液，将膜取出，转入新的塑料袋中，按0.1-0.15mL/cm²的量加入经TBST稀释(体积比1:40)的一抗(猪抗产毒多杀性巴氏杆菌阳性标准血清)，同上排除气泡并密封袋口，在摇床上室温处理1h，TBST洗6次，每次5min，将膜转入新塑料袋中，按0.1-0.15mL/cm²加入经TBST稀释(体积比1:5000)的二抗(兔抗猪IgG-HRP)，室温反应1h，TBST洗6次，每次5min，最后再用TBS漂洗2次，加入以0.01mol/LTris-Cl(pH7.6)配制的底物溶液(DAB-H₂O₂)显色，一旦出现蛋白带，立即用ddH₂O终止，即可观察并照相。结果如图5B所示，在78KD处出现特异性条带，表明rPMT-C具有良好的免疫原性。

实施例8 猪产毒多杀性巴氏杆菌标准阴、阳性血清的制备

1、标准阳性血清的制备

采用猪产毒多杀性巴氏杆菌ompH-ELISA方法(吴斌等，猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆、表达[J].畜牧兽医学报，2005，36(7)，701～704)，选择30日龄的阴性健康长白猪作为免疫动物。用0.8％甲醛分别灭活T⁺Pm和经超声波(频率30kHz，100％振幅，间歇频率0.6，超声时间12min)破碎的T⁺Pm菌液，将两者的混合物(体积比1：1)作为抗原，加入等体积弗氏完全佐剂乳化后，颈部肌肉注射2.5ml(T⁺Pm总菌量为20亿/ml)作为基础免疫原；21天时进行二免，用等体积的弗氏不完全佐剂乳化上述抗原混合物后，颈部肌肉注射5ml(T⁺Pm总菌量为20亿/ml)；15天后再加强免疫一次，即颈部肌肉注射7.5ml(T⁺Pm总菌量为20亿/ml)用弗氏不完全佐剂乳化的免疫原；10天后采血抽查，发现所制备血清ELISA毒素效价不高，于是直接耳静脉注射T⁺Pm和经超声波(频率30kHz，100％振幅，间歇频率0.6，超声时间12min)破碎的T⁺Pm菌液的混合物；一周后采血抽查，并继续静脉注射4ml(菌量：T⁺Pm总菌量为20亿/ml)混合物；最后一次免疫10天后采血，用琼脂扩散试验检测毒素抗体效价达1:32，如图6所示。同时ELISA检测毒素抗体效价达1:1280。经颈动脉采血后，37℃静置1h，4℃过夜，2000rpm/min离心20min，分离血清，在所得血清中加入0.01％叠氮钠防腐，并充分摇匀，—80℃保存备用。

2、标准阴性血清的制备

将选择的30日龄猪产毒多杀性巴氏杆菌阴性健康长白猪经颈动脉采血，分离血清，加入0.01％叠氮钠防腐，—80℃保存备用。

实施例9 猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测方法相关试剂的配方

1.包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，用双蒸馏水(ddH₂O)补充至1000mL(pH9.6)。

2.洗涤液(含0.05％Tween-20的PBS溶液)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g，KH₂PO₄ 0.2g，Tween-20 0.5mL，用双蒸馏水(ddH₂O)补充至1000m(pH7.4)。

3.封闭液：0.2g牛血清白蛋白(BSA)溶于100mL洗涤液。

4.样品稀释液：将空白对照菌(BL21/pET28b)经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导3.5h，离心收集菌体，加入原培养物体积1/10的PBS溶液(pH7.4)重悬，于—80℃速冻1h，超声波(频率30kHz，100％振幅，间歇频率0.6，超声时间12min)破碎至透明(2-3min)；取该溶液20mL，加入封闭液80mL，即为样品稀释液。

5.底物显色A液：Na₂HPO₄14.6g、柠檬酸9.33g、过氧化氢脲0.52g，加双蒸馏水(ddH₂O)定容至1000ml，调至pH5.0～5.4，无菌分装，10ml/瓶。

6.底物显色B液：四甲基联苯胺(TMB)20mg、无水乙醇10ml，加双蒸馏水(ddH₂O)定容至1000ml，无菌分装，10ml/瓶。

7.终止液(0.25％氢氟酸)：氢氟酸(40％)625μL，加双蒸馏水(ddH₂O)定容至100mL，无菌分装，10ml/瓶。

另外，兔抗猪酶标二抗为Southern biotechnology associates(SBA)公司产品，用封闭液按体积比1:5000将兔抗猪IgG-HRP酶标二抗稀释后制成，无菌分装，20ml/瓶。

实施例10 ELISA最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定(方阵滴定)

将实施例6纯化的蛋白rPMT-C(作为抗原)用包被液倍比稀释包被酶联板100μL/孔，每个浓度包被1行。于37℃温育1h后放置于4℃过夜，取出洗涤3次，每次3min，然后每孔加入150μL封闭液，37℃封闭30min，取出洗涤3次，每次3min。将血清在酶标板上从1∶20开始倍比稀释，纵向加入酶标板中，100μL/孔，37℃反应45min以后，洗涤3次。加入按体积比1∶5000用封闭液稀释的兔抗猪IgG-HRP，100μL/孔，37℃反应45min，经洗涤后分别加入50μL底物显色A液和底物显色B液，反应15min，最后加入50μL 0.25％HF终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD值。选择阳性血清与阴性血清OD₆₃₀的比值(P/N)最大时，抗原与抗体分别所对应的稀释度作为判定标准，见图7。结果抗原最佳包被浓度为20.4ng/孔，血清样品最佳稀释度为1∶40。

实施例11 猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测方法阴阳性界限的确定

选择未经猪产毒多杀性巴氏杆菌感染和免疫，用猪产毒多杀性巴氏杆菌ompH-ELISA方法(吴斌等，猪源多杀性巴氏杆菌ompH基因的克隆、表达[J]，畜牧兽医学报，2005，36(7)，701～704)检测为阴性的血清208份，进行猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测，同时设标准阴、阳性对照，结果如表1所示。计算检测阴性血清的平均值(X)和检测阴性血清的标准偏差(SD)。按X+2SD求得ELISA毒素抗体检测方法的阴阳界限为0.38。

表1 猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测方法阴阳界限的确定

实施例12 猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测方法各反应条件的优化

1.封闭液的确定

分别用含0.1％、0.5％、1％牛血清白蛋白(BSA)和5％脱脂乳的磷酸盐缓冲液作为封闭液，进行ELISA检测，确定最适合的封闭剂为5％脱脂乳(见表2)。

表2 不同封闭剂对检测标准阴、阳性血清结果的影响

2.样品稀释液的确定

分别使用(1)含0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.5％土温-20的磷酸盐缓冲液，(2)含0.5％BSA、0.5％土温-20的磷酸盐缓冲液，(3)改良样品稀释液：将空白对照菌(BL21/pET28b)经诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导3.5h，离心收集菌体，加入原培养物体积1/10的PBS溶液(pH7.4)重悬，于—80℃速冻1h，超声波(频率30kHz，100％振幅，间歇频率0.6，超声时间12min)破碎至透明(2-3min)；取该溶液20mL，加入含0.1％BSA和0.5％土温-20的磷酸盐缓冲液80mL，即为改良样品稀释液。进行ELISA检测，确定最适的样品稀释液为改良样品稀释液(见表3)。

表3 不同血清稀释液对检测标准阴、阳性血清结果的影响

3.血清最佳反应时间的确定

加入待检血清后，分别于37℃作用15分钟、30分钟、45分钟、60分钟，进行ELISA检测，确定血清的最佳反应时间为37℃45分钟，见图8A。

4.酶标抗体反应时间的确定

将酶标二抗用封闭液按体积比作1：5000稀释后，37℃分别作用15分钟、30分钟、45分钟、60分钟及90分钟，进行ELISA检测，确定酶标抗体的最佳反应时间为37℃ 30分钟，见图8B。

5.底物的最佳反应时间的确定

加入底物后37℃分别反应5分钟、10分钟、15分钟及30分钟，进行ELISA检测，确定底物的最佳反应时间为37℃ 10分钟，见图8C。

实施例13 猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒的操作步骤

用上述包被液将纯化的蛋白rPMT-C按实施例10确定的抗原最佳包被浓度包被酶标板(100μL/孔)，于37℃温育1h后，放置4℃过夜，取出用洗涤液洗涤3次，每次3min，然后每孔加入150μL封闭液，37℃封闭30min。将待检血清用样品稀释液按最佳稀释倍数稀释后加入酶标板，100μL/孔于37℃反应45分钟，用洗涤液洗涤3次，每次3min，用封闭液将兔抗猪IgG-HRP按体积比1∶5000稀释后，每孔加100μL，37℃反应30分钟，取出洗涤5次，每次3min，然后分别加入50μL底物显色A液和底物显色B液，反应10min，最后加入50μL0.25％氢氟酸终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD值。OD₆₃₀≥0.38为阳性，疑为猪产毒素多杀性巴氏杆菌感染；OD₆₃₀<0.38为阴性。

实施例14 本发明的猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒的特异性试验

用所制备的ELISA试剂盒分别检测大肠杆菌阳性血清、波氏杆菌阳性血清、胸膜肺炎放线杆菌阳性血清、副猪嗜血杆菌阳性血清、猪伪狂犬阳性血清、猪繁殖与呼吸综合症阳性血清、口蹄疫阳性血清，同时设立猪产毒多杀性巴氏杆菌阴、阳性对照，观察上述各血清与猪产毒多杀性巴氏杆菌人工表达蛋白rPMT-C的交叉反应，见表4。

表4 本发明的试剂盒的特异性检验结果

由表4可知：除T⁺Pm标准阳性血清的OD₆₃₀>0.38(临界值)，判为阳性外，其它细菌和病毒性疾病的标准阳性血清的OD₆₃₀值均小于临界值，为阴性。结果表明本发明的ELISA试剂盒具有良好的特异性。

实施例15 本发明的猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒的敏感性试验

将10份阳性血清按体积比1:5、1:10～1:1280连续倍比稀释后，分别用3批猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒和琼脂扩散试验检测。将琼脂扩散试验检测为阳性的血清的最高稀释倍数定义为该份血清的琼脂扩散试验效价；将ELISA检测为阳性的血清的最高稀释倍数定义为该份血清的ELISA效价，比较二者的敏感性。结果见表5，琼脂扩散试验检测的血清效价为1～4，而ELISA抗体诊断试剂盒检测结果效价为320～640，表明ELISA的敏感性是琼脂扩散试验的160～640倍。ELISA的敏感性高，更适合作为猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体水平检测、临床诊断及流行病学调查的有效工具。

表5 ELISA和琼脂扩散试验的检测结果比较

实施例16 本发明的猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒与Dot-blotting检测方法的符合率比较

应用该ELISA毒素抗体检测试剂盒对临床采集的182份血清样品进行检测，同时按文献(Sambrook J等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual2nd NewYork：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，1989)提供的Dot blotting分析方法进行同步检测，进而比较毒素抗体ELISA试剂盒与Dot blotting分析方法的符合率(见表6)。

表6 本发明的试剂盒与Dot-blotting方法的符合率实验结果

由表6可见两种方法检测样品的阳性符合率为92.3％(72/78)；阴性符合率87.5％(91/1O4)；总符合率为89.6％(163/182)。结果表明：该检测方法能准确地评价血清样品中猪产毒多杀性巴氏杆菌的毒素抗体水平。

实施例17 本发明的猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒的重复性试验

采用不同批次的猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA试剂盒检测相同样品的重复性试验：用3块不同批次的猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA试剂盒分别同时检测12份猪产毒多杀性巴氏杆菌阳性与阴性血清，观察OD₆₃₀值的变化情况，结果见图9。

图9结果显示，不同批次的ELISA试剂盒分别检测12份阳、阴血清所测OD₆₃₀抗体效价值变化不显著，可见，该方法具有很好的重复性，能快速、准确地诊断猪产毒多杀性巴氏杆菌感染的猪只。

实施例18 本发明试剂盒的组装

抗原包被板              2块(96孔/块)

阴性对照血清            1管(0.5ml/管)

阳性对照血清            1管(0.5ml/管)

兔抗猪IgG酶标二抗       1瓶(20ml/瓶)

样品稀释液              1瓶(50ml/瓶)

底物显色A液             1瓶(10ml/瓶)

底物显色B液             1瓶(10ml/瓶)

终止液                  1瓶(10ml/瓶)

20倍浓缩洗涤液          1瓶(30ml/瓶)

使用说明书              1份

实施例19 本发明的试剂盒的临床应用

应用本发明的猪产毒多杀性巴氏杆菌ELISA毒素抗体检测试剂盒，检测从全国17个省份采集的1091份血清样品，结果阳性血清有389份，阳性率35.61％，见图10。表明本发明的试剂盒适合于对临床采集的大量样品进行快速检测，能准确评估猪群产毒多杀性巴氏杆菌的感染状况，具有广阔的应用前景。

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。

Claims (5)

1、一种表达猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端rPMT-C蛋白的重组大肠菌BL21/pET28b-C2115，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M207012，所述的rPMT-C蛋白为毒素toxA基因C’端编码区为2115bp编码的第580个氨基酸到终止子。

2、一种表达猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素toxA基因C’端蛋白的重组质粒pET28b-C2115，其特征在于，该重组质粒为表达毒素toxA基因C’端2115个碱基的原核表达质粒。

3、一种检测猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含有权利要求1所述的重组大肠杆菌表达的猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素蛋白。

4、根据权利要求3所述的试剂盒，它包括盒体、包被有以纯化的表达毒素toxA基因C’端蛋白作为抗原的酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、兔抗猪IgG酶标二抗、样品稀释液、底物显色A液、底物显色B液、终止液和洗涤液。

5、权利要求1所述的重组大肠杆菌在制备猪产毒多杀性巴氏杆菌毒素抗体检测试剂盒中的应用。

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