CN104407156A - 检测多糖结合蛋白(lbp)的胶乳增强免疫比浊试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种定量检测脂多糖结合蛋白（LBP）的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联LBP抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与LBP抗体之间以共价交联方式连接。本发明检测试剂盒制备成本低廉，稳定性好，易于保存，数据重复性好，检测灵敏度高，可广泛应用于临床生化仪。

Description

检测多糖结合蛋白(LBP)的胶乳增强免疫比浊试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种定量检测脓度症标志应急蛋白脂多糖结合蛋白(LBP)的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法和用途。

背景技术

脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)是一种分子量为60kDa,456个氨基酸组成的糖蛋白，以单链多肽的形式在肝细胞内合成，它属于I型急性期反应蛋白，存在于人和动物的血清中。LBP既可将细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)多聚体转换为单聚体,加速LPS与其受体CD14结合,显著放大LPS的致炎作用；也可加速LPS与靶细胞膜上的清除受体结合,使LPS被靶细胞清除；还可催化LPS与脂蛋白结合,后者可中和LPS的生物学活性,加速体内LPS的清除。LBP的不同作用可能是由不同功能位点决定的。当LBP的某一功能位点与LPS的类脂A结合时,表现为对LPS的增敏作用；而当另一功能位点与LPS的类脂A结合时,则可增强LPS的内化,表现为对LPS的抑制性调理作用。生理条件下，血浆LBP的浓度很低仅达100ng/L,在LPS等致炎因子的作用下，LBP的浓度可升高100-1000倍,如儿童急性胰腺炎和细菌感染时，LBP的浓度可显著升高。LBP可在几种体液中检测到，在急性反应期腹腔的浓度是血浆的1％。经研究证实，LBP血浆水平的升高是炎症细胞因子IL-1,IL-6,TNFa介导的LBP基因转录水平的激活而引起的。因而，与常规用于炎症诊断的指标相比，LBP的早期检测是预测全身炎症反应和脓毒症的标志指标之一。该检测可能在细菌性感染的严重程度或脓毒症的早期诊断，肝病晚期合并细菌感染，高危患者(如ICU，器官移植术后或免疫抑制治疗的患者)感染性疾病的监测，疾病转归的评估，以及指导治疗方案的选择等方面有很高的价值。LBP检测可广泛用于ICU病房、外科、感染科、创伤科及新生儿监护室、器官移植科、急诊科和治疗实验室等。

对于LBP检测，现有检测方法主要有定量方法和定性检测方法，定量检测方法有双抗夹心法(ELISA)、放射免疫分析法、免疫层析法等，其中放射免疫分析法在临床中有一定的限制。目前通常应用ELISA方法检测，检测范围：0.312-20pg/mL，灵敏度：最小可测0.15pg/mL，特异性：可同检测重组或天然的待测物质，且与其它相关蛋白无交叉反应，重复性：板内，板间变异系数均<10％。尽管ELISA的灵敏度较高，但其操作复杂，需要较多时间，一般结果为定性或半定量，定量时偏差较大，且线性范围窄，对于样品稀释度不好控制。定性方法主要有免疫层析法，其可以作为定性或半定量检测方法，可以快速给出结果，定性时不需要特殊仪器，但是不能给出定量数据，而且主观误差较大。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种制备成本低廉，稳定性好，易于保存，数据重复性好，检测灵敏度高，可广泛应用于临床生化仪的LBP检测试剂盒，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种定量检测脂多糖结合蛋白(LBP)的胶乳增强免疫比浊试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联LBP抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与LBP抗体之间以共价交联方式连接。

本发明中的防腐剂1和2是指可以抑制试剂中细菌和微生物污染的一类试剂，对试剂具有防腐杀菌的作用。试剂R2中的保护剂2是一类能够保护胶乳颗粒表面的抗体的试剂。稳定剂1和2可以保持试剂内的电荷平衡。

本技术方案中的LBP胶乳增强免疫比浊试剂盒，将LBP抗体交联在聚苯乙烯胶乳微球表面，当血液中的LBP与LBP抗体反应时，带动聚苯乙烯胶乳微球聚集产生一定浊度，而浊度与血液中的LBP含量在一定范围成正比，可以用全自动生化仪在400-800nm波长下检测血液中LBP的含量。

优选地，所述试剂R1中的缓冲液1选自Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0，浓度为25～500mmol/L；所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液、Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0，浓度为25～500mmol/L。

优选地，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明对所述试剂R1中的缓冲液1进行了改进，所述试剂R1中的缓冲液1包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5－7.5g/L，生物缓冲液1的pH值为7.2－7.6。

优选地，各组分在缓冲液1中的浓度为：

所述缓冲液1的溶剂为水。

所述缓冲液1可以采用本领域内公知的各种pH调节剂来进行pH调节。

优选地，所述试剂R1中的稳定剂1选自KCl、NaCl、CaCl₂中的任意一种或多种的组合，其质量浓度为0.5％～10％，这样的稳定剂1具有价格低廉、原料易得的优点。所述试剂R2中的稳定剂2采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用；其中离子稳定剂为NaCl、KCl、Na₂CO3、Na₂SO4或者K₂SO4，悬浮稳定剂为PEG8000、蔗糖、甘油或者葡萄糖；其中优选NaCl和蔗糖配合使用，这样可以保持体系长期稳定。

优选地，所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300；所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300。这样的防腐剂1和2具有优良的防腐杀菌性能。

优选地，所述试剂R1中的增凝剂为PEG8000或者葡聚糖。更优选PEG8000，是由于PEG8000属于非离子型水溶性聚合物，在水中的溶解性比较大，可以调节试剂R1的粘度，促进抗原和抗体分子结合为复合物。

优选地，所述试剂R2中的聚苯乙烯乳胶微球的表面官能团为氨基、羧基、酰肼、醛基或环氧基，聚苯乙烯乳胶微球的的粒径在100～600nm。优选表面官能团为羧基的聚苯乙烯胶乳微球，这是由于聚苯乙烯胶乳微球表面为羧基的官能团很容易被EDC活化，从而快速与PCT抗体结合，增加偶联效果，保证测试结果的稳定性及准确性。

优选地，所述试剂R2中的LBP抗体为鼠抗人LBP抗体、山羊抗人LBP IgG抗体或兔抗人LBP IgG抗体的一种或者多种的组合。

优选地，所述试剂R1中的保护剂1为牛血清白蛋白；所述试剂R2中的保护剂2为牛血清白蛋白。所述保护剂1和2可以保护聚苯乙烯胶乳颗粒表面的LBP抗体的活性。

优选地，所述试剂R1中的EDTA的浓度为10～100mmol/L。

本发明第二方面提供了所述LBP检测试剂盒的制备方法和使用方法，具体包括如下步骤：

(1)试剂R1的制备：

在缓冲液1中加入稳定剂1、增凝剂、防腐剂1、保护剂1和EDTA，搅拌混合均匀，即得试剂R1；

(2)试剂R2的制备：

步骤一：将LBP抗体进行4℃透析，再用缓冲液2将LBP抗体稀释至2mg/ml，得到LBP抗体稀释液；将聚苯乙烯胶乳微球用蒸馏水离心、洗涤3次；

步骤二：用缓冲液2将经过步骤一洗涤后的聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.01％-0.1％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入步骤一得到的LBP抗体稀释液，室温下搅拌反应30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用缓冲液2洗涤沉淀，重复离心洗涤3次，最后加入缓冲液2、防腐剂2、稳定剂2、保护剂2搅拌混合均匀即得试剂R2。

优选地，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和显色效果，本发明对所述试剂R1中的缓冲液1进行了改进，所述试剂R1中的缓冲液1包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5－7.5g/L，生物缓冲液1的pH值为7.2－7.6。

优选地，各组分在缓冲液1中的浓度为：

所述缓冲液1的溶剂为水。

所述缓冲液1可以采用本领域内公知的各种pH调节剂来进行pH调节。

与现有检测技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.采用胶乳增强免疫比浊法，当血液中的LBP与LBP抗体反应时，带动了聚苯乙烯胶乳聚集产生一定的浊度，而浊度与血液中的LBP含量在一定范围内成正比，可以在400～800nm的波长下进行检测，检测更为方便，容易在临床中应用。

2.聚苯乙烯胶乳微球的表面官能团为氨基、羧基、酰肼或者环氧基等，其表面的官能团可以和抗体表面的氨基等结合形成共价偶联结构，使LBP抗体牢固的结合在胶乳微球表面，保证了R2的稳定性，延长了试剂有效期。

3.采用粒径为100～600nm的大颗粒聚苯乙烯胶乳颗粒，具有较大的粒径，增加了血液中LBP和LBP抗体反应时的浊度，从而增加测试反应的灵敏度、缩短了反应时间。

4.试剂R2中采用离子稳定剂和悬浮稳定剂结合使用，使试剂的电荷平衡状态，提高了LBP胶乳增强免疫比浊试剂盒的稳定性，使得LBP胶乳增强免疫比浊试剂盒的稳定性可达18个月。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODSIN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1：

本发明的试剂盒举例是双试剂，其中：

试剂R1:

试剂R2:

包被有鼠抗人脂多糖结合蛋白多克隆致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，粒径200nm，浓度1％。

校准品：

按照需要的脂多糖结合蛋白参考校准品浓度将相应的脂多糖结合蛋白标准品分别加入上述缓冲液，制备得到不同浓度的一组校准品。

实施例2：试剂盒使用方法。

1.试剂准备，试剂为液体双试剂，开瓶即用，其中：

(1)试剂R1的制备：

配置缓冲液1：水苏糖0.8-3g/L、明矾0.1-1g/L、果糖二磷酸钠0.8-3g/L六偏磷酸钠0.05-0.5g/L、甘氨酸1.5-2.25g/L、溶剂为水，PH7.4。

在缓冲液1中加入PEG80002.8g/L、叠氮钠1.8g/L、牛血清白蛋白2.0g/L、乙二胺四乙酸二钠4.0g/L、氯化钠2.0g/L，搅拌混合均匀，即得试剂R1；

(2)试剂R2的制备：

步骤一：将LBP抗体进行4℃透析，再用缓冲液2将LBP抗体稀释至2mg/ml，得到LBP抗体稀释液；将聚苯乙烯胶乳微球用蒸馏水离心、洗涤3次；

步骤二：用缓冲液2(氨基丁三醇缓冲液75mmol/L，PH7.2)将经过步骤一洗涤后的聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.01％-0.1％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入步骤一得到的LBP抗体稀释液，室温下搅拌反应30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用缓冲液2(氨基丁三醇缓冲液75mmol/L，PH7.2)洗涤沉淀，重复离心洗涤3次，最后加入缓冲液2(氨基丁三醇缓冲液75mmol/L，PH7.2)、加入PEG80002.8g/L、叠氮钠1.8g/L、牛血清白蛋白2.0g/L、乙二胺四乙酸二钠4.0g/L、氯化钠2.0g/L，搅拌混合均匀即得试剂R2。

(3)按照需要的脂多糖结合蛋白参考校准品浓度将相应的脂多糖结合蛋白标准品分别加入上述缓冲液，制备得到不同浓度的一组校准品。

2.全自动生化仪参数设置

(a)检测波长：主波长为600nm，副波长为none；

(b)检测温度：37℃；

(c)反应时间：10min，其中，孵育时间5min，加入试剂R2后立即测定读取吸光度A1，5分钟后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1；

(d)反应方向：负方向

3.检测步骤

(a)取200ul试剂R1与5ul血清样本(避免溶血)混匀；

(b)将混匀后的溶液在37℃孵育时间5min；

(c)再加入50ul试剂R2，立即测定读取吸光度A1，5分钟后读取吸光度A2，计算吸光度变化ΔA＝A2-A1。

4.通过校准曲线计算出样本中脂多糖结合蛋白LBP的含量。

下述测试为对实施例1试剂盒的性能测试

将实施例1制备的脂多糖结合蛋白检测试剂盒进行性能测试，主要测试其分析最低检出限、准确度、重复性、及抗干扰性等。

1)最低检测限：采用5％BSA生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续重复检测20次，记录检测结果。结果显示其最低检测限为1pg/ml。

2)准确性：选择合适浓度的常规检测样本，向常规样本中加入不同量的定值标准品制作成回收样本，定值样本用去离子水作为溶剂；在常规样本中加入同样量的去离子水制作成基础样本，加入的定值标准品的量不超过总体积的1/10，每个重复3次检测取其均值为回收浓度。结果显示平均回收率为100.24％，准确度较高。

3)稳定性：取脂多糖结合蛋白检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间2，4，6，8，9，10，11，12，13，14个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示脂多糖结合蛋白检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为12个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为30天。

4)抗干扰性：将不同浓度的干扰物加入到血清标本中，对照组加入蒸馏水,以加入干扰物质的血清三次检测平均值，作为实测值，以加入蒸馏水的血清的对照组三次检测平均值为基准值。实测值减去基准值然后除以基准值得偏差。结果显示样本中胆红素≤300μmol/L、血红蛋白≤1mg/mL、乳糜≤0.30％时对脂多糖结合蛋白检测试剂盒检测结果的干扰小于10％。

实施例3

对比试剂盒的制备及使用：

试剂R1中的缓冲液采用氨基丁三醇缓冲液75mmol/L，PH7.2，其他试剂及实验方法均同实施例1和2。

试剂R1:

试剂R2:

包被有鼠抗人脂多糖结合蛋白多克隆致敏聚苯乙烯胶乳颗粒，粒径200nm，浓度1％。

校准品：

按照需要的脂多糖结合蛋白参考校准品浓度将相应的脂多糖结合蛋白标准品分别加入上述缓冲液，制备得到不同浓度的一组校准品。

将实施例3制备的脂多糖结合蛋白检测试剂盒进行性能测试，方法同实施例2。

1)最低检测限：采用5％BSA生理盐水溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续重复检测20次，记录检测结果。结果显示其最低检测限为2ug/ml。

2)准确性：选择合适浓度的常规检测样本，向常规样本中加入不同量的定值标准品制作成回收样本，定值样本用去离子水作为溶剂；在常规样本中加入同样量的去离子水制作成基础样本，加入的定值标准品的量不超过总体积的1/10，每个重复3次检测取其均值为回收浓度。结果显示平均回收率为100.00％，准确度较高。

3)稳定性：取本实施例的检测试剂盒进行常规贮存稳定性试验，2-8℃放置分别按时间2，4，6，8，9，10，11，12，13，14个月进行检测；开盖稳定性试验分别按2-8℃放置0天、7天、14天、16天、18天、20天、22天、24天、26天、28天、30天、32天进行测定。结果显示本实施例的检测试剂盒贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为10个月。开盖贮存于2-8℃、避光环境中，有效期为25天。

4)抗干扰性：将不同浓度的干扰物加入到血清标本中，对照组加入蒸馏水,以加入干扰物质的血清三次检测平均值，作为实测值，以加入蒸馏水的血清的对照组三次检测平均值为基准值。实测值减去基准值然后除以基准值得偏差。结果显示样本中胆红素≤300μmol/L、血红蛋白≤1mg/mL、乳糜≤0.30％时对脂多糖结合蛋白检测试剂盒检测结果的干扰小于15％。

综上所述，本发明所提供的检测试剂盒具有良好的抗干扰性和特异性，且具有很好的灵敏性，阳性显色强，阴性本底更低，有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种脂多糖结合蛋白检测试剂盒，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1主要由缓冲液1、稳定剂1、防腐剂1、EDTA、增凝剂和保护剂1组成；所述试剂R2主要由交联LBP抗体的聚苯乙烯胶乳微球、缓冲液2、稳定剂2、防腐剂2、保护剂2组成，其中聚苯乙烯胶乳微球与LBP抗体之间以共价交联方式连接。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液1选自Hepes缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、PBS缓冲液、甘氨酸缓冲液、硼砂缓冲液中的任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0，浓度为25～500mmol/L；所述试剂R2中的缓冲液2选自PBS缓冲液、硼砂缓冲液、甘氨酸缓冲液、Hepes缓冲液、GOODS缓冲液、MOPS缓冲液中任意一种或多种的组合，其pH为7.0～9.0，浓度为25～500mmol/L。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液1包括下列组分：水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠和甘氨酸，且水苏糖、明矾、果糖二磷酸钠、六偏磷酸钠、甘氨酸的总浓度为3.5－7.5g/L，生物缓冲液1的pH值为7.2－7.6。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的稳定剂1选自KCl、NaCl、CaCl₂中的任意一种或多种的组合，其质量浓度为0.5％～10％；所述试剂R2中的稳定剂2采用离子稳定剂和悬浮稳定剂配合使用；其中离子稳定剂为NaCl、KCl、Na₂CO3、Na₂SO4或者K₂SO4，悬浮稳定剂为PEG8000、蔗糖、甘油或者葡萄糖。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的防腐剂1为叠氮钠、硫柳汞或者ProClin300；所述试剂R2中的防腐剂2为叠氮钠、硫柳汞或ProClin300。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的增凝剂为PEG8000或者葡聚糖。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的聚苯乙烯乳胶微球的表面官能团为氨基、羧基、酰肼、醛基或环氧基，聚苯乙烯乳胶微球的的粒径在100～600nm。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的保护剂1为牛血清白蛋白；所述试剂R2中的保护剂2为牛血清白蛋白。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的EDTA的浓度为10～100mmol/L。

10.根据权利要求1～9任一权利要求所述的试剂盒的制备方法和使用方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)试剂R1的制备：

在缓冲液1中加入稳定剂1、增凝剂、防腐剂1、保护剂1和EDTA，搅拌混合均匀，即得试剂R1；

(2)试剂R2的制备：

步骤一：将LBP抗体进行4℃透析，再用缓冲液2将LBP抗体稀释至2mg/ml，得到LBP抗体稀释液；将聚苯乙烯胶乳微球用蒸馏水离心、洗涤3次；

步骤二：用缓冲液2将经过步骤一洗涤后的聚苯乙烯胶乳微球稀释到质量浓度为1％，再加入质量浓度为0.01％-0.1％的EDC，在室温下搅拌反应30min，反应结束后15000rpm离心洗涤以除去未反应的EDC，然后加入步骤一得到的LBP抗体稀释液，室温下搅拌反应30min，再加入终止液终止反应，将得到的反应液15000rpm离心，用缓冲液2洗涤沉淀，重复离心洗涤3次，最后加入缓冲液2、防腐剂2、稳定剂2、保护剂2搅拌混合均匀即得试剂R2。