CN104678110B - 一种血清cenpf抗体定量检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明专利涉及一种血清CENPF抗体定量检测试剂盒，可以特异性定量检测血清标本中CENPF抗体的水平。本发明将重组CENPF抗原蛋白包被于96孔酶标板中，通过酶联免疫吸附法定量测定血清标本中的CENPF抗体水平，根据血清CENPF抗体水平高低来评估肝细胞癌患者或高危人群的疾病状态。本试剂盒提供了一种新的肝细胞癌筛查及早期诊断方法，所检测的血清CENPF自身抗体用于诊断肝细胞癌的敏感性显著优于目前临床使用的血清标志物AFP。

Description

一种血清CENPF抗体定量检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种血清CENPF抗体定量检测试剂盒。

背景技术

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要类型。由于HCC缺乏早期症状，大部分病人出现症状时已属中晚期，失去有效治疗的机会，存活期一般少于1年，早期HCC通过切除术或肝移植，5年生存率在60-70％以上。因此，通过对高危人群的定期筛查及时发现和诊断早期病例至关重要。但目前临床上仍缺乏敏感度高、特异性好，且具有临床可操作性的HCC筛查及早期诊断方法。

理想的HCC早期诊断方法不仅要有较高的特异性，能够将HCC与肝硬化、肝炎等区别开来，还要有较高的敏感性，能够在肝细胞癌的早期阶段即能检出。此外，作为HCC的筛查及早期诊断方法，还必须具备临床可操作性，如简便经济，尤其是对患者创伤最小而易于被接受等。作为目前临床常用的HCC筛查和诊断方法，超声检查虽然无创但高度依赖临床医生的个人经验且不易从肝硬化背景中发现早期HCC；CT及MRI检查能显著提高早期HCC的检出率，但需要使用专门的仪器设备，费用非常昂贵；肝穿刺组织病理学检查虽然仍是早期HCC诊断的金标准，但由于侵入性特点、操作复杂且难度大，不易为病人接受。比较而言，通过检测病人血清标志物实现HCC的早期诊断无疑具有独特的优势和很强的可操作性。

目前已用于HCC临床诊断的血清标志物主要为甲胎蛋白(AFP)，由于受研究设计(回顾性研究和前瞻性研究)、HCC病因学因素、受检人群及所设定的临界值不同等因素的影响，AFP的敏感度和特异度存在较大的差异。大多数临床研究结果表明，当临界值为20ng/ml时，AFP诊断HCC的敏感度和特异度分别为40％～65％和75％～90％不等。而且，只有当AFP血清浓度达到500ng/ml时才表现出很好的特异性，提示AFP作为HCC诊断标志物特异性高但敏感度不够，可能不适合HCC的早期诊断。近年来出现的AFP异构体(AFP-L3)和异常凝血酶原(DCP)的敏感度或特异性有了一定的提高，可与AFP联合使用以提高敏感度。其他仍处于实验室研究阶段的HCC血清标志物还包括硫酸肝素多糖3(GPC3)、高尔基蛋白73(GP73)、生长因子或细胞因子(如TGFβ1、IGF-II、HGF等)以及一些酶和同工酶(如GGT-II、AFU、AAG)等。近年来，随着以蛋白质双向电泳、新型质谱分析为主的蛋白质组学方法的应用，为寻找新型HCC标志物提供了强有利的工具，已报导筛选出一些新的潜在血清标志物。但总体说来，目前已有的或已报道的血清标志物均不同程度存在检测敏感度或特异性问题，大都距临床实际应用较远，尤其是用于HCC的早期诊断。

近年来的研究发现，在肿瘤发生发展的过程中，由于机体免疫状态的变化，患者体内会出现针对某些自体细胞抗原的抗体免疫反应。这些自体细胞抗原又称为肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigens，TAAs)。通过检测外周血中这些针对自身抗原成分的自身抗体可以区分正常人和癌症患者。由于当肿瘤相关抗原水平很低，利用常规蛋白检测方法无法检测到时，免疫系统就能监测到该特异蛋白的存在，从而引发免疫反应产生大量的抗体。因此自身抗体检测方法与抗原检测方法相比具有更高的敏感度，血清自身抗体有可能成为用于癌症早期诊断的非常有前景的标志物。

本课题组前期已通过蛋白质组学方法筛选出一批在HCC和非HCC人群(肝硬化、慢性肝炎及健康对照)中存在不同血清学水平的抗原蛋白，通过购买或重组这些抗原蛋白制成蛋白芯片，大通量验证HCC和非HCC人群血清中相应自身抗体的水平，筛选出能够区分HCC和非HCC的血清自身抗体。研究发现血清着丝粒蛋白F(CENPF)自身抗体区分HCC和非HCC的价值最高，差别有统计学意义。值得注意的是，与AFP抗原的阳性率随着肿瘤的进展而升高不同，CENPF自身抗体的阳性率一般在肿瘤早期较高，然后随着肿瘤的进展而下降。CENPF在cutoff值为1152时，其区分HCC和肝硬化、慢性肝炎以及健康对照的AUC为0.816，区分早期肝癌的AUC为0.795；而AFP的cutoff值为20ng/ml时，其区分HCC和早期HCC的AUC分别为0.821和0.789。CENPF自身抗体诊断早期HCC的灵敏度为和特异度分别为76.19％和66.67％，而AFP分别为47.96％和100％，可见CENPF自身抗体诊断早期HCC的敏感性显著高于目前常用的指标AFP，显示出CENPF自身抗体在HCC早期诊断方面具有潜在价值。同时我们发现在AFP阴性的HCC和早期HCC患者中，分别有74.56％和72.55％的患者CENPF自身抗体为阳性，显示出CENPF自身抗体对AFP阴性的HCC患者有潜在的诊断价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测试剂盒，该试剂盒能够定量检测血清中CENPF抗体水平，将有助于肝细胞癌尤其是早期肝细胞癌的筛查及早期诊断。

本发明检测试剂盒采用酶联免疫法测定，抗体检测反应板为包被有重组CENPF抗原蛋白的酶标板，待测血清或标准品中的特异性CENPF抗体能够与酶标板微孔中的CENPF蛋白特异性结合而吸附于微孔内，加入HRP标记的兔抗人IgG二抗孵育，充分洗涤后加入显色底物，终止反应后用酶标仪测定各微孔的吸光度即OD值，其OD值与CENPF抗体水平呈正比。通过标准品的检测绘制标准曲线并对各血清标本中的CENPF抗体水平进行定量。

本发明所述检测试剂盒的制备包括如下步骤：

1.重组CENPF抗原蛋白的制备：本课题组制备的重组CENPF抗原蛋白为带有GST标签的GST-CENPF(121a.a.-220a.a.)融合蛋白，采用化学合成的方法合成基因，然后采用可溶性表达载体pGEX-4T-1构建表达人CENPF重组表达质粒，转化到感受态大肠杆菌并诱导其表达GST-CENPF融合蛋白，收集菌体并处理得到菌体上清，利用Glutathione FF亲和层析柱纯化得到重组CENPF抗原蛋白。

2.检测试剂盒标准品的选定：本课题组在前期工作基础上，已通过蛋白芯片技术定量检测筛选出一批高水平表达CENPF抗体的血清标本，可以作为本检测试剂盒的标准品进行质量控制和抗体定量。

3.制备酶标反应板：用棋盘法确定酶标板的最佳包被浓度，各微孔内加入最佳浓度的重组CENPF抗原蛋白100ul，4℃过夜后甩掉蛋白溶液，用洗涤液PBS-T(0.01mol/L PBS，pH 7.2-7.4，0.05％Tween 20)洗板3次。然后向各微孔内加入1％的BSA封闭液100ul以封闭未结合的空白位点，37℃孵育2h后甩掉封闭液，用洗涤液洗板3次，在吸水纸上拍干后置于4℃保存备用。

本发明提供的检测试剂盒的优势之处在于：提供了一种新的筛查及早期诊断HCC的方法，该试剂盒所检测的血清CENPF自身抗体用于诊断HCC的敏感性显著优于目前临床使用的血清标志物AFP。

附图说明：

图1：PCR扩增重组质粒DNA琼脂糖电泳结果，其中1-6分别代表6个菌落重组质粒DNA模板，MK为DNA分子Marker(100-2000bp)。

图2：BL21(DE3)菌株在1mmol/L IPTG诱导下融合蛋白的表达情况，其中A为Non-induced crude，B为Induced crude，B1-B4为Induced crude，C为Supernatant of lysate，D为Precipitation of lysate，MK为彩虹预染蛋白Marker。

图3：大肠杆菌诱导表达产物的Western-Blot结果，a为纯化前菌体上清Western-Blot结果：其中A、B为来自两个不同菌落的BL21(DE3)所诱导表达的融合蛋白，C为化学发光蛋白Marker；b为纯化后CENPF蛋白Western-Blot结果：其中A为reduced CENPF蛋白，B为non-reduced CENPF蛋白，C为阴性对照，MK为蛋白marker。

图4：融合蛋白纯化结果，其中A为上柱样品，B为洗涤液，C为10mmol/L GSH-1洗脱液，D为10mmol/L GSH-2洗脱液，E为6M Gua-HCl洗脱液，MK为彩虹预染蛋白Marker。

图5：酶标板包被浓度为0.55ng/ml时绘制的标准曲线图，横坐标表示标准品的稀释倍数(稀释2、4、8、16、32、64、128倍以及阴性对照)，纵坐标为各稀释倍数下的OD值均值。

具体实施方式

实施例1 CENPF重组蛋白的制备

一、材料

DNA marker(100-2000bp)和彩虹预染蛋白marker(14-120KD)均购自北京天根生化科技有限公司；化学发光蛋白Marker(20-90KD)购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌Origammi2和BL21(DE3)为本实验室保存；Fast Taq Mastermix、BamHI、XhoI、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；DNA电泳凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；异丙基硫代卢-D-半乳糖苷(IPTG)为Amresco产品；GST抗体购自碧云天生物技术研究所；HRP标记的山羊抗人IgG购自美国Earthox公司；引物合成及DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。其他试剂均为国产分析纯。

二、人CENPF原核表达载体的构建及鉴定

本课题组重组表达的蛋白为CENPF特异抗原表位(121a.a.-220a.a.)蛋白，并在其N端加上了谷胱甘肽转移酶GST标签，同时含有凝血酶切割位点。共包含326个氨基酸，分子量为37.7KD，等电点为7.4。

1.人CENPF原核表达质粒的构建

采用化学合成的方法合成基因，然后采用pGEX-4T-1载体构建表达人GST-CENPF(121a.a.-220a.a.)重组可溶性原核表达体。将化学合成的基因与pGEX-4T-1载体分别用BamHI和XhoI双酶切，凝胶回收纯化产物。将两个片段用T4 DNA连接酶常温连接2h，然后16℃连接过夜，得到连接产物。取5ul转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)内，涂布于LB(含Amp抗生素)平板，37℃倒置培养过夜。挑取6个菌落分别接种于3ml液体LB培养基(含Amp)中，37℃振荡培养过夜。用碱裂解法提取质粒DNA。

2.GST-CENPF基因的鉴定

对人CENPF原核表达体进行PCR扩增，上游引物：5’-GGATCTGGTTCCGCGTGGATCCTGTAAATCTGAGCTTGAAAGAAGC-3’；下游引物：5’-CAGTCACGATGCGGCCGCTCGAGTTACTGCCATGAGAACACAG-3’。扩增产物的分子量为346bp。分别以6个菌落的质粒DNA为模版，PCR反应体系为20ul，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸20s，28个循环；最后72℃延伸5min。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果见附图1。将菌落2的重组质粒DNA经测序证实，其基因序列与GeneBank上公布的基因序列一致。

三、GST-CENPF融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株内的诱导表达

1.BL21(DE3)菌株融合蛋白的诱导表达

测序正确地重组表达质粒转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞内，挑取单个菌落放入液体LB培养基(含Amp)内，37℃振荡培养过夜。次日，按7％的比例将上述菌液加入到液体LB培养基中，37℃振荡培养50min，测得OD600值为1.0，然后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，16℃振荡培养3h。对照组不加IPTG诱导，于16℃振荡培养过夜。收集菌液到1.5ml离心管中，12000r/min离心10min后弃上清保留沉淀。用蒸馏水重悬沉淀，加入上样缓冲液煮沸10min，吸取少量菌液后，剩余菌液10000r/min离心5min后分别留取上清和沉淀，进行10％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察融合蛋白的表达情况，结果见附图2。

2.表达产物的Western-Blot鉴定

将重组菌菌体蛋白经SDS-PAGE电泳，然后进行蛋白质电转移，将蛋白质转移至硝酸纤维素滤膜上(300mA，1h)；膜用含5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐-吐温缓冲液(TBST)室温缓摇封闭3h；然后用TBST缓冲液洗涤3次后，用含GST抗体的TBST溶液4℃孵育反应过夜；次日回收GST抗体，用TBST缓冲液洗膜6次后加入1∶8000的HRP标记的山羊抗人IgG，室温下缓摇孵育1h，TBST缓冲液洗膜6次，在吸水纸上沥干缓冲液后将膜浸入化学发光液中，30s后于显像仪下呈像，结果见附图3a。

四、GST-CENPF融合蛋白的大规模表达、纯化与免疫原性鉴定

挑取含重组质粒的BL21(DE3)单菌落置100ml液体LB培养基(含Amp)中37℃震荡培养过夜。次日，按7％的比例将上述菌液加入到1000ml液体LB培养基(含Amp)中，37℃振荡培养至OD600值为1.0，加入IPTG使终浓度为1.0mmol/L，16℃振荡培养3h，按上述同样方法收集菌体，用缓冲液PBS(PH 7.0)+0.01mmol/LEDTA悬浮菌体，进行超声破碎30min，12000r/min离心去沉淀。将上清液分为3组，分别加入到经PBS(PH 7.0)预平衡的Glutathione FF亲和层析柱，用5倍床体积的PBS(PH 7.0)充分洗涤后，分别以10mmol/L的还原型谷胱甘肽GSH和6mol/L的盐酸胍Gua-HCl洗脱，收集洗脱液，进行10％SDS-PAGE电泳。结果见附图4。可见用10mmol/L的还原型谷胱甘肽GSH(PH8.0)洗脱时GST融合蛋白产量及纯度最高。将上述还原型谷胱甘肽GSH洗脱液再经过脱盐处理过柱，最终制备的蛋白浓度为0.9mg/ml。纯化后的蛋白同上方法进行了免疫原性鉴定，结果见附图3b。

实施例2 酶标板的制备

一、材料

96孔酶标板购自美国Thermo公司；重组CENPF抗原蛋白为本实验室制备；BSA购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司；TMB显色液及终止液均购自北京索莱宝科技有限公司；HRP标记的兔抗人IgG购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

二、检测试剂盒中标准品的制备

本课题组在前期研究过程中，已通过蛋白芯片技术定量检测了一批肝癌患者血清CENPF抗体水平，将其中筛选出的含有高水平CENPF抗体的血清(蛋白芯片检测信号值大于30000)的30例血清标本混合，作为本检测试剂盒的标准品。

三、酶标板包被浓度的确定

1.酶标板的包被

采用棋盘法确定酶标板的最佳包被浓度。用PBS(0.01mol/L，pH 7.2-7.4)稀释CENPF蛋白至不同浓度(0.14-1.1ug/ml)进行包被，每个浓度重复两列，各反应孔加入上述蛋白100ul置于4℃冰箱过夜；然后甩掉液体，各反应孔加入300ul洗涤液PBS-T(0.01mol/LPBS，pH 7.2-7.4，0.05％Tween 20)，在实验台上适度晃动酶标板后甩掉洗涤液，重复3次后在吸水纸上拍干酶标板。

2.酶标板的封闭

向上述酶标板的各反应孔中加入1％的BSA封闭液100ul，37℃孵育2小时后甩掉封闭液，然后用同样的方法洗板3次。

3.酶标板检测不同浓度的标准品

将标准品用样本稀释液(0.1％BSA，PBS-T)稀释至不同浓度(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128)，每一排各反应孔内加入同一浓度的标准品100ul，每一排浓度依次降低，最后一排为空白对照。将酶标板置于微孔板震荡器上500/min，孵育1h。甩掉液体后洗板6次。然后各反应孔加1∶8000的HRP-兔抗人IgG100ul，于震荡器上孵育1h后洗板6次。配置TMB显色液(等体积A液+B液)，各反应孔内加入显色液100ul，避光条件下反应10min，然后各反应孔加入终止液50ul以终止反应。在酶标仪450nm条件下测定各反应孔的OD值，结果如下表所示。

棋盘法检测酶标板不同包被浓度反应孔的OD值

4.确定最佳包被浓度

由上述实验初步确定酶标板的包被浓度为0.55ng/ml。

四、检测试剂盒标准曲线的建立

用上述0.55ng/ml包被浓度下检测不同稀释度的标准品所测得的OD值绘制标准曲线，结果见附图5。

Claims (2)

1.一种血清CENPF抗体定量检测试剂盒，其特征在于由包被带有GST标签的GST-CENPF(121a.a.-220a.a.)融合蛋白的酶标板、标准品、酶标二抗、显色底物及浓缩洗涤液组成，待测血清或标准品中的特异性CENPF抗体结合固定在酶标板微孔表面的CENPF抗原，酶标记抗体识别CENPF抗体并与之结合，形成CENPF抗原-CENPF抗体-酶的复合物，酶与底物反应显色后测出吸光度，通过标准品的检测绘制标准曲线并计算待测血清中CENPF抗体水平。

2.如权力要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品为经蛋白芯片检测的信号值大于30000的高水平CENPF抗体血清标本混合液。

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