CN109957027A - 一组着丝粒蛋白f（cenpf）分片段抗原及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明为一组着丝粒蛋白F（CENPF）分片段抗原及其应用，涉及一组血清CENPF分片段抗原，其组合可显著提高血清标本中CENPF抗体检测的敏感度和特异性。本发明将8种重组CENPF分片段抗原制备蛋白芯片，用于血清标本中的CENPF抗体水平的测定，根据8个重组CENPF分片段抗原检测血清CENPF抗体水平的高低，来综合评估早期肝细胞癌患者或高危人群的疾病状态，提供了一种新的肝细胞癌筛查及早期诊断方法。

Description

一组着丝粒蛋白F(CENPF)分片段抗原及其应用
技术领域
本发明涉及一组着丝粒蛋白F(CENPF)分片段抗原及其在血清自身抗体检测中的应用。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是原发性肝癌的主要类型。由于HCC缺乏早期症状，大部分病人出现症状时已属中晚期，失去有效治疗的机会，存活期一般少于1年，早期HCC通过切除术或肝移植，5年生存率在60-70％以上。因此，通过对高危人群的定期筛查及时发现和诊断早期病例至关重要。但目前临床上仍缺乏敏感度高、特异性好，且具有临床可操作性的HCC筛查及早期诊断方法。
理想的HCC早期诊断方法不仅要有较高的特异性，能够将HCC与肝硬化、肝炎等区别开来，还要有较高的敏感性，能够在肝细胞癌的早期阶段即能检出。此外，作为HCC的筛查及早期诊断方法，还必须具备临床可操作性，如简便经济，尤其是对患者创伤最小而易于被接受等。作为目前临床常用的HCC筛查和诊断方法，超声检查虽然无创但高度依赖临床医生的个人经验且不易从肝硬化背景中发现早期HCC；CT及MRI检查能显著提高早期HCC的检出率，但需要使用专门的仪器设备，费用非常昂贵；肝穿刺组织病理学检查虽然仍是早期HCC诊断的金标准，但由于侵入性特点、操作复杂且难度大，不易为病人接受。比较而言，通过检测病人血清标志物实现HCC的早期诊断无疑具有独特的优势和很强的可操作性。
目前已用于HCC临床诊断的血清标志物主要为甲胎蛋白(AFP)，由于受研究设计(回顾性研究和前瞻性研究)、HCC病因学因素、受检人群及所设定的临界值不同等因素的影响，AFP的敏感度和特异度存在较大的差异。大多数临床研究结果表明，当临界值为20ng/ml时，AFP诊断HCC的敏感度和特异度分别为40％～65％和75％～90％不等。而且，只有当AFP血清浓度达到500ng/ml时才表现出很好的特异性，提示AFP作为HCC诊断标志物特异性高但敏感度不够，可能不适合HCC的早期诊断。近年来出现的AFP异构体(AFP-L3)和异常凝血酶原(DCP)的敏感度或特异性有了一定的提高，可与AFP联合使用以提高敏感度。其他仍处于实验室研究阶段的HCC血清标志物还包括硫酸肝素多糖3(GPC3)、高尔基蛋白73(GP73)、生长因子或细胞因子(如TGFβ1、IGF-II、HGF等)以及一些酶和同工酶(如GGT-II、AFU、AAG)等。近年来，随着以蛋白质双向电泳、新型质谱分析为主的蛋白质组学方法的应用，为寻找新型HCC标志物提供了强有利的工具，已报导筛选出一些新的潜在血清标志物。但总体说来，目前已有的或已报道的血清标志物均不同程度存在检测敏感度或特异性问题，大都距临床实际应用较远，尤其是用于HCC的早期诊断。
近年来的研究发现，在肿瘤发生发展的过程中，由于机体免疫状态的变化，患者体内会出现针对某些自体细胞抗原的抗体免疫反应。这些自体细胞抗原又称为肿瘤相关抗原(Tumor Associated Antigens，TAAs)。通过检测外周血中这些针对自身抗原成分的自身抗体可以区分正常人和癌症患者。由于当肿瘤相关抗原水平很低，利用常规蛋白检测方法无法检测到时，免疫系统就能监测到该特异蛋白的存在，从而引发免疫反应产生大量的抗体。因此自身抗体检测方法与抗原检测方法相比具有更高的敏感度，血清自身抗体有可能成为用于癌症早期诊断的非常有前景的标志物。
本课题组前期已通过蛋白质组学方法筛选出一批在HCC和非HCC人群(肝硬化、慢性肝炎及健康对照)中存在不同血清学水平的抗原蛋白，通过购买或重组这些抗原蛋白制成蛋白芯片，大通量验证HCC和非HCC人群血清中相应自身抗体的水平，筛选出能够区分HCC和非HCC的血清自身抗体。研究发现血清着丝粒蛋白F(CENPF)自身抗体区分HCC和非HCC的价值最高，差别有统计学意义。值得注意的是，与AFP抗原的阳性率随着肿瘤的进展而升高不同，CENPF自身抗体的阳性率一般在肿瘤早期较高，然后随着肿瘤的进展而下降。CENPF在cutoff值为1152时，其区分HCC和肝硬化、慢性肝炎以及健康对照的AUC为0.816，区分早期肝癌的AUC为0.795；而AFP的cutoff值为20ng/ml时，其区分HCC和早期HCC的AUC分别为0.821和0.789。CENPF自身抗体诊断早期HCC的灵敏度为和特异度分别为76.19％和66.67％，而AFP分别为47.96％和100％，可见CENPF自身抗体诊断早期HCC的敏感性显著高于目前常用的指标AFP，显示出CENPF自身抗体在HCC早期诊断方面具有潜在价值。同时我们发现在AFP阴性的HCC和早期HCC患者中，分别有74.56％和72.55％的患者CENPF自身抗体为阳性，显示出CENPF自身抗体对AFP阴性的HCC患者有潜在的诊断价值。
由于CENPF蛋白是一个大分子量蛋白，在检测时会出现血清样本抗体水平非特异性增高现象，我们针对CENPF蛋白进行生物信息学预测，预测出8个CENPF的优势抗原表位，针对这8个表位进行同一样本检测，以提高CENPF抗体在肝癌人群检测中的特异性与灵敏度。
发明内容
本发明的目的在于提供一组着丝粒蛋白F(CENPF)分片段抗原，这些抗原片段的联合使用能够显著提高血清CENPF抗体检测的敏感度和特异性，将有助于肝细胞癌尤其是早期肝细胞癌的筛查及早期诊断。
本发明拟采用蛋白芯片法测定，将CENPF蛋白的8个分片段抗原集成在同一个张蛋白芯片上，从而对血清样本进行检测。
本发明包括如下步骤：
1.重组CENPF分片段抗原蛋白的制备：本课题组制备的重组CENPF抗原蛋白为带有GST标签或His标签的融合蛋白(121-220a.a，335-416a.a，1100-1265a.a，1670-1791a.a，1759-2093a.a，2075-2210a.a，2485-2592a.a，2808-2960a.a)，采用化学合成的方法合成基因，然后采用可溶性表达载体pET-6P构建表达人CENPF重组表达质粒，转化到感受态大肠杆菌并诱导其表达融合蛋白，收集菌体并处理得到菌体上清，利用Glutathione FF亲和层析柱或Ni-NTA柱纯化得到重组CENPF抗原蛋白。
2.蛋白芯片的制备及检测：将制备的CENPF重组抗原片段固定在醛基化载玻片上，制得蛋白芯片。然后采用间接ELISA法进行血清CENPF抗体的检测。
本发明提供的检测方法的优势之处在于：提供了一种新的筛查及早期诊断HCC的方法，同时为了避免CENPF蛋白分子量过大在检测过程带来的特异性下降的问题。将CENPF分为8个优势抗原表位进行检测。这些抗原片段的联合使用能够显著提高血清CENPF抗体检测的敏感度和特异性，将有助于肝细胞癌尤其是早期肝细胞癌的筛查及早期诊断。
附图说明：
图1：PCR扩增121-220a.a重组质粒DNA琼脂糖电泳结果，PCR扩增121-220a.a，1670-1791a.a，1759-2093a.a，2075-2210a.a，2808-2960a.a重组质粒DNA琼脂糖电泳结果，1-2分别代表121-220a.a 2个菌落重组质粒DNA模板，MK为DNA分子Marker(100-2000bp)，3.PGEX-4T-1-human-CENPF(2808-2960a.a)，4.PGEX-4T-1-human-CENPF(2808-2960a.a)EcoRV和NotI双酶切产物，5.PGEX-4T-1-human-CENPF(2075-2210a.a)，6.PGEX-4T-1-human-CENPF(2075-2210a.a)ScaI酶切产物，7.pET21a-human-CENPF(1759-2093a.a)，8.pET21a-human-CENPF(1759-2093a.a)EcoRV和XhoI双酶切产物，9.PGEX-4T-1-human-CENPF(1670-1791a.a)，10.PGEX-4T-1-human-CENPF(1670-1791a.a)EcoRV酶切产物。M为DNA分子Marker(100-5000bp)
图2：BL21及BL21(DE3)菌株在1mmol/L IPTG诱导下融合蛋白的表达情况，其中M及MK为彩虹预染蛋白Marker，1.1759-2093a.a未诱导对照，2.1759-2093a.a诱导全菌，3.1670-1791a.a未诱导对照，4.1670-1791a.a诱导全菌，5.2075-2210a.a未诱导对照，6.2075-2210a.a诱导全菌，7.2808-2960a.a未诱导对照，8.2808-2960a.a诱导全菌。
图3：BL21及BL21(DE3)菌株在1mmol/L IPTG诱导下融合蛋白的表达情况。MK.非预染蛋白Marker，1.335-416a.a未诱导对照，2.335-416a.a诱导全菌，3.1100-1265a.a未诱导对照，4.1100-1265a.a诱导全菌，5.2485-2592a.a未诱导对照，6.2485-2592a.a诱导全菌。
图4：8个抗原片段的纯化结果。MK.彩虹预染蛋白Marker，A.121-220a.a，B.335-416a.a，C.1759-2093a.a，D.1100-1265a.a，E.1670-1791a.a，F.2075-2210a.a，G.2485-2592a.a，H.2808-2960a.a。
图5：蛋白芯片点样的点阵排列。A-H.蛋白芯片玻片相同的8个区域，1.IgG，2.121-220a.a，3.335-416a.a，4.1100-1265a.a，5.1670-1791a.a，6.1759-2093a.a，7.2075-2210a.a，8.2485-2592a.a，9.2808-2960a.a，10.BSA，11.点样液。
具体实施方式
实施例1 CENPF重组蛋白的制备
一、材料
DNA marker(100-2000bp；100-5000bp)和彩虹预染蛋白marker(14-120KD)均购自北京天根生化科技有限公司；化学发光蛋白Marker(20-90KD)购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌BL21和BL21(DE3)为本实验室保存；Fast Taq Mastermix、BamHI、XhoI、T4DNA连接酶均购自NEB公司；DNA电泳凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；异丙基硫代卢-D-半乳糖苷(IPTG)为Amresco产品；引物合成及DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。其他试剂均为国产分析纯。
二、人CENPF原核表达载体的构建及鉴定
本课题组重组表达的蛋白为CENPF的8个优势抗原表位(121-220a.a，335-416a.a，1100-1265a.a，1670-1791a.a，1759-2093a.a，2075-2210a.a，2485-2592a.a，2808-2960a.a)蛋白。
1.人CENPF原核表达质粒的构建
采用化学合成的方法合成基因，然后采用pET-6P或PGEX-4T-1载体构建表达人GST-CENPF(121-220a.a，335-416a.a，1100-1265a.a，1670-1791a.a，2075-2210a.a，2485-2592a.a，2808-2960a.a)重组可溶性原核表达体或pET21a载体构建表达人His-CENPF(1759-2093a.a)重组可溶性原核表达体。将化学合成的基因与载体分别用BamHI和XhoI双酶切，凝胶回收纯化产物。将两个片段用T4DNA连接酶常温连接2h，然后16℃连接过夜，得到连接产物。取5ul转化到感受态大肠杆菌BL21或BL21(DE3)内，涂布于LB(含Amp抗生素)平板，37℃倒置培养过夜。挑取2-6个菌落分别接种于3ml液体LB培养基(含Amp)中，37℃振荡培养过夜。用碱裂解法提取质粒DNA。
2.CENPF基因的鉴定
对8个人CENPF片段原核表达体进行PCR扩增，分别以2-6个菌落的质粒DNA为模版，PCR反应体系为20ul，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性20s、55℃退火20s、72℃延伸20s，28个循环；最后72℃延伸5min。对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。重组质粒DNA经测序证实，其基因序列与GeneBank上公布的基因序列一致。结果见附图1。
三、GST-CENPF融合蛋白在大肠杆菌BL21或BL21(DE3)菌株内的诱导表达
测序正确地重组表达质粒转化到感受态大肠杆菌BL21或BL21(DE3)细胞内，挑取单个菌落放入液体LB培养基(含Amp)内，37℃振荡培养过夜。次日，按7％的比例将上述菌液加入到液体LB培养基中，37℃振荡培养50min，测得OD600值为1.0，然后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，16℃振荡培养3h。对照组不加IPTG诱导，于16℃振荡培养过夜。收集菌液到1.5ml离心管中，12000r/min离心10min后弃上清保留沉淀。用蒸馏水重悬沉淀，加入上样缓冲液煮沸10min，吸取少量菌液后，剩余菌液10000r/min离心5min后分别留取上清和沉淀，进行10％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察融合蛋白的表达情况，结果见附图2-3。
四、GST-CENPF及His-CENPF融合蛋白的大规模表达、纯化与免疫原性鉴定
GST-CENPF的表达、纯化：挑取含重组质粒的BL21或BL21(DE3)单菌落置100ml液体LB培养基(含Amp)中37℃震荡培养过夜。次日，按7％的比例将上述菌液加入到1000ml液体LB培养基(含Amp)中，37℃振荡培养至OD600值为1.0，加入IPTG使终浓度为1.0mmol/L，16℃振荡培养3h，按上述同样方法收集菌体，用缓冲液PBS(PH 7.0)+0.01mmol/LEDTA悬浮菌体，进行超声破碎30min，12000r/min离心去沉淀。将上清液分为3组，分别加入到经PBS(PH7.0)预平衡的Glutathione FF亲和层析柱，用5倍床体积的PBS(PH 7.0)充分洗涤后，以10mmol/L的还原型谷胱甘肽GSH。纯化后的蛋白进行10％SDS-PAGE电泳，结果见附图4。
His-CENPF的表达、纯化：挑取含重组质粒的BL21(DE3)单菌落置100ml液体LB培养基(含Amp)中37℃震荡培养过夜。次日，按7％的比例将上述菌液加入到1000ml液体LB培养基(含Amp)中，37℃振荡培养至OD600值为1.0，加入IPTG使终浓度为1.0mmol/L，16℃振荡培养3h，按上述同样方法收集菌体，用缓冲液PBS(PH 7.0)+0.01mmol/LEDTA悬浮菌体，进行超声破碎30min，12000r/min离心去沉淀。将上清液分为3组，分别加入到经PBS(PH 7.0)预平衡的Ni-NTA柱，用5倍床体积的PBS(PH 7.0)充分洗涤后，以10mmol/L的咪唑洗脱，收集洗脱液，进行10％SDS-PAGE电泳。结果见附图4。
实施例2 蛋白芯片的制备
一、材料
醛基芯片购自博奥公司；8个重组CENPF抗原蛋白为本实验室制备；化学发光试剂盒(美国Milipore公司)；HRP标记的兔抗人IgG购自美国Sigma公司。
二、蛋白芯片制备
1.将上述抗原蛋白按设定的顺序点于醛基基片制成蛋白芯片。点阵排列见附图5。
2.将点完蛋白的醛基芯片置于密闭容器中4℃固定过夜。
3.次日取出醛基芯片，在各反应区加入20ul封闭液并使其均匀覆盖于反应区内，
4.置于湿盒于37℃温箱中封闭2小时后用PBST洗涤3次，10s/次，晾干备用。
三、蛋白芯片的检测
1.将待检血清用样本稀释液稀释5倍，在蛋白芯片的每个反应区内各滴加10μl稀释后的血清，放置于湿盒，37℃反应30min。
2.用PBST洗涤6次，每次20s。
3.晾干后，每个区内加入1∶8000的HRP标记的兔抗人IgG 10μl，再次置于湿盒，37℃反应30min。
4.PBST洗涤6次，每次20s，晾干。

Claims (2)

1.一组CENPF蛋白分片段抗原，其特征在于，CENPF分片段抗原为一组带有GST或His标签的融合蛋白，经生物信息学软件预测优势抗原表位肽段，共包括8个片段：121-220a.a，335-416a.a，1100-1265a.a，1670-1791a.a，1759-2093a.a，2075-2210a.a，2485-2592a.a，2808-2960a.a。采用化学合成的方法合成基因，与可溶性表达载体pGEX-4T-1构建表达人CENPF重组表达质粒，转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)并诱导其表达可溶性GST-CENPF或CENPF-His融合蛋白，收集菌体后处理得到菌体上清，利用亲和层析柱纯化得到重组CENPF抗原蛋白。
2.如权利要求1所述CENPF蛋白分片段抗原制备的蛋白芯片，其特征在于，将制备的8个CENPF重组抗原片段固定在醛基化载玻片上，制成蛋白芯片，然后采用间接ELISA法进行血清CENPF抗体的检测。
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