CN112881695A - 一种血清CENPF抗体(IgG和IgM)检测胶体金试纸条 - Google Patents

一种血清CENPF抗体(IgG和IgM)检测胶体金试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胶体金试纸条,可同时对两种血清CENPF自身抗体(IgG抗体和IgM抗体)进行定性或半定量检测。本检测试纸条通过胶体金反应,能够快速定性或半定量检测血清中CENPF抗体含量,可用于早期肝细胞癌的快速筛查。本胶体金试纸条提供了一种新的肝细胞癌CENPF自身抗体检测方法,检测CENPF抗体灵敏度约为4.1ng/mL,检测时间10‑15分钟,操作简捷易行,结果直观可见,适用于早期肝细胞癌的快速筛查。

Description

一种血清CENPF抗体(IgG和IgM)检测胶体金试纸条
技术领域
本发明涉及一种血清CENPF抗体(IgG和IgM)检测胶体金试纸条。
背景技术
肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是原发性肝癌的主要类型。肝癌的发病率和死亡率分居全球癌症发病和死亡的第6位和第4位,由于HCC缺乏早期症状,大部分病人出现症状时已属中晚期,失去有效治疗的机会。通过早期诊断发现HCC后,采取切除术或肝移植,患者5年生存率通常在60-70%以上。因此,早期诊断在临床中可以为患者争取手术治疗的时间,在提高生存率、改善预后方面起到了不可替代的作用。但目前临床上仍缺乏敏感度高、特异性好,且具有临床可操作性的HCC筛查及早期诊断方法。在临床的各类检测方法中,超声、MRI及CT等检查方式虽然能够在一定程度上检测出肝癌病变的情况,但对于一些良性肝癌恶化、癌变组织转移等情况难以作出合理的预测。比较而言,通过检测病人血清标志物实现HCC的早期诊断无疑具有独特的优势和很强的可操作性。
目前已用于HCC临床诊断的血清标志物主要为甲胎蛋白(AFP)、AFP异构体(AFP-L3)、异常凝血酶原(DCP)、高尔基体糖蛋白73、γ-谷氨酰转肽酶 (GGT)、转化生长因子β1(TGF-β1)等,均不同程度存在检测敏感度或特异性低的问题,假阳性率较高,所以临床上常与其他诊断指标联合使用。近年来,随着以蛋白质双向电泳、新型质谱分析为主的蛋白质组学方法的应用,为寻找新型HCC标志物提供了强有利的工具,已报导筛选出一些新的潜在血清标志物。但总体说来,目前已有的或已报道的血清标志物大都距HCC的早期临床诊断实际应用较远。
近年来的研究发现,当肿瘤相关抗原水平很低,利用常规蛋白检测方法无法检测到时,免疫系统就能监测到该特异蛋白的存在,从而引发免疫反应产生大量的抗体。因此自身抗体检测方法与抗原检测方法相比具有更高的敏感度,血清自身抗体有可能成为用于癌症早期诊断的非常有前景的标志物。本课题组前期研究发现血清着丝粒蛋白F(CENPF)自身抗体区分HCC和非HCC的价值最高,差别有统计学意义。检测早期HCC的AUC值为0.826,高于AFP的0.749,敏感度达76.2%,远远高于AFP的49.5%,且自身抗体水平显著高于其他类型的肿瘤,特别值得一提的是AFP阴性的早期HCC患者有73.6%是CENP-F自身抗体阳性,值得注意的是,与AFP抗原的阳性率随着肿瘤的进展而升高不同, CENPF自身抗体的阳性率一般在肿瘤早期较高,然后随着肿瘤的进展而下降。
人体识别肿瘤相关抗原为外来抗原从而触发免疫反应,从而通过先天免疫系统进行消除。但其中部分恶性细胞未被消除从而得以存活,因此通常需要二次免疫反应,其中便产生IgG和IgM自身抗体。IgM是机体第一道防线的一部分,负责识别和清除感染颗粒并清除转化细胞,用于识别肿瘤相关抗原。有研究显示,一些IgM抗体已经从患者的肿瘤中分离出来,其在体内与细胞表面受体结合,诱导细胞凋亡来消除肿瘤。且IgM抗体已被证实在人类上皮细胞肿瘤的免疫监测机制中发挥重要作用。免疫反应产生的第一种免疫球蛋白是IgM,所以可将其作为一种早期诊断工具。IgM相对于IgG,在体内产生时间更早,含量变化却与IgG相当。IgG有时会受到免疫调节影响,表现为免疫抑制,而IgM则不会。遂将IgG和IgM结合检测,共同作为HCC早期诊断的诊断分子至关重要。
此外,现有技术检测着丝粒蛋白F(CENPF)自身抗体往往采用的是间接 ELISA法,不但检测过程复杂检测周期长,且往往结果非特异性强,重复性差,若用于大量临床样本筛查检测时,工作量极大,效率低,不便于大规模的早期病例筛查。本试纸条检测速度快(10-15分钟),过程简便,结果直观且准确度高。
在实际应用中,使用本发明制备的胶体金试纸条检测了103例HCC血清标本,检出IgM阳性的样本共34例(33%),在这34例中同时检出IgG阳性的样本共16例(15.5%),其中,有2例ELISA检测IgG高值的已知样本使用本发明胶体金试纸条检测时,抗体IgG也呈阳性,说明检测结果具有一致性。此外,根据标本的AFP结果,本发明对AFP阴性的早期HCC快速筛查具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术的不足,本发明提供了一种检测胶体金试纸条,该试纸条能够快速直接检测血清是否含有CENPF抗体,一份试纸条可对两种检测指标 (IgG抗体和IgM抗体)进行定性或半定量检测,检测速度快,过程简便,结果直观可视,将有助于肝细胞癌尤其是早期肝细胞癌的快速筛查。
本发明涉及一种CENPF抗体(IgG和IgM)胶体金检测试纸条,包括盒座、盒盖和胶体金试纸条,所述试纸条固定于所述盒座中部且位于所述盒座与所述盒盖之间,盒盖的加样部设置加样孔,加样部和手持端之间设置检测视窗,所述试剂条包括底层与上层,所述底层为塑料底板,在底层上依次排列粘贴吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维垫片,宽为3.5mm,所述玻璃纤维垫片上包括包被有胶体金标记的CENPF抗原抗体和样品层析垫,所述硝酸纤维素膜片上设有平行的检测线和质控线,所述检测线为两条,分别为抗人IgM抗体(T1线)和抗人IgG抗体(T2线),所述质控线上包被有羊抗鼠IgG二抗,本发明的血清CENPF抗体(IgG和IgM)的胶体金试纸条可适用于快速定性检测血清样本中的CENPF,检测CENPF IgG灵敏度可达4.1ng/mL。操作简捷易行,结果直观可视,加样10分钟后即可出结果。
作为本发明的一种优选的实施方式,本发明所述的胶体金试纸条能够同时检测两种不同类型CENPF的抗体:IgG和IgM。
作为本发明的一种优选的实施方式,本发明所述的胶体金试纸条中,抗人IgG、抗人IgM及质控线包被抗体用稀释液稀释至1mg/mL,1μL/cm浓度进行包被。
作为本发明的一种优选的实施方式,本发明所述的胶体金试纸条中,用于6 mm×150mm金垫上的金标抗体,溶于金复溶液的浓度为80ug/mL。
作为本发明的一种优选的实施方式,其特征在于采用兔抗CENPF抗体用作试纸条检测灵敏度标准品。
本发明所述检测胶体金试纸条的制备包括如下步骤:
1.重组CENPF抗原蛋白的制备:本课题组制备的重组CENPF抗原蛋白为带有GST标签的GST-CENPF(121a.a.-220a.a.)融合蛋白,采用化学合成的方法合成基因,然后采用可溶性表达载体pGEX-4T-1构建表达人CENPF重组表达质粒,转化到感受态大肠杆菌并诱导其表达GST-CENPF融合蛋白,收集菌体并处理得到菌体上清,利用Glutathione FF亲和层析柱纯化得到重组 CENPF抗原蛋白。
2.制备胶体金试纸条:
取2支1.5mL离心管用超纯水清洗两遍,吸取1mL胶体金加入每管中,一管加入8μL0.2M碳酸钾,再加入20μg CENPF蛋白,另一管加入5μL 0.2M 碳酸钾,再加入20μg鼠单抗,混匀后反应10min。向每管中分别加入50μL封闭液反应10min,11000r/min转速下离心20min。弃去上清,用500μL金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm×150mm金垫上,进行干燥。
将抗人IgG、抗人IgM用稀释液稀释至1mg/mL,1μL/cm分别作为T2检测线、T1检测线包被在NC膜上,将质控线包被抗体用稀释液稀释至1mg/mL, 1μL/cm包被在NC膜上,室温,低湿度进行干燥。在底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫(鼠单抗一层、蛋白一层)、样品层析垫,用斩切机切成3.5mm宽的试纸条用以检测。
本发明提供的检测胶体金试纸条的优势之处在于:提供了一种新的HCC 快速筛查方法,检测过程方便快捷,检测灵敏度的兔抗IgG抗体稀释度可达105 倍稀释(浓度约4.1ng/mL),结果直观可视。
附图说明:
图1:胶体金试纸条检测灵敏度标准品兔抗IgG抗体不同稀释度检测图。
图2:检测灵敏度用兔抗CENPF的ELISA法血清滴度测定变化曲线。
图3:胶体金试纸条的临床样本检测示意图。
具体实施方式
实施例1胶体金试纸条的制备
一、材料
金标抗原所用CENPF蛋白与兔抗为本实验室制备;鼠单抗、质控线包被抗体用羊抗鼠二抗、T1检测线抗人IgM抗体、T2检测线抗人IgG抗体、胶体金溶液、封闭液、稀释液、金复溶液购自南京钟鼎生物科技有限公司;吸水纸、底板、玻璃纤维垫片中的金标释放垫与样品层析垫购自Millipore公司;硝酸纤维素膜购自Sartorius公司。
二、胶体金试纸条的制备
1.标记蛋白
取2支1.5mL离心管用超纯水清洗两遍,吸取1mL胶体金加入每管中,一管加入8μL0.2M碳酸钾,再加入20μg CENPF蛋白,另一管加入5μL 0.2M 碳酸钾,再加入20μg鼠单抗,混匀后反应10min。向每管中分别加入50μL封闭液反应10min,11000r/min转速下离心20min。弃去上清,用500μL金复溶液将沉淀复溶后铺在6mm×150mm金垫上,进行干燥。
2.点膜
将抗人IgG、抗人IgM用稀释液稀释至1mg/mL,1μL/cm分别作为T2检测线、T1检测线包被在NC膜上,将质控线包被抗体用稀释液稀释至1mg/mL, 1μL/cm并包被在NC膜上,室温,低湿度进行干燥。
3.组装检测
在底板上从上到下依次粘贴吸水纸、NC膜、金垫(鼠单抗一层、蛋白一层)、样品层析垫,用斩切机切成3.5mm宽的试纸条用以检测。
4.灵敏度检测
采用灵敏度标准品兔抗IgG抗体,检测稀释度可达105倍稀释(浓度约4.1 ng/mL)(结果见图1)
实施例2检测灵敏度用兔抗的制备
1.选用新西兰白兔五只作为实验动物。
2.免疫:注射弗氏完全佐剂进行初免,而后除终免外,皆注射弗氏不完全佐剂免疫,免疫原与佐剂混合,彻底混匀后形成的稳定乳状液,采用皮下多点注射进行免疫。
3.血清采集与检测:动物免疫完成后,可取少量的血清利用ELISA进行效价检测(结果见图2和表1)。效价合格进行最终取血。
4.多抗的纯化:利用Protein G和辛酸-硫酸铵纯化抗血清。
表1.检测灵敏度用兔抗CENPF的ELISA法血清滴度测定结果
Figure BDA0002977954490000061
实施例3用胶体金试纸条进行临床样本的检测
(1)血清稀释
使用本发明制备的胶体金试纸条检测HCC血清标本,取每种血清样本 20uL加入70uL稀释液进行稀释。
(2)加样
将稀释后的样本滴加在试纸条加样孔中,反应10min后判读结果(见图3)。

Claims (4)

1.一种CENPF抗体(IgG和IgM)胶体金检测试纸条,其特征在于包括盒座、盒盖和胶体金试纸条,所述试纸条固定于所述盒座中部且位于所述盒座与所述盒盖之间,盒盖的加样部设置加样孔,加样部和手持端之间设置检测视窗,所述试剂条包括底层与上层,所述底层为塑料底板,在底层上依次排列粘贴吸水纸、硝酸纤维素膜、玻璃纤维垫片,宽为3.5mm,所述玻璃纤维垫片上包括包被有胶体金标记的CENPF抗原抗体和样品层析垫,所述硝酸纤维素膜片上设有平行的检测线和质控线,所述检测线为两条,分别为抗人IgM抗体(T1线)和抗人IgG抗体(T2线),所述质控线上包被有羊抗鼠IgG二抗;制备兔抗CENPF抗体用于检测试纸条灵敏度标准品,结果显示检测CENPF IgG灵敏度可达4.1ng/mL;本胶体金试纸条可适用于快速定性检测早期肝细胞癌血清样本中的CENPF IgG和IgM抗体水平,操作简捷易行,加样10分钟后即可出结果,可用于早期肝细胞癌的快速筛查。
2.如权利要求1所述的胶体金检测试纸条,其特征在于,所述的胶体金试纸条能够同时检测两种不同类型CENPF的抗体:IgG和IgM;检测CENPF IgG的灵敏度约为4.1ng/mL。
3.如权利要求1所述的胶体金检测试纸条,其特征在于,所述的胶体金试纸条中,抗人IgG、抗人IgM及质控线包被抗体用稀释液稀释至1mg/mL,1μL/cm浓度进行包被,用于6mm×150mm金垫上的金标抗体,溶于金复溶液的浓度为80ug/mL。
4.如权利要求1所述的胶体金检测试纸条,其特征在于采用自制兔抗CENPF抗体用作试纸条检测灵敏度标准品。
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