WO2011155358A1 - 5量体crpの製造方法、5量体crpを製造する遺伝子組換えカイコとその製造方法、単量体イヌcrpをコードするdna及びそのdnaを含む発現ベクター - Google Patents
5量体crpの製造方法、5量体crpを製造する遺伝子組換えカイコとその製造方法、単量体イヌcrpをコードするdna及びそのdnaを含む発現ベクター Download PDFInfo
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Abstract
Description
[1].5量体CRPの製造方法であって、単量体CRPをコードするDNAが導入された遺伝子組換えカイコを作成する作成工程と、作成された遺伝子組換えカイコが製造する5量体CRPを回収する回収工程とを有する5量体CRPの製造方法。
[2].前記作成工程が、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAとが導入された遺伝子組換えカイコを作成する工程である[1]に記載の製造方法。
[3].前記作成工程が、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAが導入されたカイコと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAが導入されたカイコとを交配させて遺伝子組換えカイコを作成する工程である[1]に記載の製造方法。
[4].前記転写因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである[2]又は[3]に記載の製造方法。
[5].前記回収工程が、作成された遺伝子組換えカイコがその絹糸腺に製造する5量体CRPを回収する工程である[2]から[4]のいずれかに記載の製造方法。
[6].前記CRPがイヌCRPである[1]から[5]のいずれかに記載の製造方法。
[7].前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAである[1]から[6]のいずれかに記載の製造方法。
[8].前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号4に示される塩基配列を含むDNAである[1]から[7]のいずれかに記載の製造方法。
[9].遺伝子組換えカイコであって、単量体CRPをコードするDNAが導入され、5量体CRPを製造する遺伝子組換えカイコ。
[10].遺伝子組換えカイコであって、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAとが導入され、5量体CRPを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコ。
[11].前記転写因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである[10]に記載の遺伝子組換えカイコ。
[12].前記CRPがイヌCRPである[9]から[11]のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
[13].前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAである[9]から[12]のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
[14].前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号4に示される塩基配列を含むDNAである[9]から[13]のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
[15].5量体CRPを製造する遺伝子組換えカイコの製造方法であって、単量体CRPをコードするDNAをカイコに導入する導入工程を含む、5量体CRPを製造する遺伝子組換えカイコの製造方法。
[16].5量体CRPを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコの製造方法であって、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAとをカイコに導入する導入工程を含む、5量体CRPを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコの製造方法。
[17].前記導入工程が、絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAが導入されたカイコと、該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAが導入されたカイコとを交配させてDNAが導入されたカイコを作成する工程である、[16]に記載の製造方法。
[18].前記転写因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである[16]又は[17]に記載の製造方法。
[19].前記CRPがイヌCRPである[15]から[18]のいずれかに記載の製造方法。
[20].前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAである[15]から[19]のいずれかに記載の製造方法。
[21].前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号4に示される塩基配列を含むDNAである[15]から[20]のいずれかに記載の製造方法。
[22].単量体イヌCRPをコードするDNAであって、配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する単量体イヌCRPをコードするDNA。
[23].前記塩基配列が配列番号4に示される配列を含む塩基配列である[22]に記載の単量体イヌCRPをコードするDNA。
[24].発現ベクターであって、[22]又は[23]に記載の単量体イヌCRPをコードするDNAの塩基配列を有する発現ベクター。
[25].前記塩基配列がUASの下流に機能的に結合している[24]に記載の発現ベクター。
ここで、単量体イヌCRPをコードするDNAとして、好ましくは配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられ、より好ましくは配列番号4に示される塩基配列を含むDNAが挙げられる。また、単量体ヒトCRPをコードするDNAとして、好ましくは配列番号7に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられ、より好ましくは配列番号9に示される塩基配列を含むDNAが挙げられる。
なお、配列番号1又は7で示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAには、このアミノ酸配列に、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、60%以上の相同性が挙げられ、好ましくは70%以上の相同性、より好ましくは80%以上の相同性、更に好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
また、配列番号4又は9に示される塩基配列には、それがコードするタンパク質が機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個の塩基の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有する塩基配列が含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、60%以上の相同性が挙げられ、好ましくは70%以上の相同性、より好ましくは80%以上の相同性、更に好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
配列番号1に示される単量体イヌCRPのアミノ酸配列と配列番号7に示される単量体ヒトCRPのアミノ酸配列との配列相同性は60%である。また、配列番号4に示される単量体イヌCRPの塩基配列と配列番号9に示される単量体ヒトCRPの塩基配列との配列相同性は60%である。
ここで、配列相同性は、EBIの提供するCLUSTALW2ツールを用いた、デフォルトの条件下でのペアワイズアラインメントから算出することができる。
シグナルペプチドとは、小胞体膜結合性のリボソーム上で合成された後に、分泌タンパク質が脂質二重層を通り抜ける際に必要となるアミノ酸残基である。分泌タンパク質は一般的に、最終的に活性を有する成熟型タンパク質のN末端側にシグナルペプチドが連結された状態で合成され、シグナルペプチドは分泌後に除去される。
本発明で用いることができるシグナルペプチドをコードするDNAとしては、例えば、ヒト、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、ネコ、酵母、昆虫に由来するシグナルペプチドをコードするDNAを挙げることができる。その中でも、イヌCRPを製造する場合には、イヌCRPに由来するシグナルペプチド又は昆虫に由来するシグナルペプチドをコードするDNAが好ましい。また、ヒトCRPを製造する場合には、ヒトCRPに由来するシグナルペプチド又は昆虫に由来するシグナルペプチドをコードするDNAが好ましい。
ここで、イヌCRPに由来するシグナルペプチドをコードするDNAとしては、好ましくは配列番号2に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられ、より好ましくは配列番号5に示される塩基配列を含むDNAが挙げられる。また、ヒトCRPに由来するシグナルペプチドをコードするDNAとしては、好ましくは配列番号8に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられ、より好ましくは配列番号10に示される塩基配列を含むDNAが挙げられる。
ここで、シグナルペプチドを有する単量体CRPをコードするDNAとして、好ましくは配列番号3に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAが挙げられ、より好ましくは配列番号6に示される塩基配列を含むDNAが挙げられる。
なお、配列番号3で示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAには、このアミノ酸配列に、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、60%以上の相同性が挙げられ、好ましくは70%以上の相同性、より好ましくは80%以上の相同性、更に好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
また、配列番号6に示される塩基配列には、それがコードするタンパク質が機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個の塩基の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有する塩基配列が含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、60%以上の相同性が挙げられ、好ましくは70%以上の相同性、より好ましくは80%以上の相同性、更に好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
なお、DNAの発現において、「プロモーターにより直接的又は間接的に発現が制御される」とは、目的とするDNAがプロモーターの下流に機能的に結合していること、又は、プロモーターの下流に転写因子をコードするDNAが機能的に結合しており、この転写因子によって目的とするDNAの発現が誘導されることをいう。
また、被形質転換カイコとしては、非休眠卵を産下する性質を有するカイコ、休眠卵を産下する性質を有するカイコ(例えば実用品種である、ぐんま200、春嶺、鐘月、錦秋、鐘和等)を使用することができる。ここで、休眠卵とは産卵後胚発生が一時的に停止する卵を言い、非休眠卵とは産卵後胚発生が停止せず、幼虫が孵化する卵を言う。
上前記ヘルパーベクターとしては、pHA3PIG(Tamura,T.et al.,Nat.Biotechnol.,18,81-84,2000)が挙げられるが、これに限定されるものではない。
前記トランスポゾンとしては、piggyBacが好ましいが、これに限定されるものではなく、mariner、minos等を用いることもできる。
なお、導入DNAを分割して被形質転換カイコに導入することも可能である。例えば、2分割したうちの一方のDNAが導入されたカイコが産卵した卵に、もう一方のDNAを前述の方法で人為的に導入する方法、又は2分割されたDNAのうち両方を前述の方法で一つの卵に導入する方法が挙げられる。
好ましくは、前述した導入DNAのうち、カイコ由来の絹糸腺に特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAを、前述のDNA導入方法で被形質転換カイコに導入する。次いで、前述した導入DNAのうち、前記転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した前述した本発明に共通して用いられる単量体CRPをコードするDNAを、前述のDNA導入方法で別の被形質転換カイコに導入する。次いで、これら2種類の成体カイコ同士を交配させ、次世代のカイコとして前述の導入DNAを全て有する遺伝子組換えカイコを得る。
この方法では、一の被形質転換カイコに転写因子を導入し、この転写因子により発現する組織、時期、量などを決めることができる。そのため、発現させたい遺伝子を導入した系統と交配させることにより、多くの系統を作ることなく、各組織や時期、量などを変えることができる利点がある。また、目的遺伝子を発現させることで遺伝子組換えカイコが不妊になる場合でも系統作出が可能である。更には、転写因子の選択によっては、導入DNAからの生産物の量を増加させることができる。
より好ましい態様では、本発明の5量体CRPの製造方法で用いられる遺伝子組換えカイコは、絹糸腺に5量体CRPを製造し、特に好ましい態様では、絹糸腺に5量体CRPを発現し分泌させて製造する。夾雑タンパク質が少ない限定された空間でタンパク質を高密度に発現させる器官である絹糸腺で5量体CRPが製造され、絹糸腺に5量体CRPが分泌されることで、5量体CRPの回収・精製が容易となり、5量体CRPを高効率で製造可能となるからである。
絹糸腺からの液状絹の回収方法としては、例えば、吐糸期になったカイコを解剖し、絹糸腺を摘出した後、緩衝液中でピンセットやメスで絹糸腺に傷を入れ、又は絹糸腺を緩衝液中に入れ緩衝液をボルテックスミキサーにより攪拌して、緩衝液中に放出された液状絹を回収する方法が挙げられる。その他にも、遺伝子組換えカイコが吐糸した繭から回収する方法、界面活性剤を用いる方法又は水溶液で溶かす等の当業者であれば公知の方法を絹糸の回収方法として挙げることができる。
一方、脂肪体からの分泌物の回収方法としては、幼虫体内から脂肪体を摘出し、緩衝液中でピンセットやメスで脂肪体に傷を入れ、緩衝液中に放出された分泌物を回収する方法や、分泌物を脂肪体から体液に分泌させ、その体液を分取する等の当業者であれば公知の方法を挙げることができる。
本発明における5量体CRPを含有する分泌物の回収方法の好ましい一態様としては、吐糸期になったカイコを解剖し、絹糸腺を摘出した後、緩衝液中で液状絹を抽出して回収する方法が挙げられる。この方法によれば、液状絹を回収後の5量体CRPの精製が容易となる。
後段の実施例で詳述するが、本発明の5量体CRPの製造方法により製造された5量体CRPは、ELISA法における反応性評価において、血清由来のCRPと同様に濃度依存的な反応性を示す。従って、本発明の5量体CRPの製造方法により製造された5量体CRPによって、CRP測定キット等に用いられる血清由来CRPを代替可能である。
より好ましい態様では、本発明で提供される遺伝子組換えカイコは、絹糸腺に5量体CRPを製造し、特に好ましい態様では、絹糸腺に5量体CRPを発現し分泌させて製造する。夾雑タンパク質が少ない限定された空間でタンパク質を高密度に発現させる器官である絹糸腺で5量体CRPが製造され、絹糸腺に5量体CRPが分泌されることで、5量体CRPの回収・精製が容易となり、5量体CRPを高効率で製造可能となるからである。
例えば、卵を通常の条件で催青し、孵化した蟻蚕を人工飼料等へ掃立てし、通常のカイコと同様な条件で飼育することで5令カイコまで飼育できる。
本発明で提供される遺伝子組換えカイコ、又は本発明の5量体CRPの製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコは、通常のカイコと同様に蛹化する。蛹の段階で雌雄を区別し、発蛾したのち雌雄を交尾させ、翌日採卵する。カイコ卵は通常のカイコ卵と同様に保存することが可能である。本発明で提供される遺伝子組換えカイコ、又は本発明の5量体CRPの製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコはこうした飼育を繰り返すことで継代することが可能である。
継代して得られた遺伝子組換えカイコは人工飼料による清浄飼育が可能であり、数万匹規模での大量飼育を容易に行うことができる。しかも、自然界に豊富にある桑の葉を用いてカイコの大量飼育を行えば、5量体CRPを安価かつ大量に得ることができる。
すなわち、大量飼育した本発明で提供される遺伝子組換えカイコ、又は本発明の5量体CRPの製造方法に用いられる遺伝子組換えカイコを用いて5量体CRPを高効率で製造可能である。
より好ましい態様では、本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法は、5量体CRPを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコを製造する方法である。特に好ましい態様では、本発明の遺伝子組換えカイコの製造方法は、5量体CRPを絹糸腺に発現し分泌する遺伝子組換えカイコを製造する方法である。
さらに好ましい態様では、本発明で提供される単量体イヌCRPをコードするDNAは、シグナルペプチドを有する単量体イヌCRPをコードするDNAである。シグナルペプチドを有する単量体イヌCRPをコードするDNAとしては、配列番号3に示される配列を有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するDNA、好ましくは、配列番号6に示される塩基配列を有するDNAが挙げられる。
なお、配列番号1又は3で示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAには、このアミノ酸配列に、機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個のアミノ酸の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列をコードするDNAが含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、60%以上の相同性が挙げられ、好ましくは70%以上の相同性、より好ましくは80%以上の相同性、更に好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
また、配列番号4又は6に示される塩基配列には、それがコードするタンパク質が機能的に同等な限りにおいて、1ないし数個の塩基の欠失、置換、付加および挿入から選ばれる少なくとも1種の変異が導入され、かつ、この配列と一定の相同性を有する塩基配列が含まれる。ここで、一定の相同性としては、例えば、60%以上の相同性が挙げられ、好ましくは70%以上の相同性、より好ましくは80%以上の相同性、更に好ましくは90%以上の相同性が挙げられる。
本発明で提供される発現ベクターの基礎となるベクターについては特に限定されないが、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBac系ベクター、pBP322、pBluescript、pCR-Script等が挙げられる。
なお、発現ベクターの宿主への導入は、当業者においては公知の方法、例えばエレクトロポレーション法などにより実施することができる。
本発明で提供される発現ベクターを5量体CRPの製造が可能な宿主に導入することで、後段の実施例で詳述するように活性を有する5量体イヌCRPの遺伝子工学的な製造が可能となる。
UAS配列及びその下流に連結されたシグナルペプチドを有する単量体イヌCRPをコードするDNA(cfCRP)を含むプラスミドベクターを構築した。すなわち、イヌCRP遺伝子中のMature Regionに相当する塩基配列を決定し、その塩基配列を含んだ図1に示すプラスミドベクターを構築した。なお、イヌCRP遺伝子の塩基配列として、イヌCRPと予測される配列(NCBI Reference Sequence:XM_545746)を参照した。
次いで、Mature Regionに相当する配列番号4の塩基配列の5’末端に、配列番号5の塩基配列を有するシグナルペプチドに相当する塩基配列を付加した配列番号6の塩基配列を有する塩基配列(cfCRP)を設計した。設計した塩基配列を全合成した後、合成DNAをpUC57プラスミドに挿入してpUC57-cfCRPプラスミドを構築した。なお、cfCRPのORFの両端には制限酵素サイト(SpeI)を設けた。
次いで、pUC57-cfCRPプラスミドをSpeI処理し、cfCRPフラグメントを得た。最後に、cfCRPフラグメントを、pBac-UAS-SV40のBlnIサイトに挿入して、遺伝子組換えカイコを作成するためのプラスミドベクターpBac-UAS-cfCRP-SV40(図1)を構築した。
前記(1)で構築したプラスミドベクターpBac-UAS-cfCRP-SV40が導入されたカイコと、セリシンI遺伝子から合成されるタンパク質をコードするDNAのプロモーター(Ser1)及びその下流に連結されたGAL4をコードするDNA(GAL4)が導入されたカイコとを作成し、それらを交配させてイヌCRPを産生する遺伝子組換えカイコを作成した。
次いで、遺伝子が導入されたカイコ卵から孵化した第1世代のカイコを交配させ、得られた第2世代の幼虫の体表におけるKMOマーカー遺伝子の発現を調べた。
交配させた62蛾区中1蛾区からKMOマーカー遺伝子を発現する幼虫8個体を同定した。これらの個体を継代飼育することによりイヌCRP遺伝子を持ったカイコを系統化した。
次いで、イヌCRP系統のカイコと、セリシンI遺伝子から合成されるタンパク質をコードするDNAのプロモーター(Ser1)及びその下流に連結されたGAL4をコードするDNA(GAL4)が導入された、既に系統化されているSer1GAL4系統のカイコ(田村俊樹ら,日蚕講要,74,p51,2004)とを交配した。交配により得られた次世代のカイコの中から、イヌCRP系統が有するKMOマーカー遺伝子とSer1GAL4系統が有するDsRedマーカー遺伝子との双方を発現する個体を選抜した。
前記(2)で選抜した遺伝子組換えカイコの吐糸期の幼虫から、イヌCRPを抽出し、反応性を確認した。
得られた遠心上清中にイヌCRPが存在することをイヌCRP測定ELISAキット(ICL社製)にて確認した。また、遠心上清を段階的に希釈し、希釈液中のイヌCRP量を測定して希釈直線性を確認した(図2)。
前記(3)でイヌCRP産生遺伝子組換えカイコから抽出したイヌCRP溶液からイヌCRPを分離精製した。
次いで、20mlの50mM Tris-HCl(pH7.4)、2M NaCl、10mM CaCl2でカラムを洗浄後、50mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、10mM Phosphoryl Cholineを通液してカラムよりイヌCRPを溶出させた。
得られたイヌCRP画分について、イヌCRP測定ELISAキット(ICL社製)により吸光度の上昇を確認した(表1)。
前記(4)で精製されたイヌCRPの分子量を測定した。
分子量マーカーであるThyroglobulin(M.W.670kDa)、r-globulin(M.W.158kDa)、Ovalbumin(M.W.44kDa)、Myoglobin(M.W.17kDa)、Vitamin B12(M.W.1.35kDa)を同条件化で通液し、溶出時間をイヌCRPのものと比較することによってイヌCRPの分子量を測定した。
ここで、イヌCRPの単量体の分子量がその22.9kDaと推定されるのに対し、ヒトCRPはその単量体の分子量は23.0kDaであり、血清中に5量体で存在する。
配列番号2-イヌCRPに由来するシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号3-人工配列の説明:イヌCRPのアミノ酸配列(配列番号1)とイヌCRPに由来するシグナルペプチドのアミノ酸配列(配列番号2)を連結したアミノ酸配列
配列番号4-イヌCRPの塩基配列
配列番号5-イヌCRPに由来するシグナルペプチドの塩基配列
配列番号6-人工配列の説明:イヌCRPの塩基配列(配列番号4)とイヌCRPに由来するシグナルペプチドの塩基配列(配列番号5)を連結した塩基配列
配列番号7-ヒトCRPのアミノ酸配列
配列番号8-ヒトCRPに由来するシグナルペプチドのアミノ酸配列
配列番号9-ヒトCRPの塩基配列
配列番号10-ヒトCRPに由来するシグナルペプチドの塩基配列
Claims (25)
- 5量体CRPの製造方法であって、
単量体CRPをコードするDNAが導入された遺伝子組換えカイコを作成する作成工程と、
作成された遺伝子組換えカイコが製造する5量体CRPを回収する回収工程と
を有する5量体CRPの製造方法。 - 前記作成工程が、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAと
が導入された遺伝子組換えカイコを作成する工程である請求項1に記載の製造方法。 - 前記作成工程が、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAが導入されカイコと、
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAが導入されたカイコと
を交配させて遺伝子組換えカイコを作成する工程である請求項1に記載の製造方法。 - 前記転写因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである請求項2又は3に記載の製造方法。
- 前記回収工程が、
作成された遺伝子組換えカイコがその絹糸腺に製造する5量体CRPを回収する工程である請求項2から4のいずれかに記載の製造方法。 - 前記CRPがイヌCRPである請求項1から5のいずれかに記載の製造方法。
- 前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAである請求項1から6のいずれかに記載の製造方法。
- 前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号4に示される塩基配列を含むDNAである請求項1から7のいずれかに記載の製造方法。
- 遺伝子組換えカイコであって、
単量体CRPをコードするDNAが導入され、
5量体CRPを製造する遺伝子組換えカイコ。 - 遺伝子組換えカイコであって、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAと
が導入され、
5量体CRPを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコ。 - 前記転写因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである請求項10に記載の遺伝子組換えカイコ。
- 前記CRPがイヌCRPである請求項9から11のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
- 前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAである請求項9から12のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
- 前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号4に示される塩基配列を含むDNAである請求項9から13のいずれかに記載の遺伝子組換えカイコ。
- 5量体CRPを製造する遺伝子組換えカイコの製造方法であって、
単量体CRPをコードするDNAをカイコに導入する導入工程を含む、5量体CRPを製造する遺伝子組換えカイコの製造方法。 - 5量体CRPを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコの製造方法であって、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAと、
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAと
をカイコに導入する導入工程を含む、5量体CRPを絹糸腺に製造する遺伝子組換えカイコの製造方法。 - 前記導入工程が、
絹糸腺特異的に発現するタンパク質をコードするDNAのプロモーターの下流に機能的に結合した転写因子をコードするDNAが導入されたカイコと、
該転写因子の標的プロモーターの下流に機能的に結合した単量体CRPをコードするDNAが導入されたカイコと
を交配させてDNAが導入されたカイコを作成する工程である、請求項16に記載の製造方法。 - 前記転写因子がGAL4であり、標的プロモーターがUASである請求項16又は17に記載の製造方法。
- 前記CRPがイヌCRPである請求項15から18のいずれかに記載の製造方法。
- 前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードするDNAである請求項15から19のいずれかに記載の製造方法。
- 前記単量体CRPをコードするDNAが配列番号4に示される塩基配列を含むDNAである請求項15から20のいずれかに記載の製造方法。
- 単量体イヌCRPをコードするDNAであって、配列番号1に示される配列を含むアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する単量体イヌCRPをコードするDNA。
- 前記塩基配列が配列番号4に示される配列を含む塩基配列である請求項22に記載の単量体イヌCRPをコードするDNA。
- 発現ベクターであって、請求項22又は23に記載の単量体イヌCRPをコードするDNAの塩基配列を有する発現ベクター。
- 前記塩基配列がUASの下流に機能的に結合している請求項24に記載の発現ベクター。
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