CN104630151A

CN104630151A - 一种检测猪c反应蛋白的单克隆抗体

Info

Publication number: CN104630151A
Application number: CN201510025955.7A
Authority: CN
Inventors: 夏春; 樊淑华
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2015-01-19
Filing date: 2015-01-19
Publication date: 2015-05-20

Abstract

本发明提供一种检测猪C反应蛋白的单克隆抗体，本发明还提供该单克隆抗体的制备及其应用。通过基因工程的方法得了高纯度的CRP重组蛋白；用该重组蛋白筛选出分泌CRP蛋白抗体最稳定、抗体活性最高的杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC NO.9345。该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体具有高度特异性和强亲和力，制备方法简单高效，能够监测猪血清中CRP的含量，鉴别诊断细菌和病毒性疾病，辅助观察治疗效果，从而推动抗生素的合理使用，减少药物残留，保障动物性食品的安全。

Description

一种检测猪C反应蛋白的单克隆抗体

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种单克隆抗体，其可用于检测猪C反应蛋白。

背景技术

C反应蛋白(C-reactive protein)是一种能在Ca²⁺存在时与肺炎球菌细胞壁中荚膜多糖C反应形成复合物的急性时相反应蛋白。1930年，Tillett和Francis首次在急性大叶性肺炎患者的血清中发现。1941年，Avery等测知它是一种蛋白质，故称为C反应蛋白(CRP)。后来，人们在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都测到了CRP，于是人们认为，CRP是组织损伤的一种非特异性反应的标志。

在我国，兽用抗生素在兽医临床和动物饲养方面应用广泛、不可或缺，为了达到既能促进生长又能防病治病的目的，大量的种类繁多的抗生素被应用于畜禽生产的许多环节。抗生素的长期使用和滥用带来的负面作用和严重的后果已经引起重视甚至到了令人触目惊心的地步。如何合理使用抗生素，保障我们食用的禽蛋奶肉等食品的安全成为关注焦点。由于CRP通常在细菌感染后增高，而病毒感染时不增高或增高不明显，所以常用来作为鉴别细菌和病毒感染的一个首选指标。因此，血清中CRP的检测对于鉴别细菌还是病毒感染、监测疾病的活动情况和严重性、观察治疗效果，特别是对抗生素的合理应用有很好的指导作用。

大肠杆菌表达系统是人们应用最多，研究最为透彻的外源蛋白表达系统，大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统的主要优点是其遗传背景和生化特性清楚、易于操作、生长迅速、培养基成本低、易于制备等。因此对于一些非糖基化蛋白或只要求其抗原性的蛋白，大肠杆菌表达系统是一个极好的选择。目前许多诊断试剂用的抗原都是由大肠杆菌表达的。但大肠杆菌表达的蛋白多以包涵体形式存在，无生物学活性。

目前，用于CRP的检测方法主要包括免疫比浊测定法、免疫标记测定法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)。但缺乏使用免疫印迹法(Western-blot)对CRP的有效检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猪体内CRP的单克隆抗体。

本发明的另一个目的是提供上述单克隆抗体的应用。

为了达到上述目的，本发明首先提供一株稳定分泌猪C反应蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9345。该杂交瘤细胞株已于2014年7月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为Sus scrofa C-Reactive Protein杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9345。

本发明提供了由上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

本发明提供了上述单克隆抗体在制备检测猪C反应蛋白试剂盒或诊断试剂中的应用属于本发明的保护范围。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.9345的杂交瘤细胞株在制备检测猪C反应蛋白试剂盒或诊断试剂中的应用。

本发明还提供了一种用于检测猪C反应蛋白的试剂盒，含有保藏编号为CGMCC No.9345的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体。

含有保藏编号为CGMCC No.9345的杂交瘤细胞株分泌产生的单克隆抗体的诊断试剂属于本发明的保护范围。

本发明提供了一种制备能够分泌猪C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，包括以下步骤：

(1)获得猪CRP基因，构建含有该基因的重组表达载体；

(2)重组表达载体转化感受态细胞，诱导表达重组蛋白，重组蛋白复性、通过分子筛层析和离子交换层析纯化猪CRP蛋白得了高纯度的CRP重组蛋白；

(3)将CRP蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，挑选阳性克隆，筛选杂交瘤细胞株。

其中，步骤(1)获得猪CRP基因采用PCR方法，引物如SEQ IDNO.1-2所示。

步骤(2)重组蛋白复性是采取分步加入包涵体的方法，先加入2ml包涵体，12小时候再加入1-2ml包涵体，并将复性时间延长至48h。

进一步地，步骤(2)中重组蛋白的复性具体方法为：

(a)配制500mL复性液具体配方如下：

复性Buffer于4℃冰箱预冷。以下整个复性过程都在4℃冰箱中完成。

(b)将装有500mL复性液的烧杯放置于磁力搅拌器中，加入磁力转子。将一个5mL的注射器并将其固定在烧杯上。

(c)将2mL盐酸胍溶解后的猪CRP的包涵体加入到注射器内，使其缓慢滴入复性液内，12h后再加入1-2mL包涵体，缓慢复性48h。

(d)复性后，在4℃冰箱中将溶液转移至压力搅拌式浓缩杯中，采用氮气压力，超滤膜为10kD进行浓缩。溶液至体积约为30mL时加入100mL预冷的分子筛缓冲液中【20mM Tris-HCl(母液1M，PH8.0)20ml 50mM NaCl(母液5M)10ml ddH₂O定容至1000ml，抽滤后4℃保存备用】。当溶液体积最终<50mL时，低温离心去除沉淀后，转移到10kD超滤浓缩管内继续浓缩至2-5mL左右。

进一步地，步骤(2)中分子筛层析和离子交换层析法纯化猪CRP蛋白的方法为：

(A)首先用分子筛缓冲液平衡Superdex 20016/60HiLoad凝胶层析柱。将浓缩并用分子筛缓冲液换液完毕之后的蛋白样品于4℃离心除去沉淀(13000rpm，12min)，取上清注入快速蛋白液相色谱(AKTAFPLC)的上样环中。在层析柱上以适当的流速运行，根据分子筛层析的结果检测复性效果，将相应分子量的蛋白峰收集，SDS-PAGE鉴定。

(B)将SDS-PAGE鉴定后为目的蛋白的蛋白峰收集用阴离子交换柱Resource Q进一步纯化。用低盐缓冲液A液平衡柱子并上样，样品挂上柱子后用50％高盐缓冲液B液洗脱50min。收集洗脱峰进行SDS-PAGE检测。低盐缓冲液A液配方：

10mM Tris-HCl(母液1M，pH8.0) 10ml

10mM NaCl(母液5M) 2ml，

ddH₂O定容至1000ml，抽滤后4℃保存备用。

高盐缓冲液B液配方：

10mM Tris-HCl(母液1M，pH8.0) 10ml

1M NaCl(母液5M) 200ml

ddH₂O定容至1000ml，抽滤后4℃保存备用。

本发明通过克隆猪CRP蛋白的基因；将克隆的基因插入表达载体，构建重组表达载体；用重组表达载体转化感受态大肠杆菌，诱导表达，通过分子筛层析和离子交换层析纯化得了高纯度的CRP重组蛋白；用该重组蛋白接种小鼠，取其脾淋巴细胞与小鼠Sp2/0骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞系，从中筛选出分泌CRP蛋白抗体最稳定、抗体活性最高的杂交瘤细胞株，它们所产生的抗体即为所需的单克隆抗体。该单克隆抗体具有高度特异性和强亲和力，制备方法简单高效；可直接通过Western-blot直接用于血清中CRP含量的检测，也可用于制备ELISA检测试剂盒等。

本发明的有益效果在于：本发明不仅利用大肠杆菌表达系统成功表达了猪CRP基因的主要抗原表位区。并且利用稀释复性法和分子筛层析及离子交换层析的方法得到了高纯度的表达蛋白，进而用于单克隆抗体的制备，并得到了一组特异性更强、亲和力更高的单克隆抗体。该抗体可直接用于血清中CRP的检测，这对猪CRP蛋白的检测提供了有利的技术支持。该单克隆抗体的制备能够监测猪血清中CRP的含量，鉴别诊断细菌和病毒性疾病，观察治疗效果，推动抗生素的合理使用，从而减少药物残留，推动动物性食品的安全生产。

附图说明

图1为实施例2获得的猪CRP蛋白的分子筛纯化结果图。

图2为实施例2获得的猪CRP蛋白的离子交换纯化结果图。

图3为编号为：1、2、3、4的四只小鼠接种实施例2获得的猪CRP蛋白后的血清抗体效价的测定结果图。

图4为阳性杂交瘤细胞株细胞上清WB鉴定结果图，图中1-7为细胞株1-7，8为蛋白marker。

图5为SDS-PAGE检测单克隆抗体纯度结果图。

图6为临床感染血清样品的免疫印迹检测结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1猪CRP基因的扩增和表达载体的构建

1、引物的设计与合成

根据NCBI中数据库GenBank号(NM_213844.2)核苷酸序列，利用DNAStar和Primer5.0软件设计1对包含CRP基因主要编码区的引物，上游引物P1带有NdeI酶切位点，下游引物P2带有Xhol酶切位点，上、下游引物之间所扩增片段包括CRP基因主要编码区612个碱基。

上游引物P15′-cttcatatgcagacagacatgatcggaaaggcc-3′

(SEQ ID NO：1)

下游引物P25′-tgactcgagttagggccacagctggggcttgacatacac-3′(SEQID NO：2)

2、猪总RNA的提取取猪肝脏50-100mg加入1.5ml的EP管，先加入300μL Trizol(Invitrogen)，用研磨棒捣碎研磨至粉状，再补加700μL Trizol后，冰浴15min；加200μL氯仿，充分混匀后冰浴5min；4℃、12000rpm离心15min，缓慢吸取上层水相(约500μL)于新1.5mL离心管，再加入-20℃预冷的异丙醇500uL(按1:1的比例加入)，随后上下颠倒离心管6-8次，混匀后于-20℃孵育10min；4℃、12000rpm离心10min，弃上清(此时可见管底RNA沉淀)；向沉淀中加入1mL 75％预冷乙醇洗涤RNA沉淀(用0.1％DEPC水配制)；4℃、7500rpm离心5min，再重复一次5步骤洗涤RNA沉淀，弃上清；室温风干10min；用20-30μL 0.1％DEPC水将沉淀溶解，并在55-60℃下孵育10min；冰上保存样品RNA，测OD₂₆₀/OD₂₈₀值后计算浓度后，尽可能一次性全部使用。也可低温短期保存，一般经验：-80℃可保存约一个月，-20℃一周。本实施例中猪总RNA的提取过程中，采用了1.5ml的EP管配合研磨棒进行组织破碎，而没有采用传统的液氮研磨的方法，事实证明该方法在不影响RNA提取效果的前体下，不仅可以减少组织样品的浪费，而且便于操作，在同时提取多种组织的RNA时大大降低了工作量。

3、cDNA的合成(采用Thermo Scientific RevertAid^TM First StrandcDNA Synthesis Kit)

65℃作用5min，冰上2min，轻甩(掌式离心机)，加入以下成分：

42℃，60min；70℃15min。

4、猪CRP基因的扩增建立如下PCR反应体系，总体积为50μL(使用宝生物工程有限公司的的PCR试剂盒)

PCR条件：98℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃，45sec，32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

5、PCR产物的切胶回收

使用AXYGEN公司的Axy prep DNA Gel Extraction Kit回收PCR产物。

(1)将上述猪CRP的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定包含有正确大小的目标片段。

(2)在紫外灯下确定目的DNA条带，切下含有DNA条带的凝胶块，置于1.5mL离心管中。

(3)加入3倍体积的溶胶液PN，50-60℃加热10min，期间不时温和地上下翻转离心管，充分溶解胶块。胶块完全溶解后，最好冷却至室温再上柱。

(4)吸取溶化的胶液加入吸附柱CA1中，室温放置2min，12000rpm离心30-60sec，倒掉收集管中的滤液。

(5)向吸附柱CA1中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60sec，倒掉滤液。

(6)再加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30-60sec，倒掉滤液。

(7)将吸附柱12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

(8)将吸附柱放入新的1.5mL离心管中，室温放置2-5min。

(9)加入25-40μL 65℃预热的无菌去离子水，室温放置2min，12000rpm离心2min，收集洗脱产物。

(10)将洗脱产物重新吸入吸附柱中，重复步骤9。

(11)洗脱产物即含有回收的DNA片段，取少量电泳检测并估测DNA浓度。

6、PCR产物与pMD18T载体的连接(使用宝生物工程有限公司的pMD18T连接试剂盒)。

16℃连接过夜。

7、转化感受态细胞

(1)从-80℃中取出感受态细胞E.coli DH5α，37℃溶解后，立即放于冰上(2-5min)。

(2)在20μL的DH5α感受态细胞中加入3.2.3步骤中的连接产物5μL，缓慢吹吸混匀，尽量避免气泡，然后冰浴30min。

(3)42℃气浴90sec(期间不能晃动)，然后立即轻置于冰上2-5min。

(4)加入900μL的SOC溶液，轻轻吹吸混匀，同样要避免气泡产生，置37℃，培养60-90min。

(5)将培养后的感受态细胞5000rpm离心3min，弃上清(别倒完全，留下约50-100μL)，利用残余的上清悬浮菌体，均匀涂布于Amp/LB的琼脂平板上，倒置于37℃培养12-16h。

8、质粒的小量制备(使用AXYDEN公司的Axy prep plasmidMiniprep Kit)

(1)取1-5mL经PCR鉴定阳性的培养菌入离心管中，13000rpm离心1min。

(2)向菌液沉淀的离心管中加入250μL溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮。

(3)加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。

(4)加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转数次，充分混匀，12000rpm离心10min。

(5)小心将上清移到吸附柱CP中，室温放置2min，12000rpm离心1min，弃滤液。

(6)向吸附柱CP中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃滤液。

(7)向吸附柱CP中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃滤液。

(8)12000rpm离心2min。此步不可省略，为去除乙醇，以防影响下一步实验。

(9)取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1.5mL离心管中，室温放置2-5min(为更彻底去除乙醇)，加入50-100μL 65℃预热的无菌水或洗脱缓冲液EB，室温放置2min后，12000rpm离心2min。

(10)吸取滤液加入吸附柱CP中，12000rpm离心2min，收集滤液，-20℃保存备用。

9、质粒的酶切鉴定及挑菌PCR鉴定

9.1用Nde I和XhoLI双酶切质粒。酶切体系如下：

酶切时间及条件：37℃酶切12h。限制性内切酶加入量应按照以下原则确定：按3-5U酶/1μg质粒，且酶的总体积不要超过酶切反应体系的10％。

9.2挑菌PCR鉴定

挑取Amp/LB板上的菌落于3mL的Amp/LB培养液中，37℃摇菌7-10h。取培养后菌液，进行PCR鉴定。建立如下PCR反应体系，总体积为25μL。下表中的引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。

PCR条件同1.4猪CRP基因的扩增步骤，去掉72℃10min(引物序列见1.1)。

10、重组表达载体的构建

10.1克隆质粒与pET-28a载体的双酶切回收

取克隆质粒和pET-21a载体质粒各10μL于1.5mL Eppendorf管中，加入10×PCR buffer 3μL，BSA 2μL，NdeI 1.0μL和XhoI 1.0μL，灭菌水加至30μL置37℃水浴消化3h。用1％的琼脂糖凝胶电泳重组质粒和载体的酶切产物，切下所需的目的条带，使用AXYGEN公司的Axyprep DNA Gel Extraction Kit回收PCR产物。电泳观察回收情况。

10.2BL21目的片段与载体的连接转化

取目的片段4.5μL、pET-21a载体0.5μL混合后，加入10×Ligation buffer 1μL，T4DNA连接酶1μL(3U/μL)，灭菌水补至10μL，混匀后置16℃连接过夜。将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行克隆。

10.3重组质粒的提取与鉴定(同步骤8和9)

获得表达质粒pET21a-pigCRP。

实施例2重组蛋白的诱导表达及表达蛋白的复性和纯化

1、重组蛋白的诱导表达及包涵体的提取

(1)将表达质粒pET21a-pigCRP转化到BL21(DE3)中，培养12个小时后，将单克隆菌落接种至100mLAmp⁺LB培养基中，在摇床中缓慢摇至8-10个小时后，作为母液待用；

(2)接种1％-5％的母液到3mL培养基中，37℃摇床培养至OD600到0.4-0.6，设置空菌和空质粒对照，转速200rpm；

(3)母液按照1％接种量转接到2L的Amp⁺LB培养基中，37℃，180rpm，培养至OD值为0.4-0.6后，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，160-180rpm，继续培养5h；

(4)收菌(以下步骤均在冰中进行)，4℃，12000rpm离心5min弃上清液，用40-60mLPBS进行悬浮，超声裂解(超6s，间隔12s，超声99次)；

(5)将超声后的菌液12000rpm离心10min后，判断是否为可溶性表达，分别取上清及沉淀各2μL，进行SDS-PAGE电泳，如为包涵体表达，则按照下步操作；

(6)离心后，用玻璃棒光面轻轻的将黄色的细菌碎片拨掉，离心管下部分为白色致密菌块即为包涵体；

(7)用洗涤缓冲液悬浮沉淀后，12000rpm，离心10min，倒掉上清；

(8)取一支新的50mL的离心管称重预冷备用，然后倒掉洗涤缓冲液，用重悬缓冲液悬浮并更换至已称重的新的离心管中。(取出5μL+1μL 5×上样缓冲液，煮沸10min，12000rpm，离心5min，PAGE电泳，鉴定包涵体)；

(9)4℃，12000rpm离心10min，按30mg/mL用盐酸胍溶解，并在4℃条件下搅拌均匀；

(10)4℃，12000rpm离心10min，取出上清液分装成每管1mL，于-20℃条件下保存；

2、重组蛋白的体外共复性及纯化

2.1重组蛋白的复性和浓缩

(1)配制复性液(500mL)具体配方如下：

(2)将装有500mL复性液的烧杯放置于磁力搅拌器中，加入磁力转子。将一个5mL的注射器并将其固定在烧杯上。

(3)将2mL盐酸胍溶解后的猪CRP的包涵体加入到注射器内，使其缓慢滴入复性液内，12h后再加入1-2mL包涵体，缓慢复性48h。

(4)复性后，在4℃冰箱中将溶液转移至压力搅拌式浓缩杯中，采用氮气压力，超滤膜为10kD进行浓缩。溶液至体积约为30mL时加入100mL预冷的分子筛缓冲液中【20mM Tris-HCl(母液1M，PH8.0)20ml 50mM NaCl(母液5M)10ml ddH₂O定容至1000ml，抽滤后4℃保存备用】。当溶液体积最终<50mL时，低温离心去除沉淀后，转移到10kD超滤浓缩管内继续浓缩至2-5mL左右。

2.2分子筛层析和离子交换层析法纯化猪CRP蛋白

(1)分子筛缓冲液平衡Superdex 20016/60HiLoad凝胶层析柱。将浓缩并用分子筛缓冲液换液完毕之后的蛋白样品于4℃离心除去沉淀(13000rpm，12min)，取上清注入快速蛋白液相色谱(AKTA FPLC)的上样环中。在层析柱上以适当的流速运行，根据分子筛层析的结果检测复性效果，将相应分子量的蛋白峰收集，SDS-PAGE鉴定。

(2)将SDS-PAGE鉴定后为目的蛋白的蛋白峰收集用阴离子交换柱Resource Q进一步纯化。用低盐缓冲液A液平衡柱子并上样，样品挂上柱子后用50％高盐缓冲液B液洗脱50min。收集洗脱峰进行SDS-PAGE检测。经过分子筛和离子交换层析纯化结果如图1和图2所示。低盐缓冲液A液配方：

10mM Tris-HCl(母液1M，pH8.0) 10ml

10mM NaCl(母液5M) 2ml，

ddH₂O定容至1000ml，抽滤后4℃保存备用。

高盐缓冲液B液配方：

10mM Tris-HCl(母液1M，pH8.0) 10ml

1M NaCl(母液5M) 200ml

ddH₂O定容至1000ml，抽滤后4℃保存备用。

实施例3单克隆抗体的制备

1、免疫小鼠血清抗体效价的测定用实施例2获得的猪CRP蛋白，按60μg蛋白/只小鼠的量，皮下初次免疫4只SPF BALB/c雌性小鼠，编号为：1、2、3、4。小鼠经过五次皮下加强免疫后(免疫量为30μg蛋白/只)眼眶取血，测血清效价。结果(参见图3)4号小鼠的血清抗体效价最高，用于细胞融合实验。

2、细胞融合实验取小鼠脾细胞与SP2/0细胞，采用PEG法进行融合。融合完细胞用半固体培养基(含HAT)进行筛选培养。

融合实验步骤如下：

1)将状态良好的sp2/0细胞轻柔的从培养瓶壁上吹打下来，吸入到50ml离心管中。

2)小鼠摘眼球取血，然后拉颈处死，放入75％的酒精中浸泡5min。

3)在平皿中倒入少量无血清的IMDM，将细胞筛及注射器内芯放入平皿中。用剪刀和镊子取下小鼠的脾脏，放到细胞筛上。用注射器的内芯轻轻地将脾充分碾碎，将碾好的细胞吸入到装sp2/0的离心管中，离心1500rpm，5min。

4)用剪刀和镊子取下小鼠的胸腺，碾碎。将碾好的胸腺细胞到15ml离心管中，再加入1ml的HAT，放在孵箱中备用。

5)将离心好的细胞，倒掉上清，用无血清的IMDM将细胞小心轻柔地吹匀，离心(1500rpm，5min)。

6)将离心好的细胞上清尽量倒掉。拍打离心管底充分悬浮细胞，将离心管放入37℃温水中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG，加完后，在温水中静置1min。然后2min内缓慢加入2ml的无血清的IMDM，接着2min内缓慢加入8ml无血清的IMDM。离心1000rpm，5min。

7)倒掉上清，加入10ml的血清，小心的将细胞吹匀，倒入前面准备好的胸腺细胞。再加入25ml灭过菌的半固体培养基，充分混匀。然后均匀倒入30个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入湿盒中，然后放入孵箱中培养。

3、挑克隆，筛选阳性杂交瘤细胞株

用实施例2制备的猪CRP蛋白包板，对挑选的克隆采用ELISA方法，做第一次筛选，得到53株阳性杂交瘤细胞株。

将53株阳性的细胞株，用实施例2制备的猪CRP蛋白再次包板，采用ELISA方法，做第二次筛选，得到7株阳性杂交瘤细胞株。

4、单克隆细胞亚类鉴定采用ELISA方法对7株阳性杂交瘤细胞进行了亚类的测定，结果见表1。

表1 7株阳性杂交瘤细胞株单克隆细胞亚类的鉴定

5、抗体的Western-blot鉴定用重组蛋白对7株单克隆抗体(细胞上清)，进行Western-blot检测，除2号细胞上清外，其余6株均呈阳性，条带单一且分子量正确(结果见图4)，单细胞克隆的相关信息见表2。将OD值检测较高的杂交瘤细胞株命名为：pigCRPNo.1、pigCRPNo.25、pigCRPNo.29、pigCRPNo.34、pigCRPNo43、pigCRPNo.51并于液氮中保存。另外，选择pigCRPNo.1、pigCRPNo.29两株杂交瘤细胞进行CRP单抗的亲和纯化。本发明将pigCRPNo.29号杂交瘤细胞株于2014年7月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，简称CGMCC，邮编100101)保藏，分类命名为Susscrofa C-Reactive Protein杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCCNo.9345。

电泳信息：丙烯酰胺12％；浓缩胶恒压80V；40min，分离胶恒压100V，70min；转膜信息：(湿转膜)1块胶，恒压100V，40min。

表2单克隆细胞株相关信息

3.6纯化的单克隆抗体的相关信息

3.6.1使用紫外分光光度法检测单克隆抗体的浓度，结果见表3。

表3紫外分光光度法检测单克隆抗体浓度

注：名称列中1和29分别指pigCRPNo.1和pigCRPNo.29杂交瘤细胞株分泌的单抗

3.6.2SDS-PAGE检测抗体纯度检测结果见图5。

3.6.3ELISA检测抗体亲和力亲和常数≈150000×A/抗体浓度，A代表上平台的1/2OD值所对应的抗体稀释倍数；抗体浓度的单位为mg/ml。

表4单克隆抗体亲和力测定结果

抗体稀释倍数	1	29
			200	0.963	1.152
400	0.937	1.066
			800	0.922	1.115
1600	0.994	1.17
			3200	0.964	1.17
6400	0.872	1.128
			12800	0.771	1.091
25600	0.699	0.966
			51200	0.471	0.738
102400	0.381	0.611
			空	0.001	0.02
稀释度	51200	102400

表4中的1和29分别指pigCRPNo.1和pigCRPNo.29杂交瘤细胞株分泌的单抗

3.7临床感染血清样品CRP的检测

使用保藏编号为CGMCC 9345的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体对6份细菌感染血清和2份病毒感染血清进行CRP的检测，结果表明该单克隆抗体能够直接检测细菌感染血清样品中存在的CRP，且特异性强，检测条带单一(图6中第1-6泳道)；而对于病毒感染样品，则表现为阴性(图6中第7泳道)或弱阳性(图6中第8泳道)，分析第8泳道为弱阳性的原因可能为病毒感染后导致CRP的少量生成，或继发细菌感染所致。结果如图6所示。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一株杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No.9345。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测猪C反应蛋白试剂盒或诊断试剂中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测猪C反应蛋白试剂盒或诊断试剂中的应用。

5.一种用于检测猪C反应蛋白的试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的单克隆抗体。

6.含有权利要求2所述单克隆抗体的诊断试剂。

7.一种制备能够分泌猪C反应蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获得猪CRP基因，构建含有该基因的重组表达载体；

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)获得猪CRP基因采用PCR方法，引物如SEQ ID NO.1-2所示。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)重组蛋白复性是采取分步加入包涵体的方法，先加入2ml包涵体，12小时候再加入1-2ml包涵体，并将复性时间延长至48h。

10.如权利要求7-9任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)中分子筛层析和离子交换层析法纯化猪CRP蛋白的方法为：

(A)用分子筛缓冲液平衡Superdex 200 16/60HiLoad凝胶层析柱，将浓缩并用分子筛缓冲液换液完毕之后的蛋白样品于4℃离心除去沉淀，13000rpm，12min，取上清注入快速蛋白液相色谱的上样环中；根据分子筛层析的结果检测复性效果，将相应分子量的蛋白峰收集，SDS-PAGE鉴定；

(B)将SDS-PAGE鉴定后为目的蛋白的蛋白峰收集用阴离子交换柱Resource Q进一步纯化，用低盐缓冲液A液平衡柱子并上样，样品挂上柱子后用50％高盐缓冲液B液洗脱50min，收集洗脱峰进行SDS-PAGE检测。