CN109112111A - 猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物免疫分析技术领域。具体涉及猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备与应用。本发明筛选的分泌针对猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A11，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2017107。本发明制备的单克隆抗体1A11具有良好的稳定性和特异性，可将其作为一抗用于PDCoV感染仔猪肠道免疫组织化学检测分析中或其他试剂盒的开发中。

Description

猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备与应用
技术领域
本发明属于动物免疫分析技术领域。具体涉及一种猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备与应用。
背景技术
猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,简称PDCoV)是由香港学者在2012年于猪粪便样品中首次发现的一种猪肠道致病冠状病毒。其属于尼多病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridea)δ冠状病毒属(Genus Deltacoronavirus)(Woo PC,etal.Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in the genusdeltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the genesource of gammacoronavirus and deltacoronavirus.J Virol,2012,86(7):3995-4008；Woo PC,et al.Coronavirus genomics and bioinformatics analysis.Viruses,2010,2(8):1804-1820)。PDCoV在香港首次发现后并没有引起人们的关注，其对猪的致病性并没有确切的研究。在2014年，美国俄亥俄州部分猪场检测出PDCoV，随后PDCoV在美国至少18个州流行爆发，相关的病毒分离和动物致病性试验证实此病毒对仔猪具有较强的致病性，可以引起仔猪发生以腹泻为主的肠道疾病(Wang LY,et al.Detection and geneticcharacterization of deltacoronavirus in pigs,Ohio,USA,2014.Energ Infect Dis,2014,20(7):1227-1230；Ma YM,et al.Origin,evolution,and virulence of porcinedeltacoronaviruses in the United States.mBio,2015,6(2):e00064-15；Jung K,etal.Pathogenicity of 2porcine deltacoronavirus strains in gnotobioticpigs.Energ Infect Dis,2015,21(4):650-654)。鉴于PDCoV对养猪业的影响，美国农业部于2014年6月5日发布了一项联邦政令，专门设立了包括PEDV、PDCoV在内的致猪腹泻肠道病毒病例报告机制，并拨款2620万美元用于相关的检测防治工作(www.aasv.org)。在美国出现大规模的PDCoV爆发流行后，其他国家和地区如加拿大、韩国、泰国、越南、老挝等国也相继出现了PDCoV的流行(Lee JH,et al.Detection and phylogenetic analysis ofporcine Deltacoronavirus in Korean swine farms,2015.Transbound Emerg Dis,2016,63:248-252；Wang LY,et al.Porcine coronavirus HKU15detected in 9USstates,2014.Energ Infect Dis,2014,20(9):1594-1595；Homwong N,etal.Characterization and evolution of porcine deltacoronavirus in the UnitedStates.Prev Vet Med,2016,123:168-174；Janetanakit T,et al.Porcinedeltacoronavirus,Thailand,2015.Energ Infect Dis,2016,22(4):757-759；Lorsirigool A,et al.The first detection and full-length genome sequence ofporcine deltacoronavirus isolated in Lao PDR.Arch Virol,2016,161:2909-2911)。我国在2014年底也开始出现PDCoV流行的报道，其在猪腹泻样品中的阳性率约为15％，并呈现小范围的流行状况(Chen FZ,et al.Full-Length genome characterization ofChinese porcine deltacoronavirus strain CH/SXD1/2015.Genome Announcements,2015,3(5):e01284-15；Song D,et al.Newly emerged porcine deltacoronavirusassociated with diarrhoea in swine in China:identification,prevalence andfull-Length genome sequence analysis.Transbound Emerg Dis,2015,62:575-580；Dong Nan,et al.,Porcine deltacoronavirus in Mainland China.Energ Infect Dis,2015,21(12):2254-2255.)。
已有的报道显示，PDCoV与同属于猪肠道致病冠状病毒的猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)共感染的情况比较普遍，且它们在感染猪群中引起的症状比较相似(Wang LY,et al.Detection and genetic characterization ofdeltacoronavirus in pigs,Ohio,USA,2014.Energ Infect Dis,2014,20(7):1227-1230；Song D,et al.Newly emerged porcine deltacoronavirus associated with diarrhoeain swine in China:identification,prevalence and full-Length genome sequenceanalysis.Transbound Emerg Dis,2015,62:575-580；Dong N,et al.Porcinedeltacoronavirus in Mainland China.Energ Infect Dis,2015,21(12):2254-2255)。因此，目前对于PDCoV、PEDV和TGEV感染的鉴别诊断方法主要是依靠实验室的RT-PCR检测和实时荧光定量RT-PCR检测进行病原鉴别诊断。另外，有研究报道显示，在PDCoV自然感染和人工感染的情况下，仔猪肠道的病理变化与PEDV感染引起的病理变化均比较相似，主要的病变表现为病灶区域肠绒毛出现损伤、绒毛\隐窝比例下降等(Wang LY,et al.Porcinedeltacoronavirus:histological lesions and genetic characterization.ArchVirol,2016,161:171-175)。所以根据发病仔猪的病理变化也不能区分以上几种病毒感染，而应用针对不同病毒的特异性单克隆抗体进行免疫组化分析即可特异性地区别PDCoV、PEDV和TGEV感染，为准确的鉴别诊断病毒感染提供有力的工具。但目前还没有针对PDCoV单克隆抗体的相关报道。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对现有技术存在的缺陷，提供一株分泌特异性针对猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。
本发明的第二个目的在于提供PDCoV N蛋白单克隆抗体在猪肠道致病冠状病毒PDCoV、PEDV和TGEV鉴别诊断中的应用。
本发明通过以下技术方案实现：
1、构建猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白重组表达菌株，表达纯化PDCoV N蛋白：
将猪δ冠状病毒CHN-HN-2014株(Dong N,et al.Isolation,genomecharacterization and pathogenicity of a Chinese porcine deltacoronavirusstrain CHN-HN-2014.Vet Microbiol.2016,196:98-106.)完整N基因(PDCoV CHN-HN-2014株全基因组序列已提交GenBank，登录号为KT336560.1)扩增后连接至pET-30a载体(图1)，构建得到PDCoV N蛋白的重组表达质粒pET-30a-N(图2)，将pET-30a-N转化至Rosetta(DE3)表达菌株，获得重组表达菌株。将重组菌株扩大，使用IPTG诱导蛋白表达后通过融合表达的HIS标签，使用镍株对蛋白进行纯化，获得原核表达并纯化的PDCoV N蛋白。
2、筛选制备PDCoV N蛋白单克隆抗体：
将原核表达并纯化的PDCoV N蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫BALB/c小鼠，在免疫小鼠血清效价达到要求后取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，使用纯化的PDCoV N蛋白包被ELISA板进行至少三轮阳性克隆筛选，最终获得可以稳定分泌针对PDCoV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将该细胞株命名为1A11。
3、PDCoV N蛋白单克隆抗体1A11在肠道致病冠状病毒PEDV、TGEV和PDCoV感染后免疫组化检测分析中的应用。
选取PDCoV、PEDV和TGEV三种猪肠道致病冠状病毒分别感染的仔猪和空白对照健康仔猪进行剖检，取感染猪病变明显的空肠、回肠段组织和对照猪的空肠、回肠段组织，使用针对PDCoV N蛋白的单克隆抗体1A11做为一抗进行免疫组织化学分析，通过观察分析发现使用此单抗做为一抗进行免疫组化分析，可以明显地鉴别出PDCoV感染仔猪的肠道组织。
本发明的积极效果在于：
(1)本发明制备筛选的杂交瘤细胞株1A11可以分泌特异性针对PDCoV N蛋白的单克隆抗体，与已有报道的PDCoV多抗相比其特异性更高，更容易制备，因而应用效果更好。
(2)本发明制备的单克隆抗体1a11可以应用非诊断目的的猪肠道组织免疫组织化学分析中，具有很好的特异性，能够明显地区别和检测出PDCoV、PEDV和TGEV三种病毒感染情况下的PDCoV感染猪。
(3)本发明制备的单克隆抗体应用范围较宽，同样也可以用于建立检测PDCoV的其他方法，如ELISA、IFA等。
附图说明
序列表SEQ ID NO：1是猪δ冠状病毒(PDCoV)N基因的编码区序列(不包含酶切位点和保护碱基)。片段长度为1026bp。
序列表SEQ ID NO：2是猪δ冠状病毒(PDCoV)N基因编码的蛋白质的序列，编码342个蛋白质。
图1：原核表达载体pET-30a图谱。
图2：重组载体质粒pET-30a-N图谱。
图3：pET-30a-N质粒的酶切鉴定。附图标记说明：M:DNA marker(DL 15000)；1:pET-30a-N/BamHI+Xho I。
图4：原核表达的PDCoV N蛋白的SDS-PAGE检测。附图标记说明：M：蛋白质标准；1:pET-30a载体转化菌裂解后上清；2:pET-30a-N转化菌裂解后上清；3:pET-30a-N转化菌裂解后沉淀。
图5：亲和纯化的PDCoV N蛋白的SDS-PAGE检测。附图标记说明：M:蛋白质标准；1:纯化的N蛋白。
图6：PDCoV N蛋白单克隆抗体的Western Blot验证。附图标记说明：M：蛋白质标准；1:LLC-PK1细胞；2：PDCoV CHN-HN-2014株感染的LLC-PK1细胞。
图7：利用间接免疫荧光试验验证抗PDCoV N蛋白单克隆抗体。附图标记说明：图7中的A图：PDCoV CHN-HN-2014株感染的LLC-PK1细胞；图7中的B图：正常的LLC-PK1细胞。
图8：利用间接免疫荧光试验验证单克隆抗体的特异性。附图标记说明：图8中的A图：PEDV感染的VERO细胞；图8中的B图：TGEV感染的ST细胞；图8中的C图：PDCoV CHN-HN-2014株感染的LLC-PK1细胞。
图9：仔猪小肠免疫组化分析。附图标记说明：图9中的A图：PDCoV感染的仔猪空肠；图9中的B图：PEDV感染的仔猪空肠；图9中的C图：TGEV感染的仔猪空肠；图9中的D图：正常仔猪空肠；图9中的E图：PDCoV感染的仔猪回肠；图9中的F图：PEDV感染的仔猪回肠；图9中的G图：TGEV感染的仔猪回肠；图9中的H图：正常仔猪回肠；
具体实施方式
实施例1：PDCoV N蛋白单克隆抗体细胞株的筛选与鉴定
1.猪δ冠状病毒(PDCoV)N蛋白的原核表达与纯化：
本发明中的PDCoV N基因序列是由申请人自己克隆获得的，该基因是以PDCoVCHN-HN-2014株全基因组序列为模版扩增获得的，该毒株的基因序列已经收录于GenBank数据库中，登录号为KT336560.1。
(1)PDCoV N基因原核表达质粒的构建：
将申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室分离到的猪δ冠状病毒CHN-HN-2014株(Dong N,et al.Isolation,genome characterization andpathogenicity of a Chinese porcine deltacoronavirus strain CHN-HN-2014.VetMicrobiol.2016,196:98-106)接种已长至单层的LLC-PK1细胞，待细胞出现80％以上病变时将细胞冻融3次后提取RNA，并以其为模版反转录得到cDNA。设计针对N基因的特异性上、下游引物，引物序列如下所述：P1：CGCGGATCCATGGCTGCACCAGTAGTC和P2：GTGCTCGAGTCGCTGCTGATTCCTGCTT，同时在引物中分别引入BamH I和Xho I酶切位点。通过PCR扩增(PCR反应体系为：5×PCR Buffer 10μL，dNTP Mixture(2.5mmol/L)4μL，PrimeSTAR 0.5μL，P1 1μL，P2 1μL，cDNA 1μL，ddH2O 32.5μL。PCR扩增的条件为：94℃变性5min进入循环，98℃10s、58℃30s、72℃90s，35个循环后，72℃延伸10min。)得到全长的PDCoV N基因，所得的扩增产物大小为1045bp(其中编码区序列为1-1026，序列长度为1026bp，本说明书已经公开PDCoV N基因编码的蛋白质序列SEQ ID NO：1)，见序列SEQ ID NO：1所述，序列SEQ ID NO：1中不包含酶切位点和保护性碱基)，将其回收后用BamH I和Xho I进行双酶切，再回收目的片段连接至原核表达载体pET-30a中(图1)，转化大肠杆菌(E.coli)DH5α进行质粒扩增，提取质粒后进行酶切鉴定，片段大小与预期一致(图3)，且通过测序比对发现构建的质粒中N基因没有出现突变缺失，由此获得表达PDCoV N基因的重组质粒pET-30a-N(图2)。
(2)PDCoV N蛋白的原核表达与纯化：
将获得的pET-30a-N质粒转化大场杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)：挑取单菌落扩大培养，在菌液OD630nm达到0.4-0.6时加入终浓度为0.8mmol/L的IPTG进行诱导表达。于诱导6h后取菌液12000r/min离心10min，弃去上清，用原始体积1/10的PBS缓冲液将沉淀重悬，重悬后的菌液高压破碎，于12000r/min离心30min，将上清和沉淀分别制样进行SDS-PAGE电泳，检测蛋白表达情况和表达方式。结果显示，PDCoV N蛋白在大场杆菌(E.coli)Rosetta(DE3)中成功表达，且以可溶性的蛋白形式存在(图4)。将表达菌株大量培养，高压破碎后将上清液通过AKTA FPLC(Amersham Biosciences UPC-900)纯化系统，利用融合表达的HIS标签亲和纯化获得PDCoV N蛋白，纯化后将蛋白经过SDS-PAGE电泳，电泳结果显示获得了纯度较高的PDCoV N蛋白(图5)。
2.PDCoV N蛋白单克隆抗体细胞株的筛选：
将原核表达并纯化的PDCoV N蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠，当小鼠血清效价达到要求后取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞sp20进行融合，以PDCoV N蛋白包被ELISA板进行至少三轮的阳性克隆筛选，最终获得了一株可以稳定分泌特异性针对PDCoV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，申请人将该生物材料命名为杂交瘤细胞株1A11，于2017年7月3日送交中国.武汉.武汉大学，中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017107。
3.PDCoV N蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的验证：
将PDCoV CHN-HN-2014株接种长满单层的LLC-PK1细胞，待细胞出现60％细胞病变时收取细胞样品，同时设立不接毒的LLC-PK1细胞作为对照。样品经SDS-PAGE电泳后将蛋白转移至PVDF膜，将培养的杂交瘤细胞株1A11细胞上清作为一抗进行孵育，以HRP标记的羊抗鼠IgG(购自Sigma公司)作为二抗进行Western Blot验证，结果接毒样品组泳道在45KDa处检测到特异性的蛋白条带，而对照组未检测到任何条带(图6)。
将LLC-PK1细胞接种于24孔板，待细胞长至单层后接种PDCoV CHN-HN-2014株，待细胞出现60％细胞病变时以培养的交瘤细胞株1A11细胞上清作为一抗进行间接免疫荧光试验，同时设立不接毒的LLC-PK1细胞作为对照。结果在荧光显微镜下可以观察到接毒细胞有明显的特异性荧光，而未接毒细胞未出现任何特异性荧光(图7)。
用单克隆抗体1a11为一抗对PEDV感染的VERO细胞和TGEV感染的ST细胞进行间接免疫荧光检测，验证其特异性，结果本发明制备的单克隆抗体1a11不与PEDV和TGEV发生任何反应，而PDCoV感染的LLC-PK1细胞中有明显的特异性荧光(图8)，由此说明本发明制备的单克隆抗体1a11在间接免疫荧光试验鉴别检测PDCoV、PEDV和TGEV时有较好的特异性。
对杂交瘤细胞株1A11的染色体进行了计数，结果显示本发明制备的杂交瘤细胞株的染色体数目为96条，与一般单克隆抗体杂交瘤细胞染色体数目比较一致。同时，将其连续传代培养2个月以上，并收集杂交瘤细胞上清，通过ELISA检测抗体分泌水平，结果显示该杂交瘤细胞株经过长期传代后分泌抗体的能力基本没有发生变化。说明本杂交瘤细胞株1A11具有稳定分泌抗体的能力。
此外，申请人对杂交瘤细胞株1A11分泌的抗体亚型进行了分析鉴定，结果显示其分泌的抗体为IgG1型。
由以上试验说明本发明筛选的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体可以识别PDCoV感染情况下的PDCoVN蛋白，该杂交瘤细胞株稳定性好，分泌的单克隆抗体具有较好的特异性。
实施例2：PDCoV N蛋白单克隆抗体1a11在非诊断目的的免疫组化鉴别中的应用
以PDCoV CHN-HN-2014株、PEDV AJ1102株(Bi Jing,et al.Complete genomesequence of porcine epidemic diarrhea virus strain AJ1102isolated from asuckling piglet with acute diarrhea in China.J.Virol.2012,86(19):10910-10911)以及TGEV WH-1株(TGEV WH-1株的全基因组已提交GenBank，登录号为HQ462571.1)各感染3头5日龄仔猪(品种为常规杜洛克猪)，待仔猪出现典型腹泻后将其剖杀，采集空肠和回肠段组织进行免疫组织化学分析，同时采集未感染仔猪的空肠和回肠段组织作为对照。
具体操作如下：
(1)取材与固定：分别选取感染PDCoV、PEDV和TGEV并出现腹泻的仔猪进行剖杀，同时剖杀正常对照仔猪，选取各仔猪空肠和回肠组织，编号后放入多聚甲醛固定液中固定(配方和配制方法：A液：40g多聚甲醛溶于400mL蒸馏水；B液：16.88g Na2HPO4·12H2O溶于300mL蒸馏水；C液：3.86g NaOH溶于200mL蒸馏水。B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入冷却后的A液，得到多聚甲醛固定液，以1mol/LNaOH或1mol/L HCl将多聚甲醛固定液的pH调至7.2～7.4，最后蒸馏水定容至1L，并充分混匀。4℃保存备用)。
(2)脱水：组织固定24h后将其取出，用洁净的去离子水漂洗两次，浸入浓度为70％的乙醇溶液中2h，取出后再依次于80％、90％和100％的乙醇溶液中各浸泡2h。
(3)透明：取出组织放入体积比为1：1混合的无水乙醇和二甲苯中浸渍1.5h，然后浸入二甲苯中，直至组织呈透明状体。
(4)浸蜡和包埋：将组织取出，放入融化的石蜡内浸蜡，然后将浸蜡后的组织放入融化的固体石蜡中，待其凝固后即为组织蜡块。
(5)切片和烤片：将蜡块修整后放入切片机中，切成若干4-6μm的蜡带，待其在温水上展开后放于载玻片上，于60℃温箱内烤片30min。
(6)脱蜡：按照以下步骤进行各级脱蜡：
按照表1所述的条件进行处理。
表1 脱蜡条件
(7)将切片浸入体积比为1：9混合的水和甲醇溶液中，室温30min灭活内源性酶。蒸馏水洗3次，每次5min。
(8)将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(枸橼酸盐缓冲液为常规培养液，pH 6.0)，待电炉或微波炉高火加热至沸腾后断电，间隔3min后，低火20min。冷却后用PBS(NaCl8.0g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，加入双蒸水充分溶解后，调pH值至7.4，定容至1L)，洗涤3次，每次5min。
(9)滴加5％牛血清白蛋白(BSA)封闭液(在100mL PBS中加入0.05mL吐温-20和0.5g BSA)，室温20min。甩去多余液体。
(10)滴加适当稀释的本发明制备的1a11单克隆抗体作为一抗，4℃过夜。用PBS洗3次，每次2min。
(11)滴加生物素化山羊抗小鼠IgG(购自Sigma公司)，37℃20min。用PBS洗3次，每次2min。
(12)滴加试剂SABC(购自武汉博士德生物工程有限公司)，20-37℃30min。用PBS洗4次，每次5min，若背景偏深，前三次洗时可在PBS中加终浓度为万分之一到万分之二的吐温-20。
(13)DAB显色：使用DAB显色试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司)：取1mL蒸馏水，加DAB显色试剂盒自带的A，B，C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温下显色，镜下控制反应时间，一般在10min以内。
(14)苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。
相关脱水条件见表2。
表2 相关脱水条件
(15)用中性树胶封片。
(16)在37℃烤片过夜，并在显微镜下观察。
显微镜下可以观察到PDCoV感染组仔猪肠段中肠上皮细胞中有明显的病毒聚集增殖的阳性染色，而PEDV、TGEV感染组和对照组中均没有检测到特异性的阳性信号(图9)。说明将本发明中制备的单克隆抗体1a11应用在PDCoV、PEDV和TGEV三种肠道致病冠状病毒感染的免疫组化分析中，可以明显地鉴别出PDCoV感染的仔猪，本发明对鉴别诊断具有较高的参考价值。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备与应用
<141> 2017-09-10
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1026
<212> DNA
<213> 猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1026)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1026)
<400> 1
atg gct gca cca gta gtc cct act act gac gcg tct tgg ttt cag gtg 48
Met Ala Ala Pro Val Val Pro Thr Thr Asp Ala Ser Trp Phe Gln Val
1 5 10 15
ctc aaa gct caa aac aaa aag gct act cat cct cag ttt cgt ggc aat 96
Leu Lys Ala Gln Asn Lys Lys Ala Thr His Pro Gln Phe Arg Gly Asn
20 25 30
gga gtt ccg ctt aac tcc gcc atc aaa ccc gtt gaa aac cat ggc tac 144
Gly Val Pro Leu Asn Ser Ala Ile Lys Pro Val Glu Asn His Gly Tyr
35 40 45
tgg ctg cgt tac acc aga caa aag cca ggt ggt act ccg att cct cca 192
Trp Leu Arg Tyr Thr Arg Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Ile Pro Pro
50 55 60
tcc tat gcc ttt tat tat act ggc aca ggt ccc aga gga aat ctt aag 240
Ser Tyr Ala Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Arg Gly Asn Leu Lys
65 70 75 80
tat ggt gaa ctc cct cct aat gat acc cca gca acc act cgt gtt act 288
Tyr Gly Glu Leu Pro Pro Asn Asp Thr Pro Ala Thr Thr Arg Val Thr
85 90 95
tgg gtt aag ggt tcg gga gct gac act tct att aag cct cat gtt gcc 336
Trp Val Lys Gly Ser Gly Ala Asp Thr Ser Ile Lys Pro His Val Ala
100 105 110
aaa cgc aac ccc aac aat cct aaa cat cag ctg cta cct ctc cga ttc 384
Lys Arg Asn Pro Asn Asn Pro Lys His Gln Leu Leu Pro Leu Arg Phe
115 120 125
cca acc gga gat ggc cca gct caa ggt ttc aga gtt gac ccc ttc aac 432
Pro Thr Gly Asp Gly Pro Ala Gln Gly Phe Arg Val Asp Pro Phe Asn
130 135 140
gct aga gga aga cct cag gag cgt gga agt ggc cca aga tct caa tct 480
Ala Arg Gly Arg Pro Gln Glu Arg Gly Ser Gly Pro Arg Ser Gln Ser
145 150 155 160
gtt aac tcc aga ggc aca ggc aat cag ccc agg aaa cgc gac caa tct 528
Val Asn Ser Arg Gly Thr Gly Asn Gln Pro Arg Lys Arg Asp Gln Ser
165 170 175
gca ccc gct gcg gta cgt cgt aag acc caa cat caa gct ccc aag cgg 576
Ala Pro Ala Ala Val Arg Arg Lys Thr Gln His Gln Ala Pro Lys Arg
180 185 190
act tta cct aag ggt aaa acc att tct cag gta ttt ggc aac cgg tct 624
Thr Leu Pro Lys Gly Lys Thr Ile Ser Gln Val Phe Gly Asn Arg Ser
195 200 205
cgt act ggt gcc aat gtc ggc tct gca gac act gag aag acg ggt atg 672
Arg Thr Gly Ala Asn Val Gly Ser Ala Asp Thr Glu Lys Thr Gly Met
210 215 220
gct gat cct cgc atc atg gct cta gcc aga cat gtg cct ggt gtt cag 720
Ala Asp Pro Arg Ile Met Ala Leu Ala Arg His Val Pro Gly Val Gln
225 230 235 240
gaa atg ctt ttc gct ggc cac ctt gag agc aac ttt cag gcg ggg gca 768
Glu Met Leu Phe Ala Gly His Leu Glu Ser Asn Phe Gln Ala Gly Ala
245 250 255
att acc ctt acc ttc tct tac tca atc aca gtc aag gag ggt tct cct 816
Ile Thr Leu Thr Phe Ser Tyr Ser Ile Thr Val Lys Glu Gly Ser Pro
260 265 270
gac tat gag aga ctt aag gat gcg ctc aac acg gtc gtt aac cag acc 864
Asp Tyr Glu Arg Leu Lys Asp Ala Leu Asn Thr Val Val Asn Gln Thr
275 280 285
tat gag cca ccc acc aaa cca act aag gac aag aag cct gac aaa caa 912
Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Pro Thr Lys Asp Lys Lys Pro Asp Lys Gln
290 295 300
gac cag tct gct aaa ccc aaa cag cag aag aaa cct aaa aag gta act 960
Asp Gln Ser Ala Lys Pro Lys Gln Gln Lys Lys Pro Lys Lys Val Thr
305 310 315 320
ctg cca gca gac aaa cag gat tgg gag tgg gat gat gct ttt gag ata 1008
Leu Pro Ala Asp Lys Gln Asp Trp Glu Trp Asp Asp Ala Phe Glu Ile
325 330 335
aag cag gaa tca gca gcg 1026
Lys Gln Glu Ser Ala Ala
340
<210> 2
<211> 342
<212> PRT
<213> 猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus)
<400> 2
Met Ala Ala Pro Val Val Pro Thr Thr Asp Ala Ser Trp Phe Gln Val
1 5 10 15
Leu Lys Ala Gln Asn Lys Lys Ala Thr His Pro Gln Phe Arg Gly Asn
20 25 30
Gly Val Pro Leu Asn Ser Ala Ile Lys Pro Val Glu Asn His Gly Tyr
35 40 45
Trp Leu Arg Tyr Thr Arg Gln Lys Pro Gly Gly Thr Pro Ile Pro Pro
50 55 60
Ser Tyr Ala Phe Tyr Tyr Thr Gly Thr Gly Pro Arg Gly Asn Leu Lys
65 70 75 80
Tyr Gly Glu Leu Pro Pro Asn Asp Thr Pro Ala Thr Thr Arg Val Thr
85 90 95
Trp Val Lys Gly Ser Gly Ala Asp Thr Ser Ile Lys Pro His Val Ala
100 105 110
Lys Arg Asn Pro Asn Asn Pro Lys His Gln Leu Leu Pro Leu Arg Phe
115 120 125
Pro Thr Gly Asp Gly Pro Ala Gln Gly Phe Arg Val Asp Pro Phe Asn
130 135 140
Ala Arg Gly Arg Pro Gln Glu Arg Gly Ser Gly Pro Arg Ser Gln Ser
145 150 155 160
Val Asn Ser Arg Gly Thr Gly Asn Gln Pro Arg Lys Arg Asp Gln Ser
165 170 175
Ala Pro Ala Ala Val Arg Arg Lys Thr Gln His Gln Ala Pro Lys Arg
180 185 190
Thr Leu Pro Lys Gly Lys Thr Ile Ser Gln Val Phe Gly Asn Arg Ser
195 200 205
Arg Thr Gly Ala Asn Val Gly Ser Ala Asp Thr Glu Lys Thr Gly Met
210 215 220
Ala Asp Pro Arg Ile Met Ala Leu Ala Arg His Val Pro Gly Val Gln
225 230 235 240
Glu Met Leu Phe Ala Gly His Leu Glu Ser Asn Phe Gln Ala Gly Ala
245 250 255
Ile Thr Leu Thr Phe Ser Tyr Ser Ile Thr Val Lys Glu Gly Ser Pro
260 265 270
Asp Tyr Glu Arg Leu Lys Asp Ala Leu Asn Thr Val Val Asn Gln Thr
275 280 285
Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Pro Thr Lys Asp Lys Lys Pro Asp Lys Gln
290 295 300
Asp Gln Ser Ala Lys Pro Lys Gln Gln Lys Lys Pro Lys Lys Val Thr
305 310 315 320
Leu Pro Ala Asp Lys Gln Asp Trp Glu Trp Asp Asp Ala Phe Glu Ile
325 330 335
Lys Gln Glu Ser Ala Ala
340

Claims (3)

1.一株分泌抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株1A11，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2017107。
2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株1A11分泌的单克隆抗体1a11在制备猪δ冠状病毒检测试剂盒中的应用。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株1A11分泌的单克隆抗体1a11在用于非诊断目的的猪δ冠状病毒感染的仔猪肠道免疫组织化学检测分析中的应用。
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