KR20080072644A - Ｔｒｐｍ5 이온 채널용 고속 처리 스크리닝 검정 - Google Patents

Ｔｒｐｍ5 이온 채널용 고속 처리 스크리닝 검정 Download PDF

Info

Publication number
KR20080072644A
KR20080072644A KR1020087010838A KR20087010838A KR20080072644A KR 20080072644 A KR20080072644 A KR 20080072644A KR 1020087010838 A KR1020087010838 A KR 1020087010838A KR 20087010838 A KR20087010838 A KR 20087010838A KR 20080072644 A KR20080072644 A KR 20080072644A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
assay
trpm5
cells
calcium
wells
Prior art date
Application number
KR1020087010838A
Other languages
English (en)
Inventor
로버트 더블유 브라이언트
에스 폴 리
알 카일 팔머
치펑 양
엠 엔 툴루 부버
Original Assignee
레드포인트 바이오 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 레드포인트 바이오 코포레이션 filed Critical 레드포인트 바이오 코포레이션
Publication of KR20080072644A publication Critical patent/KR20080072644A/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Abstract

당업계에서는 TRPM5와 같은 고속 작용 이온 채널의 활성을 특이적으로 조절하는 화합물을 확인할 수 있는 고속 처리 스크리닝 검정이 요망된다. 기존의 방법은 민감성 결여, 저 처리량 및 노동 집약적이라는 문제를 갖고 있다. 청구된 본 발명의 방법은 결과를 신속히 해독하고, 신호 대 노이즈 백그라운드 비가 높으며, 사용이 용이하고, 자동화 및 소형화되도록 변경될 수 있으며, 화합물이 TRPM5를 특이적으로 조절한다는 것이 검증된 광 판독 형광 검정을 제공한다.

Description

ＴＲＰＭ5 이온 채널용 고속 처리 스크리닝 검정{HIGH THROUGHPUT SCREENING ASSAY FOR THE TRPM5 ION CHANNEL}
발명의 배경
발명의 분야
본 발명은 맛에 영향을 주는 화합물을 고속 처리 스크리닝((high throughput screening)하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이온 채널 TRPM5의 활성을 조절하여 미각에 작용하는 화합물을 확인하는데 유용한 스크리닝법에 관한 것이다. 형광성 막 전위 염료를 이용한 스크리닝법은 용이하게 자동화될 수 있는 가시적인 형광 판독을 제공함으로써 수천개의 화합물을 신속히 스크리닝할 수 있도록 해 준다.
배경
미각 인식은 인간의 영양 상태에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 하등 동물과 고등 동물 모두의 생존에 필수적이다(Margolskee, R.F. J Biol. Chem. 277:1-4 (2002); Avenet, P. and Lindemann, B. J Membrane Biol. 112:1-8 (1989)). 미각 인식은 미각 수용체 세포(TRC)에 의해 수행된다. TRC는 주어진 맛과 관련된 다수의 화합물을 인지하여 인지된 것을 신호로 전환시키고 이를 뇌에서 단맛, 쓴맛, 신맛, 짠맛 또는 우마미(umami)(향긋한) 맛으로 해독하게 된다.
TRC는 특수 정단막 및 측저막을 가지는 극성화 상피 세포이다. 미뢰는 60 내지 100개의 TRC를 함유하며, 각각 막의 미소 부분이 혀의 점막면상에 노출되어 있다(Kinnamon, S.C. TINS 11:491-496 (1988)). 감각 변환은 TRC의 정단막상에서 미세 융모 과정과 상호작용하는 풍미 분자(sapid molecule) 또는 "미각 자극 물질(tastant)"에 의해 개시된다. 미각 자극 물질은 특정 막 수용체와 결합하여 세포막을 통해 전압 변화를 일으키게 되며; 이에 따라 세포의 전기 전위가 변화되거나 탈분극됨으로써 일차 미각 신경섬유의 방출 및 여기의 전달이 일어나게 된다.
이온 채널은 막에 기공을 형성하여 이온을 한 면으로부터 다른 면으로 통과시킬 수 있게 하는 막횡단 단백질이다(B. Hille (Ed), 1992, Ionic Channels of Excitable Membranes 2nd ed., Sinauer, Sunderland, Mass.에서 검토됨). 특정 이온 채널이 모든 생리막 조건하에서 개방되기도 하지만(소위 누설 채널), 많은 채널들은 특정 자극에 반응하여 열리는 "게이트(gate)"를 가진다. 예로서, 전압 의존성 채널은 막을 통한 전기 전위의 변화에 반응하고, 기계적 의존성 채널은 막의 기계적 자극에 반응하며, 리간드 의존성 채널은 특정 분자의 결합에 반응한다. 다양한 리간드 의존성 채널들이 세포외 인자, 예컨대 신경전달물질에 반응하거나(전달물질 의존성 채널), 세포내 인자, 예컨대 이온에 반응하거나(이온 의존성 채널) 또는 뉴클레오티드에 반응하여(뉴클레오티드 의존성 채널) 개방될 수 있다. 그밖의 다른 이온 채널은 단백질, 예컨대 G-단백질(G-단백질 결합 수용체 또는 GPCR)과의 상호작용에 의해 조절된다.
대부분의 이온 채널 단백질은 하나의 주 이온성 종의 침투를 매개한다. 예를 들어, 나트륨(Na+), 칼륨(K+), 클로라이드(Cl-) 및 칼슘(Ca2+) 채널이 확인되었다.
최근 발견된 이온 채널중 하나인 TRPM5는 미각 변환에 필수적이라고 밝혀졌다. Perez et al., Nature Neuroscience 5:1169-1176 (2002); Zhang et al, Cell 112:293-301 (2003). TRPM5는 이온 채널의 일시적인 수용체 전위(TRP) 패밀리의 일원이다. TRPM5는 미각 수용체 세포막을 통해 채널을 형성하며, 포스포리파제 C에 결합된 수용체 경로의 자극과 IP3-매개 Ca2+ 방출에 의해 활성화될 것으로 판단된다. 이러한 채널의 개방은 Ca2+ 수준의 증가에 좌우된다. Hofmann et al, Current Biol. 13:1153-1158 (2003). 이러한 채널의 활성화는 TRC의 탈분극으로 이어지고, 이어서 일차 미각 신경섬유의 방출 및 여기의 전달이 일어나게 된다.
TRPM5는 미각 절차의 필수 부분이기 때문에, 이를 억제하게 되면 동물이 특정 미각을 감지할 수 없게 된다. 미각 인식이 중요한 기능일지라도, 원치않는 맛을 억제하거나 차폐하는 것이 특정 상황에서는 이롭다. 예를 들어, 의약의 많은 약제학적 활성 성분은 쓴맛과 같은 달갑지 않은 맛을 낸다. 의약이 제공하는 쓴맛의 억제는 환자의 순응성을 향상시킬 수 있다. 그밖의 다른 상황에서, 개량된 인공 감미료를 개발하거나 나이든 사람과 같은 군에서 미각 상실을 치료하는데에 맛의 증진이 의도될 수 있다. Mojet et al, Chem Senses 26:845-60 (2001).
TRPM5는 수용체 자극시에 전압 조절 및 신속한 활성화/비활성화("개폐") 동 역학을 나타내어(Hofmann et al 2003), 나트륨 및 칼륨 등의 일가 양이온의 통과를 허용하게 한다. 밀접하게 관련된 단백질인 TRPM4b는 또한 Ca2+ 의존성 전압 조절을 나타내나, 개폐는 TRPM5 보다 훨씬 느리다. 따라서, TRPM5는 신속한 활성화/비활성화 동역학을 지닌 전압 의존성 Ca2+-활성화 일가 양이온 채널의 최초의 실례이다(Hofmann et al. 2003).
이온 채널 활성화 또는 억제는 세포가 특정 자극에 노출되었을 때 세포막 전위의 변화를 측정함으로써 결정될 수 있다. 이는 세포막 전위가 다중 채널에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 이온 채널 조절을 평가하는 간접 방법이다.
이온 채널 활성을 조사하는 한가지 방법은 패치-클램프(patch-clamp) 기술을 이용하여 세포막 전위의 변화를 측정하는 것이다(Hamill et al, Nature 294:462-4 (1981)). 이 기술에서는, 마이크로피펫 팁을 구비한 전극에 세포를 부착하여 세포의 전기적 조건을 직접 측정하는 것이다. 이에 따라 다양한 자극에 반응하여 막 전위 변화를 생물물리학적으로 상세하게 특성화하는 것이 가능해 진다. 즉, 패치-클램프 기술은 이온 채널의 활성을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 스크리닝 수단으로 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 기술은 습득하는 것이 어렵고, 일관된 신뢰성 데이터를 생성하는데 상당한 전문성을 요한다. 더욱이, 이 기술은 시간 소모적이어서, 1일 2 또는 3개 미만의 화합물에 대한 활성을 스크리닝할 수 있을 뿐이다.
시험 화합물의 스크리닝 방법이 고속 처리(즉, 많은 화합물을 신속히 스크리닝할 수 있도록 함), 자동화, 이용이 용이함, 민감성 및 선택성인 것이 이상적이 다. 스크리닝 분석은 또한 신호 대 백그라운드 노이즈 비가 높아야 한다(Baxter et al ., J. Biomol . Screen . 7:79-85 (2002)). 백그라운드 노이즈는 이온 채널에 대한 그의 영향에 상관없이 화합물이 제공하는 최소 자극이다. 백그라운드 측정에 대한 최소 응답이 관측될 것이기 때문에, 높은 비율은 포지티브 또는 네거티브 조절제의 가시화를 보다 단순화시킨다. 이는 조절 화합물의 확인을 분명하게 한다.
이온 채널 조절을 결정하는 유망한 고속 처리법은 세포막 전위 변화시에 형광 신호를 생성하는 형광 염료를 활용한다. 막전위 변화시, 형광 염료는 세포막 이중층의 배향을 세포내에서 세포외 위치로 "플립(flip)"시키기 때문에, 형광 증가가 발생한다. 이러한 플립은 형광 증가를 초래하고, 이는 일반적으로 광학 판독기를 사용함으로써 용이하게 검출 및 정량화된다. 이온 채널 기능의 광학적 판독은 전위적으로 민감성이고, 다목적이며, 조작 및 자동화가 가능하기 때문에, 고속 처리 스크리닝에 유리하다. 현대 광학 판독기는 다중 샘플로부터 단시간내에 형광을 검출하여 자동화할 수 있다. 형광 판독은 세포내 이온 농도를 조사하고, 막 전위를 측정하는데 널리 사용된다.
종래 형광 염료가 갖고 있는 몇몇 결점들을 해소할 목적으로, 몰레큘라 디바이스(Molecular Devices) 사 제품의 FLIPR® 막 전위 염료(FMP)와 같은 변형된 비스옥소놀 형광 염료가 개발되었다. FMP 염료는 "저속" 이온 채널에 대한 패치-클램프 기록으로 직접 결정된 막 전위에 형광을 연관시키는데 효과적이다(Baxter et al, J. Biomol Screen. 7:79-85 (2002); Behrendt et al, British J. Pharmacol. 141:737-745 (2004); 및 Whiteaker et al., J. Biomol. Screen. 6:305-312 (2001).
특정 이온 채널을 조절하는 화합물에 대한 고속 처리 스크리닝(HTS)법을 설계하는데 주된 과제는 채널 활성화의 결정 방법이 간접적이라는 것이다. TRPM5 활성의 조절을 통해 맛에 영향을 미치는 화합물을 확인하기 위하여, 맛에 미치는 화합물의 효과가 TRPM5에 특정적이면서, 세포면상에 위치한 하나 이상의 다수의 다른 채널 및 수용체에는 특정적이지 않다는 것을 입증하여야 한다. 또한, TRPM5 활성화는 칼슘 의존성이기 때문에, GPCR-작용 칼슘 유출을 또한 조절하기도 하는 화합물을 배제하여 TRPM5/시험 화합물 상호작용의 특이성을 확인하여야 한다.
따라서, 당업계에서는 다른 기전으로 작용할 수 있고, 미각 인식에 영향을 주지 않을 수도 있는 화합물로부터 TRPM5 상에서 특이적으로 작용하여 미각을 조절하는 화합물을 구분할 수 있는 HTS 검정이 요망된다. 청구된 본 발명은 신속하면서 특이적인 결과를 제공하고, 높은 신호 대 백그라운드 비를 가지며, 사용이 용이한 HTS 법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명에 따라 TRPM5 이온 채널 활성을 조절하는 화합물을 신속히 스크리닝할 수 있도록 하는 새로운 고속 처리 스크리닝 검정(high throughput screening assay)이 밝혀졌다. 본 발명의 방법은 막 전위 변화의 평가에만 의존하는 방법보다 더 선택적이다. 본 발명은 업자들로 하여금 TRPM5의 조절을 통해 작용하는 약제로부터 이온 채널의 비특이적인 조절제인 약제를 구분할 수 있도록 할 것이다. 또한, 본 발명의 방법은 이러한 고속 이온 채널의 조절에 유망하고, 미각에 영향을 미치는 수천개의 화합물이 신속하고 신뢰적으로 스크리닝될 수 있도록 할 것이다.
본 발명의 일 구체예는 막 전위 형광 염료를 사전 장입시킨(preloaded) TRPM5 발현 세포를 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 준최적(suboptimal) 농도의 약제와 접촉시키는 단계; 상기 세포를 전위 증진 화합물과 접촉시키는 단계; 광학 검출기를 사용하여 상기 전위 증진 화합물의 존재하에서의 상기 세포의 형광 강도를 측정하는 단계; 및 상기 결정된 측정 형광 강도를 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 최적 농도의 약제 존재하에서의 상이한 TRPM5 발현 세포의 형광 강도와 비교하는 단계를 포함하는, TRPM5 이온 채널의 전위 증진제를 스크리닝하기 위한 고속 처리 스크리닝 검정이다.
본 발명의 추가의 구체예는 TRPM5를 발현하고 막 전위 형광 염료를 사전 장입시킨 세포를 염화칼륨의 존재하에서 시험 화합물과 접촉시키는 단계; 광학 검출기를 사용하여 상기 전위 조절 화합물의 존재하에서의 상기 세포의 형광 강도를 측정하는 단계; 상기 결정된 측정 형광 강도를 염화칼륨 존재하 및 시험 화합물 부재하에서의 TRPM5를 발현하고 막 전위 형광 염료를 사전 장입시킨 상이한 세포의 형광 강도와 비교하는 단계; 및 KCl 및 시험 화합물에 따른 형광 강도 대 시험 화합물 부재하에서의 KCl에 따른 형광 강도의 비가 1 미만 또는 1 초과인지를 결정하여 시험 화합물이 TRPM5-특이적 조절제일 수 있는지를 평가하는 단계를 포함하는, 시험 화합물이 TRPM5 이온 채널에 특이적인 조절제인지를 결정하기 위한 고속 처리 스크리닝 검정이다.
본 발명의 다른 구체예는 TRPM5를 발현하고 세포내 칼슘 염료를 사전 장입시킨 세포를 시험 화합물 및 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 준최적 농도의 칼슘 조절제와 접촉시키는 단계; 광학 검출기를 사용하여 상기 칼슘 조절제 존재하에서의 상기 세포의 형광 강도를 측정하는 단계; 상기 결정된 측정 형광 강도를 준최적 농도의 칼슘 조절제 존재하 및 시험 화합물 부재하에서의 TRPM5를 발현하고 세포내 칼슘 염료를 사전 장입시킨 상이한 세포의 형광 강도와 비교하는 단계; 및 준최적 농도의 칼슘 조절제 및 시험 화합물에 따른 형광 강도 대 시험 화합물 부재하에서의 준최적 농도의 칼슘 조절제에 따른 형광 강도의 비가 1 미만 또는 1 초과인지를 결정하여 시험 화합물이 TRPM5-특이적 조절제일 수 있는지를 평가하는 단계를 포함하는, 시험 화합물이 TRPM5 이온 채널에 특이적인 조절제인지를 결정하기 위한 고속 처리 스크리닝 검정이다.
본 발명의 또 다른 구체예는 야생형 TRPM5 및 비기능성 TRPM5를 모두 발현하고 막 전위 형광 염료를 사전 장입시킨 세포를 상기 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 약제의 존재하에서 전위 증진제와 접촉시키는 단계; 광학 검출기를 사용하여 상기 전위 증진제 존재하에서의 상기 세포의 형광 강도를 측정하는 단계; 및 상기 결정된 측정 형광 강도를 전위 증진 화합물의 존재하에서의 야생형 TRPM5를 발현하고 막 전위 염료를 사전 장입시킨 세포의 형광 강도와 비교하여 TRPM5 증진 정도를 결정하는 단계를 포함하는, TRPM5 이온 채널의 전위 증진제를 스크리닝하기 위한 고속 처리 스크리닝 검정이다.
일부 구체예에 있어서, 비기능성 TRPM5는 TRPM5 유전자의 첫 1000 염기쌍이 결실되었다. 다른 구체예에 있어서, 비기능성 TRPM5는 TRPM5 유전자의 첫 2000 염기쌍이 결실되었다.
일부 구체예에 있어서, 청구된 방법은 TRPM5 활성을 향상시키는 화합물을 선별하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 청구된 방법은 TRPM5 활성을 억제하는 화합물을 선별하는 단계를 더 포함한다.
추가의 구체예에 있어서, 청구된 방법은 다중 웰 용기에 위치한 세포의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 청구된 방법의 다중 웰 용기는 96개의 웰을 포함하여 96개 이하의 웰을 함유할 수 있다. 다른 구체예에 있어서, 다중 웰 용기는 96 웰을 초과하여 함유할 수 있다. 또 다른 구체예에 있어서, 다중 웰 용기는 384 웰을 함유한다. 그밖의 다른 구체예에 있어서, 다중 웰 용기는 1536 웰을 함유한다.
청구된 방법의 일부 구체예에 있어서, 칼슘 농도를 증가시키는 약제는 트롬빈, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 카바콜 및 내인성 G 단백질 결합 수용체 (GPCR)의 작용제로 구성된 군중에서 선택된다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 칼슘 농도를 증가시키는 약제는 칼슘 이온 운반 물질(ionophore), 예를 들어 A23187, 칼시마이신 또는 이오노마이신이다.
청구된 방법의 일부 구체예에 있어서, 막 전위 형광 염료는 FMP 염료이다.
청구된 방법의 추가의 구체예에 있어서, 광학 검출기는 형광 조영 플레이트 판독기(FLIPR®), FLEXStation, 전압/이온 프로브 판독기(VIPR), 형광 현미경 및 전하 결합 장치(CCD) 카메라 및 Pathway HT로 구성된 군중에서 선택된다. 본 발명의 일부 구체예에 있어서, 광학 검출기는 FLIPR®이다.
본 발명의 추가의 구체예, 특징 및 이점뿐 아니라 본 발명의 다양한 구체예의 구조 및 조작은 이후에 첨부된 도면을 참조로 하여 상세히 설명된다.
본 원에 포함되고 명세서의 일부를 이루는 첨부된 도면은 본 발명의 하나 이상의 구체예를 예시하며, 설명과 함께, 본 발명의 원리를 설명하고 관련 기술의 업자들이 본 발명을 실시하고 이용할 수 있도록 추가로 제공된다.
도 1은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 TRPM5 의존성 형광 시그널링의 입증예를 나타낸다. 인간 TRPM5 이온 채널 및 무스카린 1(M1) G 단백질 결합 수용체(GPCR) 둘 다로 형질감염시킨 CHO 세포에 막 전위 염료를 장입시키고, M1 작용제인 카바콜로 자극하였다. 이 GPCR 활성화로 세포에서 세포내 칼슘 이온의 증가가 유도되어, TRPM5 이온 채널이 개방됨으로써 주로 나트륨 이온이 세포로 도입된다. 이러한 탈분극은 형광 조영 플레이트 판독기(FLIPR®)에서 측정되는 염료의 형광 신호를 증가시킨다. 주목할 것은 TRPM5에 대한 화합물의 효과를 분석하는 어세이에서, 화합물이 TRPM5의 활성화전에 첨가된다는 것이다.
도 2는 형광 현미경에 의한 일시적으로 형질감염된 HEK 293 세포에서의 TRPM5-GFP 발현을 나타낸다.
도 3은 일시적으로 형질감염된 HEK 293 세포에서 TRPM5 이온 채널 반응을 나타낸다. 도 3a 내지 3c는 FLEXstation을 사용하여 측정한 것으로, 세개의 GPCR 작 용제인 트롬빈(도 3a), 카바콜(도 3b) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)(도 3c)에 대한 형질감염 세포내 TRPM5의 응답 반응을 나타낸다.
도 4는 FLIPR-Tetra™을 이용한 TRPM5 고속 처리 스크리닝 검정에 대한 고 및 저 조절을 나타낸다. 이 검정은 0.76의 Z' 값으로 높은 신호 대 노이즈 비를 가진다(고 조절 대 저 조절). Z' > 0.5의 값은 고속 처리 스크리닝에 로버스트 검정(robust assay)임을 제시한다(Zhang, J. H. et al. J. Biomol. Screen. 4:67-13 (1999)). (Z'=1-((3*SDHC +3*SDLC)/(AVGHC-AVGLC)).
도 5a 내지 5c는 FLIPR®을 사용하여 측정된 것으로, ATP(도 5a), 카바콜(도 5b) 또는 트롬빈(도 5c)을 사용한 TRPM5를 안정하게 발현하는 세포의 자극을 나타낸다.
도 6은 85,000개를 초과한 화합물에 대한 TRPM5 고속 처리 스크리닝 결과를 나타낸다. 데이터는 조절 반응 억제 퍼센트의 빈도 분포로서 제시된다. 각 화합물은 10 μM의 농도로 시험되었다.
도 7은 Ca++ 반응 및 KCl 카운터스크린(counterscreen) 검정을 이용한 TRPM5 특이성 필터의 개략도를 나타낸다.
도 8a 내지 8b는 비선택적 억제 화합물을 확인하기 위한 KCl 카운터스크린(도 8a) 및 Ca++ 유출(도 8b) 필터를 나타낸다.
도 9a 내지 9c는 TRPM5-특이적 억제제를 확인하기 위한 TRPM5 분석에서 KCl 카운터스크린의 유용성을 나타낸다. 도 9a는 FLIPR®을 이용하여 측정된 TRPM5-특이 적 억제제의 확인을 예증한다. 도 9b는 KCl 탈분극 억제 또는 칼슘 유출 활성화 억제없이 화합물에 의한 TRPM5의 용량 반응 억제를 나타낸다. 도 9c는 TRPM5의 비특이적 억제의 두 실례를 보여준다.
도 10은 TRPM5-특이적 인핸서(enhancer) 화합물을 확인하기 위한 TRPM5 분석에서 KCl 카운터스크린의 활용성을 나타낸다.
도 11은 TRPM5-특이적 인핸서(화합물 4)를 사용한 TRPM5 활성의 용량 반응 자극을 나타낸다.
도 12는 화합물 5(30 μM)가 특히 준최적 농도의 ATP에서 TRPM5를 매우 강력히 증진시킴을 나타낸다(EC1O에서 17배).
도 13a 내지 13b는 TRPM5-매개 자극을 야기하기 위한 칼슘 이온 운반 물질 A23187(도 13a) 또는 카바콜(도 13b)의 능력에 대한 TRPM5 결실 돌연변이의 효과를 나타낸다.
개요
본 발명은 TRPM5의 활성을 조절하는 화합물의 고속 처리 스크리닝 검정에 관한 것이다. TRPM5의 조절제는 미각에 영향을 미칠 것으로 보이기 때문에, 본 발명은 TRPM5를 특이적으로 조절할 수 있는 미각 자극 물질을 확인하는데 유용한 최초의 고속 처리 스크리닝 방법을 제공한다. 이 방법은 카운터스크리닝, 준최적 용량 이용 및 TRPM5의 도미넌트 네거티브 돌연변이체(dominant negative mutant)를 이용하기 때문에, 맛에 영향을 줄 수 있는 화합물에 대한 다른 스크리닝보다도 선택적 이다.
고속 처리란 단시간내에 많은 화합물을 처리함을 의미한다. 예를 들어, 본 발명을 이용함으로써 1 시간내에 1000개가 넘는 시험 화합물을 TRPM5 활성 조절능에 대해 스크리닝할 수 있다. 이러한 분석은 TRPM5를 발현하는 세포를 이용하여 수행된다. 본 명세서 및 청구범위에 이용된 단수는 달리 명시되지 않으면 복수의 개념도 포함한다. 예를 들어, 용어 "이온 채널"은 다수의 이온 채널도 포함한다. 용어 "세포"는 다수의 세포도 포함한다.
세포는 시험 화합물에 노출되고, 채널의 개방을 촉진하거나 개방을 봉쇄하는 화합물의 능력이 측정된다. 시험 화합물의 효과는 세포를 화합물에 노출시킨 후 세포막 전위의 변화를 측정하여 결정된다. 세포막 전위의 변화에 응답하는 형광 염료가 검출에 사용된다. 화합물의 채널 조절능에 대한 특이성을 평가하는 수단이 상술된 방법과 병행하여 수행된다. 이들 병행 방법은 염화칼륨 카운터스크린의 사용, 채널을 자극하는 것으로 알려진 준최적 용량의 화합물의 사용 및 생물학적으로 불활성인 도미넌트 네거티브 TRPM5 채널의 사용을 포함한다.
특정 구성 및 배열이 논의되었지만, 이는 설명만을 목적으로 제공된 것으로 이해하여야 한다. 관련 기술의 숙련자들은 본 발명의 취지 및 영역을 벗어남이 없이 다른 구성 및 배열도 이용될 수 있음을 인정할 것이다. 관련 기술의 숙련자들에게는 본 발명이 기타 다양한 응용에 이용될 수 있다는 것이 자명할 것이다.
세포
본 발명의 방법에 사용하기 위한 세포는 기능성 또는 비기능성 TRPM5를 함유 한다. 당업자들은 TRPM5가 내인성인 세포를 사용할 수 있거나, TRPM5를 세포에 도입할 수 있다. TRPM5가 세포에 내인성이지만, 발현 수준이 적당하지 않은 경우, 당업자들은 세포내 TRPM5의 발현 수준을 증가시킬 수 있다. 주어진 세포가 TRPM5를 전혀 생성하지 않거나, 충분한 수준으로 생성하지 않는 경우, TRPM5 핵산이 발현 및 세포막 삽입을 위해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 일반적으로 "형질전환(transformation)"으로 제한없이 칭해질 수 있는 도입은 임의의 이용가능한 기술을 이용할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염(transfection), DEAE-덱스트란, 전기천공, 리포좀-매개 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어 백시니아(vaccinia) 또는 곤충 세포의 경우에는 바큘로바이러스를 사용한 형질도입(transduction)을 포함할 수 있다. 포유동물 세포 숙주 시스템의 형질전환에 대한 일반적인 측면이 미국 특허 제4,399,216호에 기술되었다. 포유동물 세포를 형질전환시키기 위한 다양한 기술에 대해서는 문헌[Keown et al, Meth. Enzym., 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al, Nature 336:348-352 (1988)]를 참조바람. 이하 상세히 설명되는 바와 같이, TRPM5는 또한 비기능성이 되게 할 수 있다. 상술된 임의의 기술을 이용하여 생물학적으로 불활성인 TRPM5를 세포에 도입할 수 있다. 불활성 TRPM5를 발현하는 세포가 TRPM5 활성화의 특이성을 확인하는데 유용하다.
TRPM5 유전자는 다양한 태아 및 성인 조직에서 4.5 kb 전사물로서 발현된다(Prawitt et al. Hum. Mol. Gen. 9:203-216 (2000)). 인간 TRPM5는 1165 아미노산, 막 스패닝 폴리펩티드를 코딩하는 24개의 엑손을 함유한 추정 판독 프레임을 가진다. 미국 국립 생물공학 정보센터(NCBI) 데이터베이스는 각각 인간 및 마우스형 TRPM5에 대해 핵산(NP_064673, NP_055370, AAP44477, AAP44476) 및 아미노산 (NM_014555, NM_020277, AY280364, AY280365) 서열에 대한 수개의 서열을 목록화하였다. 상기 서열을 포함시킨 것은 TRPM5 유전자 서열을 설명할 목적이며, 본 발명이 나열된 서열중 하나로 제한된다는 것은 아니다.
분리 서열의 공급원에 따라 유전자 서열에 상당한 이질성이 있을 수 있음을 당업계에서는 인식하고 있다. 본 발명은 TRPM5의 보존적으로 변형된 변이체의 사용도 구상한다. 보존적으로 변형된 변이체는 아미노산 및 핵산 서열 둘 다에 적용된다. 특정 핵산 서열에 있어서, 보존적으로 변형된 변이체는 동일하거나, 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하거나, 또는 아미노산 서열을 실질적으로 동일한 서열로 코딩하지 않는 핵산을 의미한다. 유전자 코드의 퇴보로 인해, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 주어진 임의의 단백질을 코딩한다.
예를 들어, 코돈 GCA, GCC, GCG 및 GCU는 모두 아미노산 알라닌을 코딩한다. 따라서, 알라닌이 코돈에 의해 특정되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩된 폴리펩티드의 변경없이 기술된 임의의 상응하는 코돈으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이체는 "침묵 변이체(silent variation)"이며, 보존적으로 변형된 변이체의 1종이다. 본 원에서 모든 핵산 서열은 폴리펩티드를 코딩하며, 또한 핵산의 모든 가능한 침묵 변이체를 기술한다. 당업자들은 핵산내 각 코돈(통상 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 AUG 및 통상 트립토판에 대한 유일한 코돈인 TGG는 제외)을 변경하여 기능적으로 동일한 분자를 수득할 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코 딩하는 핵산의 각 침묵 변이체는 기술된 각 서열을 함축한다.
기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환표는 당업계에 익히 알려졌다. 예를 들어, 보존적 치환체를 선택하기 위한 전형적인 가이드라인의 일례는 다음과 같다(원래의 잔기후 전형적인 치환체가 이어짐): ala/gly 또는 ser; arg/lys; asn/gln 또는 his; asp/glu; cys/ser; gln/asn; gly/asp; gly/ala 또는 pro; his/asn 또는 gln; ile/leu 또는 val; leu/ile 또는 val; lys/arg 또는 gln 또는 glu; met/leu 또는 tyr 또는 ile; phe/met 또는 leu 또는 tyr; ser/thr; thr/ser; trp/tyr; tyr/trp 또는 phe; val/ile 또는 leu. 다른 전형적인 가이드라인은 다음과 같은 6개 군을 이용하며, 각 군은 상호 보존적 치환체인 아미노산을 함유한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 리신 (I); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W); (또 다른 참조예: Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984); Schultz and Schimer, Principles of Proteins Structure, Springer-Verlag (1979)). 당업자들이라면 상기 언급된 치환체들이 가능한 유일한 보존적 치환체가 아니라는 것을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 특정 목적을 위해, 모든 하전된 아미노산이 포지티브인지 또는 네거티브인지 간에 상관없이 서로에 대한 보존적 치환체로 간주될 수 있다. 또한, 코딩 서열에 단일 아미노산 또는 적은 비율의 아미노산이 변경, 첨가 또는 결실된 개별 치환, 결실 또는 첨가도 "보존적으로 변형된 변이체"로 간주될 수 있다.
TRPM5를 특이적으로 조절하는 화합물을 확인하기 위해 도미넌트 네거티브형의 TRPM5가 또한 고속 처리 스크리닝 검정에 사용될 수 있다. 본 원에서 "도미넌트 네거티브(dominant negative)"라는 것은 단백질이 이온 채널 형성능을 보유하도록 야생형 서브유니트에 결합하기 위해 경쟁하는 적어도 하나의 변이체 TRPM5 단량체를 포함하나 일가 양이온의 유출은 조절할 수 없는 단백질을 의미한다. 이온 채널의 조성에 따라, 일가 양이온 유출이 억제되는 정도는 달라질 것이다.
본 발명의 변이체 TRPM5 단백질은 비보존적 변형(예: 치환)을 포함한다. 본 원에서 "비보존적" 변형이라는 것은 야생형 잔기 및 돌연변이 잔기가 소수성, 전하, 크기 및 형태를 비롯하여 하나 이상의 물리적 성질이 매우 상이한 변형을 의미한다. 예를 들어, 극성 잔기로부터 비극성 잔기로의 변형 또는 그 반대, 양전하 잔기로부터 음전하 잔기로의 변형 또는 그 반대 및 대형 잔기로부터 소형 잔기로의 변형 또는 그 반대는 비보존적 변형이다. 예를 들어, 다음과 같은 보다 유의적으로 영향을 미치는 치환이 수행될 수 있다: 변경 영역에서 폴리펩티드 백본의 구조, 예를 들어 알파 나선형 구조 또는 베타 시트 구조; 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성; 또는 측쇄의 벌크. 일반적으로 폴리펩티드의 성질에 가장 큰 변화를 일으킬 것으로 예상되는 치환은 (a) 친수성 잔기, 예를 들어 세릴 또는 트레오닐이 소수성 잔기, 예를 들어 류실, 이소류실, 페닐알라닐, 발릴 또는 알라닐 대신(또는 이에 의해) 치환되거나; (b) 시스테인 또는 프롤린이 임의의 다른 잔기 대신(또는 이에 의해) 치환되거나; (c) 양전기성 측쇄를 가지는 잔기, 예를 들어 리실, 아르기닐 또는 히스티딜이 음전기성 잔기, 예를 들어 글루타밀 또는 아스파틸 대신(또 는 이에 의해) 치환되거나; 또는 (d) 벌키한 측쇄를 가지는 잔기, 예를 들어 페닐알라닌이 측쇄를 갖지 않는 잔기, 예를 들어 글리신 대신(또는 이에 의해) 치환되는 것이다. 일 구체예에 있어서, 본 발명의 변이체 TRPM5 단백질은 적어도 하나의 비보존적 변형을 갖는다. 일 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 해독에 따라 TRPM5 유전자의 첫 1000 염기쌍이 결실된 변이체 TRPM5 단백질이 생겨난다. 다른 구체예에 있어서, 폴리뉴클레오티드의 해독에 따라 TRPM5 유전자의 첫 2000 염기쌍이 결실된 변이체 TRPM5 단백질이 생겨난다.
예를 들어, 미국 특허 제6,188,965호; 6,296,312호; 6,403,312호에 이전에 기술된 PDA™ 시스템; 알라닌 스캐닝(미국 특허 제5,506,107호 참조), 유전자 셔플링(shuffling)(WO 01/25277), 부위 포화 돌연변이생성, 평균장, 서열 상동성, 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 점 또는 결실 돌연변이 부위 및 타입의 선택을 제시하는 당업자들에게 공지된 다른 방법을 이용하여 변이체 단백질을 생성할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 세포는 유기체로 존재하거나 이로부터 추출될 수 있거나, 이를 코딩하는 적절한 단백질 또는 핵산으로 일시 또는 영구적으로 형질감염 또는 형질전환된 세포 또는 세포주일 수 있거나, 내인성(즉, 인공적으로 도입되지 않음) 유전자로부터 필요한 TRPM5를 발현하는 세포 또는 세포주일 수 있다.
TRPM5 단백질의 발현이라는 것은 내인성 유전자 또는 세포에 도입된 핵산 유래 TRPM5 유전자 서열로부터 TRPM5 폴리펩티드를 해독하는 것을 말한다. 본 원에서 사용되는 용어 "인 시튜(in situ)"는 이러한 모든 가능성을 포함한다. 따라서, 인 시튜 방법은 TRPM5를 (고유 채널로서, 또는 세포에 도입된 핵산으로부터) 발현하는 적절한 반응성의 세포주에서 수행될 수 있다. 세포주는 조직 배양물로 존재할 수 있거나, 예를 들어, 비인간 동물 대상에서의 세포주 이종이식물일 수 있다.
본 원에서 사용되는 용어 "세포막"은 생물학적 구획을 둘러싸고 있는 지질 이중층을 의미하며, 이러한 막을 포함한 전체 세포 또는 세포 부분을 포함한다.
포유동물 세포의 안정한 형질감염에 있어서는, 사용한 발현 벡터 및 형질감염 기법에 따라 소분획의 세포만이 외래 DNA를 이들의 게놈에 통합시킬 수 있다. 이들 인티그런트(integrant)를 확인 및 선별하기 위하여, 선택가능 마커(예: 항생제 내성)를 코딩하는 유전자가 일반적으로 대상 유전자와 함께 숙주 세포에 도입된다. 바람직한 선택가능 마커는 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트 등의 약물에 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선택가능 마커를 코딩하는 핵산은 TRPM5를 코딩하는 것과 동일한 벡터내 숙주 세포로 도입될 수 있거나, 별도의 벡터로 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 약물 선택성으로 확인할 수 있다(예: 선택가능 마커 유전자가 통합된 세포는 생존하나, 다른 세포들은 사멸할 것이다).
주목해야 할 것은 TRPM5의 발현이 또한 당업계에 공지된 임의의 다수의 유도성 프로모터, 예컨대 테트라사이클린 반응성 요소, TRE에 의해서도 조절될 수 있다는 것이다. 예를 들어, TRPM5는 클론테크(Clontech) 사에서 공급하는 Tet-on 및 Tet-off 발현 시스템을 사용한 발현 조절로 세포막상에 선택적으로 존재할 수 있다(Gossen, M. and Bujard, H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992)). Tet-on 시스템에서, 유전자 발현은 테트라사이클린 유도체 독시사이클린(Dox)을 첨 가함으로써 활성화되는 반면, Tet-off 시스템에서는, 유전자 발현이 테트라사이클린(Tc) 또는 Dox를 제거함으로써 동작한다. 임의의 다른 유도성 포유동물 유전자 발현 시스템도 사용될 수 있다. 예로서는 포유동물 세포에서 유전자를 조건적으로 발현하도록 열충격 인자, 스테로이드 호르몬, 중금속 이온, 포르볼 에스테르 및 인터페론을 사용하는 시스템을 들 수 있다.
본 발명의 검정에 사용된 세포주는 TRPM5의 일시적 발현을 이루기 위해 이용될 수 있거나, TRPM5 펩티드를 발현하는 작제물로 안정하게 형질감염될 수 있다. 안정하게 형질전환된 세포주를 생성하기 위한 수단은 당업계에 주지되어 있으며, 이러한 수단들이 본 원에서 사용될 수 있다. 세포의 예로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, COS-7, HeLa, HEK 293, PC-12 및 BAF를 들 수 있으나, 이들로만 한정되지 않는다.
세포내 TRPM5의 발현 수준은 TRPM5 핵산을 세포에 도입하거나, TRPM5를 코딩하는 이종 핵산으로부터 발현을 야기하거나 발현되도록 함으로써 증가시킬 수 있다. 이종 유전자의 도입없이 TRPM5를 내생적으로 발현하는 세포가 사용될 수 있다. 이러한 세포는 본 발명의 방법에 사용하기에 충분한 수준의 TRPM5를 내생적으로 발현할 수 있거나, 본 원에 개시된 바와 같은 보충을 필요로 하는 저수준의 TRPM5 만을 발현할 수 있다.
세포내 TRPM5의 발현 수준은 또한 내인성 유전자의 발현을 증가시킴으로써도 증가시킬 수 있다. 내인성 유전자 활성화 기술은 당업계에 공지되었으며, 바이러스성 프로모터(WO 93/09222; WO 94/12650 및 WO 95/31560) 및 인공 전사 인자(Park et al. Nat. Biotech. 21:1208-1214 (2003)의 사용을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
세포내 TRPM5의 발현 수준은 핵산 하이브리드화, 중합효소 연쇄반응, RNase 보호, 도트 블롯팅(dot blotting), 면역세포화학 및 웨스턴 블롯팅(Western blotting)을 포함하나 이들에만 한정되지 않는 당업계에 공지된 기술로 결정될 수 있다. 또한, TRPM5 발현은 리포터 유전자 시스템을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어 레드 또는 그린 형광 단백질을 포함하는 이러한 시스템(참조예: Mistili and Spector, Nature Biotechnology 15:961-964 (1997))은 당업자들에게 공지된 표준 기술, 예를 들어, 형광 현미경을 이용하여 리포터 유전자의 가시화를 가능하게 한다. 더욱이, 공지된 포지티브 조절 화합물, 예컨대 트롬빈에 의해 활성화될 TRPM5의 능력은 TRPM5 발현 세포 조작후 결정될 수 있다.
본 원에 기술된 세포는 임의의 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다. 배양 조건, 이를테면 배지, 온도, pH 등은 과도한 실험없이 당업자들이 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 극대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실용화 기술은 문헌 ["Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach", M. Butler, ed. JRL Press, (1991) 및 Sambrook et al, 상동]으로부터 확인할 수 있다.
세포내 칼슘 활성화
TRPM5는 나트륨과 같은 일가 양이온 투과성 칼슘-활성화 이온 채널이다. 따라서, 채널 활성을 관찰하기 위하여는, 세포내 칼슘 저장물질이 먼저 활성화되어야 한다. 세포내 칼슘 저장물을 활성화하는 방법은 많이 있으며, 많은 칼슘 활성화제가 당업계에 공지되었고, 이들에는 트롬빈, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 카바콜 및 칼슘 이온 운반 물질(예: A23187)가 포함되나 이들에만 한정되지 않는다. 칼슘 농도 범위의 나노몰 증가가 TRPM5 채널 활성화에 필요하지만, 청구된 본 발명에 유용한 농도 범위는 당업계에 공지된 바와 같이, ATP의 경우 예를 들어 10-10 내지 10-4M이며, 정확한 농도는 세포 타입 및 인큐베이션 시간을 비롯한 다양한 요인들에 따라 달라질 수 있다. 칼슘 농도의 증가는 칼슘 민감성 염료, 예를 들어 Fluo 3, Fluo 4, 또는 FLIPR 칼슘 3 염료 및 Fura2와 연계된 단일 세포 이미지 기법을 이용하여 확인할 수 있다.
후술하는 바와 같이, 준최적 용량의 칼슘 활성화제의 적용이 TRPM5 조절 특이성을 이차 스크리닝하는데 이용될 수 있다. 시험 세포를 상술한 저용량의 칼슘 활성화제와 인큐베이션하여 달성가능한 최대치보다 낮은 형광 반응이 생성되도록 하였다. 일반적으로, 용량은 효과 농도 또는 EC20-30으로 언급되며, 이는 형광 강도가 최대 반응의 20-30%인 효과 조건을 말하는 것이다. 본 원에 사용되는 "EC"라는 것은 형광 강도가 최대 반응의 20-30%로 생성되는 효과 조건을 의미한다. TRPM5-특이적 활성화 화합물의 첨가시, 이러한 낮은 반응은 최대 수준의 활성화에 이르거나, 이에 근접하도록 증가할 것이다.
TRPM5-특이적 조절 화합물을 확인하는데 카운터스크리닝 기술이 또한 유용하다. TRPM5와 더불어 또는 그 대신에 다른 이온 채널, 특히 미각 변환에 관여하지 않는 채널을 조절하는 화합물로부터 TRPM5 억제 및 활성화에 특이적인 화합물을 식별하는 능력이 중요하다. 이후 좀 더 상세히 설명하는 바와 같이, 염화칼륨은 다수의 이온 채널을 비특이적으로 활성화하나, TRPM5를 활성화지 않는다. 따라서, KCl 활성화는 TRPM5-특이적 조절 화합물을 확인하는데 카운터스크린으로서 이용될 수 있다.
형광 염료
본 발명의 검정 및 방법에 이용될 수 있는 전압 민감성 염료는 세포 막 전위를 다루는데 사용되고 있다(Zochowski et al., Biol. Bull. 198:1-21 (2000)). 막 전위 염료 또는 전압 민감성 염료는 탈분극 세포에 유입되고, 세포내 단백질 또는 막에 결합하며, 형광을 증대시키는 분자 또는 분자의 배합물을 의미한다. 이들 염료는 예컨대 세포에서 발현된 TRPM5와 같은 이온 채널의 활성 변화를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 전압 민감성 염료로는 변형된 비스옥소놀 염료, 나트륨 염료, 칼륨 염료 및 토륨 염료를 들 수 있으나, 이들에만 한정되는 것은 아니다. 염료는 세포에 유입되어 세포내 단백질 또는 막에 결합함으로써 증대된 형광 및 레드 스펙트럼 시프트를 나타낸다(Epps et al, Chem. Phys. Lipids 69:137-150 (1994)). 탈분극 증가로 음이온성 염료가 더 많이 유입됨으로써 형광이 증가하게 된다.
시험 화합물의 첨가전에, 막 전위 염료를 분석할 TRPM5 세포에 30 내지 240 분간 사전 장입시킨다. 사전 장입(preloading)이라는 것은 시험 화합물 첨가전에, 형광 염료를 염료가 세포에 유입되어 세포내 친유성 부분에 결합하는 동안 첨가하는 것을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 막 전위 염료는 몰레큘라 디바이스(Molecular Devices) 사로부터 구입할 수 있는 FMP 염료(Catalog Nos. R8034, R8123)이다. 다른 구체예에 있어서, 적합한 염료는 이파장 FRET-계 염료, 예컨대 DiSBAC2, DiSBAC3 및 CC-2-DMPE(Invitrogen Cat. No. K1016)이다. [화학명 Pacific Blue™ 1,2-디테트라데카노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 트리에틸암모늄 염]. 세포는 전형적으로 37 ℃에서 염료의 1 내지 10 μM 완충 용액으로 20 내지 60 분동안 처리된다.
세포내 칼슘 수준을 측정하는 염료는 TRPM5 특이성을 확인하는데에도 이용된다. 일 구체예에 있어서, 세포내 칼슘 염료는 몰레큘라 디바이스 사로부터 구입할 수 있는 FLIPR 칼슘 3 염료(Part Number: R8091)이다. 일 구체예에 있어서, 적합한 염료, 예컨대 Fluo-3, Fluo-4(Invitrogen 사 제품(Cat. Numbers F14242 및 F14202))가 세포내 칼슘 증가를 측정하는데 사용될 수 있다. 세포는 전형적으로 37 ℃에서 염료의 1 내지 10 μM 완충 용액으로 20 내지 60 분동안 처리된다. 일부의 경우, 세포로부터 염료 용액을 제거하고, 분석 진행전에 새로운 분석 완충액을 첨가하는 것이 필요할 수 있다.
분석 검출
막 전위 변화에 따른 염료의 스펙트럼 특성의 변경을 검출 및 기록하는 것은 당업자들에게 공지된 임의의 수단으로 수행될 수 있다. 본 원에서 사용된 "기록하는"이라는 것은, 예컨대 형광 조영 분석에서 얻은 것과 같은 처리 형광 신호로부터 입수한 데이터를 수집 및/또는 저장하는 것을 의미한다.
일부 구체예에 있어서, 본 발명의 분석은 스펙트럼(즉, 형광) 특성의 변화를 검출하기 위해 현미경 이미지를 이용하여 단리 세포상에서 수행된다. 다른 구체예에 있어서, 분석은 다중 웰 포맷으로 수행되며, 스펙트럼 특성은 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 결정된다.
"웰(well)"이란 일반적으로 분리(예를 들어 단리된 샘플을 위해 제공됨)되었거나, 또는 하나 이상의 다른 경계 영역과 연결(예를 들어 웰내 하나 이상의 샘플간의 유체 소통을 위해 제공됨)될 수 있는 컨테이너내 경계 영역을 의미한다. 예를 들어, 기질상에서 증식된 세포는 통상 생 세포용 배양 배지도 또한 함유할 수 있는 웰내에 함유된다. 기질은 임의의 적합한 물질, 예컨대 플라스틱, 유리 등을 포함할 수 있다. 플라스틱은 통상적으로 시험관내 세포의 유지 및/또는 증식을 위해 사용된다.
상기 언급된 바와 같은 "다중 웰 용기"는 어레이에 복수개의 웰을 포함하는 기질의 일례이다. 본 발명에 유용한 다중 웰 용기는 각종 표준 포맷중 임의의 것(예를 들어, 2, 4, 6, 24, 96, 384 또는 1536 등의 웰을 가지는 플레이트)일 수 있으나, 비표준 포맷(예를 들어, 3, 5, 7 등의 웰을 가지는 플레이트)일 수도 있다.
단일 세포 조영에 적절한 구성은 컴퓨터 시스템이 장착된 현미경의 사용을 포함한다. 이러한 구성의 일례인 칼 자이츠 사(Carl Zeiss)로부터의 ATTO's Attofluor® Ratio Vision® 실시간 디지털 형광 분석장치는 생 세포 및 준비한 표본에서 형광 프로브를 분석하기 위한 완전 일체형 워크 스테이션이다(ATTO, Rockville, MD). 시스템은 사용 프로브의 광학적 성질에 의해서만 제한되는 이온들 을 개별적으로 또는 동시에 조합하여 관측할 수 있다. 표준 조영 시스템은 다중 염료 실험, 예컨대 GFP(형질감염용)와 병용되는 FMP(나트륨용)를 동일 세포에서 동일 시간에 걸쳐 수행할 수 있다. 다중 염료로부터의 영상비 및 그래픽 데이터가 온라인으로 표시된다.
본 발명의 분석이 다중 웰 포맷으로 수행되는 경우, 사용한 염료의 스펙트럼 양 변화를 검출하는데 적합한 장치는 다중 웰 마이크로플레이트 판독기이다. 적합한 장치는, 예를 들어, 몰레큘라 디바이스 사 제품인 FLBXstation® 마이크로플레이트 판독기 및 유체 이행 시스템 또는 FLEPR® 시스템, 하마마츠(Hamamatsu) 사 제품인 FDSS 6000 및 오로라 바이오사이언스사(Aurora, Bioscience Corp. CA, USA) 제품인 "VIPR" 전압 이온 프로브 판독기로서 상업적으로 구입이 가능하다. FLIPR-Tetra™은 1536개 이하의 동시 액체 전달 시스템을 이용하여 실시간 동적 세포-기반 분석을 제공하는 이세대 판독기이다. 이들 모든 시스템은 가시 파장 범위에서 여기되는 시판 염료, 예컨대 FMP와 함께 사용될 수 있다.
FLIPR® 시스템을 사용하여, 형광 강도 변화가 경시적으로 모니터되며, 예를 들어 도 9a 내지 9c에 도시된 바와 같이 그래프상으로 표시된다. TRPM5 증진 화합물의 첨가는 형광 증가를 야기하는 반면, TRPM5 봉쇄 화합물은 형광 증가를 봉쇄한다.
액체를 단일 웰 또는 다중 웰에 동시에 주입할 수 있는 수개의 상용화 형광 검출기가 이용가능하다. 이들로는 몰레큘라 디바이스 사의 FlexStation(8개의 웰), BMG NovoStar(2개의 웰) 및 Aurora VEPR(8개의 웰)을 들 수 있으나, 이들로만 한정되지 않는다. 전형적으로, 이들 장비는 플래쉬(flash) 발광 또는 형광 모드로 96-웰 플레이트를 판독하는데 12 내지 96 분을 요한다(1 분/웰). 별법은 조절제를 동일한 모든 웰에 동시에 주입하고, 전하 결합 장치(CCD) 카메라로 이미지하여 전체 플레이트에서 발광을 측정하는 것인데, 이는 FLIPR®, FLIPR-384 또는 FLIPR-Tetra™ 장비에서 칼슘 반응이 칼슘-민감성 형광 염료에 의해 판독되는 방식과 유사하다. 아머샴(Amersham) 사 제품의 이세대 LEADSEEKER, Perkin Elmer CellLux - Cellular Fluorescence Workstation 및 Hamamatsu FDSS6000 시스템과 같이 액체 처리방법이 통합된 그밖의 다른 형광 이미지 시스템이 다른 상업적 공급처로부터 기대된다. 이들 장비는 일반적으로 FMP 염료(540ex ± 15 nm, 570em ± 15 nm) 및 칼슘 염료 (490ex ± 15 nm, 530em ± 15 nm)를 판독하기에 적절한 여기 및 방출 세팅으로 구성될 수 있다. 여기/방출 특성은 각 염료 마다 다르기 때문에, 장비는 각 분석에 선택된 염료를 검출하도록 구성된다.
시험 화합물
본 발명의 스크리닝법에 사용된 시험 화합물로는 예를 들어, 합성 유기 화합물, 화학적 화합물, 천연 산물, 폴리펩티드 및 펩티드, 핵산 등이 포함되나, 이들로만 한정되는 것은 아니다.
실질적으로 임의의 화학적 화합물이 본 발명의 검정에 전위 조절제 또는 리간드로서 사용될 수 있다. 주로, 수성 또는 유기(특히 디메틸 설폭사이드- 또는 DMSO-계) 용액에 용해되는 화합물이 사용된다. 검정은 검정 단계를 자동화하여 다량의 화학 라이브러리를 스크리닝하도록 설계된다. 화합물은 세포에 편리한 임의의 공급원으로부터 제공된다. 검정은 전형적으로 병행(예를 들어, 동일한 플레이트상의 상이한 웰에서 상이한 시험 화합물을 사용하여 로봇식 검정으로 미량역가 플레이트상에서 미량역가 포맷으로) 실시된다. ChemDiv(San Diego, CA), Sigma-Aldrich(St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica-Analytika(Buchs Switzerland) 등과 같이 화합물의 공급처는 많이 있음을 알고 있을 것이다.
본 원에 사용된 "조절하는"이란 TRPM5의 기능적 활성에 대한 임의의 효과를 포함한다. 이는 적절한 자극제의 존재하에, 또는 이에 반응하여 채널의 활성을 봉쇄하거나 억제하는 것을 포함한다. 다른 한편으로, 조절제는 채널의 활성을 향상시킬 수 있다. 본 원에서 "증진"이란 TRPM5의 기능적 활성의 임의의 증가를 포함한다.
일 구체예에 있어서, 고속 처리 스크리닝법은 다수의 전위 TRPM5 조절제를 함유하는 소형 유기 분자 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 단계를 포함한다. 이어서, 이 "화학적 라이브러리"는 목적하는 특징적 활성을 나타내는 라이브러리 멤버(특정 화학 종 또는 서브클래스)를 확인하기 위하여 본 원에 기술된 바와 같이 하나 이상의 검정에서 스크리닝된다. 따라서, 확인된 화합물은 통상적인 "선도 화합물(lead compound)"로서 제공될 수 있거나, 자체로 유망하거나 실질적인 산물로 사용될 수 있다.
조합 화학 라이브러리는 시약과 같은 다수의 화학적 "빌딩 블록(building block)"을 조합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 생성되는 다양한 화합물을 수집하는 것이다. 예를 들어, 선형 조합 화학적 라이브러리, 예컨대 폴리펩티드 라이브러리는 화학적 빌딩 블록 세트(아미노산)를 주어진 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 화합물내 아미노산의 수)에 대해 매번 가능한 방식으로 조합하여 형성된다. 이와 같은 화학적 빌딩 블록의 조합 혼합으로 수백만개의 화합물이 합성될 수 있다.
조합 화학 라이브러리의 구축 및 스크리닝은 당업자들에게 주지되어 있다. 이러한 조합 화학 라이브러리에는 펩티드 라이브러리가 포함되나, 이에만 한정되지 않는다(참조예 미국 특허 제5,010,175호; Furka Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493 (1991) 및 Houghton et al., Nature 354:84-88 (1991)). 화학적 다양성 라이브러리를 생성하는 다른 화학이 또한 이용될 수 있다. 이러한 화학에는 펩토이드(예: PCT 공개 제WO 91/19735호), 코딩 펩티드(예: PCT 공개 제WO 93/20242호), 랜덤 바이오-올리고머(예: PCT 공개 제WO 92/00091호), 벤조디아제핀(예: 미국 특허 제5,288,514호), 디버소머(diversomer), 예컨대 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드(Hobbs et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993)), 비닐성 폴리펩티드(Hagihara et al., J. Amer. Chem. Soc. 114:6568 (1992)), 글루코스 스카폴딩을 함유한 비펩티드성 펩티드 모방약(Hirschmann et al, J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218 (1992)), 소형 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성물(Chen et al., J. Amer. Chem. Soc. 116:2661 (1994)), 올리고카바메이트(Cho et al, Science 261:1303 (1993)) 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell et al, J. Org. Chem. 59:658 (1994)), 핵산 라이브러리(참조: Ausubel, Berger and Sambrook, 모두 상동), 펩티드 핵산 라이브러리(참조예: 미국 특허 제5,539,083호), 항체 라이브러리(참조예: Vaughn et al, Nature Biotechnology, 74:309-314 (1996) 및PCT/US96/10287), 탄수화물 라이브러리(참조예: Liang et al, Science, 274:1520-1522 (1996) 및 미국 특허 제5,593,853호), 소형 유기 분자 라이브러리(참조예: 미국 특허 제5,569,588호; 티아졸리디논 및 메티아자논, 미국 특허 제5,549,974호; 피롤리딘, 미국 특허 제5,525,735호 및 5,519,134호; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 제5,506,337호; 벤조디아제핀, 미국 특허 제5,288,514호 등)이 포함되나, 이들로만 한정되지 않는다.
조합 라이브러리의 구축 장치는 상업적으로 구입가능하다(참조예: 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA). 또한, 다수의 조합 라이브러리 자체가 상업적으로 구입가능하다(참조예: ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscow, Russia; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd, Moscow, Russia; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD; 등).
후보 약제, 화합물, 약물 등은 전형적으로, 유기 분자, 바람직하게는 분자량이 100 달톤 초과 내지 약 10,000 달톤 미만, 바람직하게는 약 2000 내지 5000 달톤 미만인 소형 유기 화합물이더라도, 다수의 화학적 부류를 포함한다. 후보 화합물은 단백질과 구조적 상호작용, 특히 수소결합에 필요한 작용기를 포함할 수 있으 며, 전형적으로 적어도 아민, 카보닐, 하이드록실 또는 카복실기, 바람직하게는 적어도 2개의 화학 작용기를 포함한다. 후보 화합물은 하나 이상의 상기 언급된 작용기로 치환된 환식 탄소 또는 복소환식 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함할 수 있다. 후보 화합물은 또한 펩티드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 이들의 유도체, 구조 유사체 또는 조합물을 비롯한 생체분자에서도 확인된다.
그밖의 다른 각종 시약들이 본 발명에 따른 스크리닝 검정에 포함될 수 있다. 이러한 시약들에는 염, 용매, 천연 단백질, 예를 들어 알부민, 세정제 등이 포함되나, 이들에만 한정되지 않으며, 이들은 최적의 단백질-단백질 결합을 촉진하고/하거나 비특이적 또는 백그라운드 상호작용을 감소시키기 위하여 사용될 수 있다. 용매의 예로는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 에탄올 및 아세톤을 포함할 수 있으나, 이들에만 한정되지 않고, 일반적으로 총 검정 부피의 1% (v/v) 이하의 농도로 사용된다. 또한, 검정 효율을 향상시키는 시약, 예컨대 프로테아제 저해제, 항균제 등이 사용될 수도 있다. 그밖에, 방법에 사용된 성분들의 혼합물이 필요한 결합을 제공하는 임의의 순서로 첨가될 수 있다.
개시된 검정을 이용하여 확인된 화합물은 섭취가능한 조성물, 즉, 식품 및 음료뿐 아니라 경구 투여되는 의약품중에 성분 또는 향미제로 유용할 가망성이 있다. 미각 인식을 조절하는 화합물은 식품 또는 음료에 단독으로 또는 향미제와 함께 사용될 수 있다. 이러한 화합물(들)의 양은 목적하는 정도로 미각 인식을 조절하는 양일 것이며, 일반적으로 그의 개시 농도는 0.1 내지 1000 μM일 수 있다.
실시예 1 :
일시 형질감염 세포를 이용한 이미지-기반 고속 처리 스크리닝 검정
이하 상세히 설명하는 바와 같이, 인간 TRPM5 유전자를 지닌 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킨 HEK 293 세포를 고속 처리 스크리닝 검정을 개발하는데 이용하였다. FMP 염료 및 칼슘 활성화제에 의한 세포 자극을 이용하여 HEK 293 세포내 Na+ 이온 변화를 간접적으로 측정하였다.
플라스미드 작제
Thermoscript RT-PCR 시스템(Invitrogen)을 이용하여 인간 소장 폴리 A+ RNA(BD Biosciences)로부터 제1 스트랜드 cDNA를 합성하고, 전장 hTRPM5를 GC Melt(BD Biosciences)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 산물을 Pure Link PCR 정제(Invitrogen)로 PCR 정제하고, TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 벡터에 삽입하였다. 시퀀싱후, 6개의 돌연변이를 확인하고, 이 돌연변이를 고속 변환 다중 부위 지정 돌연변이생성 키트(Stratagene)를 사용하여 2 라운드로 교정하였다. 각 라운드에서 세개의 돌연변이가 교정되었다. EcoRI 및 NotI 제한 효소를 사용하여 TOPO TA 벡터로부터 전장 TRPM5를 잘라내고, EcoRI 및 NotI로 또한 분해시킨 pENTR 3C 벡터에 결찰시켰다. 삽입 및 벡터 밴드를 겔 추출하고, SNAP 겔 정제 키트(Invitrogen)를 사용하여 정제하였다. 마지막으로, LR 재조합 반응(Invitrogen)을 이용하여 진입 클론을 해당 목적 벡터에 삽입하였다(예: pT-Rex- DEST 30, pcDNA-DEST 53, pcDNA 3.2/v5-DEST 및 pcDNA 6.2/V5-DEST).
형질감염
1.0×106 HEK 293 세포(ATCC)를 6-웰 조직 배양 디시의 각 웰에 밤새 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 제조업자의 프로토콜에 따라 8 ㎕의 리포펙타민 2000(Invitrogen) 및 TRPM5 cDNA을 함유하는 4 μg의 pcDNA3.2 벡터로 형질감염시킨 다음, 밤새 인큐베이션하였다. 그 다음날, 형질감염 세포를 트립신 처리하고, 투명한 바닥의 96 웰 블랙 폴리-D-리신 플레이트(Corning)에 100 ㎕ 부피로 웰당 70,000 세포의 밀도로 시딩하고, 37 ℃/5% CO2 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다.
형광 현미경
HEK 형질감염 세포가 TRPM5를 발현하는 것을 확인하기 위하여, TRPM5를 발현하는 6 μg의 플라스미드 DNA로 일시적으로 형질감염되고(상술된 바와 같음), Lab TekII 챔버 슬라이드상에서 증식시킨 세포를 평가하였다. 대조군으로 비형질감염 세포를 형질감염 세포와 동시에 증식시켰다. 형광 현미경의 그린 검출 채널(515-530 nm)을 이용하여 GFP-TRPM5 발현 세포의 형광 방출을 검출하였다.
막 전위 분석
HEK 세포에서 TRPM5의 발현이 확인되면, 100 ㎕의 블루 또는 레드 FMP 염료(Molecular Devices)를 일시적으로 형질감염된 세포로 시딩된 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 37 ℃/5% CO2 인큐베이터에서 1 시간동안 인큐 베이션하였다. 플레이트를 530 nm 여기 및 565 nm 방출로 FLEXStation 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices)에서 판독하였다. 세포가 칼슘 활성화제(카바콜, 트롬빈 펩티드 또는 ATP)에 노출되는 경우 형광이 3 분간 모니터되었다.
결과
GFP-TRPM5 플라스미드로 형질감염된 밝은 녹색 HEK 293 세포의 출현으로 입증되는 바와 같이(도 2), TRPM5 플라스미드는 용이하게 발현되었다.
자극에 대한 TRPM5 반응의 입증자료가 도 3a 내지 3c에 예시되었다. TRPM5 형질감염 세포에 FMP 염료를 장입시킨 후, 트롬빈(도 3a), 카바콜(도 3b) 또는 ATP(도 3c)로 처리하고, FLEXstation에서 세포 형광의 증가를 모니터하였다. 세개의 시약은 모두 작용제 첨가의 최초 30 초내에 상대 형광에서 강력한 스파이크를 생성하였다. 작용제 첨가후 약 1 분에 형광 수준이 거의 베이스라인 수준으로 복귀되기 때문에 반응은 사실상 일시적이었다. 모의 처리된 세포는 ATP 및 카바콜 처리 세포 모두에서 낮은 반응을 나타내었으나, 트롬빈 처리군에서는 고도의 백그라운드 형광이 관찰되었다. 트롬빈 처리된 세포의 형광은 백그라운드에 비해 4배나 높았으며, 따라서 백그라운드 형광은 데이터 해석을 방해하지 않았다.
고속 처리 포맷에 본 발명의 스크리닝법을 응용한 것이 도 4에 나타나 있으며, 여기에서는 384-웰 플레이트내 샘플이 FLIPR-Tetra™(Molecular Devices) 상에서 5 분 검정으로 평가되었다. TRPM5-형질감염 HEK 세포를 15,000/웰로 20 ㎕ 배지중 폴리-D-리신 코팅된 384 웰 플레이트상에 밤새 시딩하였다. 막 전위 염료를 웰당 20 ㎕로 첨가하고, 플레이트를 37 ℃에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 플레이 트를 FLIPR-Tetra™에 위치시키고, 적절한 필터를 이용하여 형광 판독을 취하였다. 10 초후, 완충액 또는 불활성화제(ATP) 10 ㎕를 세포에 첨가하였다(제1 첨가). 200 초에서, 모든 세포에 10 ㎕의 ATP를 이차 첨가하였다. 완충액이 첨가된 세포에서 강력한 재현성 TRPM5 반응이 나타난(고 조절) 반면, 초기 ATP로 자극된 것은 불황성화되어 이차 첨가의 ATP에 반응을 나타내지 못하였다(저 조절). 고 조절과 저 조절 간의 피크 높이(각 피크에 대해 최대 - 최소값)에 5 배 이상의 차이가 있었으며, 이는 검정이 고속 처리 스크리닝에 적합하다는 것을 제시하는 것이다. 더욱이, Z'* 값은 0.76로 산출되었으며, 이는 0.5의 HTS 허용값보다 높은 것이다. (Z'=1-((3*SD고 조절+3*SD저 조절)/(고 조절-저 조절)).
실시예 2 :
안정하게 형질감염된 세포를 이용한 이미지-기반 고속 처리 스크리닝 검정
TRPM5의 자극을 또한 TRPM5를 안정하게 발현하는 HEK 세포에서도 볼 수 있었다. TRPM5 발현의 확인 후, TRPM5 활성 조절능을 후술하는 바와 같이 분석하였다.
플라스미드 작제 및 형질감염
상술된 기법에 따라 hTRPM5를 함유하는 pcDNA 3.2 벡터를 이용하여 TRPM5를 안정하게 발현하는 HEK 세포를 생성하였다. 35 mm 조직 배양 디시에서 1.0×106 HEK 293 세포를 4 μg의 pcDNA 3.2-TrpM5로 형질감염시켜 안정한 클론을 생성하였다. 형질감염 이틀후, 세포를 트립신 처리하고, 단일 클론 선택을 위해 1 mg/ml 제네티신(Ivitrogen)을 함유하는 증식 배지에 1:10 및 1:100으로 희석시켰다. 세포를 단 일 개별 클론이 단리되어 확장될 수 있을 때까지 상기 배지에 유지시켰다. 개별 클론을 선택하고, 선택압을 유지하기 위하여 세포를 0.25 mg/ml 제네티신을 함유하는 배지에 유지시켰다. 이어서, 개별 클론을 상술된 바와 같이 FLIPR® 또는 FLEXstation에서 막 전위 염료로 조사하였다. 그후, ATP 및 카바콜에 가장 큰 형광 반응을 나타내는 클론을 선택하여 추가의 분석을 위해 조사하였다. ATP 및 카바콜에 최고의 EC50을 가지는 선택한 클론을 확장시키고, 고속 처리 스크리닝 검정용으로 사용하였다.
결과
HEK 세포에서 안정하게 발현된 TRPM5를 상이한 농도의 수개의 GPCR 작용제에 대한 반응성에 대해 분석하였다. 분석은 510 내지 545 nm 여기 및 565 내지 625 nm 방출 필터 세트를 이용하여 FLIPR® 상에서 수행하였다. 안정하게 발현하는 HEK 세포를 함유하는 분석 플레이트에 1X 막 전위 분석 염료 레드(Molecular Devices)를 37 ℃ 및 5% CO2 인큐베이터에서 1 시간동안 장입시켰다. 이어서, 플레이트를 인큐베이터에서 제거하고 FLIPR® 상에서 판독을 수행하기 전에 실온에서 15 분간 평형화시켰다. 플레이트를 FLIPR® 상에서 총 3 분간 판독하였다. 10 초간 베이스라인 형광을 FLIPR® 상에서 구한 후, 각 작용제를 첨가하고, FLIPR®로 2 분 50 초동안 더 판독하였다. 도 5는 모의 형질감염 세포에 비해 TRPM5 발현 세포의 상대 형광이 증가한 것으로 예증되는 바와 같이, GPCR 작용제의 농도 변화에 따라 두 TRPM5 발현 클론이 자극되었음을 나타낸다. 그래프상의 값은 작용제 첨가시 최대 형광-최소 형광의 차이를 나타낸다. 개별 클론들은 클론 번호로 표시되는데 반해, 클론 풀은 선택 저항성인 모든 세포의 총합을 나타낸다. 모든 경우에, 클론 1은 세개의 모든 작용제(ATP, 카바콜 및 트롬빈 펩티드, 각각 도 5a 내지 5c)에 대해 가장 강력한 반응을 나타낸다. 클론 5 및 풀화된 클론은 클론 1에 비해 낮은 반응을 나타내었다. 그러나, 클론 5 및 풀 반응은 둘 다 비형질감염 세포에 비해 최소 3배나 더 높았다. 모의 비형질감염 세포는 어떤 작용제 농도에서도 거의 반응을 나타내지 않거나 반응을 나타내지 않았다.
실시예 3 :
준최적 농도의 칼슘-활성화제를 사용한 고속 처리 스크리닝 검정
세포내 칼슘 수준을 증가시키는 준최적 농도의 약제를 사용하여 전위 활성화 화합물의 특이성을 확인할 수 있다. 이러한 타입의 시험에서는, 예를 들어 카바콜의 고농도를 사용하기 보다, 감소된 농도가 추가의 시험 화합물과 함께 또는 시험 화합물 없이 TRPM5-발현 세포에 첨가된다. TRPM5 활성 향상제는 감소된 카바콜 처리된 세포의 형광 강도를 고 용량으로 처리된 세포에서 관측되는 수준으로 증가시키는 시험 화합물이다.
준최적 농도 범위를 결정할 수 있도록 TRPM5 발현 세포에 대한 카바콜 용량 반응 곡선을 작성하였다. 시험 화합물 첨가전에 TRPM5 발현 세포를 EC2O-EC30 수준의 카바콜(0.3 내지 1 μM)과 인큐베이션하였다. 모의 인큐베이션 및 EC1O0 처리 세포를 대조군으로 사용하였다. EC20-EC30 처리 세포의 형광 강도를 EC1O0 처리 세포에 근접하는 수준으로 증가시킨 시험 화합물을 TRPM5의 활성체로 분류하였다.
실시예 4 :
TRPM5 특이성에 대한 KCl 카운터스크린
TRPM5 활성화에 대한 특이성 분석의 강화 필요성이 도 6에 도시되었다. 상술된 고속 처리 스크리닝 검정을 이용하여 85,000개가 넘는 화합물을 스크리닝하고, 억제값의 가우시안 분포(Gaussian distribution)를 플롯팅하였다. 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 대부분의 화합물은 조절 반응 억제의 -25 내지 +25 퍼센트 범위내에 들었다. 따라서, 특이성이 더 큰 TRPM5 조절 화합물을 확인하기 위하여는, 다른 이온 채널에 대해서도 작용하는 화합물이 분석으로부터 제거되어야 한다.
KCl은 다수의 이온 채널을 활성화하나, TRPM5를 활성화지 않는다. 따라서, KCl은 TRPM5에 특이적인 조절 화합물을 확인하는데 카운터스크린으로서 이용될 수 있다.
이상적인 봉쇄제는 TRPM5를 봉쇄하나, 다른 채널은 봉쇄하지 않을 것이다. TRPM5 분석은 막 전위 염료를 사용하여 실시예 3에서와 같이 수행된다. 시험 화합물을 첨가한 뒤, 세포를 ATP로 자극하여 채널을 유도함으로써 염료 반응이 일어나도록 한다. 이 과정은 도 7에 개략적으로 도시되었다. KCl 카운터스크린을 동일 화합물로 처리된 동일 세포를 사용하여 실시예 3에서와 같이 수행하되, 자극은 ATP가 아닌 20 mM KCl로 수행한다. KCl 자극 및 비자극 반응을 대조군으로 사용한다. KCl 카운터스크린을 사용하여 확인한 비선택적 억제 화합물의 예를 도 8a에 나타내었다. 화합물 F001344,A3(하기 구조)은 TRPM5를 억제할 뿐만 아니라 KCl 반응도 억제한다(화살표). 화합물이 작용제-유도된 Ca++ 유출 반응을 방해하는지 또는 방해하지 않는지를 결정하기 위하여 추가의 특이성 분석에서는 Ca++ 유출 염료(칼슘 3 염료, Part No. R8091)를 이용한다. Ca++ 유출 분석으로 확인된 비선택적 억제 화합물의 예를 도 8b에 나타내었다. 화합물 F0013488,C13(하기 구조)은 TRPM5를 저해할 뿐만 아니라 Ca++ 유출 반응도 활성화한다(화살표).
Figure 112008032111099-PCT00001
도 9a는 4 농도의 시험 화합물인 화합물 1(하기 구조)에 대한 TRPM5 분석에서 FLIPR 트레이스를 나타낸다. 패널 1은 TRPM5 반응의 용량 반응 억제를 나타낸다. 패널 2 및 3은 화합물의 용량 증가가 KCl 또는 Ca++ 반응을 변경시키지 않음을 입증한다. 이들 결과의 정량화를 도 9b에 나타내었다. 두개의 추가의 시험 화합물(화합물 2 및 3)을 도 9c에 도시하였는데, TPRM5의 비특이적 억제를 보여주며, 여기에서 화합물 2는 또한 KCl 반응도 억제하고, 화합물 3은 Ca++ 반응을 억제한다.
Figure 112008032111099-PCT00002
KCl 카운터스크린이 또한 선택적 TRPM5 증진 화합물을 확인하는데 유용하다. 도 10은 TRPM5의 선택적 증진을 나타낸다. 카운터스크린 실험은 시험 화합물 4의 존재하에서 상술한 바와 같이 수행되었다. TRPM5 발현 HEK 및 CHO 세포는 시험 화합물 4의 첨가시 각각 131% 및 135%의 최대 자극을 나타내었다. 증가된 양의 시험 화합물 4의 첨가는 또한 TRPM5 활성에 용량 의존성 증가로 이어졌다(도 11). 더욱이, 화합물 5를 사용한 준최적(EC10) 농도의 ATP 작용제에서 매우 강한 증진이 관찰된다(도 12).
실시예 5 :
도미넌트 네거티브 TRPM5를 사용한 고속 처리 검정
도미넌트 네거티브형의 채널을 사용하여 TRPM5에 대한 특이성을 이룰 수 있는지를 조사하기 위하여 결실 돌연변이를 생성하였다. N1OOO 결실 돌연변이는 유전자의 첫 1000 염기쌍이 결실된 mTRPM5 형태이고, N2000 결실 돌연변이는 유전자의 첫 2000 염기쌍이 결실된 것이다. 유전자의 첫 2000 염기쌍은 mTRPM5 이온 채널의 아미노-말단 도메인에 상응한다. 이 영역의 결실은 전체 아미노-말단 도메인이 제거되고 단백질이 이온 채널의 제1 막횡단 영역으로 시작하는 단백질의 절단 변형체 이다. 결실 돌연변이는 각각 첫 1000 염기쌍 및 첫 2000 염기쌍이 결실된 유전자를 증폭하도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR로 작제되었다. 사용한 세포수, 인큐베이션 시간 및 염료를 상술된 바와 같이 하여 후술하는 실험을 수행하였다.
야생형 mTRPM5에 대한 상이한 비율의 결실 돌연변이 형질감염을 영 벡터(null vector)를 갖는 야생형 mTRPM5과 비교하여 실험을 수행하였다. 형질감염 DNA의 총량을 4 μg으로 유지하였다. 1×106 HEK 293 세포를 6 웰 디시에 밤새 플레이팅하였다. 이어서, 결실 돌연변이 mTRPM5/야생형 mTRPM5 및 야생형 mTRPM5/pSV3-neo를 표 1에 제시된 바와 같은 비율로 리포펙타민 2000을 사용하여 HEK 293 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 하루후, 웰당 15,000 세포를 384 플레이트에 플레이팅하고, 인큐베이터에서 밤새 유지하였다. 다음날, 세포에 막 전위 염료를 37 ℃에서 장입시키고, A23187에 대한 반응 및 카바콜 용량 반응을 비교하였다.
Figure 112008032111099-PCT00003
도 13a 내지 13b에 도시된 바와 같이, 결실 돌연변이의 농도가 증가함에 따라 A23187(도 13a) 또는 카바콜(도 13b)에 반응하는 상대 형광은 감소한다. 그러나, 영 벡터(pSV3-neo)의 존재하에서는 감소가 없다. 또한, 리간드에 대한 칼슘 반응에 효과는 없으며, 이는 막 전위 반응의 감소가 칼슘 농도 변경에 따르지 않을 수 있음을 제시하는 것이다.
본 발명의 다양한 구체예가 상술되었지만, 이들은 예시 목적으로만 제공되었지 제한적인 의미는 아닌 것으로 이해하여야 한다. 관련 업계의 숙련자들은 형태와 설명에 있어서 다양한 변화가 본 발명의 취지 및 영역을 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 알고 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 범위 및 영역은 상술된 예시적인 구체예로 제한되어서는 안되며, 하기 청구범위 및 이들의 균등범위에 준해서만 한정되어야 한다. 본 원에 인용된 모든 문헌, 특허 및 특허 출원들은 그의 전체내용이 본 명세서에 참고로 포함되었다.

Claims (63)

  1. (a) 막 전위 형광 염료를 사전 장입시킨(preloaded) TRPM5 발현 세포를 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 준최적(suboptimal) 농도의 약제와 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 세포를 전위 증진 화합물과 접촉시키는 단계;
    (c) 광학 검출기를 사용하여 상기 전위 증진 화합물의 존재하에서의 상기 세포의 형광 강도를 측정하는 단계; 및
    (d) 측정된 형광 강도를 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 최적 농도의 약제 존재하에서의 상이한 TRPM5 발현 세포의 형광 강도와 비교하는 단계
    를 포함하는, TRPM5 이온 채널의 전위 증진제를 스크리닝하기 위한 고속 처리 스크리닝 검정(high throughput screening assay).
  2. 제1항에 있어서, TRPM5 활성을 향상시키는 하나 이상의 시험 화합물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 검정.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포가 다중 웰 용기에 위치한 것인 검정.
  4. 제3항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 96개 이하의 웰을 포함하는 것인 검정.
  5. 제3항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 96개 보다 많은 웰을 포함하는 것인 검정.
  6. 제3항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 384개의 웰을 포함하는 것인 검정.
  7. 제3항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 1536개의 웰을 포함하는 것인 검정.
  8. 제1항에 있어서, 상기 칼슘 농도를 증가시키는 약제가 트롬빈, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 카바콜, 칼슘 이온 운반 물질 및 내인성 G 단백질 결합 수용체 분자의 작용제로 구성된 군중에서 선택되는 것인 검정.
  9. 제8항에 있어서, 상기 약제가 트롬빈인 것인 검정.
  10. 제8항에 있어서, 상기 약제가 ATP인 것인 검정.
  11. 제8항에 있어서, 상기 약제가 카바콜인 것인 검정.
  12. 제1항에 있어서, 상기 막 전위 형광 염료가 형광 조영 플레이트 판독기 막 전위(Fluorescent Imaging Plate Reader Membrane Potential: FMP) 염료인 것인 검정.
  13. 제1항에 있어서, 상기 광학 검출기가 형광 조영 플레이트 판독기(FLIPR®), FLEXStation, 전압/이온 프로브 판독기(VIPR), 형광 현미경 및 전하 결합 장치(CCD) 카메라 및 Pathway HT로 구성된 군중에서 선택되는 것인 검정.
  14. 제13항에 있어서, 상기 광학 검출기가 FLIPR®인 것인 검정.
  15. (a) TRPM5를 발현하고 막 전위 형광 염료를 사전 장입시킨 세포를 염화칼륨의 존재하에서 시험 화합물과 접촉시키는 단계;
    (b) 광학 검출기를 사용하여 상기 전위 조절 화합물의 존재하에서의 상기 세포의 형광 강도를 측정하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 결정된 측정 형광 강도를 염화칼륨 존재하 및 시험 화합물 부재하에서의 TRPM5를 발현하고 막 전위 형광 염료를 사전 장입시킨 상이한 세포의 형광 강도와 비교하는 단계; 및
    (d) 염화칼륨 및 시험 화합물에 따른 형광 강도 대 시험 화합물 부재하에서의 염화칼륨에 따른 형광 강도의 비가 1 미만 또는 1 초과인지를 결정하여 시험 화합물이 TRPM5-특이적 조절제일 수 있는지를 평가하는 단계
    를 포함하는, 시험 화합물이 TRPM5 이온 채널에 특이적인 조절제인지를 결정하기 위한 고속 처리 스크리닝 검정.
  16. 제15항에 있어서, TRPM5 활성을 향상시키는 시험 화합물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 검정.
  17. 제15항에 있어서, TRPM5 활성을 억제하는 시험 화합물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 검정.
  18. 제15항에 있어서, 상기 세포가 다중 웰 용기에 위치한 것인 검정.
  19. 제18항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 96개 이하의 웰을 포함하는 것인 검정.
  20. 제18항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 96개 보다 많은 웰을 포함하는 것인 검정.
  21. 제18항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 384개의 웰을 포함하는 것인 검정.
  22. 제18항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 1536개의 웰을 포함하는 것인 검정.
  23. 제15항에 있어서, 상기 칼슘 농도를 증가시키는 약제가 트롬빈, 아데노신 트 리포스페이트(ATP), 카바콜, 칼슘 이온 운반 물질 및 내인성 G 단백질 결합 수용체 분자의 작용제로 구성된 군중에서 선택되는 것인 검정.
  24. 제23항에 있어서, 상기 약제가 트롬빈인 것인 검정.
  25. 제23항에 있어서, 상기 약제가 ATP인 것인 검정.
  26. 제23항에 있어서, 상기 약제가 카바콜인 것인 검정.
  27. 제15항에 있어서, 상기 막 전위 형광 염료가 형광 조영 플레이트 판독기 막 전위(FMP) 염료인 것인 검정.
  28. 제15항에 있어서, 상기 광학 검출기가 형광 조영 플레이트 판독기(FLIPR®), FLEXStation, 전압/이온 프로브 판독기(VIPR), 형광 현미경 및 전하 결합 장치(CCD) 카메라 및 Pathway HT로 구성된 군중에서 선택되는 것인 검정.
  29. 제28항에 있어서, 상기 광학 검출기가 FLIPR®인 것인 검정.
  30. (a) TRPM5를 발현하고 세포내 칼슘 염료를 사전 장입시킨 세포를 시험 화합 물 및 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 준최적 농도의 칼슘 조절제와 접촉시키는 단계;
    (b) 광학 검출기를 사용하여 상기 칼슘 조절 화합물의 존재하에서의 상기 세포의 형광 강도를 측정하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 결정된 측정 형광 강도를 준최적 농도의 칼슘 조절제의 존재하 및 시험 화합물 부재하에서의 TRPM5를 발현하고 세포내 칼슘 염료를 사전 장입시킨 상이한 세포의 형광 강도와 비교하는 단계; 및
    (d) 준최적 농도의 칼슘 조절제 및 시험 화합물에 따른 형광 강도 대 시험 화합물 부재하에서의 준최적 농도의 칼슘 조절제에 따른 형광 강도의 비가 1 미만 또는 1 초과인지를 결정하여 시험 화합물이 TRPM5-특이적 조절제일 수 있는지를 평가하는 단계
    를 포함하는, 시험 화합물이 TRPM5 이온 채널에 특이적인 조절제인지를 결정하기 위한 고속 처리 스크리닝 검정.
  31. 제30항에 있어서, TRPM5 활성을 향상시키는 시험 화합물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 검정.
  32. 제30항에 있어서, TRPM5 활성을 억제하는 시험 화합물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 검정.
  33. 제30항에 있어서, 상기 세포가 다중 웰 용기에 위치한 것인 검정.
  34. 제33항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 96개 이하의 웰을 포함하는 것인 검정.
  35. 제33항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 96개 보다 많은 웰을 포함하는 것인 검정.
  36. 제33항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 384개의 웰을 포함하는 것인 검정.
  37. 제33항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 1536개의 웰을 포함하는 것인 검정.
  38. 제30항에 있어서, 상기 칼슘 조절제가 트롬빈, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 카바콜, 칼슘 이온 운반 물질 및 내인성 G 단백질 결합 수용체 분자의 작용제로 구성된 군중에서 선택되는 것인 검정.
  39. 제38항에 있어서, 상기 칼슘 조절제가 트롬빈인 것인 검정.
  40. 제38항에 있어서, 상기 칼슘 조절제가 ATP인 것인 검정.
  41. 제38항에 있어서, 상기 칼슘 조절제가 카바콜인 것인 검정.
  42. 제30항에 있어서, 상기 세포내 칼슘 염료가 형광 조영 플레이트 판독기(FLIPR) 칼슘 3 염료인 것인 검정.
  43. 제30항에 있어서, 상기 광학 검출기가 형광 조영 플레이트 판독기(FLIPR®), FLEXStation, 전압/이온 프로브 판독기(VIPR), 형광 현미경 및 전하 결합 장치(CCD) 카메라 및 Pathway HT로 구성된 군중에서 선택되는 것인 검정.
  44. 제43항에 있어서, 상기 광학 검출기가 FLIPR®인 것인 검정.
  45. (a) 야생형 TRPM5 및 비기능성 TRPM5 모두로 감염되고 막 전위 형광 염료를 사전 장입시킨 세포를 상기 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 약제의 존재하에서 전위 증진제와 접촉시키는 단계;
    (b) 광학 검출기를 사용하여 상기 전위 증진제 존재하에서의 상기 세포의 형광 강도를 측정하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)로부터 측정된 형광 강도를 전위 증진 화합물의 존재하에서의 야생형 TRPM5를 발현하고 막 전위 염료를 사전 장입시킨 세포의 형광 강도와 비교하여 TRPM5 증진 정도를 결정하는 단계
    를 포함하는, TRPM5 이온 채널의 전위 증진제를 스크리닝하기 위한 고속 처리 스크리닝 검정.
  46. 제45항에 있어서, 비기능성 TRPM5는 TRPM5 유전자의 첫 1000 염기쌍이 결실된 것인 검정.
  47. 제45항에 있어서, 비기능성 TRPM5는 TRPM5 유전자의 첫 2000 염기쌍이 결실된 것인 검정.
  48. 제45항에 있어서, TRPM5 활성을 향상시키는 화합물을 선별하는 단계를 더 포함하는 것인 검정.
  49. 제45항에 있어서, 상기 세포가 다중 웰 용기에 위치한 것인 검정.
  50. 제49항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 96개 이하의 웰을 포함하는 것인 검정.
  51. 제49항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 96개 보다 많은 웰을 포함하는 것인 검정.
  52. 제49항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 384개의 웰을 포함하는 것인 검정.
  53. 제49항에 있어서, 상기 다중 웰 용기가 1536개의 웰을 포함하는 것인 검정.
  54. 제45항에 있어서, 상기 칼슘 농도를 증가시키는 약제가 트롬빈, 아데노신 트리포스페이트(ATP), 카바콜, 칼슘 이온 운반 물질 및 내인성 G 단백질 결합 수용체 분자의 작용제로 구성된 군중에서 선택되는 것인 검정.
  55. 제54항에 있어서, 상기 약제가 트롬빈인 것인 검정.
  56. 제54항에 있어서, 상기 약제가 ATP인 것인 검정.
  57. 제54항에 있어서, 상기 약제가 카바콜인 것인 검정.
  58. 제54항에 있어서, 상기 약제가 칼슘 이온 운반 물질 A23187인 것인 검정.
  59. 제45항에 있어서, 상기 막 전위 형광 염료가 형광 조영 플레이트 판독기 막 전위(FMP) 염료인 것인 검정.
  60. 제45항에 있어서, 상기 광학 검출기가 형광 조영 플레이트 판독기(FLIPR®), FLEXStation, 전압/이온 프로브 판독기(VIPR), 형광 현미경 및 전하 결합 장치(CCD) 카메라 및 Pathway HT로 구성된 군중에서 선택되는 것인 검정.
  61. 제60항에 있어서, 상기 광학 검출기가 FLIPR®인 것인 검정.
  62. TRPM5 유전자의 첫 1000 염기쌍이 결실되어 있는 단리된 핵산.
  63. TRPM5 유전자의 첫 2000 염기쌍이 결실되어 있는 단리된 핵산.
KR1020087010838A 2005-11-03 2006-11-03 Ｔｒｐｍ5 이온 채널용 고속 처리 스크리닝 검정 KR20080072644A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73263605P 2005-11-03 2005-11-03
US60/732,636 2005-11-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080072644A true KR20080072644A (ko) 2008-08-06

Family

ID=38023838

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087010838A KR20080072644A (ko) 2005-11-03 2006-11-03 Ｔｒｐｍ5 이온 채널용 고속 처리 스크리닝 검정

Country Status (12)

Country Link
US (2) US7749730B2 (ko)
EP (1) EP1952149A4 (ko)
JP (1) JP2009514535A (ko)
KR (1) KR20080072644A (ko)
CN (1) CN101300489A (ko)
AU (1) AU2006311827A1 (ko)
BR (1) BRPI0618247A2 (ko)
CA (1) CA2626852A1 (ko)
ES (1) ES2317819T1 (ko)
NO (1) NO20082351L (ko)
RU (1) RU2008115455A (ko)
WO (1) WO2007056160A2 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4594924B2 (ja) * 2003-02-21 2010-12-08 ザ クイーンズ メディカル センター Ｔｒｐｍ５モジュレーターのスクリーニング方法
BRPI0618224A2 (pt) * 2005-11-03 2011-08-23 Redpoint Bio Corp derivados de hidrazona e usos dos mesmos
MX2009008243A (es) * 2007-02-02 2009-08-12 Redpoint Bio Corp Uso de un inhibidor de trpm5 para regular la insulina y la liberacion de glp-1.
CA2693700A1 (en) 2007-07-11 2009-01-15 Sru Biosystems, Inc. Methods for identifying modulators of ion channels
US9134307B2 (en) 2007-07-11 2015-09-15 X-Body, Inc. Method for determining ion channel modulating properties of a test reagent
WO2009045377A2 (en) * 2007-10-01 2009-04-09 Redpoint Bio Corporation A non-desensitizing mutant of the transient receptor potential trpm5 ion channel
EP2245171A2 (en) * 2008-02-01 2010-11-03 Chromocell Corporation Cell lines and methods for making and using them
JP2011527573A (ja) * 2008-07-11 2011-11-04 エス アール ユー バイオシステムズ，インコーポレイテッド イオンチャネルの調節因子を同定する方法
US20100298335A1 (en) * 2009-05-22 2010-11-25 Kaufman Herbert E Preparations and Methods for Ameliorating or Reducing Presbyopia
US8299079B2 (en) 2009-05-22 2012-10-30 Kaufman Herbert E Preparations and methods for ameliorating or reducing presbyopia
EP2505201A1 (en) * 2011-03-29 2012-10-03 Nestec S.A. Trmp5 inhibitors support body weight reduction without reducing food intake
CN102393451B (zh) * 2011-08-01 2013-10-23 重庆大学 基于能斯特电势荧光染料的细胞钾电极特性的检测方法
CN104101589B (zh) * 2014-07-29 2016-04-27 重庆大学 基于tmrm的细胞静息膜电位和钠钾离子通透性比值检测方法
CN109187504A (zh) * 2018-07-11 2019-01-11 佛山市顺德区欧罗拉生物科技有限公司 一种基于离子通道阅读器的离子转运通道活性分析方法
CN110530829A (zh) * 2019-08-20 2019-12-03 北京爱思益普生物科技股份有限公司 一种基于荧光的早期药物筛选方法
CN111175299B (zh) * 2019-11-22 2022-08-05 浙江农林大学 一种基于细胞图像识别的甜味溶液检测方法

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
FR2662020B1 (fr) * 1990-05-11 1996-04-19 Thomson Tubes Electroniques Tube electronique a grille cylindrique.
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
WO1992021029A1 (en) 1991-05-10 1992-11-26 Genentech, Inc. Selecting ligand agonists and antagonists
NZ245015A (en) 1991-11-05 1995-12-21 Transkaryotic Therapies Inc Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
TW402639B (en) 1992-12-03 2000-08-21 Transkaryotic Therapies Inc Protein production and protein delivery
US5580748A (en) * 1993-05-03 1996-12-03 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Diagnostic tests for alzheimers disease
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US6296312B1 (en) 1995-02-21 2001-10-02 Neutral Posture Ergonomics, Inc. Armrest assembly
EP2258726A1 (en) 1995-06-14 2010-12-08 The Regents of the University of California High affinity human antibodies to c-erbB-2
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
DK0974111T3 (da) 1997-04-11 2003-04-22 California Inst Of Techn Apparat og metode til automatiseret design af proteiner
US5876946A (en) * 1997-06-03 1999-03-02 Pharmacopeia, Inc. High-throughput assay
AU3198899A (en) * 1998-03-20 1999-10-11 Rockefeller University, The Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof
US6403312B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Xencor Protein design automatic for protein libraries
WO2001025277A1 (en) 1999-10-07 2001-04-12 Maxygen Aps Single-chain antagonist polypeptides
WO2002087306A2 (en) 2001-05-01 2002-11-07 Senomyx, Inc. High throughput cell-based assay for monitoring sodium channel activity and discovery of salty taste modulating compounds
US6917108B2 (en) * 2002-11-14 2005-07-12 International Business Machines Corporation Reliable low-k interconnect structure with hybrid dielectric
JP4594924B2 (ja) * 2003-02-21 2010-12-08 ザ クイーンズ メディカル センター Ｔｒｐｍ５モジュレーターのスクリーニング方法
EP1599732B1 (en) * 2003-03-05 2007-05-09 Metabolex Inc. Methods and compositions for treating and diagnosing diabetes and related diseases involving beta-trp (mtr1 / ltrpc5 / trpm5)
US7135298B2 (en) * 2003-03-26 2006-11-14 The Burnham Institute For Medical Research Screening assay for agents that alter target of Rapamycin activity
CA2561993A1 (en) * 2004-03-30 2006-04-13 Painceptor Pharma Corporation Compositions and methods for modulating gated ion channels
WO2007047985A2 (en) * 2005-10-19 2007-04-26 Senomyx, Inc. Trpm5 based assays and the use thereof for the identification of modulators of sweet, bitter or umami (savory) taste

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009514535A (ja) 2009-04-09
WO2007056160A2 (en) 2007-05-18
US20070111264A1 (en) 2007-05-17
AU2006311827A1 (en) 2007-05-18
CA2626852A1 (en) 2007-05-18
NO20082351L (no) 2008-08-01
RU2008115455A (ru) 2009-12-10
EP1952149A2 (en) 2008-08-06
US7749730B2 (en) 2010-07-06
BRPI0618247A2 (pt) 2011-08-23
US20100248988A1 (en) 2010-09-30
CN101300489A (zh) 2008-11-05
EP1952149A4 (en) 2009-02-18
ES2317819T1 (es) 2009-05-01
WO2007056160A3 (en) 2007-11-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20080072644A (ko) Ｔｒｐｍ5 이온 채널용 고속 처리 스크리닝 검정
US7674594B2 (en) Screening assay for inhibitors of TRPA1 activation by a lower alkyl phenol
Rajan et al. Interaction with 14‐3‐3 proteins promotes functional expression of the potassium channels TASK‐1 and TASK‐3
ES2339960T3 (es) Metodos de cribado para compuestos que modulan la actividad de receptores acoplados a proteina g.
US7384755B2 (en) Cell-based assay for G-protein-coupled receptor-mediated activity employing a mutated cyclic nucleotide-gated ion channel and a membrane potential dye
US20080124753A1 (en) SpiceMatrix Technology for Taste Compound Identification
Samways et al. Native and recombinant ASIC1a receptors conduct negligible Ca2+ entry
US7208290B2 (en) Methods of co-expressing umami taste receptors and chimeric Gα15 variants
EP2167643A2 (en) Identification of trpml3 (mcoln3) as a salty taste receptor and use in assays for identifying taste (salty) modulators and/or therapeutics that modulate sodium transport, absorption or excretion and/or aldosterone and/or vasopressin production or release
WO2009008950A2 (en) Identification of trpml3 (mcoln3) as a salty taste receptor and use in assays for identifying taste (salty) modulators and/or therapeutics that modulate sodium transport, absorption or excretion and/or aldosterone and/or vasopressin production or release
Gebert-Oberle et al. Calcium/calmodulin regulates signaling at the α1A adrenoceptor
US11467168B2 (en) Methods of identifying a moldulator of otopetrin-mediated proton translocation activity
US7875452B2 (en) Non-desensitizing mutant of the transient receptor potential TRPM5 ion channel
Lerner et al. A New Tool for Investigating G Protein‐Coupled Receptors
KR20080008072A (ko) 세포사멸 검출 세포 및 이를 이용한 세포사멸 검출 방법
Jayawickreme et al. A new tool for investigating G protein-coupled receptors
EP2108954A1 (en) A test system for detecting intracellular cyclic nucleotide level and methods and uses thereof
JP4848282B2 (ja) 電位色素及びカルシウム色素を用いた新規の細胞ベースアッセイ
US20050033021A1 (en) Chimeric Gatiphal 15 variants and their use in the analysis and discovery of modulators of G-protein coupled receptors

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application