RU2624048C2 - Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4 - Google Patents

Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4 Download PDF

Info

Publication number
RU2624048C2
RU2624048C2 RU2013115852A RU2013115852A RU2624048C2 RU 2624048 C2 RU2624048 C2 RU 2624048C2 RU 2013115852 A RU2013115852 A RU 2013115852A RU 2013115852 A RU2013115852 A RU 2013115852A RU 2624048 C2 RU2624048 C2 RU 2624048C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
oligonucleotide
gene
neu4
sequence
disease
Prior art date
Application number
RU2013115852A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013115852A (ru
Inventor
Джозеф КОЛЛАРД
ШЕРМАН Ольга ХОРКОВА
Original Assignee
Курна, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Курна, Инк. filed Critical Курна, Инк.
Publication of RU2013115852A publication Critical patent/RU2013115852A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2624048C2 publication Critical patent/RU2624048C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлены способы повышения экспрессии гена сиалидазы 4 (NEU4) с использованием олигонуклеотида, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом для гена NEU4. Представлен олигонуклеотид длиной от 10 до 30 нк, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом для гена NEU4. Также представлена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество указанного олигонуклеотида. Группа изобретений позволяет повышать экспрессию гена NEU4, что применимо для лечения или предотвращения заболеваний, ассоциированных с геном NEU4 и/или по меньшей мере одним продуктом, кодируемым указанным геном. 6 н. и 30 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/390216, поданной 6 октября 2010 года, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.
[0002] Варианты реализации настоящего изобретения включают олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию гена NEU4 и связанных с ним молекул.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Гибридизация ДНК-РНК и РНК-РНК важна для многих аспектов функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию ДНК, транскрипцию и трансляцию. Гибридизация также играет главную роль во множестве технологий, которые позволяют либо обнаруживать конкретную нуклеиновую кислоту, либо изменять ее экспрессию. Антисмысловые нуклеотиды, например, нарушают экспрессию генов за счет гибридизации с РНК-мишенью, тем самым препятствуя сплайсингу РНК, транскрипции, трансляции и репликации. Антисмысловая ДНК обладает дополнительной особенностью, заключающейся в том, что гибриды ДНК-РНК выступают в качестве субстрата для ферментативного расщепления рибонуклеазой Н, активность которой присутствует в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как в случае олигодезоксинуклеотидов (ОДН), или они могут представлять собой продукты экспрессии эндогенных генов в виде молекул РНК. Недавно Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) одобрило антисмысловое лекарственное средство, Витравен (VITRAVENE™) (для лечения цитомегаловирусного ретинита), что свидетельствует о возможности применения антисмыслового лекарственного средства в терапевтических целях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Настоящее краткое описание предлагает краткое описание настоящего изобретения с той целью, чтобы вкратце обозначить предмет и сущность настоящего изобретения. Краткое описание представляют с пониманием того, что его не следует применять для толкования или ограничения объема или смыслового содержания формулы изобретения.
[0005] В одном варианте реализации согласно изобретению предложены способы для ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта путем применения антисмыслового олигонуклеотида (олигонуклеотидов), нацеленного на любую область природного антисмыслового транскрипта, приводящего к увеличению экспрессии соответствующего смыслового гена. Авторы настоящей заявки также предполагают, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто с помощью малых интерферирующих РНК (ммРНК), рибозимов и малых молекул, рассматриваемых в рамках настоящего изобретения.
[0006] Согласно одному варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в биологических системах, включая, но неограничиваясь перечисленными, клетки или ткани пациента in vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанной биологической системы или указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной примерно от 5 примерно до 30 нуклеотидов, при этом последовательность указанного олигонуклеотида по меньшей мере на 50% идентична последовательности обратного комплемента полинуклеотида, содержащего от 5 до 30 последовательных нуклеотидов в пределах нуклеотидов 1-2119 последовательности SEQ ID NO: 2, или в пределах нуклеотидов 1-1245 последовательности SEQ ID NO: 3, или 1-490 последовательности SEQ ID NO: 4, или 1-527 последовательности SEQ ID NO: 5, или 1-946 последовательности SEQ ID NO: 6, или 1-703 последовательности SEQ ID NO: 7, с обеспечением тем самым модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в указанных биологических системах, включая указанные клетки или ткани пациента in vivo или in vitro.
[0007] В одном варианте реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность для полинуклеотидов NEU4, присутствующих в биологической системе, например, на нуклеотиды, указанные в последовательности, соответствующей SEQ ID NOS: 2-7, и любые их варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и последовательности, которые представляют собой их комплемент. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов указаны в виде последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 8-11.
[0008] Согласно другому варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, при этом последовательность указанного олигонуклеотида по меньшей мере на 50% идентична последовательности обратного комплемента антисмысловой последовательности для полинуклеотида NEU4; с обеспечением тем самым модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
[0009] Согласно другому варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, при этом последовательность указанного олигонуклеотида по меньшей мере на 50% идентична последовательности антисмыслового олигонуклеотида для антисмыслового полинуклеотида гена NEU4; с обеспечением тем самым модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
[0010] Согласно другому варианту реализации изобретение включает способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в биологической системе, включающий осуществление контакта указанной биологической системы с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом, который нацелен на область природного антисмыслового транскрипта полинуклеотида NEU4; что приводит к модулированию функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в указанной биологической системе.
[0011] Согласно другому варианту реализации изобретение включает способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в биологической системе, включающий осуществление контакта указанной биологической системы с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом, который нацелен на область природного антисмыслового транскрипта полинуклеотида NEU4; что приводит к модулированию функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в указанной биологической системе.
[0012] В одном варианте реализации изобретение включает способ повышения функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в биологической системе, который соответствует SEQ ID NO. 1, включающий осуществление контакта указанной биологической системы с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом, который нацелен на область природного антисмыслового транскрипта полинуклеотида NEU4; что приводит к повышению функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида NEU4 или экспрессии его продуктов.
[0013] Согласно другому варианту реализации изобретение включает способ повышения функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в биологической системе, который соответствует SEQ ID NO. 1, включающий осуществление контакта указанной биологической системы с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом, который нацелен на область природного антисмыслового транскрипта указанного полинуклеотида NEU4; что приводит к повышению функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида NEU4 или экспрессии его продуктов, где природные антисмысловые транскрипты выбраны из SEQ ID NOS. 2-7.
[0014] Согласно другому варианту реализации изобретение включает способ повышения функции и/или экспрессии полинуклеотида NEU4 в биологической системе, который соответствует SEQ ID NO. 1, включающий осуществление контакта указанной биологической системы с по меньшей мере одним антисмысловым олигонуклеотидом, который нацелен на область природного антисмыслового транскрипта указанного полинуклеотида NEU4; что приводит к повышению функции и/или экспрессии указанного полинуклеотида NEU4 или экспрессии его продуктов, где природные антисмысловые транскрипты выбраны из SEQ ID NOS. 2-7, и где антисмысловые олигонуклеотиды выбраны по меньшей мере из одной SEQ ID NOS. 8-11.
[0015] В одном варианте реализации композиция содержит один или более антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами гена NEU4.
[0016] В одном варианте реализации олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных или замещенных нуклеотидов.
[0017] В одном варианте реализации олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированных связей.
[0018] В еще одном варианте реализации модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, включая молекулы фосфотиоатных, метилфосфонатных производных нуклеиновых кислот, пептидо-нуклеиновых кислот, 2'-O-метил-, фтор- или углерод-, метилен- или других закрытых нуклеиновых кислот (ЗНК; locked nucleic acids, LNA). Предпочтительно, модифицированные нуклеотиды представляют собой молекулы закрытых нуклеиновых кислот, включая ЗНК с α-L-рибо-конфигурацией (α-L-3HK).
[0019] В одном варианте реализации олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или интраперитонеально.
[0020] В одном варианте реализации олигонуклеотиды вводят в составе фармацевтической композиции. Схема лечения включает по меньшей мере однократное введение антисмысловых соединений пациенту; однако, это лечение может быть модифицировано до введения многократных доз в течение некоторого периода времени. Лечение может быть объединено с одним или более другими типами терапии.
[0021] В одном варианте реализации олигонуклеотиды инкапсулированы в липосому или присоединены к молекуле-носителю (например, холестерину, ТАТ-пептиду).
[0022] Другие аспекты описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0023] На Фигуре 1 представлены результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, которые показывают кратное изменение + стандартное отклонение для мРНК гена NEU4 после обработки клеток HepG2 фосфоротиоатными олигонуклеотидами, введенными с применением липофектамина 2000, по сравнению с контролем. Результаты ПНР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК гена NEU4 в клетках HepG2 значимо повышаются через 48 часов после обработки одним из антисмысловых олигонуклеотидов NEU4 антисмысловым олигонуклеотидом Hs.678184. Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1789-CUR-1792, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQ ID NOS: 8-11, соответственно.
[0024] Описание Перечня последовательностей - SEQ ID NO: 1: сиалидаза 4 человека (NEU4), транскриптный вариант 3, мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI (Национального центра биотехнологической информации США): NM_001167600); SEQ ID NO: 2: Природная антисмысловая последовательность (HS.678184) для гена NEU4; SEQIDNO:3: Природная антисмысловая последовательность (ВС038567) для гена NEU4; SEQ ID NO: 4: Природная антисмысловая последовательность (CR747539) для гена NEU4; SEQIDNO:5: Природная антисмысловая последовательность (BF527387) для гена NEU4; SEQ ID NO: 6: Природная антисмысловая последовательность (BF528789) для гена NEU4; SEQ ID NO: 7: Природная антисмысловая последовательность (BG913694) для гена NEU4, и SEQ ID NOS: 8-11: Антисмысловые олигонуклеотиды. Символ ʺ*ʺ обозначает фосфотиоатную связь.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0025] Некоторые аспекты изобретения описаны ниже со ссылкой на примеры применения для иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные конкретные детали, связи и способы приведены с целью обеспечения полного понимания изобретения. Однако специалист в данной области техники без труда обнаружит, что изобретение может быть применено на практике без одной или более конкретных деталей или с другими способами. Настоящее изобретение не ограничивается упорядочиванием действий или событий, так как некоторые действия могут быть осуществлены в разном порядке и/или одновременно с другими действиями или событиями. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события требуются для реализации методологии в соответствии с настоящим изобретением.
[0026] Все гены, названия генов и продукты генов, описанные в настоящей заявке, соответствуют гомологам из организмов любых видов, для которых применимы композиции и способы, предложенные в настоящей заявке. Таким образом, данные термины включают, но без ограничения, гены и генные продукты из организмов людей и мышей. Понимают, что, когда предложен ген или продукт гена из организма конкретного вида, этот элемент изобретения представлен исключительно в качестве примера, и его не следует истолковывать как ограничение, если контекст, в котором он появляется, ясно не указывает на обратное. Соответственно, например, гены, описанные в настоящей заявке, которые в некоторых вариантах реализации относятся к нуклеотидным и аминокислотным последовательностям млекопитающих, охватывают гомологичные и/или ортологичные гены и продукты генов из организмов других животных, включая, но без ограничения, других млекопитающих, рыб, земноводных, пресмыкающихся и птиц. В одном варианте реализации гены или нуклеотидные последовательности представляют собой гены или последовательности человека.
Определения
[0027] Терминология, применяемая в настоящей заявке, служит исключительно для описания конкретных вариантов реализации и не ограничивает изобретение. В настоящей заявке неопределенная и определенная формы единственного числа также включают множественные формы, если контекст ясно не предписывает иное. Кроме того, в той мере, в какой термины ʺвключающийʺ, ʺвключаетʺ, ʺимеющийʺ, ʺимеетʺ, ʺсʺ или их варианты применяют в подробном описании и/или формуле изобретения, такие термины подразумевают включение в себя подобно термину ʺсодержащийʺ.
[0028] Термин ʺпримерноʺ или ʺприблизительноʺ обозначает нахождение внутри диапазона приемлемой погрешности для конкретной величины, определенного специалистом в данной области техники, который будет зависеть отчасти от того, каким образом величину измеряют или определяют, т.е. от ограничений измерительной системы. Например, термин ʺпримерноʺ может означать, что величина находится в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения, как показывает практика в данной области техники. Альтернативно, термин ʺпримерноʺ может означать диапазон погрешности, составляющий вплоть до 20%, предпочтительно вплоть до 10%, более предпочтительно вплоть до 5% и еще более предпочтительно вплоть до 1% от заданной величины. Альтернативно, применительно к биологическим системам или процессам, термин может означать нахождение в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах пятикратного значения и более предпочтительно двукратного значения величины. В тех случаях, когда в заявке и формуле изобретения приведены конкретные значения, то, если не указано иное, следует предполагать термин ʺпримерноʺ, обозначающий нахождение внутри диапазона приемлемой погрешности для конкретной величины.
[0029] В настоящей заявке термин ʺмРНКʺ обозначает известный на настоящий момент мРНК-транскрипт(ы) гена-мишени и любые дополнительные транскрипты, происхождение которых может быть объяснено.
[0030] С помощью терминов ʺантисмысловые олигонуклеотидыʺ или ʺантисмысловое соединениеʺ обозначают молекулу РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (РНК-, ДНК-мишенью). Например, если антисмысловое соединение представляет собой олигорибонуклеотид, оно связывается с другой РНК-мишенью за счет РНК-РНК-взаимодействий и изменяет активность РНК-мишени. Антисмысловой олигонуклеотид может увеличивать или подавлять экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Определение включает любую чужеродную молекулу ДНК или РНК, подходящую с терапевтической, диагностической или другой точки зрения. Такие молекулы включают, например, молекулы антисмысловых ДНК или РНК, молекулы интерферирующих РНК (РНКи), микроРНК, ложных РНК, ммРНК, ферментативные РНК, РНК, применяемые в исправляющей терапии, и РНК, имеющие свойства агонистов и антагонистов, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности (external guide sequence, EGS), сплайс-варианты, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени. В связи с этим данные соединения могут быть введены в форме одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
[0031] В контексте настоящего изобретения термин ʺолигонуклеотидʺ относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин ʺолигонуклеотидʺ также включает линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), закрытые нуклеиновые кислоты (ЗНК; locked nucleic acids, LNA), фосфотиоатные, метилфосфонатные производные и т.п. Олигонуклеотиды способны к специфичному связыванию с полинуклеотидом-мишенью за счет регулярных взаимодействий между мономерными звеньями, такими как Уотсон-Криковский тип спаривания оснований, Хугстиновский или обратный Хугстиновский типы спаривания оснований и т.п.
[0032] Олигонуклеотид может быть ʺхимернымʺ, то есть составленным из разных областей. В контексте настоящего изобретения ʺхимерныеʺ соединения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат две или более химически отличные области, например, область (области) ДНК, область (области) РНК, область (области) ПНК и т.д. Каждая химически отличная область состоит из по меньшей мере одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Эти олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере одну область, в которой олигонуклеотид модифицирован с целью проявления одного или более желаемых свойств. Желаемые свойства олигонуклеотида включают, но без ограничения, например, повышенную устойчивость к деградации нуклеазами, повышенное клеточное поглощение и/или повышенную способность к связыванию с нуклеиновой кислотой-мишенью. Разные области олигонуклеотида могут, таким образом, обладать разными свойствами. Химерные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть получены в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или аналогов олигонуклеотидов, описанных выше.
[0033] Олигонуклеотид может быть составлен из областей, которые могут быть соединены в ʺрядʺ, то есть когда мономеры соединены последовательно, как в нативной ДНК, или соединены посредством спейсеров. Спейсеры формируют ковалентный ʺмостикʺ между областями и имеют в предпочтительных случаях длину, не превышающую примерно 100 углеродных атомов. Спейсеры могут иметь разные функциональные характеристики, например, нести положительный или отрицательный заряд, обладать свойствами специфичного связывания нуклеиновых кислот (интеркаляторы, вещества, связывающиеся с бороздками, токсины, флуорофоры и т.д.), быть липофильными, индуцировать образование специфических вторичных структур, как, например, аланинсодержащие пептиды, которые индуцируют образование альфа-спиралей.
[0034] В настоящей заявке термины ʺген NEU4ʺ и ʺсиалидаза 4ʺ включают все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.
[0035] В настоящей заявке слова LP5125, MGC102757, MGC18222, N-ацетил-альфа-нейраминидаза 4 и сиалидаза 4 рассматривают как имеющие одно и то же значение в литературе и применяют взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0036] В настоящей заявке термин ʺолигонуклеотид, специфичный кʺ или ʺолигонуклеотид, нацеленный наʺ относится к олигонуклеотиду, содержащему последовательность, (i) способную образовывать стабильный комплекс с частью гена-мишени или (ii) способную образовывать стабильный дуплекс с частью мРНК-транскрипта гена-мишени. Стабильность комплексов и дуплексов может быть определена посредством теоретических расчетов и/или анализов in vitro. Типовые анализы для определения стабильности гибридизационных комплексов и дуплексов описаны в Примерах ниже.
[0037] В настоящей заявке термин ʺнуклеиновая кислота-мишеньʺ охватывает ДНК, РНК (содержащую пре-мРНК и мРНК), транскрибируемую с такой ДНК, и также кДНК, получаемую на матрице такой РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфичная гибридизация олигомерного соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальной функции нуклеиновой кислоты. Это модулирование функции нуклеиновой кислоты-мишени с помощью соединений, которые специфично гибридизуются с последней, в общем случае называют ʺантисенс-технологиейʺ. Затрагиваемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Затрагиваемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляция белков на матрице РНК, сплайсинг РНК с образованием одного или более видов мРНК и каталитическая активность, которая может присутствовать у РНК или которой РНК может способствовать. Суммарный эффект такого препятствия функции нуклеиновой кислоты-мишени заключается в модулировании экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.
[0038] РНК-интерференция ʺРНКиʺ опосредована молекулами двухцепочечной РНК (дцРНК), которые имеют последовательности, гомологичные их нуклеотидным последовательностям-ʺмишенямʺ. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения посредники представляют собой дуплексы ʺмалых интерферирующихʺ РНК (ммРНК) длиной 5-25 нуклеотидов. ммРНК образуются в результате разрезания дцРНК ферментом-РНКазой, известным как Дайсер (Dicer). Дуплексные продукты ммРНК включаются в состав мультибелкового комплекса, называемого RISC (индуцируемый РНК комплекс сайленсинга). Без привязки к какой-либо конкретной теории, комплекс RISC, как полагают, нацелен на нуклеиновую кислоту-мишень (на роль которой подходит мРНК), при этом дуплекс ммРНК взаимодействует с мРНК за счет комплементарности их последовательностей, вызывая расщепление мРНК каталитическим путем. Малые интерферирующие РНК, которые могут быть применены согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы и применены в соответствии со способами, которые хорошо известны в данной области техники и которые будут хорошо знакомы специалисту в данной области техники. Малые интерферирующие РНК для применения в соответствии со способами согласно настоящему изобретению подходящим образом содержат от примерно 1 до примерно 50 нуклеотидов (нт). В примерах неограничивающих вариантов реализации ммРНК могут содержать от примерно 5 до примерно 40 нт, от примерно 5 до примерно 30 нт, от примерно 10 до примерно 30 нт, от примерно 15 до примерно 25 нт или примерно 20-25 нуклеотидов.
[0039] Отбор подходящих олигонуклеотидов упрощается при применении компьютерных программ, которые автоматически выравнивают нуклеотидные последовательности и отмечают идентичные или гомологичные области. Такие программы применяют для сравнения нуклеотидных последовательностей, полученных, например, в результате поиска в базах данных, таких как GenBank, или посредством секвенирования ПЦР-продуктов. Сравнение нуклеотидных последовательностей из организмов ряда видов позволяет отобрать нуклеотидные последовательности, которые обнаруживают подходящую степень идентичности между видами. В случае генов, которые не были просеквенированы, проводят блотгинги по Саузерну с целью определения степени идентичности между генами вида-мишени и других видов. Путем проведения блоттингов по Саузерну при различных степенях строгости условий гибридизации, как хорошо известно в данной области техники, можно получить приблизительную меру идентичности. Эти процедуры позволяют осуществить отбор олигонуклеотидов, которые показывают высокую степень комплементарности нуклеотидным последовательностям-мишеням субъекта, подлежащего контролю, и меньшую степень комплементарности соответствующим нуклеотидным последовательностям других видов. Специалист в данной области техники обнаружит, что существует значительная свобода выбора подходящих областей генов для применения согласно настоящему изобретению.
[0040] С помощью термина ʺферментативная РНКʺ обозначают молекулу РНК, обладающую ферментативной активностью (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Ферментативные нуклеиновые кислоты (рибозимы) действуют за счет, во-первых, связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит через участок ферментативной нуклеиновой кислоты, связывающий РНК-мишень, который находится в непосредственной близости к ферментативному участку молекулы, катализирующему расщепление РНК-мишени. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота сперва распознает и далее связывает РНК-мишень за счет спаривания оснований и, как только происходит связывание с нужным сайтом, проявляет ферментативную активность, разрезая РНК-мишень.
[0041] С помощью термина ʺложная РНКʺ обозначают молекулу РНК, которая имитирует природный связывающий домен для лиганда. Ложная РНК, таким образом, конкурирует с природной связывающей мишенью за связывание конкретного лиганда. Например, было показано, что сверхэкспрессия РНК-элемента трансактивационного ответа (TAR) ВИЧ может действовать как ʺложнаяʺ и эффективно связывает белок tat (транскрипционный трансактиватор) ВИЧ, таким образом препятствуя связыванию этого белка с последовательностями TAR, кодируемыми РНК ВИЧ. Подразумевают, что приведенная информация представляет собой конкретный пример. Специалисты в данной области техники обнаружат, что это всего лишь один пример, и другие варианты реализации могут быть легко разработаны с применением методик, общеизвестных в данной области техники.
[0042] В настоящей заявке термин ʺмономерыʺ, как правило, обозначает мономеры, соединенные посредством фосфодиэфирных связей или их аналогов с образованием олигонуклеотидов, размеры которых изменяются в пределах от нескольких мономерных единиц, например, от примерно 3-4, до примерно нескольких сотен мономерных единиц. Аналоги фосфодиэфирных связей включают: фосфотиоатные, фосфодитиоатные, метилфосфонатные, фосфоселеноатные, фосфорамидатные связи и т.п., как более подробно описано ниже.
[0043] Термин ʺнуклеотидʺ распространяется на встречающиеся в природе нуклеотиды, а также не встречающиеся в природе нуклеотиды. Специалисту в данной области техники должно быть ясно, что различные нуклеотиды, которые ранее считали ʺне встречающимися в природеʺ, были впоследствии найдены в природе. Таким образом, термин ʺнуклеотидыʺ включает не только известные молекулы, содержащие пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но также и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Иллюстративные примеры других типов нуклеотидов представляют собой молекулы, содержащие аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диаминопурин, 8-оксо-N6-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N4,N4-этаноцитозин, N6,N6-этано-2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин, 5-(C3-C6)-алкинилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолпиридин, изоцитозин, изогуанин, инозин и ʺне встречающиеся в природеʺ нуклеотиды, описанные в публикации Benner et al, Патент США №5432272. Термин ʺнуклеотидʺ распространяется на каждый и все из этих примеров, а также их аналоги и таутомеры. Особенно интересными нуклеотидами являются те из них, которые содержат аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые рассматривают как встречающиеся в природе нуклеотиды, относительно терапевтического и диагностического применения у людей. Нуклеотиды содержат природные 2'-дезокси- и 2'-гидроксисахара, например, описанные в Romberg and Baker, DNA Replication, 2 nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), a также их аналоги.
[0044] Термин ʺаналогиʺ в применении к нуклеотид ам включает синтетические нуклеотиды, содержащие модифицированные основания и/или модифицированные сахара (см., например, аналоги, описанные, в основном, в Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25 (22), 4429-4443, Toulme, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19: 17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489: 117-139; Freier S.M, (1997) Nucleic Acid Research, 25: 4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin R, (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10: 297-310); 2'-O, 3'-C-соединенные [3.2.0]бициклоарабинонуклеозиды. Такие аналоги включают синтетические нуклеотиды, направленные на усиление связывающих свойств, например, стабильности дуплексов или триплексов, специфичности и т.п.
[0045] В настоящей заявке термин ʺгибридизацияʺ обозначает спаривание практически комплементарных цепей олигомерных соединений. Один механизм спаривания задействует образование водородных связей, которые могут представлять собой Уотсон-Криковские, Хугстиновские или обратные Хугстиновские водородные связи между комплементарными основаниями нуклеозидов или нуклеотидов (нуклеотидами) цепей олигомерных соединений. Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеотидами, которые спариваются за счет образования водородных связей. Гибридизация может происходить при различных условиях.
[0046] Антисмысловое соединение является ʺспособным к специфичной гибридизацииʺ, если связывание указанного соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью нарушает нормальное функционирование нуклеиновой кислоты-мишени, приводя к модулированию функции и/или активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нуклеотидными последовательностями, не являющимися мишенями, в условиях, при которых необходимо специфичное связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия и в условиях, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.
[0047] В настоящей заявке фраза ʺстрогие условия гибридизацииʺ или ʺстрогие условияʺ относится к условиям, при которых соединение согласно изобретению будет гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью, но с минимальным количеством других последовательностей. Строгие условия зависят от последовательности и будут различаться в разных обстоятельствах, и, в контексте настоящего изобретения, ʺстрогие условияʺ, при которых олигомерные соединения гибридизуются с последовательностью-мишенью, определяются природой и составом олигомерных соединений и видами анализов, посредством которых их исследуют. В общем случае, строгие условия гибридизации включают низкие концентрации (<0,15М) солей, содержащих неорганические катионы, такие как Na+ или К+ (т.е. низкую ионную силу), температуру выше точки, расположенной на 20°C-25°C ниже Тпл комплекса олигомерное соединение: последовательность-мишень, и присутствие денатурантов, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид или детергент додецилсульфат натрия (ДСН). Например, скорость гибридизации снижается на 1,1% на каждый добавленный 1% формамида. Примером условий гибридизации с высокой степенью строгости является гибридизация с применением 0,1Х буфера хлорид натрия-цитрат натрия (SSC, стандартный цитратно-солевой)/0,1% (масс/об.) ДСН при 60°С в течение 30 минут.
[0048] В настоящей заявке термин ʺкомплементарныйʺ относится к способности точного спаривания между двумя нуклеотидами или одной или двумя олигомерными цепями. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении цепи антисмыслового соединения способно к образованию водородных связей с нуклеиновым основанием в определенном положении цепи нуклеиновой кислоты-мишени, причем, указанная нуклеиновая кислота-мишень представляет собой молекулу ДНК, РНК или олигонуклеотида, то положение, в котором происходит образование водородных связей между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью, считают комплементарным положением. Олигомерное соединение и дополнительная молекула ДНК, РНК или олигонуклеотида комплементарны друг другу, когда достаточное число комплементарных положений в каждой молекуле заняты нуклеотидами, способными образовывать водородные связи друг с другом. Таким образом, термины ʺспецифично гибридизующийсяʺ и ʺкомплементарныйʺ применяют для обозначения достаточной степени точного спаривания, или комплементарности, в пределах достаточного числа нуклеотидов, так что между олигомерным соединением и нуклеиновой кислотой-мишенью происходит стабильное и специфичное связывание.
[0049] Как понимают специалисты в данной области техники, последовательность олигомерного соединения не обязательно должна быть на 100% комплементарна последовательности его нуклеиновой кислоты-мишени для того, чтобы соединение было способно к специфичной гибридизации. Кроме того, олигонуклеотид может гибридизоваться поверх одного или более сегментов, так что промежуточные или соседние сегменты оказываются не вовлеченными в процесс гибридизации (например, петлевая структура, отсутствие комплементарности или шпилечная структура). Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению содержат последовательность, комплементарную на по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 99% области-мишени в пределах нуклеотидной последовательности-мишени, на которую эти соединения нацелены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов антисмыслового соединения комплементарны области-мишени и, следовательно, специфично гибридизовались бы с ним, характеризовалось бы 90% комплементарностью. В данном примере остальные некомплементарные нуклеотиды могут располагаться в кластерах комплементарных нуклеотидов или чередоваться с комплементарными нуклеотидами и не обязательно должны примыкать друг к другу или к комплементарным нуклеотидам. По этой причине антисмысловое соединение длиной 18 нуклеотидов, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеотида, которые фланкированы двумя областями, полностью комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени, в целом характеризовалось бы 77,8% комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью и попадало бы, таким образом, в рамки настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен обычным способом с применением программ BLAST (средства поиска основного локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных в данной области техники. Процент гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности может быть определен с помощью, например, программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) с применением параметров, установленных по умолчанию, которая использует алгоритм Смита-Ватермана (Adv. Appl. MtfA., (1981) 2, 482-489).
[0050] В настоящей заявке термин ʺтемпература плавления (Тпл)ʺ относится к температуре, в условиях определенной ионной силы, pH и концентрации нуклеиновой кислоты, при которой 50% олигонуклеотидов, комплементарных последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в состоянии равновесия. Как правило, строгие условия гибридизации будут отличаться тем, что концентрация соли составляет по меньшей мере примерно от 0,01 до 1,0 М концентрации ионов Na (или других солей) при pH, равном 7,0-8,3, и температура равна по меньшей мере примерно 30°C для коротких олигонуклеотидов (например, длиной от 10 до 50 нуклеотидов). Строгие условия могут также быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид.
[0051] В настоящей заявке термин ʺмодулированиеʺ обозначает либо увеличение (стимулирование), либо ослабление (ингибирование) экспрессии гена.
[0052] Термин ʺвариантʺ, применительно к последовательности полинуклеотида, может охватывать последовательность полинуклеотида, относящегося к гену дикого типа. Это определение может также включать, например, ʺаллельныеʺ, ʺсплайс-ʺ, ʺвидовыеʺ или ʺполиморфныеʺ варианты. Сплайс-вариант может быть в значительной степени идентичным исходной молекуле, но будет в общем случае содержать большее или меньшее число полинуклеотидов вследствие альтернативного сплайсинга экзонов во время процессинга мРНК. Соответствующий полипептид может обладать дополнительными функциональными доменами или отличаться отсутствием доменов. Видовые варианты представляют собой последовательности полинуклеотидов, которые варьируют от одного вида к другому. Особенно полезными согласно настоящему изобретению являются варианты продуктов генов дикого типа. Варианты могут возникнуть в результате по меньшей мере одной мутации в нуклеотидной последовательности и могут приводить к появлению измененных мРНК или полипептидов, структура или функция которых могут быть или могут не быть изменены. Любой отдельно взятый природный или рекомбинантный ген может не иметь или иметь одну или много аллельных форм. Обычные мутационные изменения, вызывающие возникновение вариантов, в общем случае приписывают природным делециям, вставкам или заменам нуклеотидов. Каждый из этих типов изменений может произойти отдельно или в комбинации с остальными типами, один или более раз в данной последовательности.
[0053] Итоговые полипептиды в общем случае будут характеризоваться значительной идентичностью аминокислотных последовательностей относительно друг друга. Полиморфный вариант представляет собой вариацию в полинуклеотидной последовательности конкретного гена между отдельными особями данного вида. Полиморфные варианты также могут охватывать ʺодиночные нуклеотидные полиморфизмыʺ (ОНП), или мутации, затрагивающие одно основание, при которых полинуклеотидная последовательность изменяется на одно основание. Наличие ОНП может указывать на, например, некоторую популяцию со склонностью к болезненному состоянию, что отражает восприимчивость против устойчивости.
[0054] Производные полинуклеотиды включают нуклеиновые кислоты, подвергнутые химической модификации, например, замещению водорода на алкил, ацил или аминогруппу. Производные, например, производные олигонуклеотиды, могут содержать не встречающиеся в природе фрагменты, такие как измененные остатки сахаров или связи между остатками сахаров. Типовыми среди них являются фосфотиоатные и другие содержащие серу виды связей, которые известны в данной области техники. Производные нуклеиновые кислоты могут также содержать метки, включая радионуклеотиды, ферменты, флуоресцентные агенты, хемилюминесцентные агенты, хромогенные агенты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.
[0055] ʺПроизводнымʺ полипептидом или пептидом является тот, который модифицирован, например, посредством гликозилирования, пегилирования, фосфорилирования, сульфатирования, восстановления/алкилирования, ацилирования, химического сочетания или мягкой обработки формалином. Производное может также быть модифицировано добавлением детектируемой метки, либо напрямую, либо косвенно, включая, но без ограничения, радиоизотопную, флуоресцентную и ферментативную метку.
[0056] В настоящей заявке термин ʺживотноеʺ или ʺпациентʺ включает, например, людей, овцу, лосей, оленя, чернохвостого оленя, норок, млекопитающих, обезьян, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, коз, собак, кошек, крыс, мышей, птиц, курицу, пресмыкающихся, рыбу, насекомых и паукообразных.
[0057] Термин ʺмлекопитающееʺ распространяется на теплокровных млекопитающих, которым, как правило, оказывают медицинскую помощь (например, люди и одомашненные животные). Примеры включают кошачьих, псовых, лошадиных, бычьих, и человека, а также только человека.
[0058] Термин ʺлечениеʺ распространяется на лечение болезненного состояния у млекопитающего и включает: (а) предотвращение возникновения болезненного состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к болезненному состоянию, но оно еще не было диагностировано у субъекта; (b) ингибирование болезненного состояния, например, остановку его развития; и/или (с) облегчение болезненного состояния, например, индукцию ремиссии болезненного состояния, до тех пор, пока не будет достигнут желаемый результат. Лечение также включает уменьшение интенсивности симптома заболевания (например, уменьшение боли или дискомфорта), при этом такое уменьшение интенсивности симптомов может напрямую влиять или не влиять на заболевание (например, причину, передачу, проявление и т.д.).
[0059] В настоящей заявке термин ʺракʺ относится ко всем типам рака или новообразований или злокачественных опухолей, обнаруженных у млекопитающих, включая, но без ограничения: лейкемии, лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы. Рак проявляется в виде ʺопухолиʺ или ткани, содержащей злокачественные раковые клетки. Примеры опухолей включают саркомы и карциномы, такие как, но без ограничения: фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хондрома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, саркома Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальной железы, папиллярная карцинома, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечно-клеточная карцинома, гепатома, карцинома желчного протока, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карцинома легкого, мелкоклеточная карцинома легкого, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, неврома слухового нерва, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома. Дополнительные виды рака, которые можно лечить с применением предложенной композиции согласно изобретению, включают, но без ограничения, например, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, нейробластому, рак молочной железы, рак яичника, рак легкого, рабдомиосаркому, первичный тромбоцитоз, первичную макроглобулинемию, мелкоклеточные опухоли легкого, первичные опухоли мозга, рак желудка, рак толстой кишки, злокачественную инсулиному поджелудочной железы, злокачественный карциноид, рак мочевого пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, предраковые заболевания кожи, рак яичка, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак пищевода, рак мочеполового тракта, злокачественную гиперкальциемию, рак шейки матки, рак эндометрия, рак коры надпочечников и рак предстательной железы.
[0060] В настоящей заявке термин ʺневрологическое заболевание или расстройствоʺ относится к любому заболеванию или расстройству нервной системы и/или зрительной системы. ʺНеврологическое заболевание или расстройствоʺ включает заболевание или расстройства, которые затрагивают центральную нервную систему (мозг, ствол мозга и мозжечок), периферическую нервную систему (включая черепные нервы) и вегетативную нервную систему (части которой находятся и в центральной, и в периферической нервной системе). Неврологическое заболевание или расстройство включает, но без ограничения, приобретенную эпилептиформную афазию; острый диссеминированный энцефаломиелит; адренолейкодистрофию; возрастную макулярную дегенерацию; агенезию мозолистого тела; агнозию; синдром Айкарди; болезнь Александера; болезнь Альпера; альтернирующую гемиплегию; болезнь Альцгеймера; сосудистую деменцию; боковой амиотрофический склероз; анэнцефалию; синдром Ангельмана; ангиоматоз; аноксию; афазию; апраксию; арахноидальные кисты; арахноидит; мальформацию Арнольда-Киари; артериовенозную мальформацию; синдром Аспергера; атаксию-телеангиэктазию; синдром дефицита внимания и гиперактивности; аутизм; вегетативную дисфункцию; боль в спине; болезнь Баттена; болезнь Бехчета; паралич Белла; доброкачественный эссенциальный блефароспазм; доброкачественную фокальную эпилепсию; амиотрофию; доброкачественную внутричерепную гипертензию; болезнь Бинсвангера; блефароспазм; синдром Блоха-Сульцбергера; повреждение плечевого сплетения; абсцесс мозга; травму головного мозга; опухоли мозга (включая мультиформную глиобластому); опухоль спинного мозга; синдром Броун-Секара; болезнь Канавана; синдром запястного канала; каузалгию; центральный болевой синдром; центральный понтинный миелинолиз; цефалический синдром; аневризму сосудов головного мозга; церебральный артериосклероз; церебральную атрофию; церебральный гигантизм; церебральный паралич; болезнь Шарко-Мари-Тута; невропатию и невропатическую боль, вызванные химиотерапией; мальформацию Киари; хорею; хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию; хроническую боль; хронический региональный болевой синдром; синдром Коффина-Лоури; кому, включающую устойчивое вегетативное состояние; врожденную лицевую диплегию; кортикобазальную дегенерацию; височный артериит; краниосиностоз; болезнь Крейтцфельдта-Якоба; кумулятивные травматические расстройства; синдром Кушинга; инклюзионную цитомегалию; цитомегаловирусную инфекцию; синдром танцующих глаз-танцующих ног; синдром Денди-Уокера; болезнь Доусона; синдром Де Морсье; паралич Дежерин-Клюмпке; деменцию; дерматомиозит; диабетическую нейропатию; диффузный склероз; вегетативную дистонию; дисграфию; дислексию; дистонию; раннюю инфантильную эпилептическую энцефалопатию; синдром пустого турецкого седла; энцефалит; энцефалоцеле; энцефалотригеминальный ангиоматоз; эпилепсию; паралич Эрба; эссенциальный тремор; болезнь Фабри; синдром Фара; потерю сознания; семейный спастический паралич; фебрильные судороги; синдром Фишера; атаксию Фридрейха; лобно-височную деменцию и другие ʺтаупатииʺ; болезнь Гоше; синдром Герстманна; гигантоклеточный артериит; гигантоклеточную инклюзионную болезнь; глобоидно- клеточную лейкодистрофию; синдром Гийена-Барре; HTLV-1-ассоциированную миелопатию (миелопатию, ассоциированную с вирусом Т-клеточного лейкоза человека); болезнь Галлервордена-Шпатца; травму головы; головную боль; гемифациальный спазм; наследственную спастическую параплегию; наследственную полиневропатическую атаксию; синдром коленчатого узла; опоясывающий лишай; синдром Хираямы; ВИЧ-ассоциированные деменцию и нейропатию (также неврологические проявления СПИДа); голопрозэнцефалию; болезнь Хантингтона и другие заболевания, обусловленные наличием полиглутаминовых повторов; гидроанэнцефалию; гидроцефалию; гиперкортицизм; гипоксию; иммуноопосредованный энцефаломиелит; миозит с включениями телец; недержание пигмента; инфантильную форму болезни накопления фитановой кислоты; инфантильную болезнь Рефсума; инфантильные спазмы; воспалительную миопатию; внутричерепную кисту; внутричерепную гипертензию; синдром Жубера; синдром Кернса-Сейра; болезнь Кеннеди; синдром Kinsboume; синдром Клиппеля-Фейля; болезнь Краббе; болезнь Кугельберга-Веландер; куру; болезнь Лафора; миастенический синдром Ламберта-Итона; синдром Ландау-Клеффнера; боковой медуллярный синдром (синдром Валленберга); необучаемость; болезнь Лея; синдром Леннокса-Гасто; синдром Леша-Нихена; лейкодистрофию; деменцию с тельцами Леви; лиссэнцефалию; синдром окружения; болезнь Лу Герига (например, болезнь двигательных нейронов, или боковой амиотрофический склероз); заболевание поясничных дисков; болезнь Лайма - неврологические осложнения; болезнь Мачадо-Джозефа; макроэнцефалию; мегацефалию; синдром Мелькерссона-Розенталя; болезнь Меньера; менингит; болезнь Менкеса; метахроматическую лейкодистрофию; микроцефалию; мигрень; синдром Миллера-Фишера; мини-инсульты; митохондриальные миопатии; синдром Мебиуса; мономелическую амиотрофию; болезнь двигательных нейронов; болезнь мойя-мойя; мукополисахаридозы; мультиинфарктную деменцию; моторную мультифокальную невропатию; рассеянный склероз и другие демиелинизирующие расстройства; множественную системную атрофию с ортостатической гипотензией; мышечную дистрофию; тяжелую псевдопаралитическую миастению; диффузный миелинокластический склероз; раннюю миоклоническую энцефалопатию; миоклонус; миопатию; врожденную миотонию; нарколепсию; нейрофиброматоз; злокачественный нейролептический синдром; неврологические проявления СПИДа; неврологические осложнения после волчанки; нейромиотонию; нейрональный цероидный липофусциноз; нарушения миграции нейронов; болезнь Ниманна-Пика; синдром О'Салливана-МакЛауда; затылочную невралгию; скрытую дизрафию спинного мозга; синдром Охтахара; оливопонтоцеребеллярную атрофию; опсоклонус-миоклонус синдром; неврит зрительного нерва; ортостатическую гипотензию; синдром перегрузки; парестезию; нейродегенеративное заболевание или расстройство (болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Алыдгеймера, боковой амиотрофический склероз (БАС), деменцию, рассеянный склероз и другие заболевания и расстройства, связанные с гибелью нейронов); врожденную парамиотонию; паранеопластические заболевания; пароксизмальные приступы; синдром Парри-Ромберга; болезнь Пелицеуса-Мерцбахера; периодические параличи; периферическую нейропатию; болезненную нейропатию и нейропатическую боль; устойчивое вегетативное состояние; первазивные расстройства развития; световой рефлекс чихания; болезнь накопления фитановой кислоты; болезнь Пика; защемление нерва; опухоли гипофиза; полимиозит; порэнцефалию; постполиомиелитный синдром; постгерпетическую невралгию; постинфекционный энцефаломиелит; ортостатическую гипотензию; синдром Прадера-Вилли; первичный боковой склероз; прионные заболевания; прогрессирующую гемифациальную атрофию; прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию; прогрессирующую склерозирующую полиодистрофию; прогрессирующий надъядерный паралич; доброкачественную внутричерепную гипертензию; синдром Рамсея-Ханта (типы I и II); энцефалит Расмуссена; синдром рефлекторной симпатической дистрофии; болезнь Рефсума; повторяющиеся расстройства движения; туннельный синдром; синдром беспокойных ног; миелопатию, ассоциированную с ретровирусной инфекцией; синдром Ретта; синдром Рейе; пляску Святого Витта; болезнь Сандхоффа; болезнь Шильдера; шизэнцефалию; септо-оптическую дисплазию; синдром детского сотрясения; опоясывающий лишай; синдром Шая-Дрейджера; синдром Шегрена; апноэ во сне; синдром Сотоса; спастичность; расщепленный позвоночник; повреждение спинного мозга; опухоли спинного мозга; спинальную мышечную атрофию; синдром мышечной скованности; инсульт; синдром Стерджа-Вебера; подострый склерозирующий панэнцефалит; подкорковую атеросклеротическую энцефалопатию; хорею Сиденгама; обмороки; сирингомиелию; позднюю дискинезию; болезнь Тея-Сакса; височный артериит; синдром фиксированного спинного мозга; болезнь Томсена; синдром верхней апертуры грудной клетки; невралгию тройничного нерва; паралич Тодда; синдром Туретта; транзиторную ишемическую атаку; трансмиссивные спонгиоформные энцефалопатии; поперечный миелит; черепно-мозговую травму; тремор; тригеминальную невралгию; тропический спастический парапарез; туберозный склероз; сосудистую деменцию (мультиинфарктную деменцию); васкулит, в том числе височный артериит; болезнь Гиппеля-Линдау; синдром Валленберга; болезнь Верднига-Гоффмана; синдром Веста; хлыстовую травму; синдром Вильямса; болезнь Вильсона и синдром Цельвегера.
[0061] ʺПролиферативное заболевание или расстройствоʺ включает, но без ограничения, гемопоэтические неопластические расстройства с участием гаперпластических/неопластических клеток гемопоэтического происхождения, возникающих из миелоидных, лимфоидных или эритроидных ростков или их клеток-предшественников. Эти заболевания включают, но без ограничения, эритробластный лейкоз, острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ), хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ), злокачественные лимфомы, включая, но без ограничения, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), который включает В-клеточный ОЛЛ и Т-клеточный ОЛЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ), волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) и макроглобулинемию Вальденстрема (MB). Дополнительные формы злокачественных лимфом включают, но без ограничения, неходжкинскую лимфому и ее варианты, периферические Т-клеточные лимфомы, Т-клеточный лейкоз-лимфому взрослых (ATL), кожную Т-клеточную лимфому (КТКЛ), крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз (LGF), болезнь Ходжкина и болезнь Рид-Штернберга.
[0062] ʺВоспалениеʺ относится к системным воспалительным состояниям и состояниям, локально ассоциированным с миграцией и привлечением моноцитов, лейкоцитов и/или нейтрофилов. Примеры воспаления включают, но не ограничиваются перечисленными, воспаление в результате инфицирования патогенными организмами (включая грамположительных бактерий, грамотрицательных бактерий, вирусов, грибов и паразитов, таких как простейшие и гельминты), отторжение трансплантата (включая отторжение солидных органов, таких как почки, печень, сердце, легкие или роговица, а также отторжение трансплантатов костного мозга, включая реакцию трансплантата против хозяина (РТПХ)), или в результате хронических локализованных или острых аутоиммунных или аллергических реакций. Аутоиммунные заболевания включают острый гломерулонефрит, ревматоидный или реактивный артрит, хронический гломерулонефрит, воспалительные заболевания кишечника, такие как болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и некротический энтероколит, гепатит, сепсис, алкогольная болезнь печени, неалкогольный стеатоз; синдромы ассоциированные с переливанием гранулоцитов; воспалительные дерматозы, такие как контактный дерматит, атопический дерматит, псориаз, системная красная волчанка (СКВ), аутоиммунный тиреоидит, рассеянный склероз, а также некоторые формы диабета, или любые другие аутоиммунные состояния, когда атака собственной иммунной системы субъекта приводит к патологическим разрушениям тканей. Аллергические реакции включают: аллергическую астму, хронические бронхиты, острую гиперчувствительность и гиперчувствительность замедленного типа. Системные воспалительные состояния включают воспаление, ассоциированное с травмами, ожогами, реперфузией после ишемических событий (например, тромбоз сердца, головного мозга, кишечника или периферических сосудов, включая инфаркта миокарда и инсульт), сепсис, РСДВ или синдром полиорганной недостаточности. Увеличение численности клеток воспаления происходит также в атеросклеротических бляшках. Воспаление включает, но не ограничивается перечисленным, неходжкинскую лимфому, гранулематоз Вегенера, тиреоидит Хашимото, гепатоцеллюлярную карциному, атрофию тимуса, хронический панкреатит, ревматоидный артрит, реактивную лимфоидную гиперплазию, остеоартрит, неспецифический язвенный колит, папиллярную карциному, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, острый холецистит, хронический холецистит, цирроз печени, хронический сиаладенит, перитонит, острый панкреатит, хронический панкреатит, хронический гастрит, аденомиоз, эндометриоз, острый цервицит, хронический цервицит, лимфоидную гиперплазию, рассеянный склероз, гипертрофию, вторичную по отношению к идиопатической тромбоцитопенической пурпуре, первичную IgA нефропатию, системную красную волчанку, псориаз, эмфизема легких, хронический пиелонефрит и хронический цистит. Полинуклеотидные и олигонуклеотидные композиции и молекулы
[0063] Мишени: В одном варианте реализации мишени включают нуклеотидные последовательности гена сиалидазы 4 (NEU4), включая, без ограничения, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном NEU4.
[0064] Сиалидаза представляет собой гликогидролитический фермент, который присутствует в живых организмах, он отщепляет остаток сиаловой кислоты от невосстанавливающего конца сахаридных цепей гликопротеинов и гликолипидов. Известно, что при отщеплении сиаловой кислоты от молекул сахаридной цепи, может начаться не только деградация этих молекул, но также измениться конформация молекул, в результате чего могут измениться многие важные клеточные функции, такие как механизм распознавания рецепторами, клеточная адгезия и иммунный механизм. Кроме того, стало ясно, что сиалидаза обладает быстрым изменением активности в связи с пролиферацией и перерождением клеток в раковые, и участвует в метастатической способности раковых клеток. Однако, существует мало данных о том, как сиаловая кислота удаляется in vivo. Это из-за того, что исследования сиалидаз млекопитающих на молекулярном уровне отстают, и существует много неизвестных моментов, касающихся их структуры и механизма экспрессии.
[0065] Вследствие того, что сиалидаза млекопитающих проявляет довольно низкую активность и крайне неустойчива, то выделение и очистка фермента затруднены. В течение длительного времени сиалидазу часто рассматривали как один из простых лизосомальных ферментов, участвующих в диссимиляции и деградации. В такой ситуации мы выделили и очистили фермент с использованием в качестве источника фермента в основном тканей крыс, и обнаружили, что существует четыре типа сиалидаз, которые отличаются по своей природе от сиалидаз бактерий, вирусов, простейших и т.п. Эти ферменты локализуются в лизосомальном матриксе, лизосомальной мембране, плазматической мембране (мембране на поверхности клетки) и цитоплазме в клетке, соответственно, и они отличаются друг от друга не только в ферментативными характеристиками, такими как субстратная специфичность, но и иммунологическими свойствами. Среди сиалидаз, сиалидазы, локализованные в цитоплазме, могут быть получены из скелетных мышц крысы в виде однородного очищенного продукта. Впервые в мире удалось клонирование кДНК для сиалидаз животного и была определена их первичная структура. Также был проведен геномный анализ структуры и анализ ее функции с применением кДНК в качестве зонда, и было выяснено, что фермент участвует в дифференцировке и росте клеток скелетных мышц. Эти исследования можно рассматривать как часть новаторских исследований по изучению сиалидазы в мире.
[0066] В предыдущих исследованиях, было выяснено, что существует возможность того, что сиалидаза, локализована в плазматической мембране, проявляет увеличение активности при пролиферации и перерождении клеток в раковые, и это также глубоко связанно с дифференциацией нервных клеток и передачей сигнала клетками. Однако, на сегодняшний день нет полного понимания структуры этого фермента, механизма, вызывающего изменения активности, и тому подобное. Для того чтобы ответить на эти вопросы, многие исследователи в этой области уже давно желают осуществить клонирование ее кДНК. Например, если благодаря этому ферменту будет выяснен механизм ракового изменения, то можно было бы использовать эти результаты для диагностики и лечения рака. Кроме того, поскольку ганглиозиды существуют на поверхности мембран многих клеток и участвуют в важных клеточных функциях, таких как клеточная адгезия и передача информации, и они также являются основным церебральным компонентами, сиалидаза использует их в качестве специфического субстрата и она расценивается как вовлеченная в некоторые важные функции черепно-мозговых нервов.
[0067] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды применяют для предотвращения или лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных с членами семейства генов NEU4. Типовые заболевания и расстройства, опосредованные геном сиалидазы 4 (NEU4), которые можно лечить с помощью антисмысловых олигонуклеотидов согласно изобретению и/или с помощью клеток/тканей, регенерированных из стволовых клеток, полученных с применением антисмысловых соединений и/или содержащих антисмысловые соединения, включают: заболевание или расстройство, ассоциированное с аномальными функцией и/или экспрессией сиалидазы, рак, пролиферативное заболевание или расстройство, апоптоз, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением регуляции апоптоза, диабет, сердечнососудистое заболевание или расстройство, болезнь Тея-Сакса, лизосомную болезнь накопления, воспалительное заболевание или расстройство (например, воспалительное заболевание кишечника, включая болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, псориаз, артрит и т.д.), воспаления; метаболическое заболевание или расстройство, метаболический синдром, синдром резистентности к инсулину, диабет, гиперлипидемия, жировая болезнь печени, кахексия, ожирение, атеросклероз, артериосклероз, заболевание, расстройство или состояние, ассоциированное с измененным метаболизмом холестерина, повышенное кровяное давление, неврологическое заболевание или расстройство, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением дифференцировки нервных клеток; заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением образования аксонов; заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушением десиализации гликопротеинов и инфекциями (например, вирусная инфекция, системная инфекция и т.д.).
[0068] В одном варианте реализации модулирование гена NEU4 с помощью одного или более антисмысловых олигонуклеотидов представляет собой введение последних пациенту, нуждающемуся в этом, для предотвращения или лечения любого заболевания или расстройства, связанного с аномальными экспрессией, функцией, активностью белка NEU4 по сравнению с нормальным контролем.
[0069] В одном варианте реализации олигонуклеотиды специфичны для полинуклеотидов гена NEU4, которые содержат, без ограничения, некодирующие области. Мишени гена NEU4 включают варианты гена NEU4; мутанты гена NEU4, в том числе ОНП; некодирующие последовательности гена NEU4; аллели, фрагменты и т.п. Предпочтительно, олигонуклеотид представляет собой молекулу антисмысловой РНК.
[0070] В соответствии с вариантами реализации изобретения, молекула нуклеиновой кислоты-мишени не ограничивается исключительно полинуклеотидами NEU4, но распространяется на любые из изоформ, рецепторов, гомологов, некодирующих областей гена NEU4 и т.п.
[0071] В одном варианте реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность (природную антисмысловую последовательность для кодирующих и некодирующих областей) для мишеней NEU4, включая, без ограничения, варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и последовательности, которые представляют собой их комплемент. Предпочтительно, олигонуклеотид представляет собой молекулу антисмысловой РНК или ДНК.
[0072] В одном варианте реализации олигомерные соединения согласно настоящему изобретению также включают варианты, в которых разные основания находятся в одном или более нуклеотидных положениях в соединении. Например, если первый нуклеотид представляет собой аденин, то могут быть получены варианты, содержащие тимидин, гуанозин, цитидин или другие природные или неприродные нуклеотиды в этом положении. Это может быть выполнено в любой из позиций антисмыслового соединения. Эти соединения далее исследуют применяя способы, описанные в настоящей заявке, с целью определения их способности ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени.
[0073] В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность между антисмысловым соединением и мишенью составляет от примерно 50% до примерно 60%. В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет от примерно 60% до примерно 70%. В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет от примерно 70% до примерно 80%. В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет от примерно 80% до примерно 90%. В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет примерно 90%, примерно 92%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100%.
[0074] Антисмысловое соединение является способным к специфичной гибридизации, если связывание указанного соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью нарушает нормальное функционирование нуклеиновой кислоты-мишени, приводя к потере активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нуклеотидными последовательностями, не являющимися мишенями, в условиях, при которых необходимо специфичное связывание. Такие условия включают, например, физиологические условия в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия и условия, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.
[0075] Антисмысловое соединение, будь то ДНК, РНК, химерное соединение, замещенное соединение и т.д., способно к специфичной гибридизации, когда связывание соединения с молекулой ДНК- или РНК-мишени нарушает нормальное функционирование ДНК- или РНК-мишени, приводя к потере функции, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с последовательностями, не являющимися мишенями, в условиях, при которых необходимо специфичное связывание, т.е. при физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия и условиях, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.
[0076] В одном варианте реализации нацеленное воздействие на ген NEU4, включающее, без ограничения, антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскрываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.д., одну или несколько последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 2-7, и т.п., модулирует экспрессию или функцию гена NEU4. В одном варианте реализации экспрессия или функция увеличиваются по сравнению с контролем. В одном варианте реализации экспрессия или функция подавляются по сравнению с контролем.
[0077] В одном варианте реализации олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, соответствующие SEQ ID NOS: 8-11, включая антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскрываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.д. Эти олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных связей включают фосфотиоатные, фосфодитиоатные связи и т.п. В одном варианте реализации нуклеотиды содержат фосфатное производное. Фосфатное производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к остатку сахара или аналогу остатка сахара в модифицированных олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфат, алканфосфат, фосфотиоат и т.п. Получение указанных выше аналогов фосфата и их включение в состав нуклеотидов, модифицированных нуклеотидов и олигонуклеотидов, по сути, также известно и не обязательно должно быть описано в настоящей заявке.
[0078] Специфичность и чувствительность антисмысловой последовательности также используются специалистами в данной области техники для терапевтического применения. Антисмысловые олигонуклеотиды были применены в качестве терапевтических агентов для лечения болезненных состояний у животных и человека. Антисмысловые олигонуклеотиды были безопасно и эффективно введены людям, и многочисленные клинические испытания в настоящее время находятся в стадии реализации. Таким образом, установлено, что олигонуклеотиды могут представлять собой подходящие терапевтические средства, которые могут быть сконфигурированы так, чтобы подходить к режимам лечения для обработки клеток, тканей и животных, особенно людей.
[0079] В вариантах реализации настоящего изобретения олигомерные антисмысловые соединения, в частности, олигонуклеотиды, связываются с молекулами нуклеиновых кислот-мишеней и модулируют экспрессию и/или функцию молекул, кодируемых геном-мишенью. Затрагиваемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Затрагиваемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляция белков на матрице РНК, сплайсинг РНК с образованием одного или более видов мРНК и каталитическая активность, которая может присутствовать у РНК или которой РНК может способствовать. Функции могут быть усилены или ингибированы в зависимости от желаемых функций.
[0080] Антисмысловые соединения включают антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности (EGS), сплайс-варианты, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени. Сами по себе эти соединения могут быть введены в форме одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
[0081] Нацеливание антисмыслового соединения на молекулу конкретной нуклеиновой кислоты, в контексте настоящего изобретения, может представлять собой многоступенчатый процесс. Процесс обычно начинается с идентификации нуклеиновой кислоты-мишени, функция которой подлежит модулированию. Эта нуклеиновая кислота-мишень может являться, например, клеточным геном (или мРНК, транскрибируемой на матрице гена), экспрессия которого связана с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или молекулой нуклеиновой кислоты из инфекционного агента. Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота-мишень кодирует ген сиалидазы 4 NEU4.
[0082] Процесс нацеливания обычно также включает определение по меньшей мере одной области-мишени, сегмента или сайта в пределах нуклеиновой кислоты-мишени для того, чтобы антисмысловое взаимодействие могло произойти, так что желаемый эффект, например, модулирование экспрессии, будет достигнут.В контексте настоящего изобретения термин ʺобластьʺ определяют как часть нуклеиновой кислоты-мишени, имеющую по меньшей мере одну поддающуюся идентификации структуру, функцию или характеристику. Внутри областей нуклеиновых кислот-мишеней находятся сегменты. ʺСегментыʺ определяют как меньшие области или части областей в пределах нуклеиновой кислоты-мишени. ʺСайтыʺ в настоящем изобретении определяют как позиции в пределах нуклеиновой кислоты-мишени.
[0083] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми последовательностями гена сиалидазы 4 NEU4 и модулируют экспрессию и/или функцию гена NEU4 (соответствующего SEQ ID NO: 1). Примеры антисмысловых последовательностей включают последовательности, соответствующие SEQ ID NOS: 2-11.
[0084] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются с одним или более сегментами полинуклеотидов сиалидазы 4 NEU4 и модулируют экспрессию и/или функцию гена NEU4. Сегменты содержат по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов смысловых или антисмысловых полинуклеотидов NEU4.
[0085] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды специфичны к природным антисмысловым последовательностям для гена NEU4, при этом связывание олигонуклеотидов с природными антисмысловыми последовательностями для гена NEU4 модулирует экспрессию и/или функцию гена NEU4.
[0086] В одном варианте реализации олигонуклеотидные соединения содержат последовательности, соответствующие SEQ ID NOS: 8-11, антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскрываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.д. Эти олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных связей включают фосфотиоатные, фосфодитиоатные связи и т.п. В одном варианте реализации нуклеотиды содержат фосфатное производное. Фосфатное производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к остатку сахара или аналогу остатка сахара в модифицированных олигонуклеотид ах согласно настоящему изобретению, может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфат, алканфосфат, фосфотиоат и т.п. Получение указанных выше аналогов фосфата и их включение в состав нуклеотидов, модифицированных нуклеотидов и олигонуклеотидов, по сути, также известно и не обязательно должно быть описано в настоящей заявке.
[0087] Поскольку, как известно в данной области техники, инициаторный кодон представляет собой, как правило, 5'-AUG (в транскрибируемых молекулах мРНК; 5'-ATG в соответствующей молекуле ДНК), инициаторный кодон также часто называют ʺAUG кодонʺ, ʺстарт-кодонʺ или ʺAUG старт-кодонʺ. Меньшая часть генов имеет инициаторный кодон, содержащий последовательность РНК 5'-GUQ 5'-UUG или 5'-CUG; и 5'-AUA, 5'-ACG и 5'-CUG, как было показано, функционируют in vivo. Таким образом, термин ʺинициаторный кодонʺ и ʺстарт-кодонʺ может охватывать множество последовательностей кодонов, хотя инициаторная аминокислота в каждом случае представляет собой, как правило, метионин (у эукариот) или формилметионин (у прокариот). Эукариотические и прокариотические гены могут содержать два или более альтернативных старт-кодона, любой из которых может быть предпочтительно использоваться для инициации трансляции в конкретном типе клеток или ткани, или при конкретном наборе условий. В контексте настоящего изобретения, ʺстарт-кодонʺ и ʺинициаторный кодонʺ относятся к кодону или кодонам, которые используются in vivo для инициации трансляции мРНК, транскрибируемой на матрице гена, кодирующего белок сиалидазы 4 NEU4, независимо от последовательности (последовательностей) таких кодонов. Кодон терминации трансляции (или ʺстоп-кодонʺ) гена может иметь одну из трех последовательностей, т.е. 5'-UAA, 5'-UAG и 5'-UGA (соответствующими последовательностями ДНК являются 5'-ТАА, 5'-TAG и 5'-TGA, соответственно).
[0088] Термины ʺобласть старт-кодонаʺ и ʺобласть инициаторного кодонаʺ относятся к части такой мРНК или гена, которая охватывает от примерно 25 до примерно 50 последовательных нуклеотидов в любом направлении (т.е. 5' или 3') от инициаторного кодона. Аналогично, термины ʺобласть стоп-кодонаʺ и ʺобласть кодона терминации трансляцииʺ относятся к части такой мРНК или гена, которая охватывает от примерно 25 до примерно 50 последовательных нуклеотидов в любом направлении (т.е. 5' или 3') от кодона терминации трансляции. Следовательно, ʺобласть старт-кодонаʺ (или ʺобласть инициаторного кодонаʺ) и ʺобласть стоп-кодонаʺ (или ʺобласть кодона терминации трансляцииʺ) обе являются областями, на которые могут быть эффективно нацелены антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению.
[0089] Открытая рамка считывания (ОРС) или ʺкодирующая областьʺ, которая, как известно в данной области техники, относится к области между инициаторным кодоном и кодоном терминации трансляции, также представляет собой область, на которую может быть эффективно направлено воздействие. В контексте настоящего изобретения область-мишень является внутригенной областью, включающей инициаторный кодон или кодон терминации трансляции открытой рамки считывания (ОРС) гена.
[0090] Другая область-мишень включает 5'-нетранслируемую область (5'-НТО), обозначающую в данной области техники часть мРНК в 5'-направлении от инициаторного кодона и, таким образом, содержащую нуклеотиды между 5°-сайтом кэпирования и инициаторным кодоном мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). Еще одна область-мишень включает 3'-нетранслируемую область (3'-НТО), обозначающую в данной области техники часть мРНК в 3' -направлении от кодона терминации трансляции и, таким образом, содержащую нуклеотиды между код оном терминации трансляции и 3'-концом мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). 5'-сайт кэпирования мРНК содержит N7-метилированный остаток гуанозина, присоединенный к самому крайнему 5'-остатку мРНК посредством 5'-5'-трифосфатной связи. Область 5'-кэпа мРНК, как считают, включает собственно структуру 5'-кэпа, а также первых 50 нуклеотидов, прилегающих к сайту кэпирования. Другая область-мишень согласно настоящему изобретению представляет собой область 5'-кэпа.
[0091] Несмотря на то, что некоторые эукариотические мРНК-транскрипты прямо транслируются, многие из них содержат одну или более областей, известных как ʺинтроныʺ, которые вырезаются из транскрипта, прежде чем он подвергается трансляции. Остальные (и, таким образом, транслируемые) области известны как ʺэкзоныʺ, и они соединяются друг с другом с образованием непрерывной последовательности мРНК. В одном варианте реализации нацеливание на сайты сплайсинга, т.е. на места соединения интрон-экзон или места соединения экзон-интрон, особенно подходит в случаях, в которых аберрантный сплайсинг вовлечен в развитие заболевания или в которых сверхсинтез конкретного продукта сплайсинга вовлечен в развитие заболевания. Соединение в результате аберрантного слияния вследствие перестройки или делеции представляет собой другой вариант реализации сайта-мишени. мРНК-транскрипты, полученные в результате процесса сплайсинга двух (или более) мРНК из различных источников гена известны как ʺтранскрипты слиянияʺ. Интроны могут быть эффективно задействованы в качестве мишени с применением антисмысловых соединений, нацеленных на, например, ДНК или пре-мРНК.
[0092] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются с кодирующими и/или некодирующими областями полинуклеотида-мишени и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
[0093] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
[0094] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются со смысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
[0095] Альтернативные РНК-транскрипты могут быть получены из одной и той же геномной области ДНК. Эти альтернативные транскрипты в общем случае известны как ʺвариантыʺ. Конкретнее, ʺварианты пре-мРНКʺ представляют собой транскрипты, получаемые из одной и той же геномной ДНК, которые отличаются от других транскриптов, получаемых из этой же геномной ДНК, положением их либо старт-, либо стоп-кодона и содержат как интронные, так и экзонные последовательности.
[0096] После удаления одной или более экзонной или интроной областей или их частей в процессе сплайсинга варианты пре-мРНК становятся источниками меньших ʺвариантов мРНКʺ. Следовательно, варианты мРНК являются процессированными вариантами пре-мРНК, и каждый уникальный вариант пре-мРНК должен всегда давать уникальный вариант мРНК в результате сплайсинга. Эти варианты мРНК также известны как ʺальтернативные сплайс-вариантыʺ. Если сплайсинга варианта пре-мРНК не происходит, то вариант пре-мРНК идентичен варианту мРНК.
[0097] Варианты могут быть получены путем применения альтернативных сигналов для запуска или остановки транскрипции. Пре-мРНК и мРНК могут иметь более одного старт-кодона или стоп-кодона. Варианты, которые происходят из пре-мРНК или мРНК, использующих альтернативные старт-кодоны, известны как ʺальтернативные старт-вариантыʺ этих пре-мРНК или мРНК. Те транскрипты, которые используют альтернативный стоп-кодон, известны как ʺальтернативные стоп-вариантыʺ этих пре-мРНК или мРНК. Один конкретный тип альтернативного стоп-варианта представляет собой ʺполиА-вариантʺ, в котором множественные получаемые транскрипты являются результатом альтернативного выбора одного из ʺполиА-стоп-сигналовʺ транскрипционным аппаратом, что приводит к получению транскриптов, которые заканчиваются на уникальных полиА-сайтах. В контексте настоящего изобретения типы вариантов, описанные в настоящей заявке, также представляют собой варианты реализации нуклеиновых кислот-мишеней.
[0098] Области в целевой нуклеиновой кислоте, с которыми гибридизуются антисмысловые соединения, определяют как часть области-мишени длиной по меньшей мере 5 нуклеотидов, на которую нацелено активное антисмысловое соединение.
[0099] В то время как специфические последовательности некоторых типовых сегментов-мишеней приведены в настоящей заявке, как будет обнаружено специалистом в данной области техники, эти последовательности служат для иллюстрации и описания конкретных вариантов реализации в рамках настоящего изобретения. Дополнительные сегменты-мишени легко поддаются идентификации специалистом в данной области техники в свете настоящего описания.
[00100] Сегменты-мишени длиной 5-100 нуклеотидов, содержащие цепь из по меньшей мере пяти (5) последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов в пределах иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней, как полагают, также являются подходящими для нацеливания.
[00101] Сегменты-мишени могут включать последовательности ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов с 5'-конца одного из иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней (остальные нуклеотиды представляют собой последовательную цепь той же самой ДНК или РНК, начинающуюся непосредственно выше от 5'-конца сегмента-мишени и продолжающуюся в пределах от примерно 5 до примерно 100 нуклеотидов). Аналогично предпочтительные сегменты-мишени представлены последовательностями ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов с 3'-конца одного из иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней (остальные нуклеотиды представляют собой последовательную цепь той же самой ДНК или РНК, начинающуюся непосредственно ниже 3'-конца сегмента-мишени и продолжающуюся в пределах от примерно 5 до примерно 100 нуклеотидов). Специалист в данной области техники, имеющий в наличии сегменты-мишени, проиллюстрированные в настоящей заявке, будет способен без проведения лишних экспериментов идентифицировать далее предпочтительные сегменты-мишени.
[00102] Как только одну или более областей-мишеней, сегментов-мишеней или сайтов-мишеней идентифицируют, отбирают антисмысловые соединения, которые в достаточной степени комплементарны мишени, т.е. гибридизуются достаточно хорошо и с достаточной специфичностью с получением желаемого эффекта.
[00103] В вариантах реализации настоящего изобретения олигонуклеотиды связываются с антисмысловой цепью конкретной мишени. Олигонуклеотиды имеют длину по меньшей мере 5 нуклеотидов и могут быть синтезированы таким образом, что каждый олигонуклеотид нацелен на перекрывающиеся последовательности, так что олигонуклеотиды синтезируют для покрытия всей длины полинуклеотида-мишени. Указанные мишени также включают и кодирующие, и некодирующие области.
[00104] В одном варианте реализации предпочитают воздействовать на конкретные нуклеиновые кислоты антисмысловыми олигонуклеотидами. Нацеливание антисмыслового соединения нав конкретную нуклеиновую кислоту представляет собой многоступенчатый процесс. Процесс обычно начинается с идентификации последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой подлежит модулированию. Эта последовательность может представлять собой, например, клеточный ген (или мРНК, транскрибируемую на матрице этого гена), экспрессия которого связана с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или некодирующий полинуклеотид, такой как, например, некодирующая РНК (нкРНК).
[00105] Молекулы РНК могут быть классифицированы на (1) матричные РНК (мРНК), которые транслируются в белки, и (2) РНК, не кодирующие белки (нк РНК). нкРНК включают микроРНК, антисмысловые транскрипты и другие единицы транскрипции (ЕТ), содержащие высокую плотность стоп-кодонов и не имеющие каких-либо протяженных ʺоткрытых рамок считыванияʺ. Многие нкРНК, по-видимому, начинаются с сайтов инициации в 3'-нетранслируемых областях (3'-НТО) кодирующих белок локусов. нкРНК, как правило, редки и по меньшей мере половина из нкРНК, которые были просеквенированы Международным консорциумом по анализу РНК (FANTOM), по-видимому, не являются полиаденилированными. Большинство исследователей по очевидным причинам сфокусировали внимание на полиаденилированных мРНК, которые подвергаются процессингу и экспорту в цитоплазму. Недавно было показано, что набор неполиаденилированных ядерных РНК может быть очень большим и что многие такие транскрипты появляются из так называемых межгенных областей. Механизм, посредством которого нкРНК могут регулировать экспрессию генов, заключается в спаривании оснований с транскриптами-мишенями. РНК, которые функционируют за счет спаривания оснований, могут быть сгруппированы в (1) цис-кодируемые РНК, которые кодируются в одном и том же участке гена, но на противоположной цепи по отношению к РНК, на которые они воздействуют, показывая, таким образом, совершенную комплементарность их мишени, и (2) транс-кодируемые РНК, которые кодируются в участках хромосом, отличных от участков для РНК, на которые они воздействуют, и не показывают в совершенной степени потенциального спаривания оснований с их мишенями.
[00106] Без привязки к какой-либо конкретной теории, модификация антисмыслового полинуклеотида антисмысловыми олигонуклеотидами, описанными в настоящей заявке, может изменять экспрессию соответствующих смысловых информационных РНК. Однако такая регуляция может быть либо несогласованной (антисмысловой ʺнокдаунʺ приводит к повышению уровня информационной РНК), либо согласованной (антисмысловой ʺнокдаунʺ приводит к сопутствующему понижению уровня информационной РНК). В этих случаях антисмысловые олигонуклеотиды могут быть нацелены на перекрывающиеся или неперекрывающиеся части антисмыслового транскрипта, в результате чего происходит его ʺнокдаунʺ или секвестрирование. Кодирующие, а также некодирующие антисмысловые {молекулы} можно нацеливать одинаковым образом, и обе категории способны регулировать соответствующие смысловые транскрипты - либо согласованным, либо несогласованным образом. Стратегии, которые применяют для выявления новых олигонуклеотидов для взаимодействия с мишенями, могут быть основаны на ʺнокдаунеʺ антисмысловых РНК-транскриптов антисмысловыми олигонуклеотидами или на любых других способах модулирования желаемой мишени.
[00107] Стратегия 1: В случае несогласованной регуляции ʺнокдаунʺ антисмыслового транскрипта повышает экспрессию обычного (смыслового) гена. В случае, если этот ген кодирует известную или предполагаемую мишень для лекарственного средства, то ʺнокдаунʺ его антисмыслового эквивалента может предположительно имитировать действие агониста рецептора или стимулятора фермента.
[00108] Стратегия 2: В случае согласованной регуляции можно одновременно осуществить ʺнокдаунʺ как антисмыслового, так и смыслового транскриптов и тем самым добиться синергетического уменьшения экспрессии обычного (смыслового) гена. Если, например, антисмысловой олигонуклеотид применяют для достижения ʺнокдаунаʺ, тогда эта стратегия может быть применена для нацеливания одного антисмыслового олигонуклеотида на смысловой транскрипт и другим антисмысловым олигонуклеотидом на соответствующий антисмысловой транскрипт или единственным энергетически симметричным антисмысловым олигонуклеотидом, одновременно нацеленным на перекрывающиеся смысловые и антисмысловые транскрипты.
[00109] Согласно настоящему изобретению, антисмысловые соединения включают антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности (EGS), ммРНК соединения, одно- или двухцепочечные РНК-интерферирующие (РНКи) соединения, такие как ммРНК соединения, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени и модулируют ее функцию. Соответственно, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные соединения, РНК-подобные соединения или их смеси или могут представлять собой миметики одного или более из указанных соединений. Такие соединения могут представлять собой одноцепочечные, двухцепочечные, кольцевые или шпилькообразные олигомерные соединения и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания, некомплементарные положения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают в виде линейных соединений, но они могут быть соединены или получены иным способом для получения кольцевых и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать такие конструкты, как, например, две гибридизованных цепи, образующих полностью или частично двухцепочечное соединение или одиночную цепь с самокомплементарностью, достаточной для гибридизации и образования полностью или частично двухцепочечного соединения. Указанные две цепи могут быть связаны внутренними связями, имея свободные 3'- или 5'-концы, или могут быть связаны с образованием непрерывной шпилькообразной структуры или петли. Указанная шпилькообразная структура может содержать липкий конец либо на 5'-, либо на 3'-конце, образующий удлинение одноцепочечного характера. Указанные двухцепочечные соединения необязательно могут содержать липкие концы. Другие модификации могут включать конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, нуклеотидам в определенных положениях, сахарам в определенных положениях или к одной из межнуклеозидных связей. Альтернативно, указанные две цепи могут быть связаны посредством не-нуклеинового фрагмента или линкерной группы. Образованная только одиночной цепью дцРНК может принимать форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса. Таким образом, указанные дцРНК могут быть полностью или частично двухцепочечными. Специфическое модулирование экспрессии генов может быть достигнуто за счет стабильной экспрессии шпилек дцРНК в трансгенных клеточных линиях, однако, в некоторых вариантах реализации указанные экспрессия или функция генов увеличиваются. При образовании из двух цепей или одиночной цепи, принимающей форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса, указанные две цепи (или образующие дуплекс области одиночной цепи) представляют собой комплементарные цепи РНК, которые спариваются основаниями по Уотсону-Крику.
[00110] При попадании в систему, соединения согласно настоящему изобретению могут вызывать действие одного или нескольких ферментов или структурных белков по расщеплению или другим модификациям нуклеиновой кислоты-мишени или могут работать по механизму ʺзанятия положенияʺ (occupancy-based mechanism). В общем случае, нуклеиновые кислоты (в том числе олигонуклеотиды) могут быть описаны как ʺДНК-подобныеʺ (т.е. содержащие, как правило, один или более 2'-дезоксисахаров и, как правило, преимущественно Т, а не U основания) или ʺРНК-подобныеʺ (т.е. содержащие, как правило, один или более 2'-гидрокси- или 2'-модифицированных сахаров и, как правило, преимущественно U, а не Т основания). Спирали нуклеиновых кислот могут быть представлены структурами более чем одного типа, чаще всего А- и В-формами. Считают, что, в общем случае, олигонуклеотиды, которые имеют структуру, подобную В-форме, являются ʺДНК-подобнымиʺ, а олигонуклеотиды, которые имеют структуру, подобную А-форме, являются ʺРНК-подобнымиʺ. В некоторых (химерных) вариантах реализации антисмысловое соединение может содержать области как А-, так и В-формы.
[00111] В одном варианте реализации желаемые олигонуклеотиды или антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одно из следующего: антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, химерные антисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие модифицированные связи, интерферирующие РЖ (РНКи), малые интерферирующие РНК (ммРНК); микро интерферирующие РНК (микро-РНК); малые временные РНК (мвРНК); или короткие шпилечные РНК (кшРНК); малые РНК индуцированной активации гена (РНКа); малые активирующие РНК (маРНК) или их комбинации.
[00112] дцРНК может также активировать экспрессию генов, механизм, который получил название ʺмалые РНК индуцированной активации геновʺ или РНКа. дцРНК, нацеленные на промоторы генов, вызывают мощную транскрипционную активацию ассоциированных генов. РНКа была продемонстрирована в клетках человека с помощью синтетических дцРНК, называемых ʺмалые активирующие РНКʺ (маРНК). В настоящее время неизвестно, консервативна ли РНКа в других организмах.
[00113] Было обнаружено, что малые двухцепочечные РНК (дцРНК), такие как малые интерферирующие РНК (ммРНК) и микроРНК (микро-РНК), запускают эволюционно консервативный механизм, известный как РНК-интерференция (РНКи). РНКи неизбежно ведет к выключению (сайленсингу) генов за счет ремоделирования хроматина, что приводит к подавлению транскрипции, деградации комплементарной мРНК или блокированию трансляции белка. Тем не менее, в примерах, подробно описанных в последующей экспериментальной части, показано, что олигонуклеотиды вызывают увеличение экспрессии и/или функции полинуклеотидов сиалидазы 4 NEU4 и кодируемых ими продуктов. дцРНК может также выступать в качестве малых активирующих РНК (маРНК). Без привязки к какой-либо конкретной теории, посредством нацеленного действия на последовательности в промоторах генов-мишеней маРНК индуцируют экспрессию гена-мишени в результате явления, называемого дцРНК индуцированной транскрипционной активацией (РНКа).
[00114] В другом варианте реализации ʺпредпочтительные сегменты-мишениʺ, определенные в настоящей заявке, можно применять для отбора дополнительных соединений, которые модулируют экспрессию полинуклеотидов сиалидазы 4 NEU4. ʺМодуляторыʺ представляют собой соединения, понижающие или повышающие экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей ген сиалидазы 4 NEU4, и содержащие по меньшей мере 5-нуклеотидный участок, комплементарный предпочтительному сегменту-мишени. Способ отбора включает этапы осуществления контакта предпочтительного сегмента-мишени молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей смысловые или природные антисмысловые полинуклеотиды NEU4 с одним или несколькими потенциальными модуляторами, и отбор одного или более потенциального модулятора, понижающего или повышающего экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды NEU4, например, SEQ ID NO: 8-11. После того, как подтверждена способность потенциального(ых) модулятора(ов) к модулированию (например, понижению или повышению) экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды NEU4, указанный модулятор можно применять для дальнейших исследований функций полинуклеотидов NEU4, или для применения в качестве агента для исследований, диагностики или лечения согласно настоящему изобретению.
[00115] Нацеленное воздействие при помощи природной антисмысловой последовательности предпочтительно модулирует функцию гена-мишени. Например, гена NEU4 (в частности, под номером последовательности в базе данных NCBI NM_001167600). В одном варианте реализации мишень представляет собой антисмысловой полинуклеотид гена NEU4. В одном варианте реализации антисмысловой олигонуклеотид нацелен на смысловые и/или природные антисмысловые последовательности полинуклеотидов NEU4 (в частности, под номером последовательности в базе данных NCBI NM_001167600), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу, и указанные мишени включают кодирующие и некодирующие участки антисмысловых и/или смысловых полинуклеотидов NEU4.
[00116] Предпочтительные целевые сегменты согласно настоящему изобретению могут также быть скомбинированы с соответствующими комплементарными антисмысловыми соединениями, предложенными в настоящем изобретении, с формированием стабилизированных двухцепочечных (дуплексных) олигонуклеотидов.
[00117] В данной области техники показано, что такие двухцепочечные олигонуклеотидные фрагменты модулируют экспрессию мишеней и регулируют трансляцию, а также процессинг РНК, посредством антисмыслового механизма. Кроме того, указанные двухцепочечные фрагменты могут подвергаться химическим модификациям. Например, показано, что такие двухцепочечные фрагменты ингибируют мишень посредством классической гибридизации антисмысловой цепи указанного дуплекса с мишенью, запуская тем самым ферментное расщепление мишени.
[00118] В одном варианте реализации антисмысловой олигонуклеотид нацелен на полинуклеотиды сиалидазы 4 NEU4 (в частности, под номером последовательности в базе данных NCBI NM_001167600), их варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу.
[00119] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула нуклеиновой кислоты не ограничивается собственно геном NEU4 и может быть представлена любыми его полинуклеотидными вариантами и любыми полинуклеотидам, которые продуцируются, влияют, сильно воздействуют или являются следствием или относятся к продуктам экспрессии NEU4 и/или любым его изоформам.
[00120] В одном варианте реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов NEU4, например, полинуклеотидов, представленных в последовательностях SEQ ID NOS: 2-7, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены последовательностями SEQ ID NOS: 8-11.
[00121] В одном варианте реализации указанные олигонуклеотиды комплементарны или связываются с нуклеотидными последовательностями антисмысловых последовательностей для гена NEU4, включающими, не ограничиваясь перечисленными, некодирующие смысловые и/или антисмысловые последовательности, связанные с полинуклеотидами NEU4, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул NEU4. [00122] В одном варианте реализации указанные олигонуклеотиды комплементарны нуклеотидным последовательностям природных антисмысловых последовательностей для гена NEU4, соответствующим SEQ ID NOS: 2-7, или связываются с ними, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул NEU4.
[00123] В одном варианте реализации олигонуклеотиды содержат последовательности, состоящие по меньшей мере из 5 последовательных нуклеотидов последовательностей SEQ ID NOS: 8-11, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул NEU4.
[00124] Указанные полинуклеотидные мишени включают NEU4, в том числе представителей этого семейства, варианты NEU4; мутанты NEU4, в том числе однонуклеотидный полиморфизм; некодирующие последовательности NEU4; аллели NEU4; видовые варианты, фрагменты и т.п. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу.
[00125] В одном варианте реализации олигонуклеотид, который нацелен на полинуклеотиды NEU4, включает: антисмысловую РНК, интерферирующую РНК (мРНК), малую интерферирующую РНК (ммРНК); микро интерферирующую РНК (микроРНК), малую, временную РНК (мвРНК), или короткую шпилечную РНК (кшРНК); малую РНК-индуцированной активации гена (РНКа), или малую активирующую РНК (маРНК).
[00126] В одном варианте реализации направленное воздействие с помощью олигонуклеотидов на полинуклеотиды сиалидазы 4 (NEU4), например, соответствующие SEQ ID NOS: 2-11, модулируют экспрессию или функцию этих мишеней. В одном варианте реализации экспрессия или функция увеличивается по сравнению с контролем. В одном варианте реализации экспрессия или функция подавляется по сравнению с контролем.
[00127] В одном варианте реализации антисмысловые соединения включают последовательности, соответствующие SEQ ID NOS: 8-11. Такие олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированный нуклеотид, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п.
[00128] В одном варианте реализации последовательности SEQ ID NOS: 8-11 содержат один или более ЗНК-нуклеотид. В Таблице 1 приведены типовые антисмысловые олигонуклеотиды, подходящие для применения в способах согласно настоящему изобретению.
Таблица 1:
ID последовательности Наименование антисмысловой последовательности Последовательность
SEQ ID NO: 8 CUR-1789 G*G*G*T*C*T*G*T*G*G*T*C*G*G*A*G*T*C*T*T
SEQ ID NO: 9 CUR-1790 G*G*C*A*G*A*T*T*C*A*G*G*G*C*A*T*G*G*G*A
SEQ ID NO: 10 CUR-1791 G*A*C*C*T*A*C*C*T*G*T*T*T*C*C*C*A*C*C*A*C
SEQ ID NO: 11 CUR-1792 X*G*T*C*C*C*A*G*C*A*C*A*G*C*C*C*T*T*G*T
[00129] Модулирование нужной целевой нуклеиновой кислоты может быть осуществлена несколькими известными в данной области техники способами. Например, антисмысловые олигонуклеотиды, ммРНК и т.д. Молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты (например, рибозимы) представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, способные катализировать одну или несколько разнообразных реакций, включая способность многократно расщеплять другие отдельные молекулы нуклеиновой кислоты чувствительным к последовательности нуклеиновых оснований сиквенс-специфичным образом. Такие молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты могут применяться, например, для нацеленного действия на практически любой РНК-транскрипт.
[00130] Из-за сиквенс-специфичности транс-расщепляющие молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты являются многообещающими потенциальными терапевтическими агентами для лечения заболеваний человека. Ферментативные молекулы нуклеиновых кислот могут быть сконструированы для расщепления конкретных РНК мишеней в общем пуле клеточной РНК. Такое расщепление делает указанные мРНК нефункциональными и отменяет экспрессию белка с этой РНК. Таким образом, синтез белка, связанного с болезненным состоянием может быть избирательно заблокирована.
[00131] В общем случае, ферментативные нуклеиновые кислоты с активностью по расщеплению РНК действуют, во-первых, за счет связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит посредством мишень-связывающего фрагмента ферментативной нуклеиновой кислоты, который располагается в непосредственной близости к ферментативному фрагменту указанной молекулы, расщепляющему целевую РНК. Таким образом, указанная ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает целевую РНК, а потом связывается с ней посредством комплементарного спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком ферментативно расщепляет целевую РНК. Стратегическое расщепление такой целевой РНК уничтожит ее способность к прямому синтезу кодируемого белка. После того, как ферментативная нуклеиновая кислота связала и расщепила целевую РНК, она отсоединяется от этой РНК, освобождается для другой мишени и может повторно связывать и расщеплять новые мишени.
[00132] Ряд подходов, таких как in vitro стратегии отбора (извлечения) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, В 205, 435), были использованы для получения новых нуклеиновых катализаторов, способных катализировать различные реакции, такие как расщепление и лигирование фосфодиэфирных связей и амидных связей.
[00133] Получение рибозимов, обладающих оптимальной каталитической активностью, внесет существенный вклад в любую стратегию, включающую применение РНК-расщепляющих рибозимов для регулирования генной экспрессии. Рибозим типа ʺголовка молоткаʺ, например, функционирует со скоростью каталитической реакции (kcat) приблизительно 1 мин-1 в присутствии насыщающих (10 мМ) концентраций кофактора Mg2+. Показано, что синтетический ʺРНК-лигазныйʺ рибозим катализирует соответствующую реакцию самоизменения со скоростью приблизительно 100 мин-1. Кроме того, известно, что определенные модифицированные рибозимы типа ʺголовка молотаʺ, имеющие связывающие субстрат состоящие из ДНК ʺручкиʺ, катализируют расщепление РНК со скоростями оборотов, достигающими 100 мин-1. Наконец, замещение специфического остатка каталитического ядра ʺголовки молотаʺ определенными нуклеотидными аналогами дает модифицированные рибозимы, демонстрирующие повышение скорости каталитической реакции вплоть до 10-кратного. Эти результаты показывают, что рибозимы могут обеспечивать химические преобразования с каталитическими скоростями, значительно превышающими таковые, демонстрируемые in vitro большинством природных саморасщепляющих рибозимов. В этом случае возможно, что структуры некоторых саморасщепляющих рибозимов можно оптимизировать, чтобы получить максимальную каталитическую активность, или что могут быть получены совершенно новые РНК мотивы, демонстрирующие значительно увеличенные скорости фосфодиэфирного расщепления РНК.
[00134] Внутримолекулярное расщепление РНК-субстрата РНК катализатором, соответствующим модели ʺголовка молотаʺ, впервые было показано в 1987 (Uhlenbeck, О.С. (1987) Nature, 328: 596-600). Указанный РНК катализатор был выделен и вступал в реакцию с различными РНК-молекулами, подтверждая, что он действительно является катализатором.
[00135] Каталитические РНК, сконструированные на основе мотива ʺголовка молотаʺ, применялись для расщепления специфических целевых последовательностей осуществлением подходящего спаривания оснований в каталитической РНК для обеспечения необходимого спаривания оснований с целевыми последовательностями. Это позволило применить указанную каталитическую РНК для расщепления специфических целевых последовательностей и показать, что каталитические РНК, сконструированные согласно модели ʺголовка молотаʺ, предположительно способны расщеплять специфические субстратные РНК in vivo.
[00136] РНК-интерференция (РНКи) стала мощным инструментом модулирования генной экспрессии у млекопитающих и в клетках млекопитающих. Этот подход предполагает получение малых интерферирующих РНК (ммРНК) в виде самой РНК или в виде ДНК, с применением экспрессионной плазмиды или вируса и кодирующей последовательности для малых шпилечных РНК, которые процессируются в ммРНК. Эта система обеспечивает эффективный транспорт пре-ммРНК в цитоплазму, где они проявляют активность, и позволяет применение регулируемых и тканеспецифичных промоторов генной экспрессии
[00137] В одном варианте реализации олигонуклеотид или антисмысловое соединение содержит олигомер или полимер рибонуклеиновой кислоты (РНК) и/или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их миметик, химеру, аналог или гомолог. Этот термин включает олигонуклеотиды, состоящие из встречающихся в природе нуклеотидов, сахаров и ковалентных межнуклеозидных (скелетных) связей, а также олигонуклеотиды, содержащие не встречающиеся в природе фрагменты, функционирующие сходным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительнее нативных форм, так как они обладают необходимыми свойствами, такими как, например, увеличенное поглощение клетками, увеличенная связывающая способность в отношении целевой нуклеиновой кислоты и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
[00138] Согласно настоящему изобретению указанные олигонуклеотиды или ʺантисмысловые соединенияʺ включают антисмысловые олигонуклеотиды (например, РНК, ДНК, их миметики, химеры, аналоги или гомологи), рибозимы, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), ммРНК соединения, одно- или двухцепочечные РНК-интерферирующие (РНКи) соединения, такие как ммРНК соединения, каРНК, аРНК, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты и модулируют ее функцию. Соответственно, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные соединения, РНК-подобные соединения или их смеси, или могут представлять собой миметики одного или более из указанных соединений. Такие соединения могут представлять собой одноцепочечные, двухцепочечные, кольцевые или шпилькообразные олигомерные соединения и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания, некомплементарные положения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают в виде линейных соединений, но они могут быть объединены или получены иным способом для получения кольцевых или и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать такие конструкты, как, например, две гибридизованных цепи, формирующих полностью или частично двухцепочечное соединение, или одиночная цепь с достаточной самокомплементарностью для гибридизации и формирования полностью или частично двухцепочечного соединения. Указанные две цепи могут быть связаны внутренними связями, имея свободные 3' или 5' концы, или могут связываться с образованием непрерывной шпилькообразной структуры или петли. Указанная шпилькообразная структура может содержать липкий конец на 5' или на 3' конце, образующий удлинение одноцепочечного характера. Указанные двухцепочечные соединения в некоторых случаях могут содержать липкие концы. Другие модификации могут включать конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, нуклеотидам в определенных положениях, сахарам в определенных положениях или к одной из межнуклеозидных связей. Как вариант, указанные две цепи могут быть связаны посредством не-нуклеинового фрагмента или линкерной группы. Сформированная одиночной цепью дцРНК может принимать форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса. Таким образом, указанные дцРНК могут быть полностью или частично двухцепочечными. Специфическое модулирование генной экспрессии может быть достигнуто стабильной экспрессией дцРНК-шпилек в трансгенных клеточных линиях. При формировании из двух цепей или одиночной цепи, принимающей форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с формированием дуплекса, указанные две цепи (или формирующие дуплекс участки одиночной цепи) представляют собой комплементарные цепи РНК, которые спариваются по Уотсону-Крику.
[00139] При введении в систему соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут приводить к активации одного или более ферментов или структурных белков, влияя на расщепление или иные модификации целевой нуклеиновой кислоты, либо могут действовать через механизмы ʺзаполненияʺ. Как правило, нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть названы ʺДНК-подобнымиʺ (т.е., как правило, содержащими один или более 2'-дезокси-сахар и, как правило, преимущественно Т, а не U, основания) или ʺРНК-подобнымиʺ (т.е., как правило, содержащими один или более 2'-гидроксил или 2'-модифицированные сахара и, как правило, преимущественно Т, а не U, основания). Спирали нуклеиновых кислот могут быть представлены структурами более чем одного типа, чаще всего А- и В-формами. Предполагают, что, как правило, олигонуклеотиды, имеющие структуру типа В-формы, ʺДНК-подобныʺ, а имеющие структуру типа А-формы, ʺРНК-подобныʺ. Согласно некоторым вариантам реализации (с химерами) антисмысловое соединение может содержать участки как А-, так и В-формы.
[00140] Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению могут содержать антисмысловой фрагмент приблизительно от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов (т.е. приблизительно от 5 до приблизительно 80 связанных нуклеозидов) длиной. Это относится к длине указанной антисмысловой цепи или части указанного антисмыслового соединения. Иными словами, одноцепочечное антисмысловое соединение, предложенное в настоящем изобретении, содержит от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов, а двухцепочечное антисмысловое соединение, предложенное в настоящем изобретении, (такие как, например, дцРНК) содержит смысловую и антисмысловую цепь или фрагменты от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов длиной. Специалисту в данной области техники будет ясно, что под этим понимаются антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного.
[00141] В одном варианте реализации антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, содержат антисмысловые фрагменты 10-50 нуклеотидов длиной. Специалисту в данной области техники будет ясно, что сюда включены олигонуклеотиды, содержащие антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, или 50 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного. Согласно некоторым вариантам реализации длина указанных олигонуклеотидов составляет 15 нуклеотидов.
[00142] В одном варианте реализации антисмысловые или олигонуклеотидные соединения, предложенные в настоящем изобретении, содержат антисмысловые фрагменты, составляющие от 12 или 13 до 30 нуклеотидов в длину. Специалисту в данной области техники будет ясно, что сюда включены антисмысловые соединения, содержащие антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного.
[00143] В одном варианте реализации олигомерные соединения, предложенные в настоящем изобретении, также включают варианты, в которых в одном или нескольких положениях нуклеотидов указанного соединения присутствуют различающиеся основания. Например, если первый нуклеотид представляет собой аденозин, могут быть получены варианты, которые содержат тимидин, гуанозин или цитидин в этом положении. Это может быть осуществлено в любом положении указанного антисмыслового или ддРНК-соединения. Такие соединения затем тестируют с применением способов, описанных в настоящей заявке, для определения их способности ингибировать экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
[00144] Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности между указанным антисмысловым соединением и мишенью составляет от приблизительно 40% до приблизительно 60%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 60% до приблизительно 70%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 70% до приблизительно 80%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 80% до приблизительно 90%. Согласно некоторым вариантам реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляют приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.
[00145] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды, такие как, например, молекулы нуклеиновой кислоты, представленные в последовательностях SEQ ID NOS: 8-11, включают одну или более чем одну замену или модификацию. Согласно одному из вариантов реализации указанные нуклеотиды заменены закрытыми нуклеиновыми кислотами (ЗНК).
[00146] В одном варианте реализации указанные олигонуклеотиды нацеленно взаимодействуют с одним или более участком молекул нуклеиновой кислоты смысловых и/или антисмысловых кодирующих и/или некодирующих последовательностей, связанных с геном NEU4, и последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 1-7. Олигонуклеотиды также нацелены на перекрывающиеся участки, соответствующие SEQ ID NOS: 1-7.
[00147] Некоторые предпочтительные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, представляют собой химерные олигонуклеотиды. ʺХимерные олигонуклеотидыʺ или ʺхимерыʺ в контексте настоящего изобретения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат два или более химически отличных участка, каждый из которых состоит по меньшей мере из одного нуклеотида. Такие олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере один участок модифицированных нуклеотидов, обеспечивающий одно или более полезное свойство (такое как, например, увеличенная устойчивость к нуклеазам, увеличенное поглощение клетками, повышенная связывающая способность по отношению к мишени) и участок, который представляет собой субстрат для ферментов, способных к расщеплению РНК.-ДНК или РНК:РНК гибридов. Как пример, РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет РНК-цепь РНК:ДНК дуплекса. Активация РНКазы Н, таким образом, приводит к расщеплению целевой РНК, тем самым значительно повышая эффективность антисмыслового модулирования генной экспрессии. Соответственно, при использовании химерных олигонуклеотидов сопоставимые результаты часто могут быть получены с более короткими олигонуклеотидами, по сравнению с использованием фосфоротиоатных дезоксиолигонуклеотидов, гибридизующихся с тем же целевым участком. Расщепление целевой РНК можно определять стандартным способом посредством гель-электрофореза и, при необходимости, сопутствующих методик гибридизации нуклеиновых кислот, известных в данной области техники. В одном варианте реализации химерный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один участок, модифицированный для увеличения способности связываться с мишенью, и, как правило, участок, функционирующий как субстрат РНКазы Н. Связывающая способность олигонуклеотида по отношению к мишени (в данном случае, нуклеиновой кислоте, кодирующей ras) определяется стандартным способом измерением температуры плавления пары олигонуклеотид/мишень, представляющим собой температуру, при которой олигонуклеотид и мишень диссоциируют; диссоциацию определяют спектрофотометрически. Чем выше температура плавления, тем больше связывающая способность указанного олигонуклеотида по отношению к мишени.
[00148] Химерные антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде составных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или миметиков олигонуклеотидов согласно приведенным выше описаниям. Такие соединения также известны в данной области техники как гибриды или гапмеры. Примеры патентов США, в которых описано получение таких гибридных структур, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356; и 5700922, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00149] В одном варианте реализации модифицируемый участок указанного олигонуклеотида содержит по меньшей мере один нуклеотид, модифицированный по 2' положению сахара, наиболее предпочтительно 2'-O-алкил, 2'-O-алкил-O-алкил или 2'-фтор-модифицированный нуклеотид. В другом варианте реализации РНК модификации включают 2'-фтор, 2'-амино и 2'-O-метильные модификации рибозы пиримидинов, лишенные азотистого основания остатки или обратное основание на 3'-конце указанной РНК. Такие модификации олигонуклеотидов осуществляют стандартными способами; показано, что такие олигонуклеотиды имеют более высокую температуру плавления (т.е. большую способность связываться с мишенью), чем 2'-дезоксиолигонуклеотиды, относительно определенной мишени. В результате такой повышенной связывающей способности значительно усиливается ингибирование генной экспрессии РНКи-олигонуклеотидом. РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, расщепляющую РНК цепь РНК:ДНК дуплексов; активация этого фермента, таким образом, приводит к расщеплению целевой РНК, и, следовательно, может значительно увеличивать эффективность РНКи ингибирования. Расщепление целевой РНК может быть подтверждено обычным способом посредством гель-электрофореза. В одном варианте реализации указанный химерный олигонуклеотид также модифицирован для увеличения устойчивости к нуклеазе. Клетки содержат множество экзо- и эндонуклеаз, способных разлагать нуклеиновые кислоты. Показано, что некоторые нуклеотидные и нуклеозидные модификации придают олигонуклеотиду, в состав которого они входят, большую устойчивость к нуклеазному расщеплению по сравнению с нативным олигодезоксинуклеотидом. Устойчивость к нуклеазам измеряют обычным способом, инкубируя олигонуклеотиды с клеточными экстрактами или растворами с выделенными нуклеазами и измеряя содержание интактных олигонуклеотидов спустя определенное время, как правило, посредством гель-электрофореза. Олигонуклеотиды, модифицированные для увеличения устойчивости к нуклеазам, остаются интактными на протяжении более длительного времени по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами. Показано, что ряд модификаций олигонуклеотидов усиливают или придают им устойчивость к нуклеазам. Олигонуклеотиды, которые содержат по меньшей мере одну фосфоротиоатную модификацию, на настоящий момент более предпочтительны. В некоторых случаях модификации олигонуклеотидов, усиливающие способность связываться с мишенью также, независимым образом, способны повышать устойчивость к нуклеазам.
[00150] Специфические примеры некоторых предпочтительных олигонуклеотидов, предусмотренных настоящим изобретением, включают содержащие модифицированные остовы, например, фосфоротиоаты, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, алкильные с короткой цепью или циклоалкильные связи между сахарами или гетероатомные с короткой цепью или гетероциклические связи между сахарами. Наиболее предпочтительными являются олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остовами и с гетероатомными остовами, в частности, СН2--NH--O--CH2, CH, --N(CH3)--O--CH2 [известный как метилен(метилимино) или ММ1 остов], СН2--O--N(СН3)--СН2, СН2--N(CH3)--N(СН3)--СН2 и O--N(СН3)--СН2--СН2 остовы, где нативный фосфодиэфирный остов представлен в виде O--P--O--CH,). Амидные остовы, описанные в De Mesmaeker et al. (1995) Асе. Chem. Res. 28: 366-374, также являются предпочтительными. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, содержащие морфолиновые остовы (Summerton and Weller, патент США 5034506). В другом варианте реализации, таком как остов на основе пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), фосфодиэфирный остов олигонуклеотида заменен полиамидным остовом, нуклеотиды связаны прямо или непрямо с азотными атомами азагрупп полиамидного остова. Олигонуклеотиды могут также содержать один или более фрагмент замещенного сахара. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей в положении 2': ОН, SH, SCH3, F, OCN, ОСН3, O(CH2)nCH3, O(CH2)nNH2 или O(CH2)nCH3, где n принимает значения от 1 до приблизительно 10; C1-C10 низшие алкилы, алкоксиалкокси, замещенные низшие алкилы, алкарил или аралкил; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; О--, S--, или N-алкил; О--, S--, или N-алкенил; SOCH3; SO2 СН3; ONO2; NO2; N3; NH2; гетероциклоалкил; гетероциклоалкарил; аминоалкиламино; полиалкиламино; замещенные силилы; РНК расщепляющую группу; репортерную группу; интеркалятор; группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида; или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-метоксиэтокси [2'-O-СН2СН2ОСН3, также известный как 2'-O-(2-метоксиэтил)]. Другие предпочтительные модификации включают 2-метокси (2'--O--СН3), 2'-пропокси (2'-OCH2CH2CH3) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации могут быть также осуществлены в других положениях олигонуклеотида, в частности, по 3' положению сахара 3' концевого нуклеотида и 5' положению 5' концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики сахаров, такие как циклобутилы, вместо пентофуранозильной группы.
[00151] Олигонуклеотиды могут также содержать, дополнительно или альтернативно, модификации или замены нуклеинового основания (часто называемого в данной области техники просто ʺоснованиемʺ). Используемые в настоящей заявке термины ʺнемодифицированныеʺ или ʺприродныеʺ нуклеотиды включают аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают нуклеотиды, обнаруживаемые в природных нуклеиновых кислотах редко или временно, например, гипоксантин, 6-метиладенин, 5-Me пиримидины, в частности, 5-метилцитозин (также называемый 5-метил-2' дезоксицитозин и часто упоминаемый в данной области техники как 5-Ме-С), 5-гидроксиметилцитозин (ГМЦ), гликозил ГМЦ и гентобиозил ГМЦ, а также синтетические нуклеотиды, например, 2-аминоаденин, 2-(метиламино)аденин, 2-(имидазолилалкил)аденин, 2-(аминоалкиламино)аденин или другие гетерозамещенные алкиладенины, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 5-бромурацил, 5-гидроксиметилурацил, 8-азагуанин, 7-деазагуанин, N6 (6-аминогексил)аденин и 2,6-диаминопурин. ʺУниверсальноеʺ основание из известных в данной области техники, например, инозин, может также быть включено. Показано, что 5-Ме-С замещения увеличивают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С и на настоящий момент являются предпочтительными замещениями оснований.
[00152] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, включает химическое связывание с указанным олигонуклеотидом одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, увеличивающих активность или поглощение клетками указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты включают, не ограничиваясь перечисленными, липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, фрагмент холестерила, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту. Олигонуклеотиды, содержащие липофильные фрагменты, и способы получения таких олигонуклеотидов известны в данной области техники, см., например, патенты США №5138045, 5218105 и 5459255.
[00153] Необязательно, чтобы все положения конкретного нуклеотида были модифицированы единообразно, и на самом деле в одном олигонуклеотиде, или даже в одном нуклеозиде в составе олигонуклеотида может содержаться более одной из упомянутых выше модификаций. Настоящее изобретение также включает олигонуклеотиды, которые представляют собой химерные олигонуклеотиды согласно данному выше определению.
[00154] В другом варианте реализации молекула нуклеиновой кислоты, предложенная в настоящем изобретении, конъюгирована с другим фрагментом, включая, но не ограничиваясь перечисленными, лишенные оснований нуклеотиды, полиэфиры, полиамины, полиамиды, пептиды, углеводороды, липиды или полиуглеводородные соединения. Специалистам в данной области техники будет ясно, что такие молекулы могут быть связаны с любым одним или более чем одним нуклеотидом, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, в нескольких положениях на сахаре, основании или фосфатной группе.
[00155] Олигонуклеотиды, применяемые согласно настоящему изобретению, могут быть удобно и просто получены с применением общеизвестной техники твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза коммерчески доступно от ряда поставщиков, включая Applied Biosystems. Можно также применять любые другие способы такого синтеза; фактический синтез указанного олигонуклеотида не представляет трудностей для среднего специалиста в данной области техники. Также общеизвестна возможность применения сходных методик для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоатные и алкилатные производные. Также общеизвестна возможность применения сходных техник и коммерчески доступных модифицированных амидитов и продуктов на основе стекла с контролируемым размером пор (CPG), таких как биотин-, флуоресцеин-, акридин- или псорален-модифицированные амидиты и/или CPG (доступные от Glen Research, Sterling VA) для синтеза флуоресцентно меченых, биотинилированных или других модифицированных олигонуклеотидов, таких как холестерин-модифицированные олигонуклеотиды.
[00156] В соответствии с настоящим изобретением подразумевается применение модификаций, например, применение мономеров ЗНК для усиления силы, специфичности и продолжительности действия и расширение диапазона путей введения олигонуклеотидов, состоящих из конкретных компонентов, таких как МОЭ, АНК, ФАНК, ФТ и т.д. Это может быть достигнуто замещением некоторых мономеров в конкретных олигонуклеотидах ЗНК-мономерами. ЗНК-модифицированный олигонуклеотид может иметь размер, соответствующий исходному соединению, или может быть больше, либо, предпочтительно, меньше. Предпочтительно, чтобы такие ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды содержали менее чем приблизительно 70%, более предпочтительно менее чем приблизительно 60%, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 50% мономеров ЗНК, и чтобы их размеры составляли приблизительно от 5 до 25 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 12 до 20 нуклеотидов.
[00157] Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы включают, не ограничиваясь перечисленными: фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая 3'алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая 3'-амино фосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, и боранофосфаты, включающие нормальные 3'-5' связи, 2'-5' связанные аналоги, и имеющие обращенную полярность, где соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Различные соли, смешанные соли и свободные кислоты также включены.
[00158] Примеры патентов США, раскрывающих получение вышеприведенных фосфорсодержащих связей, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563 253; 5571799; 5587361; и 5625050, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00159] Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы, не включающие атомы фосфора, образованы алкильными с короткой цепью или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или более гетероатомными с короткой цепью или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (образованными частично сахаром нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, содержащие смешанные N, О, S и СН2-компоненты.
[00160] Примеры патентов США, содержащие указание по получению описанных выше олигонуклеотидов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; и 5677439, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00161] В других предпочтительных миметиках олигонуклеотидов и сахара, и межнуклеозидная связь, т.е. остов, нуклеотидных единиц, заменены новыми группами. Основания сохраняют для гибридизации с подходящим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно из таких олигомерных соединений, олигонуклеотидный миметик, продемонстрировавший прекрасную способность к гибридизации, называют пептидной нуклеиновой кислотой (ПНК). В ПНК-соединениях сахарный остов олигонуклеотида заменен амидсодержащим остовом, например, аминоэтилглициновым остовом. Основания нуклеиновых кислот сохранены и связаны прямо или непрямо с азотными атомами азагрупп амидной части остова. Примеры патентов США, в которых описано получение ПНК-соединений, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5539082; 5714331; и 5719262, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. Дальнейшее описание ПНК-соединений можно найти у Nielsen, et al. (1991) Science 254, 1497-1500.
[00162] В одном варианте реализации изобретения олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеозиды с гетероатомными остовами, и в частности- CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N-(CH3)-O-CH2-, известным как метилен (метилимино) или ММ1 остов, - СН2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3) СН2- и -O-N(CH3)-CH2-CH2-, где нативный фосфодиэфирный остов представлен как -O-Р-O-СН2- согласно упомянутому выше патенту США 5489677, и амидные остовы согласно упомянутому выше патенту США 5602240. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, содержащие морфолиновые остовы согласно вышеупомянутому патенту США 5034506.
[00163] Модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать один или более фрагмент замещенного сахара. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей по положению 2': ОН; F; О-, S-, или N-алкил; О-, S-, или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил; или О алкил-О-алкил, где указанные алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный C1-C10 алкил или C2-C10 алкенил и алкинил. В частности, предпочтительными являются O(СН2)n OmCH3, O(CH2)n, ОСН3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2)nON(CH3)2, где n и m могут принимать значения от 1 до приблизительно 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей по положению 2': С→СО, (низшие алкилы, замещенные низшие алкилы, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенные силилы, РНК расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида, или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-O-CH2CH2OCH3, также известную как 2'-O-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЭ), т.е. алкоксиалкокси группу. Еще одна предпочтительная модификация включает 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е., O(CH2)2ON(CH3)2 группу, также известную как 2-ДМАОЭ, согласно описанию в приведенных ниже в настоящей заявке примерах, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известной в данной области техники как 2'-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-ДМАЭОЭ), т.е., 2'-O-CH2-O-CH2-N(СН2)2.
[00164] Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси (2'-OCH3), 2'-аминопропокси (2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации могут быть также осуществлены в других положениях олигонуклеотида, в частности, по 3' положению сахара 3' концевого нуклеотида или в 2'-5'связанных олигонуклеотидах и 5' положению 5' концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики сахаров, например, циклобугильные фрагменты вместо пентофуранозильного сахара. Примеры патентов США, в которых описано получение таких модифицированных сахарных структур, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; и 5700920, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00165] Олигонуклеотиды могут также содержать модифицированные или замещенные нуклеиновые основания (часто называемое в данной области техники просто ʺоснованияʺ). В контексте настоящей заявки ʺнемодифицированныеʺ или ʺприродныеʺ нуклеотиды включают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают другие синтетические и природные нуклеотиды, такие как 5-метилцитозин (5-me-С), 5-гидроксиметил цитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил урацил и цитозин, 6-азо урацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдо-урацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
[00166] Далее, нуклеотиды включают описанные в патенте США 3687808, описанные в 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', стр.858-859, Kroschwitz, J.l., ed. John Wiley & Sons, 1990, описанные у Engllsch et al., 'Angewandle Chemie, international Edition', 1991, 30, стр.613, и описанные у Sanghvl, Y.S., Chapter 15, 'Antlsense Research and Applications', стр.289-302, Crooke, S.T. и Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидов подходят, в частности, для увеличения связывающей способности олигомерных соединений, предложенных в настоящем изобретении. Такие включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и 0-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. 5-метилцитозиновые замещения, как было показано, повышают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°C (Sanghvl, Y.S., Crooke, S.T., Lebleu, В., eds, 'Antlsense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278) и на настоящий момент являются предпочтительными замещениями оснований, в частности, в комбинации с 2'-O-метоксиэтиловыми модификациями сахаров.
[00167] Примеры патентов США, в которых описано получение вышеупомянутых модифицированных нуклеотидов, а также других модифицированных нуклеотидов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 3687808, а также 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5596091; 5614617; 5750692 и 5681941, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00168] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, подразумевает химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагмента или конъюгата, стимулирующего активность, распределение в клетках или поглощение клетками указанного олигонуклеотида.
[00169] Такие фрагменты содержат, не ограничиваясь перечисленными, липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, холевая кислота, тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-гас-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-гас-глицеро-3-Н-фосфонат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, или октадециламиновый или гексиламино-карбонил-t оксихолестериновый фрагмент.
[00170] Примеры патентов США, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00171] Поиск новых лекарственных средств: Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут также применяться для поиска новых лекарств и валидации мишеней. Настоящее изобретение включает применение описанных в настоящей заявке соединений и предпочтительных целевых сегментов при поиске новых лекарственных средств для выяснения взаимосвязей, существующих между полинуклеотидами сиалидазы 4 (NEU4) и болезнью, фенотипом или состоянием. Такие способы включают обнаружение или модулирование полинуклеотидов NEU4, включая осуществление контакта образца, ткани, клетки или организма с соединениями, предложенными в настоящем изобретении, измерение уровня нуклеиновой кислоты или белка полинуклеотидов NEU4 и/или оценка соответствующего фенотипического или химического конечного состояния через некоторое время после лечения, и, в некоторых случаях, сравнение измеряемой величины с необработанными образцами или образцами, обработанными другими предложенными в настоящем изобретении соединениями. Эти способы могут применяться параллельно или в комбинации с другими экспериментами по определению функций неизвестных генов в процессе валидации мишеней или для определения обоснованности применения конкретного генного продукта в качестве мишени для лечения или предотвращения конкретного заболевания, состояния или фенотипа.
Оценка увеличения или ингибирования экспрессии генов:
[00172] Перенос экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или в организм-хозяина может быть оценен прямым определением присутствия указанной нуклеиновой кислоты в указанных клетке или организме. Такое определение может быть проведено несколькими известными специалистам в данной области техники способами. Например, присутствие экзогенной нуклеиновой кислоты может быть определено посредством саузерн-блоттинга или полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением праймеров, специфически амплифицирующих нуклеотидные последовательности, связанные с указанной нуклеиновой кислотой. Экспрессия указанных экзогенных нуклеиновых кислот также может быть измерена с применением общепринятых способов, в том числе анализа генной экспрессии. Например, мРНК, полученная из экзогенной нуклеиновой кислоты, может быть обнаружена и количественно определена с применением нозерн-блоттинга и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
[00173] Экспрессия РНК с указанной экзогенной нуклеиновой кислоты может также быть определена измерением ферментативной активности или активности репортерного белка. Например, антисмысловая модулирующая активность может быть непрямо измерена через понижение или повышение экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в качестве показателя того, что экзогенная нуклеиновая кислота производит эффекторную РНК. Используя консервативность последовательностей, можно сконструировать праймеры и использовать для амплификации кодирующих участков указанных генов-мишеней. Сначала можно использовать наиболее активно экспрессируемую кодирующая область каждого гена для построения модели контрольного гена, хотя может быть использована любая кодирующая или некодирующая область. Каждый контрольный ген получен встраиванием каждой кодирующей области между кодирующей репортер областью и ее поли(А)-сигналом. Эти плазмиды производят мРНК с репортерным геном в вышележащей части гена и потенциальной мишенью РНКи в 3' некодирующей области. Эффективность индивидуальных антисмысловых олигонуклеотидов может быть проанализирована по модулированию репортерного гена. Репортерные гены, подходящие для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, включают гены синтазы ацетогидроксикислот (АГКС), щелочной фосфатазы (ЩФ), бетагалактозидазы (LacZ), бета глюкоронидазы (GUS), хлорамфеникол ацетилтрансферазы (ХАТ), зеленого флуоресцентного белка (GFP), красного флуоресцентного белка (RFP), желтого флуоресцентного белка (YFP), голубого флуоресцентного белка (CFP), пероксидазы хрена (ПОХ), люциферазы (Luc), нопалин синтазы (NOS), октопин синтазы (OCS) и их производных. Доступны различные селективные маркеры, придающие устойчивость к ампициллину, блеомицину, хлорамфениколу, гентамицину, гигромицину, канамицину, линкомицину, метотрексату, фосфинотрицину, пуромицину и тетрациклину. Способы определения модулирования репортерного гена хорошо известны в данной области техники, и включают, не ограничиваясь перечисленными: флуорометрические способы (например, флуоресцентная спектроскопия, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS), флуоресцентная микроскопия), определение устойчивости к антибиотику.
[00174] Экспрессия белка и мРНК NEU4 может быть проанализирована с применением известных специалистам в данной области техники способов, описанных в любом из разделов настоящей заявки. Например, для измерения уровней белка могут применяться методы иммуноанализа, такие как ИФА. Наборы ИФА для анализа NEU4 коммерчески доступны, например, от R&D Systems (Minneapolis, MN).
[00175] В вариантах реализации экспрессия NEU4 (например, мРНК или белка) в образце (например, в клетках или тканях in vivo или in vitro), обработанном с применением антисмыслового олигонуклеотида, предложенного в настоящем изобретении, оценивается посредством сравнения с экспрессией NEU4 в контрольном образце. Например, экспрессия белка или нуклеиновой кислоты может сравниваться с применением известных специалистам в данной области техники способов с таковой в плацебо-образце или в необработанном образце. Как вариант, может быть проведено сравнение с образцом, обработанным контрольным антисмысловым олигонуклеотидом (например, имеющим измененную или иную последовательность), в зависимости от того, какую информацию необходимо получить. Согласно другому варианту реализации различие в экспрессии белка или нуклеиновой кислоты NEU4 между необработанным и обработанным образцами может сравниваться с различием в экспрессии различных нуклеиновых кислот (включая любые стандартные, признанные исследователем подходящими, например, конститутивный ген) в обработанном и необработанном образцах.
[00176] Наблюдаемые различия могут быть выражены в удобной форме, например, в виде пропорции или доли, для сравнения с контролем. В вариантах реализации уровень мРНК или бежа NEU4 в образце, обработанном антисмысловым олигонуклеотидом, предложенным в настоящем изобретении, повышается или снижается приблизительно 1,25-кратно-10-кратно или более относительно необработанного образца или образца, обработанного контрольной нуклеиновой кислотой. В вариантах реализации уровень мРНК или белка NEU4 повышается или снижается по меньшей мере приблизительно 1,25-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,3-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,4-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,6-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,7-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,8-кратно, по меньшей мере приблизительно 2-кратно, по меньшей мере приблизительно 2,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 3-кратно, по меньшей мере приблизительно 3,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 4-кратно, по меньшей мере приблизительно 4,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 5-кратно, по меньшей мере приблизительно 5,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 6-кратно, по меньшей мере приблизительно 6,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 7-кратно, по меньшей мере приблизительно 7,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 8-кратно, по меньшей мере приблизительно 8,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 9-кратно, по меньшей мере приблизительно 9,5-кратно, или по меньшей мере приблизительно 10-кратно или более.
Наборы, реагенты для исследования, диагностика и терапия
[00177] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно применять для диагностики, лечения и профилактики, а также в качестве реагентов для исследований и компонентов наборов. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, способные ингибировать генную экспрессию с высокой специфичностью, часто используются специалистами в данной области техники для выяснения функций отдельных генов или распознавания функций различных компонентов биологического пути.
[00178] Для применения в наборах и для диагностики, и в различных биологических системах, соединения, предложенные в настоящем изобретении, по отдельности или в комбинации с другими соединениями или терапевтическими средствами подходят в качестве инструмента дифференциального и/или комбинаторного анализа для определения паттернов экспрессии части или всего набора генов, экспрессируемых в клетках и тканях.
[00179] Используемый в настоящей заявке термин ʺбиологическая системаʺ или ʺсистемаʺ определен как любой организм, клетка, клеточная культура или ткань, экспрессирующая, или с приобретенной способностью экспрессировать, продукты генов сиалидазы 4 (NEU4). Они включают, не ограничиваясь перечисленными: человека, трансгенных животных, клетки, культуры клеток, ткани, ксенотрансплантаты, трансплантаты и их комбинации.
[00180] Согласно одному из неограничивающих примеров паттерны экспрессии в клетках или тканях, обработанных одним или несколькими антисмысловыми соединениями, сравнивают с контрольными клетками или тканями, не обработанными антисмысловыми соединениями, и исходя из полученных паттернов анализируют дифференциальные уровни генной экспрессии, так как они связаны, например, с болезнью, сигнальными путями, локализацией в клетках, уровнями экспрессии, размером, структурой или функцией изучаемых генов. Эти исследования могут быть выполнены на стимулированных или не стимулированных клетках в присутствии или в отсутствие других соединений, которые влияют на паттерны экспрессии.
[00181] Примеры способов анализа генной экспрессии, известных в данной области техники, включают анализ на ДНК-чипах или на микрочипах, SAGE (серийный анализ экспрессии генов), READS (рестриктазная амплификация расщепляемых кДНК), TOGA (полный анализ генной экспрессии), белковые чипы и протеомику, секвенирование меток экспрессируемой последовательности (EST), вычитающий РНК фингерпринтинг (SuRF), вычитающее клонирование, дифференциальный дисплей (DD), сравнительная геномная гибридизация, FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) и масс-спектрометрические методы.
[00182] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, подходят для исследований и диагностики, поскольку такие соединения гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими сиалидазу 4 (NEU4). Например, олигонуклеотиды, гибридизующиеся с эффективностью и в условиях, описанных в настоящей заявке, являясь эффективными модуляторами гена NEU4, представляют собой эффективные праймеры или зонды в условиях, благоприятных для амплификации или определения гена, соответственно. Такие праймеры и зонды подходят для способов, требующих специфического определения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих NEU4, и для амплификации указанных молекул нуклеиновой кислоты для определения или для применения в дальнейших исслеованиях гена NEU4. Гибридизация указанных антисмысловых олигонуклеотидов, в частности, праймеров и зондов, предложенных в настоящем изобретении, с нуклеиновой кислотой, кодирующей NEU4, может быть определена при помощи известных в данной области техники способов. Такие способы могут включать конъюгирование фермента с указанным олигонуклеотидом, радиоактивное мечение указанного олигонуклеотида и любые другие подходящие способы детекции. Могут также быть подготовлены наборы для определения уровней NEU4 в образце при помощи таких способов определения.
[00183] Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений также используются специалистами в данной области техники для терапевтических целей. Антисмысловые соединения применялись в качестве терапевтических компонентов при лечении болезненных состояний у животных, в том числе человека. Лекарственные средства на основе антисмысловых олигонуклеотидов безопасно и эффективно вводили людям, и в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания. Таким образом, установлено, что антисмысловые соединения могут применяться в качестве терапевтических средств, которые могут быть модифицированы под терапевтические схемы для лечения клеток, тканей и животных, в особенности человека.
[00184] В случае терапевтических средств животное, предпочтительно человек, у которого, предположительно, имеется заболевание или расстройство, лечение которого может проводиться модулированием экспрессии полинуклеотидов NEU4, получает лечение в виде введения антисмысловых соединений в соответствии с настоящим изобретением. Например, согласно одному из неограничивающих вариантов реализации указанные способы включают этап введения животному, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества модулятора гена NEU4. Модуляторы гена NEU4, предложенные в настоящем изобретении, эффективно модулируют активность гена NEU4 или модулируют экспрессию белка NEU4. Согласно одному из вариантов реализации указанные активность или экспрессия гена NEU4 у животного подавлены приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, указанные активность или экспрессия гена NEU4 у животного подавлены приблизительно на 30%. Более предпочтительно, указанные активность или экспрессия гена NEU4 у животного подавлены приблизительно на 50% или более. Таким образом, указанные олигомерные соединения модулируют экспрессию мРНК гена сиалидазы 4 (NEU4) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% относительно контроля.
[00185] В одном варианте реализации указанные активность и/или экспрессия гена сиалидазы 4 (NEU4) у животного повышены приблизительно на 10%ʺ по сравнению с контролем. Предпочтительно, указанные активность или экспрессия гена NEU4 у животного повышены приблизительно на 30%. Более предпочтительно, указанные активность или экспрессия гена NEU4 у животного повышены на 50% или более. Таким образом, указанные олигомерные соединения изменяют экспрессию мРНК гена NEU4 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% относительно контроля.
[00186] Например, повышение или снижение экспрессии гена сиалидазы 4 (NEU4) может быть определено в сыворотке, крови, жировой ткани, печени или любой другой жидкости организма, ткани или органе указанного животного. Предпочтительно, клетки, содержащиеся в указанных анализируемых жидкостях, тканях или органах, содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептиды NEU4 и/или собственно белок NEU4.
[00187] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, применять в фармацевтических композициях посредством добавления эффективного количества соединения к подходящему фармацевтически приемлемому разбавителю или носителю. Применение соединений и способов, предложенных в настоящем изобретении, может также подходить для профилактики.
Конъюгаты
[00188] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, включает химическое связывание с указанным олигонуклеотидом одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, усиливают клеточное распределение или поглощение клетками указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты или конъюгаты могут включать конъюгированные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгированные группы, предложенные в настоящем изобретении, включают интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, простые полиэфиры, группы, улучшающие фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, улучшающие фармакокинетические свойства олигомеров. Типовые конъюгированные группы включают холестерины, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Группы, усиливающие фармакодинамические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, улучшающие поглощение, повышающие сопротивление разрушению и/или усиливающие сиквенс-специфичную гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой. Группы, улучшающие фармакокинетические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, улучшающие поглощение, распределение, метаболизм или выведение соединений, предложенных в настоящем изобретении. Типовые конъюгированные группы описаны в международной заявке на патент PCT/US92/09196, поданной 23 октября 1992, и патенте США 6287860, включенных в настоящую заявку посредством ссылки. Конъюгированные фрагменты включают, не ограничиваясь перечисленными: липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, холевую кислоту, тиоэфир, например, гексил-5-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-гас-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-гас-глицеро-3-Нфосфонат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, октадециламин или фрагмент гексиламино-карбонил-оксихолестерина. Олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть также конъюгированы с активными лекарственными веществами, например, аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, дансилсаркозином, 2,3,5-трийодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиади азидом, хлортиазидом, диазепином, индометицином, барбитуратом, цефалоспорином, сульфамидным препаратом, антидиабетическим средством, антибактериальным веществом или антибиотиком.
[00189] Примеры патентов США, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают, не ограничиваясь перечисленными: патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941.
Составы
[00190] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, также могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами-мишенями рецепторов, составами для перорального, ректального, местного или иного пути введения, для способствования поглощению, распределению и/или абсорбции. Примеры патентов США, в которых описано получение таких способствующих поглощению, распределению и/или абсорбции составов, включают, не ограничиваясь перечисленными: патенты США 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543165; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; и 5595756, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00191] Хотя указанные антисмысловые олигонуклеотиды не обязательно должны вводиться при помощи вектора, чтобы модулировать экспрессию и/или функцию мишени, варианты реализации настоящего изобретения включают векторные конструкции для экспрессии антисмысловых олигонуклеотидов, включая промоторы, последовательности генов составных промоторов и обладающие выраженной конститутивной промоторной активностью, или промоторной активностью, которая может быть индуцирована при необходимости.
[00192] В одном варианте реализации осуществление изобретения включает введение по меньшей мере одного из вышеуказанных антисмысловых олигонуклеотидов при помощи подходящей системы доставки на основе нуклеиновой кислоты. Согласно одному из вариантов реализации такая система включает невирусный вектор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом. Примеры таких невирусных векторов включают собственно олигонуклеотид (например, любая(ые) из последовательностей SEQ ID NOS: 8-11) или его комбинацию с подходящим белковым, полисахаридным или липидным составом.
[00193] Дополнительно, подходящие системы доставки нуклеиновой кислоты включают вирусные векторы, как правило, на основе последовательности одного или нескольких аденовирусов, аденоассоциированного вируса (ААВ), хелпер-зависимого аденовируса, ретровируса, или липосомального комплекса с японским гемагтлютинирующим вирусом (HVJ). Предпочтительно, указанный вирусный вектор содержит сильный эукариотический промотор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом, например, промотор цитомегаловируса (ЦМВ).
[00194] Дополнительные предпочтительные векторы включают вирусные векторы, белки слияния и химические конъюгаты. Ретровирусные векторы включают вирусы мышиного лейкоза Молони и ВИЧ-вирусы. Один из предпочтительных ВИЧ-вирусных векторов содержит по меньшей мере два вектора, где гены gag и pol происходят из генома ВИЧ, а ген env - из другого вируса. Предпочтительными являются ДНК-вирусные векторы. Такие векторы включают pox-векторы, такие как ортопокс- или авипокс-векторы, герпесвирусные векторы, такие как векторы на основе вируса простого герпеса (HSV) 1, аденовирусные векторы и векторы на основе аденоассоциированного вируса.
[00195] Антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, включают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое при введении животному, включая человека, способно обеспечить получение (прямо или непрямо) биологически активного метаболита или его компонента.
[00196] Термин ʺфармацевтически приемлемые солиʺ относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений, предложенных в настоящем изобретении: т.е. солям, сохраняющим необходимую биологическую активность исходного соединения и, кроме того, не дающих нежелательных токсических эффектов. Предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей олигонуклеотидов и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00197] Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, содержащие антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении. Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут вводиться различными способами в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение, и от того, на какую область необходимо воздействовать. Введение может быть местным (в том числе через глаза и через слизистые оболочки, включая вагинальное и ректальное введение), через легкие, например, посредством вдыхания или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе при помощи небулайзера; интратрахеально, интраназально, эпидермально и трансдермально), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенные, внутриартериальные, подкожные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или интравентрикулярное, введение.
[00198] При лечении тканей центральной нервной системы введение может осуществляться, например, инъекцией или инфузией в спинномозговую жидкость. Введение антисмысловой РНК в спинномозговую жидкость описано, например, в заявке на патент США, опубликованной под номером 2007/0117772, ʺMethods for slowing familial ALS disease progression)) (ʺСпособы замедления развития наследственного заболевания БАСʺ), включенной в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00199] Если предполагается введение антисмыслового олигонуклеотида, предложенного в настоящем изобретении, в клетки центральной нервной системы, введение может осуществляться совместно с одним или несколькими агентами, способными обеспечить проникновение указанного антисмыслового олигонуклеотида через гематоэнцефалический барьер. Инъекция может быть сделана, например, в энторинальную область коры или гиппокамп. Доставка нейротрофических факторов введением аденовирусного вектора в двигательные нейроны мышечной ткани описана, например, в патенте США 6632427, ʺAdenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neuronsʺ (ʺПеренос генов в двигательные нейроны мозга, опосредованный аденовирусным векторомʺ), включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Доставка векторов непосредственно в мозг, например, в стриатум, таламус, гиппокамп или черную субстанцию известна в данной области техники и описана, например, в патенте США 6756523, ʺAdenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brainʺ (ʺАденовирусные векторы для переноса чужеродных генов в клетки центральной нервной системы, в частности, клетки мозгаʺ), включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Введение может быть быстрым в случае инъекции или осуществляться в течение некоторого промежутка времени в случае медленной инфузии или введения составов с замедленным высвобождением.
[00200] Рассматриваемые антисмысловые олигонуклеотиды могут быть связаны или конъюгированы с агентами, обеспечивающими необходимые фармацевтические или фармакокинетические свойства. Например, указанный антисмысловой олигонуклеотид может сочетаться с любым веществом, которое, как известно в данной области техники, способствует проникновению или транспорту через гематоэнцефалический барьер, таким как антитело к рецептору трансферрина, и вводимому путем внутривенной инъекции. Указанное антисмысловое соединение может быть связано с вирусным вектором, например, придающим указанному антисмысловому соединению большую эффективность и/или усиливающим транспорт указанного антисмыслового соединения через гематоэнцефалический барьер. Осмотическое преодоление гематоэнцефалического барьера может также быть достигнуто, например, инфузией сахаров, включая, но не ограничиваясь перечисленными, мезоэритрит, ксилит, D(+) галактозу, D(+) лактозу, D(+) ксилозу, дульцит, миоинозитол, L(-) фруктозу, D(-) маннит, D(+) глюкозу, D(+) арабинозу, D(-) арабинозу, целлобиозу, D(+) мальтозу, D(+) раффинозу, L(+) рамнозу, D(+) мелибиозу, D(-) рибозу, адонит, D(+) арабит, L(-) арабит, D(+) фукозу, L(-) фукозу, D(-) ликсозу, L(+) ликсозу и L(-) ликсозу, или аминокислот, включая, но не ограничиваясь перечисленными, глутамин, лизин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, тирозин, валин и таурин. Способы и материалы для повышения проникновения через гематоэнцефалический барьер описаны, например, в патенте США 4866042, ʺMethod for the delivery of genetic material across the blood brain barrierʺ (ʺСпособы доставки генетического материала через гематоэнцефалический барьерʺ), патенте США 6294520, ʺMaterial for passage through the blood-brain barrierʺ (ʺМатериал для прохождения через гематоэнцефалический барьерʺ) и патенте США 6936589, ((Parenteral delivery systemsʺ (ʺПарентеральные системы доставкиʺ), включенных в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00201] Рассматриваемые антисмысловые соединения могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами-мишенями рецепторов, составами для перорального, ректального, местного или иного пути введения, для способствования поглощению, распределению и/или абсорбции. Например, катионные липиды могут также быть включены в указанный состав для облегчения поглощения олигонуклеотидов. Одной из таких композиций, как показано, способствующей поглощению, является LIPOFECTin (доступный у GIBCO-BRL, Bethesda, MD).
[00202] Олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну 2'-O-метоксиэтильную модификацию, предположительно подходят, в частности, для перорального введения. Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Обычные фармакологические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимы или желательны. Подходящие применения включают также покрытия для презервативов, перчаток и т.п.
[00203] Фармацевтические составы, предложенные в настоящем изобретении, которые могут быть представлены в виде удобной единичной дозированной формы, могут быть получены согласно общепринятым методикам, хорошо известным в области фармацевтической индустрии. Такие техники включают этап соединения активных ингредиентов с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами. Как правило, указанные составы получают равномерным глубоким соединением активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкомолотыми твердыми носителями, или с ними обоими, и затем, при необходимости, придают продукту форму.
[00204] Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде любой из многих возможных лекарственных форм, включая, но не ограничиваясь перечисленными, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также быть получены в виде суспензий на основе водных, неводных или смешанных сред. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Указанная суспензия может также содержать стабилизаторы.
[00205] Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленными: растворы, эмульсии, пены и содержащие липосомы составы. Фармацевтические композиции и составы, предложенные в настоящем изобретении, могут содержать один или более усилители проникновения, носители, вспомогательные вещества или другие активные или неактивные ингредиенты.
[00206] Эмульсии представляют собой, как правило, гетерогенные системы, где одна жидкость распределена в другой в виде капель, как правило, более 0,1 мкм в диаметре. Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты помимо дисперсных фаз, и активное лекарственное вещество может присутствовать в растворе в водной фазе, масляной фазе или быть представлено отдельной фазой. Микроэмульсии также относятся к вариантам реализации настоящего изобретения. Эмульсии и их применение хорошо известны в данной области техники и подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00207] Составы, предложенные в настоящем изобретении, включают липосомальные составы. В контексте настоящего изобретения термин ʺлипосомаʺ означает пузырьки, состоящие из амфифильных липидов, образующих один или более чем один сферический бислой. Липосомы представляют собой однослойные или многослойные пузырьки с мембраной, образованной липофильными веществами и водной внутренней фазой, где содержится композиция, которую необходимо доставить. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые предположительно взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. pH-чувствительные или отрицательно заряженные липосомы, предположительно, скорее захватывают ДНК, чем образуют с ней комплексы. Как катионные, так и некатионные липосомы применялись для доставки ДНК в клетки.
[00208] Липосомы также включают ʺстерически стабилизированныеʺ липосомы, что при использовании в настоящей заявке относится к липосомам, содержащим один или более специализированный липид. После включения в липосомы эти специализированные липиды образуют липосомы с увеличенной продолжительностью существования по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примеры стерически стабилизированных липосом являются такие, в которых часть образующего пузырек липидного компонента липосомы содержит один или более гликолипид или дериватизирован одним или несколькими гидрофильными полимерами, таких как фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ). Липосомы и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00209] Фармацевтические составы и композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также включать поверхностно-активные вещества. Применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, составах и эмульсиях хорошо известно в данной области техники. Поверхностно-активные вещества и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00210] Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение включает различные усилители проникновения, способствующие эффективной доставке нуклеиновых кислот, в частности, олигонуклеотидов. Кроме способствования диффузии нелипофильных препаратов через клеточные мембраны, усилители проникновения повышают проникающую способность липофильных препаратов. Усилители проникновения могут быть разделены на пять больших категорий, а именно, поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие агенты, и нехелатирующие не-ПАВ-вещества. Усилители проникновения и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00211] Специалисту в данной области техники будет понятно, что составы получают согласно стандартным методикам в соответствии с их назначением, т.е. способом введения.
[00212] Предпочтительные составы для местного применения включают такие, в которых олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, смешаны с агентами для местного введения, такими как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Предпочтительные липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеилфосфатидил DOPE этаноламин, димиристоилфосфатидил холин DMPC, дистеаролфосфатидилхолин) отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидил глицерина DMPG) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеилфосфатидил этаноламин DOTMA).
[00213] Для местного или другого применения олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомы или входить в состав липосомальных комплексов, в частности, с катионными липосомами. Как вариант, олигонуклеотиды могут входить в состав липидных комплексов, в частности с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и сложные эфиры, их фармацевтически приемлемые соли, и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00214] Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, содержащие микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, порционные упаковки, таблетки или минитаблетки. Присутствие загустителей, вкусоароматических агентов, разбавителей, эмульгаторов, диспергирующих агентов или связующих веществ может быть желательным. Предпочтительными составами для перорального приема являются такие, в которых олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, вводятся совместно с одним или несколькими усилителями проникновения, поверхностно-активными веществами и хелатирующими веществами. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или сложные эфиры или их соли, желчные кислоты и/или их соли. Предпочтительные желчные кислоты/соли и жирные кислоты и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Также предпочтительными являются комбинации усилителей проникновения, например, жирные кислоты/соли в комбинации с желчными кислотами/солями. В частности, предпочтительной является комбинация натриевой соли лауриновой кислоты, каприновой кислоты и УДХК. Другие усилители проникновения включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. Олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть введены перорально, в гранулированной форме, включая высушенные распылением частицы, или в составе комплексов микро- или наночастиц. Комплексообразующие агенты для олигонуклеотидов и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00215] Композиции и составы для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, включая, но не ограничиваясь перечисленными, усилители проникновения, переносчики и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.
[00216] Определенные варианты реализации настоящего изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие одно или более олигомерное соединение и один или более другой химиотерапевтический агент, действующий с помощью не-антисмыслового механизма. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают, не ограничиваясь перечисленными, химиотерапевтические лекарственные средства для лечения рака, такие как даунорубицин, дауномицин, дакганомицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозина арабинозид, бис-хлорэтил-нитрозомочевина, бусульфан, митомицин C, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевина, мустарген, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевина, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксицикло-фосфорамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (VP-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстильбэстрол (DES). При применении с соединениями, предложенными в настоящем изобретении, такие химиотерапевтические агенты могут применяться индивидуально (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид в течение некоторого времени, затем МТХ и олигонуклеотид), или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими агентами (например, 5-FU, МТХ и олигонуклеотид, или 5-FU, лучевая терапия и олигонуклеотид). Противовоспалительные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь перечисленными, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды, и противовирусные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь перечисленными, рибавирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, могут также быть скомбинированы в композициях, предложенных в настоящем изобретении. Комбинации антисмысловых соединений и других не-антисмысловых лекарственных средств также входят в объем настоящего изобретения. Два или более скомбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.
[00217] В другом сходном варианте реализации композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотидов, нацеленных на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту. Например, первой мишенью может быть конкретная антисмысловая последовательность для гена сиалидазы 4 (NEU4), а второй мишенью может быть участок другой нуклеотидной последовательности. Как вариант, композиции, предложенных в настоящем изобретении, могут содержать два антисмысловых соединения или более, нацеленных на разные участки одной и той же целевой нуклеиновой кислоты сиалидазы 4 (NEU4). Многочисленные примеры антисмысловых соединений приведены в настоящей заявке, другие могут быть выбраны из подходящих соединений, известных в данной области техники. Два или более скомбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.
Дозирование:
[00218] Получение фармацевтических композиций и их последующее введение (дозирование) должны быть знакомы специалистам в данной области техники. Дозы зависят от тяжести и чувствительности к лечению болезненного состояния-мишени терапии, курс лечения может длиться от нескольких дней до нескольких месяцев, или до излечения, или до облегчения болезненного состояния. Оптимальный режим дозирования может быть рассчитан на основании измерений накопления препарата в организме пациента. Специалист без труда определит оптимальные дозировки, методологию дозировок и частоту повторения. Оптимальные дозы могут варьировать в зависимости от относительной эффективности конкретных олигонуклеотидов, и, как правило, могут быть рассчитаны исходя из ЕС50, эффективных для животных моделей in vitro и in vivo. Как правило, доза составляет от 0,01 мкг до примерно 10 мг на кг массы тела, и может вводиться однократно или чаще ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже каждые 2-20 лет. Специалист без труда может рассчитать частоту введения доз, основанную на времени удержания и концентрациях лекарства в жидкостях или тканях организма. После проведения эффективного лечения может быть желательно применение поддерживающей терапии у пациента для предотвращения рецидива заболевания, при этом указанный олигонуклеотид вводится в поддерживающих дозах, варьирующих от 0,01 мкг до примерно 10 мг на кг массы тела, от однократного или более частого ежедневного приема до однократного приема один раз в 2-20 лет.
[00219] Согласно вариантам реализации пациент получает дозу лекарственного средства, составляющую по меньшей мере приблизительно 1, по меньшей мере приблизительно 2, по меньшей мере приблизительно 3, по меньшей мере приблизительно 4, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 6, по меньшей мере приблизительно 7, по меньшей мере приблизительно 8, по меньшей мере приблизительно 9, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 35, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 45, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 90, или по меньшей мере приблизительно 10 мг/кг массы тела. Некоторые вводимые дозировки антисмысловых олигонуклеотидов описаны, например, в патенте США 7563884, ʺAntlsense modulation of PTP1B expression)) (ʺАнтисмысловое модулирование экспрессии PTP1Bʺ), включенном в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00220] Хотя выше и были описаны различные варианты реализации настоящего изобретения, следует понимать, что они представлены только в качестве примеров, а не для ограничения. Многочисленные модификации раскрытых вариантов реализации могут быть осуществлены согласно описаниям в настоящей заявке, не выходя за рамки сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, объем и сущность настоящего изобретения не ограничены какими-либо из приведенных выше вариантов реализации.
[00221] Все упоминаемые здесь документы включены в настоящую заявку посредством ссылок. Все публикации и патентные документы, упомянутые в настоящей заявке, включены посредством ссылок в том же объеме, как если бы каждая публикация или каждый патентный документ были упомянуты в индивидуальном порядке. Цитируя различные источники в данном документе, заявители не признают, что какой-либо из источников представляет ʺпредшествующий уровень техникиʺ относительно настоящего изобретения. Варианты реализации предложенных в изобретении композиций и способов проиллюстрированы приведенными ниже примерами.
ПРИМЕРЫ
[00222] Следующие неограничивающие Примеры предназначены для иллюстрации некоторых вариантов реализации настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что вариации содержания и вариантов элементов описанных компонентов очевидны специалистам в данной области техники и входят в объем вариантов реализации настоящего изобретения.
Пример 1: Конструирование антисмысловых олигонуклеотидов, специфичных к молекуле нуклеиновой кислоты, антисмысловой к сиалидазы 4 (NEU4), и/или смысловой цепи полинуклеотида NEU4
[00223] Как указано выше, термин ʺолигонуклеотид, специфичный дляʺ или ʺолигонуклеотид с нацеленным действиемʺ относится к олигонуклеотиду, содержащему последовательность, (i) способную формировать стабильный комплекс с фрагментом гена-мишени или (ii) способную формировать стабильный дуплекс с фрагментом мРНК-транскрипта гена-мишени.
[00224] Отбор подходящих олигонуклеотидов упрощается при применении компьютерных программ (например, IDT AntiSense Design, IDT OligoAnalyzer), автоматически идентифицирующих в каждой конкретной последовательности субпоследовательности из 19-25 нуклеотидов, способных образовывать гибриды с целевой полинуклеотидной последовательностью, имеющие требуемую температуру плавления (как правило, 50-60°C), и не образующие авто-димеров или других комплексных вторичных структур. Отбор подходящих олигонуклеотидов также упрощается при применении компьютерных программ, которые автоматически выравнивают нуклеотидные последовательности и определяют участки идентичности или гомологии. Такие программы применяют для сравнения нуклеотидных последовательностей, полученных, например, в результате поиска в базах данных, таких как GenBank, или посредством секвенирования ПЦР-продуктов. Сравнение нуклеотидных последовательностей различных генов и межгенных областей конкретного генома позволяет отобрать нуклеотидные последовательности, которым свойственна необходимая степень специфичности к нужному гену. Такие процедуры позволяют провести отбор олигонуклеотидов, проявляющих значительную степень комплементарности целевым нуклеотидным последовательностям и более низкую степень комплементарности другим нуклеотидным последовательностям из конкретного генома. Специалисту в данной области техники будет ясно, что существует значительная свобода выбора подходящих участков генов для применения согласно настоящему изобретению.
[00225] Антисмысловое соединение является ʺспособным к специфичной гибридизацииʺ, если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, приводя к модулированию функции и/или активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми нуклеотидными последовательностями в условиях, при которых необходимо специфичное связывание, т.е. в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия и в условиях, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.
[00226] Характеристики гибридизации олигонуклеотидов, описанных в настоящей заявке, могут быть определены с применением одного или более in vitro способов анализа из известных специалистам в данной области техники. Например, указанные характеристики олигонуклеотидов, описанных в настоящей заявке, могут быть получены путем определения силы связывания целевых природных антисмысловых последовательностей и молекул потенциального лекарственного средства с применением анализа кривых плавления.
[00227] Сила связывания целевых природных антисмысловых последовательностей и молекулы потенциального лекарственного средства (далее - Молекулы) может быть оценена с применением любых стандартных способов измерения силы межмолекулярных взаимодействий, например, анализа кривых плавления.
[00228] Анализ кривых плавления определяет температуру, при которой происходит быстрый переход от двухцепочечной к одноцепочечной конформации комплекса природной антисмысловой последовательности/молекулы. Эта температура широко используется как надежная мера силы взаимодействия между двумя молекулами. Анализ кривых плавления может быть выполнен с применением кДНК-копии актуальной природной антисмысловой молекулы РНК или синтетического нуклеотида ДНК или РНК, соответствующего связывающему сайту Молекулы. Доступны многочисленные наборы, содержащие все необходимые реагенты для проведения анализа (например, набор MeltDoctor от Applied Biosystems Inc.). Такие наборы содержат подходящий буферный раствор, содержащий один из связывающих двухцепочечную ДНК (дцДНК) красителей (таких как красители HRM от ABI, SYBR Green, SYTO и т.д.). Свойства дцДНК-красителей таковы, что они практически не флуоресцируют в свободной форме, но очень выраженно флуоресцируют при связывании с дцДНК.
[00229] Для проведения анализа указанную кДНК или соответствующий олигонуклеотид смешивают с Молекулой в концентрациях, определенных согласно протоколам конкретных производителей. Смесь подогревают до 95°C для диссоциации пре-формированных комплексов дцДНК, затем медленно охлаждают до комнатной температуры или другой более низкой температуры, указанной производителем набора, для ренатурации молекул ДНК. Вновь сформировавшиеся комплексы затем медленно нагревают до 95°C, одновременно непрерывно измеряя интенсивность флуоресценции в результате реакции. Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна количеству присутствующих в реакции дцДНК. Информация может быть получена с применением инструмента на основе ПЦР в режиме реального времени, совместимого с набором (например, StepOne Plus Real Time PCR System от ABI или инструмент lightTyper от Roche Diagnostics, Lewes, UK).
[00230] Пики плавления получают построением графика зависимости отрицательной производной флуоресценции по температуре (-d(Флуоресценция)/dT) по оси y) от температуры (ось x) с применением подходящего программного обеспечения (например, lightTyper (Roche) или SDS Dissociation Curve, ABI). Информацию анализируют с целью определить температуру быстрого перехода комплекса дцДНК в одноцепочечные молекулы. Эту температуру называют температурой плавления, и она прямо пропорциональна силе взаимодействия между двумя молекулами. Как правило, температура плавления превышает 40°C.
Пример 2: Модулирование полинуклеотидов NEU4
[00231]
Все антисмысловые олигонуклеотиды, используемые в примере 2, были сконструированы, как описано в примере 1. Производителю (IDT Inc. of Coralville, IA) было поручено производство сконструированных фосфоротиоат-связанных олигонуклеотидов и производство фосфоротиоатных аналогов, представленных в таблице 1. Знак звездочка между нуклеотидами указывает на наличие фосфоротиоатной связи. Олигонуклеотиды, необходимые для эксперимента в примере 2, могут быть синтезированы с использованием любых соответствующих современных методов, например, метода, с применением IDT: твердофазной подложки, такой как стеклянные бусины (CPG) с контролируемым размером пор 5 микрон, и амидофосфитных мономеров (нормальных нуклеотидов, у которых все активные группы защищены защитными группами, например, тритил на сахаре, бензоил на A и С и N-2-изобутирил на G). Защитные группы предотвращают нежелательные реакции в процессе синтеза олигонуклеотидов. Защитные группы удаляются в конце процесса синтеза. Начальный нуклеотид связан с твердофазной подложкой через 3'-углерод и синтез протекает в направлении 3'→5'. Добавление нового основания к растущей олигонуклеотидной цепи происходит в четыре этапа: 1) удаление защитных групп от 5'-кислорода иммобилизованного нуклеотида с помощью трихлоруксусной кислоты; 2) связывание между собой иммобилизованных и следующих в последовательности нуклеотидов с помощью тетразола; реакция протекает через промежуточное соединение тетразолиламидофосфит; 3) непрореагировавшие свободные нуклеотиды и побочные продукты реакции вымываются и непрореагировавшие иммобилизованные олигонуклеотиды блокируются, чтобы предотвратить их участие в следующем раунде синтеза; блокировка достигается путем ацетилирования свободного 5'-гидроксила при помощи уксусного ангидрида и N-метил- имидазола; 4) для стабилизации связей между нуклеотидами фосфор окисляется при помощи йода и воды, если должна быть получена фосфодиэфирная связь, или при помощи реагента Бокажа (3Н-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксид), если желательна фосфоротиоатная связь. Путем чередования двух окисляющих агентов, может быть построен химерный остов. Четыре этапа цикла, описанного выше, повторяются для каждого нуклеотида в последовательности. После синтеза полной последовательности, олигонуклеотид отщепляется от твердофазной подложки и с него снимают защитные группы с применением гидроксида аммония при высокой температуре. Защитные группы вымывают путем обессоливания, а остающиеся олигонуклеотиды лиофилизируют.
Обработка клеток HepG2 антисмысловыми олигонуклеотидами
[00232] Для выполнения эксперимента, описанного в примере 2, клетки HepG2 из АТСС (cat# НВ-8065) вьгоащивали на ростовой среде (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, либо Mediatech cat# MT-10-010-CV)+10% ЭБС (Mediatech cat# MT35-011-CV)+пенициллин/стрептомицин (Mediatech cat# MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO2. За день до эксперимента клетки пересевали с плотностью 0,5×104/мл в 6-луночные планшеты и инкубировали при 37°C и 5% CO2. В день эксперимента среду в 6-луночных планшетах заменяли на свежую ростовую среду.
[00233] Олигонуклеотиды, полученные от производителя в лиофилизированной форме, разводили до концентрации 20 мкМ деионизованной водой, свободной от РНКаз/ДНКаз. Два мкл этого раствора инкубировали с 400 мкл среды OptiMEM (Gibco cat#31985-070) и 4 мкл Липофектамина 2000 (Lipofectamine 2000) (Invitrogen cat# 11668019) при комнатной температуре в течение 20 мин, затем вносили по каплям в одну лунку 6-луночного планшета с клетками HepG2. Аналогичную смесь, содержащую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для контрольной ʺпустойʺ трансфекции. После 3-18 ч инкубации при 37°C и 5% CO2 среду заменяли на свежую ростовую среду. Через 48 ч после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду удаляли и выделяли РНК из клеток с применением SV Total RNA Isolation System от Promega (cat # Z3105) или набора RNeasy Total RNA Isolation kit от Qiagen (cat# 74181), следуя инструкциям производителя. 600 нг выделенной РНК вводили в реакцию обратной транскрипции, проводимую с применением кДНК-набора Verso cDNA kit от Thermo Scientific (cat#AB1453B) или набора High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (cat# 4368813) согласно описанию в протоколе производителя. кДНК, полученные в результате реакции обратной транскрипции, применяли для мониторинга генной экспрессии при помощи ПЦР в режиме реального времени с применением ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) и праймеров/зондов, сконструированных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00896887_m1(NEU4) от Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Использовали следующий цикл ПЦР: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов при (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) с применением термоциклера Мх4000 (Stratagene) или аппарата для ПЦР в режиме реального времени StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems). Кратность изменения экспрессии гена после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и ложнотрансфицированными образцами.
Результаты: Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни мРНК гена NEU4 в клетках HepG2 значимо повышаются через 48 ч после обработки одним из антисмысловых олигонуклеотидов NEU4, сконструированными для антисмысловой мРНК Hs.678184 гена NEU4 (Фигура 1).
[00234] Несмотря на то, что настоящее изобретение проиллюстрировано и описано посредством ссылок на один или несколько вариантов реализации, эквивалентные изменения и модификации будут очевидны для специалистов в данной области техники после прочтения и понимания настоящего описания и прилагаемых чертежей. Кроме того, хотя конкретные свойства согласно настоящему изобретению могут раскрываться только в одном из нескольких вариантов реализации, такие свойства могут быть скомбинированы с одним или несколькими другими свойствами других вариантов реализации, что может быть необходимо и полезно для любого или частного случая применения.
[00235] Реферат настоящего изобретения позволит читателю быстро понять техническую суть изобретения. Подразумевается, что он не будет использован для целей толкования или ограничения сути и объема приведенной ниже формулы изобретения.

Claims (40)

1. Способ повышения экспрессии гена сиалидазы 4 (NEU4) в клетке, культуре клеток или ткани, которая экспрессирует или способна экспрессировать ген NEU4, включающий: введение по меньшей мере одного олигонуклеотида длиной от 10 до 30 нуклеотидов, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 2, повышая, таким образом, экспрессию гена сиалидазы 4 (NEU4).
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетка или ткань представляет собой клетку или ткань пациента.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична участку последовательности, обратно комплементарной последовательности SEQ ID NO: 2.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична участку последовательности SEQ ID NO: 1.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экспрессия гена сиалидазы 4 (NEU4) увеличивается in vivo или in vitro по сравнению с контролем.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид нацелен на нуклеотидную последовательность, антисмысловую по отношению к кодирующим нуклеотидным последовательностям гена сиалидазы 4 (NEU4).
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид нацелен на природный антисмысловой полинуклеотид, имеющий перекрывающиеся последовательности с геном сиалидазы 4 (NEU4).
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит одну или более модификаций, выбранных из: по меньшей мере одного модифицированного остатка сахара, по меньшей мере одной модифицированной межнуклеозидной связи, по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида и их комбинаций.
9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере один модифицированный остаток сахара, выбранный из: 2'-О-метоксиэтил-модифицированного остатка сахара, 2'-метокси-модифицированного остатка сахара, 2'-О-алкил-модифицированного остатка сахара, бициклического остатка сахара и их комбинаций.
10. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, выбранную из: фосфотиоата, 2'-О-метоксиэтила (МОЭ), 2-фтор, алкилфосфоната, фосфодитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, триэфирфосфата, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинаций.
11. Способ по п. 7, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из: пептидонуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты, арабинонуклеиновой кислоты (2-дезокси-2-фтор-D-арабинонуклеиновой кислоты, FANA), их аналога, производного и комбинаций.
12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну из последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 8-11.
13. Способ повышения экспрессии гена сиалидазы 4 (NEU4) в клетках или тканях млекопитающих, экспрессирующих или способных экспрессировать ген NEU4, in vivo или in vitro, включающий: введение по меньшей мере одного олигонуклеотида малой интерферирующей РНК (миРНК) длиной от 19 до 30 нуклеотидов, причем указанный олигонуклеотид миРНК специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 2, повышая, таким образом, экспрессию гена сиалидазы 4 (NEU4).
14. Олигонуклеотид длиной от 10 до 30 нуклеотидов, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 2 в клетке, культуре клеток или ткани, которая экспрессирует или способна экспрессировать ген NEU4, повышая, таким образом, экспрессию гена сиалидазы 4 (NEU4), причем указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну модификацию, выбранную из: по меньшей мере одного модифицированного остатка сахара; по меньшей мере одной модифицированной межнуклеотидной связи; по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида и их комбинаций; и при этом
последовательность указанного олигонуклеотида по меньшей мере на 80% идентична участку последовательности, обратно комплементарной SEQ ID NO: 2, или по меньшей мере на 80% идентична участку последовательности SEQ ID NO: 1.
15. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна модификация включает межнуклеотидную связь, выбранную из группы, состоящей из: фосфотиоата, алкилфосфоната, фосфодитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, триэфирфосфата, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинаций.
16. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную межнуклеотидную связь.
17. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит остов из фосфотиоатных межнуклеотидных связей.
18. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, при этом указанный модифицированный нуклеотид выбран из: пептидонуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты, их аналога, производного и комбинации.
19. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит множество модификаций, при этом указанные модификации включают модифицированные нуклеотиды, выбранные из: фосфотиоата, алкилфосфоната, фосфодитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, триэфирфосфата, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинаций.
20. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит множество модификаций, при этом указанные модификации включают модифицированные нуклеотиды, выбранные из: пептидонуклеиновых кислот, закрытых нуклеиновых кислот, их аналогов, производных и комбинации.
21. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный остаток сахара, выбранный из: 2'-О-метоксиэтил-модифицированного остатка сахара, 2'-метокси-модифицированного остатка сахара, 2'-О-алкил-модифицированного остатка сахара, бициклического остатка сахара и их комбинации.
22. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит множество модификаций, при этом указанные модификации включают модифицированные остатки сахаров, выбранные из: 2'-О-метоксиэтил-модифицированного остатка сахара, 2'-метокси-модифицированного остатка сахара, 2'-О-алкил-модифицированного остатка сахара, бициклического остатка сахара и их комбинации.
23. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид нацелен на нуклеотидную последовательность, антисмысловую по отношению к кодирующим нуклеотидным последовательностям гена сиалидазы 4 (NEU4).
24. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность, имеющую перекрывающиеся последовательности с геном сиалидазы 4 (NEU4).
25. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид повышает экспрессию гена сиалидазы 4 (NEU4) in vivo или in vitro по сравнению с нормальным контролем.
26. Олигонуклеотид по п. 14, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NOS: 8-11.
27. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с геном сиалидазы 4 (NEU4) и/или по меньшей мере одним продуктом, кодируемым указанным геном, содержащая эффективное количество
по меньшей мере одного олигонуклеотида по п. 14 или
по меньшей мере одного олигонуклеотида длиной от 10 до 30 нуклеотидов, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 2, повышая, таким образом, экспрессию гена сиалидазы 4 (NEU4), и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
28. Композиция по п. 27, отличающаяся тем, что последовательность указанного олигонуклеотида по меньшей мере примерно на 80% идентична любой из последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 8-11.
29. Композиция по п. 27, отличающаяся тем, что указанный олигонуклеотид содержит последовательность, выбранную из SEQ ID NOS: 8-11.
30. Композиция по п. 29, отличающаяся тем, что олигонуклеотид содержит одну или более модификаций или замен.
31. Композиция по п. 27, отличающаяся тем, что указанные одна или более модификаций выбраны из: фосфотиоата, метилфосфоната, пептидонуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты и их комбинаций.
32. Способ предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с геном сиалидазы 4 (NEU4) и/или по меньшей мере одним продуктом, кодируемым указанным геном, включающий: введение пациенту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного олигонуклеотида по п. 14 или по меньшей мере одного олигонуклеотида длиной от 10 до 30 нуклеотидов, который специфически связывается с природным антисмысловым олигонуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 2, повышая, таким образом, экспрессию гена сиалидазы 4 (NEU4).
33. Способ по п. 32, отличающийся тем, что заболевание, ассоциированное с указанным по меньшей мере одним геном сиалидазы 4 (NEU4), выбрано из: заболевания или расстройства, ассоциированного с аномальными функцией и/или экспрессией сиалидазы, рака, пролиферативного заболевания или расстройства, апоптоза, заболевания или расстройства, ассоциированного с нарушением регуляции апоптоза, диабета, сердечно-сосудистого заболевания или расстройства, болезни Тея-Сакса, лизосомной болезни накопления, воспалительного заболевания или расстройства (например, воспалительного заболевания кишечника, включая болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, псориаз, артрит и т.д.), воспаления; метаболического заболевания или расстройства, метаболического синдрома, синдрома резистентности к инсулину, диабета, гиперлипидемии, жировой болезни печени, кахексии, ожирения, атеросклероза, артериосклероза, заболевания, расстройства или состояния, ассоциированного с измененным метаболизмом холестерина, повышенного кровяного давления, неврологического заболевания или расстройства, заболевания или расстройства, ассоциированного с нарушением дифференцировки нервных клеток; заболевания или расстройства, ассоциированного с нарушением образования аксонов; заболевания или расстройства, ассоциированного с нарушением десиализации гликопротеинов и инфекцией (например, вирусной инфекцией, системной инфекцией и другими типами инфекций).
34. Способ индукции апоптоза в клетке, культуре клеток или ткани, которая экспрессирует или способна экспрессировать ген 4 (NEU4), включающий введение олигонуклеотида по п. 14 или
олигонуклеотида длиной от 10 до 30 нуклеотидов, который специфически связывается с природным антисмысловым полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 2, повышая, таким образом, экспрессию гена сиалидазы 4 (NEU4).
35. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична участку последовательности, обратно комплементарной последовательности SEQ ID NO: 2, или указанный олигонуклеотид имеет последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична участку последовательности SEQ ID NO: 1.
36. Способ по п. 34, отличающийся тем, что указанная клетка или ткань представляет собой клетки или ткани пациента.
RU2013115852A 2010-10-06 2011-10-05 Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4 RU2624048C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39021610P 2010-10-06 2010-10-06
US61/390,216 2010-10-06
PCT/US2011/054858 WO2012047956A2 (en) 2010-10-06 2011-10-05 Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013115852A RU2013115852A (ru) 2014-11-20
RU2624048C2 true RU2624048C2 (ru) 2017-06-30

Family

ID=45928395

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013115852A RU2624048C2 (ru) 2010-10-06 2011-10-05 Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8993533B2 (ru)
EP (1) EP2625274B1 (ru)
JP (1) JP5986998B2 (ru)
KR (1) KR101886457B1 (ru)
CN (1) CN103210086B (ru)
CA (1) CA2813901C (ru)
ES (1) ES2640755T3 (ru)
RU (1) RU2624048C2 (ru)
TW (1) TWI645036B (ru)
WO (1) WO2012047956A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2698199C1 (ru) * 2018-05-18 2019-08-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" Средство для подавления экспрессии генов, связанных с накоплением холестерина макрофагами человека

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2011325956B2 (en) 2010-11-12 2016-07-14 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
BR112014028631A2 (pt) 2012-05-16 2017-10-17 Rana Therapeutics Inc composições e métodos para modulação da expressão da família de genes da hemoglobina
JP2015523853A (ja) 2012-05-16 2015-08-20 ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド Ａｔｐ２ａ２発現を調節するための組成物及び方法
EA201492116A1 (ru) 2012-05-16 2015-05-29 Рана Терапьютикс, Инк. Композиции и способы для модулирования экспрессии mecp2
WO2013173638A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating smn gene family expression
CN104540946A (zh) 2012-05-16 2015-04-22 Rana医疗有限公司 用于调节utrn表达的组合物和方法
WO2015051283A1 (en) 2013-10-04 2015-04-09 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
EP3212824A4 (en) 2014-10-30 2018-08-08 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
EP3271460A4 (en) 2015-03-17 2019-03-13 The General Hospital Corporation INTERACTOME RNA OF COMPLEX REPRESSIVE POLYCOMB 1 (PRC1)
CA3042401A1 (en) 2016-11-01 2018-05-11 The Research Foundation For The State University Of New York 5-halouracil-modified micrornas and their use in the treatment of cancer

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100105760A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-29 Curna, Inc. Treatment of Apolipoprotein-A1 Related Diseases by Inhibition of Natural Antisense Transcript to Apolipoprotein-A1

Family Cites Families (387)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
EP0260032B1 (en) 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US4866042A (en) 1987-11-18 1989-09-12 Neuwelt Edward A Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
ATE151467T1 (de) 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
US5288512A (en) 1987-12-15 1994-02-22 The Procter & Gamble Company Reduced calorie fats made from triglycerides containing medium and long chain fatty acids
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
NL8800756A (nl) 1988-03-25 1989-10-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna.
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US6294520B1 (en) 1989-03-27 2001-09-25 Albert T. Naito Material for passage through the blood-brain barrier
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
ATE269870T1 (de) 1989-10-24 2004-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte oligonukleotide
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
US6034233A (en) 1990-05-04 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome
EP0745689A3 (en) 1990-05-11 1996-12-11 Microprobe Corporation A dipstick for a nucleic acid hybridization assay
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
BR9106702A (pt) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Inc Analogo de oligonucleotideos e processos para modular a producao de uma proteina por um organismo e para tratar um organismo
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
BR9106729A (pt) 1990-08-03 1993-07-20 Sterling Winthrop Inc Composto,processos para inibir a degradacao por nuclease de compostos e para estabilizar sequencias de nicleotideos ou oligonucleosideos,composicao utilizavel para inibir expressao de genes e processo para inibir expressao de genes em um mamifero necessitando de tal tratamento
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
JPH06505704A (ja) 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
JP3172178B2 (ja) 1990-11-08 2001-06-04 ハイブライドン インコーポレイテッド 合成オリゴヌクレオチドに対する多重リポータ基の組込み
ATE159548T1 (de) 1990-11-13 1997-11-15 Immunex Corp Bifunktionelle wählbare fusionsgene
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US6307040B1 (en) 1992-03-05 2001-10-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5576302A (en) 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5661134A (en) 1991-10-15 1997-08-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
IL101600A (en) 1992-04-15 2000-02-29 Yissum Res Dev Co Synthetic partially phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
ES2312164T3 (es) 1992-09-25 2009-02-16 Aventis Pharma S.A. Vectores de adenovirus para la transferencia de genes extraños en celulas del sistema nervioso central, particularmente en el cerebro.
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
AU674891B2 (en) 1992-10-15 1997-01-16 Toray Industries, Inc. Process for producing major histocompatibility antigen class II protein and material having the same immobilized thereon
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
HU9501974D0 (en) 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthrop Inc Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
ES2290951T3 (es) 1993-05-11 2008-02-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Oligonucleotidos antisentido que combaten el corte y empalme aberrante y metodos de uso de los mismos.
EP0804590A1 (en) 1993-05-21 1997-11-05 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
CA2170869C (en) 1993-09-03 1999-09-14 Phillip Dan Cook Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
DE69417918T2 (de) 1993-11-30 2000-01-05 Mcgill University, Montreal Dna methyltransferase inhibierung
US5908779A (en) 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
WO1995015972A1 (en) 1993-12-09 1995-06-15 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
AU1925195A (en) 1994-02-22 1995-09-04 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5902880A (en) 1994-08-19 1999-05-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
FR2727867B1 (fr) 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
GB9501465D0 (en) 1995-01-25 1995-03-15 King S College London Nucleoside phosphorothioate derivatives,synthesis and use thereof
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
IT1275862B1 (it) 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
IT1276642B1 (it) 1995-03-03 1997-11-03 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso presente in linfociti b ed oligodeossinucleotidi sintetici utili per inibirne l'azione
US5543165A (en) 1995-06-06 1996-08-06 Hill; Julie B. Process of making a soluble tea product with champagne-like properties
US5739311A (en) 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
DK0882061T3 (da) 1996-02-14 2004-09-27 Isis Pharmaceuticals Inc Sukkermodificerede gapped oligonukleotider
US6504007B1 (en) 1996-03-14 2003-01-07 Genentech, Inc. GDNF receptor
WO1997039120A2 (en) 1996-04-17 1997-10-23 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of vascular endothelial growth factor (vefg/vpf) expression
US5786213A (en) 1996-04-18 1998-07-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of endogenous gastrin expression for treatment of colorectal cancer
US5756710A (en) 1996-06-05 1998-05-26 The Trustees Of Columbia University In City Of New York Phosphorothioate oligonucleotides that bind to the V3-loop and uses thereof
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US5849902A (en) 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6013786A (en) 1997-08-22 2000-01-11 Hybridon, Inc. MDM2-specific antisense oligonucleotides
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
DE04020014T1 (de) 1997-09-12 2006-01-26 Exiqon A/S Bi-zyklische - Nukleosid,Nnukleotid und Oligonukleotid-Analoga
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6034883A (en) 1998-01-29 2000-03-07 Tinney; Charles E. Solid state director for beams
US6175409B1 (en) 1999-04-02 2001-01-16 Symyx Technologies, Inc. Flow-injection analysis and variable-flow light-scattering methods and apparatus for characterizing polymers
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US7321828B2 (en) 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
US6221587B1 (en) 1998-05-12 2001-04-24 Isis Pharmceuticals, Inc. Identification of molecular interaction sites in RNA for novel drug discovery
US6833361B2 (en) 1998-05-26 2004-12-21 Ribapharm, Inc. Nucleosides having bicyclic sugar moiety
HUP0102152A3 (en) 1998-05-26 2002-04-29 Icn Pharmaceuticals Inc Costa Nucleosid and oligo nucleotid analogues having bicyclic sugar derivative
US20030139359A1 (en) 2001-12-04 2003-07-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phospholipid scramblase 3 expression
US6100090A (en) 1999-06-25 2000-08-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of PI3K p85 expression
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6214986B1 (en) 1998-10-07 2001-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bcl-x expression
US6376541B1 (en) 1998-11-06 2002-04-23 Alcon Manufacturing, Ltd. Upregulation of endogenous prostaglandins to lower intraocular pressure
US5985663A (en) 1998-11-25 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of interleukin-15 expression
EP1621212B1 (en) 1999-01-27 2011-11-16 Coda Therapeutics, Inc. Formulations comprising antisense nucleotides to connexins
BRPI0008131B8 (pt) 1999-02-12 2021-05-25 Daiichi Sankyo Co Ltd composto ou um sal deste, análogo de oligonucleotídeo, composição farmacêutica, sonda para um gene,iniciador para começar a amplificação, uso de um análogo de oligonucleotídeo ou de um sal deste farmacologicamente aceitável, agente antisentido, e, agente antígeno
AU767133B2 (en) 1999-02-26 2003-10-30 University Of British Columbia, The TRPM-2 antisense therapy
JP4726302B2 (ja) 1999-03-15 2011-07-20 ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア Ａｂｃ１ポリペプチドおよびコレステロール水準を調節する方法と試薬
US20040137423A1 (en) 1999-03-15 2004-07-15 Hayden Michael R. Compositions and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
CA2368169C (en) 1999-03-18 2012-07-10 Exiqon A/S Detection of mutations in genes by specific lna primers
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
US6734291B2 (en) 1999-03-24 2004-05-11 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
AU3418800A (en) 1999-03-24 2000-10-09 Exiqon A/S Improved synthesis of (2.2.1)bicyclo nucleosides
NZ514350A (en) 1999-03-26 2004-12-24 Aventis Pharma Inc Compositions and methods for effecting the levels of cholesterol
ATE386127T1 (de) 1999-04-08 2008-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Verbesserung der immunantwort als anwendung in impfstoff und gentherapie
AU4657500A (en) 1999-04-21 2000-11-02 Pangene Corporation Locked nucleic acid hybrids and methods of use
PT1178999E (pt) 1999-05-04 2007-06-26 Santaris Pharma As Análogos de l-ribo-lna
US20030233670A1 (en) 2001-12-04 2003-12-18 Edgerton Michael D. Gene sequences and uses thereof in plants
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
DE19925073C2 (de) 1999-06-01 2001-07-19 Stefan Weiss Nucleinsäuremoleküle mit spezifischer Erkennung von nativem PrP·S··c·, Herstellung und Verwendung
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
AU781437B2 (en) 1999-06-25 2005-05-26 Serono Genetics Institute S.A. A novel BAP28 gene and protein
US20040006031A1 (en) 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of HMG-CoA reductase expression
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
EP1218411A4 (en) 1999-09-20 2004-09-01 Millennium Pharm Inc SECRETED PROTEINS AND THEIR USES
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6986988B2 (en) 1999-10-06 2006-01-17 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger RNA
US6528262B1 (en) 1999-10-06 2003-03-04 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger RNA
WO2001051630A1 (en) 2000-01-07 2001-07-19 Baylor University Antisense compositions and methods
WO2001051490A1 (en) 2000-01-14 2001-07-19 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methanocarba cycloalkyl nucleoside analogues
US6303374B1 (en) 2000-01-18 2001-10-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of caspase 3 expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
JP2001247459A (ja) 2000-03-03 2001-09-11 Oakland Uniservices Ltd 癌の組み合わせ療法
US6936467B2 (en) 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
KR20030003240A (ko) 2000-03-27 2003-01-09 유니버시티 오브 델라웨어 개질된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 이용한 표적염색체 게놈 변경법
US7402434B2 (en) 2000-05-08 2008-07-22 Newman Stuart A Splice choice antagonists as therapeutic agents
EP1294754A1 (en) 2000-06-29 2003-03-26 Pharma Pacific Pty. Ltd. Interferon-alpha induced gene
WO2002009700A1 (en) 2000-07-28 2002-02-07 Cancer Research Technology Limited Cancer treatment by combination therapy
AU2001282522A1 (en) 2000-08-29 2002-03-13 Takeshi Imanishi Novel nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
CA2420656A1 (en) 2000-09-02 2003-02-26 Grunenthal Gmbh Antisense oligonucleotides against vanilloid receptor 1
US6444464B1 (en) 2000-09-08 2002-09-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of E2F transcription factor 2 expression
EP1319014A1 (en) 2000-09-20 2003-06-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of flip-c expression
WO2002031141A2 (en) 2000-10-13 2002-04-18 Institut De Cardiologie De Montreal Antisense oligonucleotide directed toward mammalian vegf receptor genes and uses thereof
US20030228618A1 (en) 2000-11-24 2003-12-11 Erez Levanon Methods and systems for identifying naturally occurring antisense transcripts and methods, kits and arrays utilizing same
US20050222029A1 (en) 2001-01-04 2005-10-06 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating diseases
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
WO2002068470A2 (en) 2001-02-26 2002-09-06 Pharma Pacific Pty Ltd Interferon-alpha induced gene
US20020147165A1 (en) 2001-02-22 2002-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
AUPR497101A0 (en) 2001-05-14 2001-06-07 Queensland University Of Technology Polynucleotides and polypeptides linked to cancer and/or tumorigenesi
IL143379A (en) 2001-05-24 2013-11-28 Yissum Res Dev Co Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses
US7053195B1 (en) 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
US20050019915A1 (en) 2001-06-21 2005-01-27 Bennett C. Frank Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
ES2566561T3 (es) 2001-07-12 2016-04-13 University Of Massachusetts Producción in vivo de ARN pequeños de interferencia que median el silenciamiento génico
US7153954B2 (en) 2001-07-12 2006-12-26 Santaris Pharma A/S Method for preparation of LNA phosphoramidites
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7259150B2 (en) 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
EP1446412B1 (en) 2001-09-04 2012-03-07 Exiqon A/S Novel lna compositions and uses thereof
US6936589B2 (en) 2001-09-28 2005-08-30 Albert T. Naito Parenteral delivery systems
US20040214766A1 (en) 2001-10-01 2004-10-28 Kari Alitalo VEGF-C or VEGF-D materials and methods for treatment of neuropathologies
DE60209380T2 (de) 2001-10-10 2006-10-19 Société des Produits Nestlé S.A. Kaffeepflanze mit verringerter alpha-d-galaktosidase-aktivität
US7125982B1 (en) 2001-12-05 2006-10-24 Frayne Consultants Microbial production of nuclease resistant DNA, RNA, and oligo mixtures
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CA2365811A1 (en) 2001-12-21 2003-06-21 Institut De Cardiologie A new gene therapy using antisense strategy to estrogen receptors (er .alpha. and/or er .beta.) to optimize vascular healing and cardioprotection after vascular injury
KR20030056538A (ko) 2001-12-28 2003-07-04 주식회사 웰진 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발
US20030191075A1 (en) 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
AU2003212729A1 (en) 2002-02-25 2003-09-09 Gunnar Norstedt Vitamin d upregulated protein 1 (vdup-1) methods and uses thereof
WO2003077215A2 (en) 2002-03-08 2003-09-18 Glen Research Corporation Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same
GB2386836B (en) 2002-03-22 2006-07-26 Cancer Res Ventures Ltd Anti-cancer combinations
US7169916B2 (en) 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US20050215504A1 (en) 2002-04-02 2005-09-29 Bennett C F Antisense modulation of sterol regulatory element-binding protein-1 expression
EP1501930A2 (en) 2002-04-05 2005-02-02 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation hif-1alpha expression
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
US20040033480A1 (en) 2002-08-15 2004-02-19 Wong Norman C.W. Use of resveratrol to regulate expression of apolipoprotein A1
AU2003270537B2 (en) 2002-09-10 2008-03-20 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Methods and compositions for production of flavonoid and isoflavonoid nutraceuticals
JP2006500070A (ja) 2002-09-25 2006-01-05 ファルマシア・コーポレーション ファルネソイドｘ受容体発現のアンチセンス調節
AU2003278957A1 (en) 2002-09-26 2004-04-23 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
GB2394658A (en) 2002-11-01 2004-05-05 Cancer Rec Tech Ltd Oral anti-cancer composition
MXPA05004722A (es) 2002-11-01 2005-08-03 Univ Pennsylvania Composiciones y metodos para la inhibicion del factor inducible por hipoxia 1 alfa con acido ribonucleico corto de interferencia.
WO2004041838A1 (en) 2002-11-01 2004-05-21 University Of Massachusetts Regulation of transcription elongation factors
EP1562971B1 (en) 2002-11-05 2014-02-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
WO2004042029A2 (en) 2002-11-05 2004-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomers comprising modified bases for binding cytosine and uracil or thymine and their use
US20060009410A1 (en) 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
US7687617B2 (en) 2002-11-18 2010-03-30 Santaris Pharma A/S Oligonucleotides with alternating segments of locked and non-locked nucleotides
US7250289B2 (en) * 2002-11-20 2007-07-31 Affymetrix, Inc. Methods of genetic analysis of mouse
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7790867B2 (en) 2002-12-05 2010-09-07 Rosetta Genomics Inc. Vaccinia virus-related nucleic acids and microRNA
US7713738B2 (en) 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
US7339051B2 (en) 2003-04-28 2008-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
WO2004108081A2 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
US7541344B2 (en) 2003-06-03 2009-06-02 Eli Lilly And Company Modulation of survivin expression
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
CN100558893C (zh) 2003-09-18 2009-11-11 Isis药物公司 eIF4E表达的调节
US8258105B2 (en) 2003-10-07 2012-09-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides optimized for kidney targeting
EP1675948A2 (en) 2003-10-23 2006-07-05 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA)
RU2377301C2 (ru) 2003-12-23 2009-12-27 Сантарис Фарма А/С ОЛИГОМЕРНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ПОНИЖАЮЩЕЕ ЭКСПРЕССИЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕНА Bcl-2, КОНЪЮГАТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОМЕРНОГО СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
AU2005206794B2 (en) 2004-01-12 2010-09-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Up-regulation of bone morphogenetic protein (BMP) gene expression in bone cells by electromagnetic signals
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
GB0403041D0 (en) 2004-02-11 2004-03-17 Milner Anne J Induction of apoptosis
EP1566202A1 (en) 2004-02-23 2005-08-24 Sahltech I Göteborg AB Use of resistin antagonists in the treatment of rheumatoid arthritis
US7402574B2 (en) 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
CA2567937A1 (en) 2004-05-26 2005-12-08 Rosetta Genomics Ltd. Viral and viral associated mirnas and uses thereof
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7297786B2 (en) 2004-07-09 2007-11-20 University Of Iowa Research Foundation RNA interference in respiratory epitheial cells
KR20070018146A (ko) * 2004-07-20 2007-02-13 세네스코 테크놀로지스 인코포레이티드 염증 반응을 저해/억제하기 위한 아폽토시스-특이적ｅＩＦ-5Ａ ｓｉＲＮＡ 및 안티센스 폴리뉴클레오타이드의이용
WO2006023880A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
KR101176245B1 (ko) 2004-11-09 2012-08-22 엔존 파마슈티컬즈, 인코포레이티드 ＨＩＦ－１ａ 발현의 억제를 위한 효능적 ＬＮＡ 올리고뉴클레오티드
US7795233B2 (en) * 2004-11-19 2010-09-14 Miyagi Ken Composition comprising double stranded RNA that inhibits expression of NEU3 and method for treating cancer
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
WO2006113743A2 (en) 2005-04-18 2006-10-26 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for rna interference with sialidase expression and uses thereof
US7737265B2 (en) 2005-06-27 2010-06-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. RNAi modulation of HIF-1 and therapeutic uses thereof
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
WO2007028065A2 (en) 2005-08-30 2007-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
US20070074300A1 (en) * 2005-09-28 2007-03-29 Suleiman Igdoura Sialidase inhibitors for the treatment of cardiovascular disease
AU2006305886C1 (en) 2005-10-28 2011-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of huntingtin gene
CA2626584A1 (en) 2005-11-04 2007-05-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of nav1.8 gene
DK2641970T3 (en) 2005-11-17 2015-02-02 Univ Texas Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA
EP1957109A2 (en) * 2005-12-02 2008-08-20 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of cdc2-like kinases (clks) and methods of use thereof
CN101378764A (zh) 2005-12-09 2009-03-04 贝勒研究院 通过血液白细胞微阵列分析对系统性红斑狼疮的诊断、预后和疾病发展的监测
CN100356377C (zh) 2005-12-20 2007-12-19 无锡永中科技有限公司 文档显示方法
WO2007071824A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Oy Jurilab Ltd Novel genes and markers associated with high-density lipoprotein -cholesterol (hdl-c)
CN101437933B (zh) * 2005-12-28 2013-11-06 斯克里普斯研究所 作为药物靶标的天然反义和非编码的rna转录物
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
PL1984381T3 (pl) 2006-01-27 2011-03-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
WO2007115168A2 (en) 2006-03-31 2007-10-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of eg5 gene
EP2015758B1 (en) * 2006-05-05 2014-04-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating expression apob
KR101036126B1 (ko) 2006-05-11 2011-05-23 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 및 방법
US7547684B2 (en) 2006-05-11 2009-06-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1867338A1 (en) 2006-05-30 2007-12-19 Université Libre De Bruxelles Pharmaceutical composition comprising apolipoproteins for the treatment of human diseases
WO2007143752A2 (en) 2006-06-09 2007-12-13 The Regents Of The University Of California Targets in breast cancer for prognosis or therapy
WO2008057556A2 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate ese-1 transcription factor function and to treat ese-1 transcription factor associated diseases
WO2008066672A2 (en) 2006-11-06 2008-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate transcription factor function and to treat transcription factor associated diseases
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
EP2121939B1 (en) 2007-01-19 2013-12-04 Plant Bioscience Limited Methods for modulating the sirna and rna-directed-dna methylation pathways
CA2686933A1 (en) 2007-04-06 2008-10-16 The Johns Hopkins University Methods and compositions for the treatment of cancer
US20080293142A1 (en) 2007-04-19 2008-11-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction
CN106995819B (zh) 2008-07-01 2020-10-20 孟山都技术公司 用于调控靶基因表达的重组dna构建体和方法
EP2177615A1 (en) 2008-10-10 2010-04-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for a genome wide identification of expression regulatory sequences and use of genes and molecules derived thereof for the diagnosis and therapy of metabolic and/or tumorous diseases
US8606289B2 (en) 2008-11-10 2013-12-10 Qualcomm Incorporated Power headroom-sensitive scheduling
US8464551B2 (en) 2008-11-18 2013-06-18 Air Products And Chemicals, Inc. Liquefaction method and system
US9209196B2 (en) 2011-11-30 2015-12-08 Sharp Kabushiki Kaisha Memory circuit, method of driving the same, nonvolatile storage device using the same, and liquid crystal display device

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100105760A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-29 Curna, Inc. Treatment of Apolipoprotein-A1 Related Diseases by Inhibition of Natural Antisense Transcript to Apolipoprotein-A1

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
T. HASEGAWA et al., Role of Neu4L sialidase and its substrate ganglioside GD3 in neuronal apoptosis induced by catechol metabolites, FEBS Letters, Issue 581, pp. 406-412, 2007. ПРОШИН С.Н., ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ СИАЛИДАЗ В ФОРМИРОВАНИИ ПЛАСТИЧНОСТИ НЕРВНОЙ ТКАНИ, Психофармакология и биологическая наркология, т.7, NO. 1, с. 1414-1418, 2007. K. YAMAGUCHI et al., Evidence for mithchondrial localization of a novel human sialidase (NEU4), Biochemical Journal Vol. 390, Issue 1, pp. 85-93, 2005. *
YAMANAMI et al., Down-regulation of sialidase NEU4 may contribute to invasive properties of human colon cancers, Cancer Sci Vol. 98, NO. 3, pp. 299-307, 2007. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2698199C1 (ru) * 2018-05-18 2019-08-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии" Средство для подавления экспрессии генов, связанных с накоплением холестерина макрофагами человека

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012047956A2 (en) 2012-04-12
RU2013115852A (ru) 2014-11-20
KR101886457B1 (ko) 2018-08-07
EP2625274A4 (en) 2014-04-02
US20150167007A1 (en) 2015-06-18
ES2640755T3 (es) 2017-11-06
TWI645036B (zh) 2018-12-21
TW201219569A (en) 2012-05-16
CA2813901C (en) 2019-11-12
EP2625274A2 (en) 2013-08-14
CN103210086B (zh) 2017-06-09
JP2014503179A (ja) 2014-02-13
WO2012047956A3 (en) 2012-06-21
KR20130138233A (ko) 2013-12-18
US8993533B2 (en) 2015-03-31
US20130245095A1 (en) 2013-09-19
CN103210086A (zh) 2013-07-17
CA2813901A1 (en) 2012-04-12
JP5986998B2 (ja) 2016-09-06
EP2625274B1 (en) 2017-07-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2585229C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с атональным гомологом 1 (атон1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена атон1
RU2620980C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn
RU2611191C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных со связывающим половые гормоны глобулином (гспг), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к гспг
RU2597972C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с геном альфа-l-идуронидазы (idua), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена idua
RU2615450C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
RU2624048C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4
US9771593B2 (en) Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TNFR2
RU2611195C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с интерферон- связанным регулятором развития 1 (ifrd1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ifrd1
RU2619185C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с разобщающим белком 2 (ucp2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ucp2
RU2639550C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с сайт-1 мембраносвязанной пептидазой транскрипционных факторов (mbtps1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к mbtps1
RU2616283C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с субстратом рецептора инсулина 2 (irs2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к irs2
RU2608493C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с nanog, путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта nanog
RU2611190C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с геном dlg, путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена dlg
JP5964232B2 (ja) ‘ｉｑモチーフ含有ｇｔｐアーゼ活性化タンパク質’（ｉｑｇａｐ）に対する天然アンチセンス転写産物の阻害によるｉｑｇａｐ関連疾患の治療
WO2010148065A9 (en) Treatment of paraoxonase 1 (pon1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pon1
WO2011017516A2 (en) Treatment of insulin gene (ins) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (ins)
WO2012009347A2 (en) Treatment of bcl2 binding component 3 (bbc3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bbc3
RU2575608C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с белком апоптозного ответа простаты par4, путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена par4