KR100245767B1 - 무작위바이오-올리고머 라이브러리, 라이브러리의 합성방법 그리고 이의 이용방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일정크기의 공지된 성분물의 바이오-올리고머의 라이브러리를 제공하고 라이브러리에는 바이오-올리로머의 모든 가능한 서열을 포함하고 이 합성방법을 제공한다. 라이브러리의 바이오-올리고머는 펩티드, 핵산 또는 이들의 혼합물이다. 본 발명은 결합 생활성과 촉매활성과 같은 소요의 특징을 설명하는 라이브러리에서 바이오-올리고머를 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명은 공지된 기술보다는 라이브러리에서 유용한 바이오-올리고머 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 그리고 질병의 치료 또는 진단에 유용한 방법을 제공한다.

Description

무작위 바이오-올리고머 라이브러리, 라이브러리의 합성방법 그리고 이의 이용방법{RANDOM BIO-OLIGOMER LIBRARY, A METHOD OF SYNTHESIS THEREOF, AND A METHOD OF USE THEREOF}
1. 발명의 분야
본 발명은 고형 서포트에 부착된 바이오-올리고머의 라이브러리에 관계하는데 각 고형상 서포트는 단일 바이오-올리고머종이 부착되어 있고 바이오-올리고머의 모노머 단량체들의 모든 가능한 조합으로 구성된 라이브러리이다. 본 발명의 바이오-올리고머는 펩티드로 올리고뉴클레오티드 또는 키메릭 펩티드-올리고뉴클레오티드 구조일 수 있다. 본 발명은 이와 같은 라이브러리의 합성방법에 관계한다. 본 발명은 올리고머 라이브러리를 이용하여 소요의 생물학적 활성을 나타내는 분자 또는 중개물질에 결합시킬 수 있는 리간드를 확인하고 특징화하는 것에 관계한다. 바이오-올리고머 라이브러리는 화학반응을 촉매할 수 있다.
2. 발명의 배경
리간드의 인식과 결합은 거의 생물학적 공적 예로써, 면역인식, 세포 시그날과 통신, 전사와 해독, 세포내 시그날과 촉매 효소반응과 같은 것을 조절한다. 호르몬, 성장인자 그리고 신경전달인자와 같은 리간드의 활성을 길항 또는 저항할 수 있는 길항제로 작용하는 물질을 확인하는 것이 이 기술분야에 숙원이 되어왔다. B-세포(항체-중개) 또는 T-세포(세포-중개) 면역반응을 유도하고 화학반응을 촉매할 수 있고 전사 또는 해독단계에서 세포발현을 조절할 수 있다.
특히 흥미로운 것이 단백질 또는 펩티드 리간드이다. 이들은 호르몬, 성장인자 신경활성분자와 면역 에피토프의 주된 구성물이다. 또한 길항작용을 하거나 또는 수용체-조절 생물학적 활성을 저항하거나 항체 또는 T-세포 에피토프의 대부분의 효과가 펩티드가 된다. 제약학적 약물의 개발은 수용체 결합부위에 중요한 열쇠가 된다. 그러나 펩티드 리간드 서열의 결정에 있어서 어려움이 가장 큰 장애물이다. 이와 같은 서열의 완전한 수와 다양성이 특정 복합물질을 분리해내고 에피토프의 위치를 확인하고 이 에피토프를 서열화하는 것을 제외한 것이 실행할 수 없는 목표가 되어왔다. 이와 같은 문제점은 에피토프가 1차서열에는 인접하지 않는 아미노산 잔기로 구성된다는 복합적인 문제와 연결되어 있다.
이 분야의 몇몇 연구자는 특정 아미노산에 상보적인 뉴클레오티드에 기초한 아미노산 서열을 결정함으로써 시간 소모적인 과정을 극복하려는 시도를 해왔다. 단백질은 아미노산으로 구성된 거대 펩티드로써: 각 아미노산은 세 개의 핵산잔기의 하나 혹은 그이상의 코돈으로 인코드되어 있다. 예로써 아미노산 글루타민을 포함하는 펩티드A는 세 개의 핵산코드 즉: 시토신, 아데닌과 구아닌에 의해 인코드되어 있다. 이 코드에 상보적인 것이 구아닌(시토신과 결합), 티민(아데닌과 결합) 그리고 시토신이 되고 이것이 펩티드B의 아미노산 코드가 된다. 상보이론에 따르면 펩티드B는 펩티드A와 결합한다. 특히 보스트와 블라록크는 주어진 펩티드가 핵산 상보서열로 인코드된 또다른 펩티드에 결합할 수 있고 이 정보에 의해 상보 펩티드의 아미노산 서열을 예측할 수 있다. 이것은 펩티드를 합성하는 서열과 이들의 결합능에 사용할 수 있다.
이와 같은 접근방식은 상기 문제점을 해결할 수는 없으나 상보펩티드 사이의 결합친화력이 일반적으로 낮기 때문에 15잔기이상의 상보펩티드가 요구된다. 또한 이와 같은 접근방식은 소요단백질의 결합파트너의 아미노산 서열 또는 핵산서열의 지식이 요구된다. 또한 이와 같은 접근방식은 1차서열에서는 접촉하지 않은 아미노산으로 구성된 에티포트에는 작업을 할 수 없다.
최근에는 수용체에 결합할 수 있는 펩티드 리간드를 확인하는데 이용할 수 있고 펩티드 라이브러리의 제조에 관계하는 보고서가 있다. 한 방식은 거대 라이브러리를 만드는 재조합 박테리오 파아지를 이용하는 것이다. '파지방법'(Scott and Smith 1990, Science 249:386-390; Cwirla, et al., 1990, PNAS, 87:6378-6382; Devlin et al., 1990, Science 249:404-406)을 이용하여 거대 라이브러리를 만들 수 있다. 유전코드와 생물학적 시스템은 시스템의 다양성에 유전적 제한이 있다. 두 번째 방법은 Geysen 방법(Geysen et al., 1986, Molecular Immunology 23:709-715; Geysen et al., 1987, J. Immunologic Method 102:259-274)에 의한 화학적 방법을 이용하고 최근의 Fodor et al(1991, Science 251, 767-773)이 예가 된다. 한정된 수의 펩티드(103-104)의 Geysen 방법은 몇일간의 폴리에틸렌 핀에서 합성할 수 있다. Fodor 방법은 'light-directed spatially addressable parallel chemical synthesis' 기술을 이용한다. 이 기술은 광화학 펩티드 합성 방법 개발의 부족에 의해 제한을 받는다.
거대 평행 동시 펩티드 합성 기술은 개발되었다. Houghton 에 의하면 폴리프로필렌 메쉬 펙에서 동시에 유사한 펩티드를 수백개를 합성할 수 있다고 한다(tea bag method (Houghton, 1985, PNAS, 82:5131-5135), Berg et al., (1989, J. Am. Chem. Soc. 111:8024-8026)에서는 신규한 폴리스티렌-그래프트 폴리에틸렌 필름이 평행하게 펩티드 합성을 지탱할 수 있다고 한다. 이 두 기술은 표준 Boc 아미노산 수지와 표준 비보호법, 중화법, 결합과 Merrifield의 원 고형상과정 프로토콜을 이용한다(1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154).
푸르카(1988, 14th International Congress of Biochemistry, Volum 5, Abstract FR:013)에서 세 개의 상이한 아미노산의 결합에 의한 펩티드 혼합물을 생산하고 수지에 혼합한다. 푸르카에 의한 이 과정은 생산된 펩티드의 다수에서 소요의 펩티드를 분리하는 방법에는 만족할만한 것이 못된다.
Geysen, Fodor, Houghton, Berg와 Furka의 화학기술에서 동시에 수천 펩티드를 합성하고 검사할 수 있다. 이 기술은 가능한 수만펩티드 서열에 한정되는데 소요의 부분 사이에 결합부분에 상응하는 하나이상의 부분이 있어야 한다. 다섯 개의 아미노산 서열에서 공지된 20개 아미노산으로 20 또는 3.2 ×106의 아미노산 조합이 된다. 이 모든 과정이 동시에 수만펩티드를 합성할 수는 없다. 또한 다양한 펩티드 사슬길이에 의해 다수성이 생성된다. Stewart 와 Young (1984, Solid Phase Synthesiz, Second Edition, Pierce Chemical Co., Rockford)에 설명된 통상적인 펩티드 합성으로는 동시에 수만 펩티드의 합성 방법이 되지는 못한다.
또한 통상적인 펩티드 합성방법중에는 완전히 무작위로 고형상 서포트에 결합하는 펩티드 라이브러리의 합성방법이 없다. 완전 무작위 펩티드 라이브러리는 펩티드의 모든 종을 동량을 포함하는 라이브러리와 같은 모든 분자종의 종은 통계적 분포에 하나가 된다.
완전 무작위 펩티드의 합성은 다양한 아미노산을 단일반응 용기에 넣어서는 실행할 수 없는데 그 이유는 다양한 아미노산의 결합속도가 고형상 펩티드 합성(SSPS) 동안에 상이하기 때문이다(Ragnarsson et al., 1971, Acta. Chem. Scand 25:1487, 1489; Ragnarsson et al., 1974, J. Org. Chem. 31:3837-3842). 예로써 성장 펩티드에 Fmoc-글리신의 결합속도는 Fmoc-발린보다 훨씬 빠른데 발린의 큰 옆사슬로 인한 공간적 방해 때문이다. 결합반응 1회동안에 수지에 모든 20개 활성 진핵 L-아미노산을 혼합할 경우 대부분의 신속한 반응 아미노산은 펩티드에 적절하게 결합하고 각 펩티드종이 동량으로는 수득할 수 없다. 또한 친핵성은 모든 각기 상이한 반응성을 가진다.
또한 이전의 펩티드 합성 방법으로는 단일 고형상 서포트에 단일 펩티드종이 부착된 103펩티드보다 더큰 라이브러리 합성방법이 없다. 서포트에 한종만이 나올 경우 펩티드 분리기술을 강화시킬 수 있다.
따라서 바이오-올리고머 서열과 같은 올리고 핵산서열과 무작위 펩티드 서열의 라이브러리가 필요하고 단일 바이오-올리고머종은 나머지 라이브러리에서 신속하게 분리할 수 있다. 또한 이들 무작위 바이오-올리고머 서열수만을 합성하는 신속한 방법이 필요하다.
3. 발명의 요약
본 발명은 모든 가능한 서브유닛의 조합으로 구성된 바이오-올리고머의 라이브러리와 라이브러리를 만드는 방법과 이 라이브러리의 이용방법에 관계한다.
특히 본 발명은 SPS의 두 개의 엘리코트를 제공하는 단계를 반복하는 것으로 구성된 라이브러리 생성방법과 SPS의 엘리코트에 서브유닛을 제공하고; SPS의 모든 부위에 실제적인 완전한 결합 서브유닛으로 고형상 서포트를 형성하고 결합의 수를 추정하고 필요하다면 완전한 반응으로 강화시키고 고형상 서포트/신규 서브유닛 복합물을 완전히 혼합하고 전술한 단계를 반복하여 고형상 서포트에 연결된 바이오 올리고머의 보호그룹을 제거한다. 구체예에서 서브유닛은 아미노산이고 바이오-올리고머는 펩티드이다. 또다른 구체예에서 서브유닛은 뉴클레오시드이고 바이오-올리고머는 올리고뉴클레오티드이다. 구체예에서 뉴클레오시드는 데옥시리보뉴클레산 또다른 구체예에서는 서브유닛이 아미노산 또는 뉴클레오시드이고 바이오-올리고머는 펩티드-올리고뉴클레오티드 키메라이다.
본 발명은 수용체 분자에 대한 바이오-올리고머 리간드 서열을 결정하는 방법으로 고형상 서포트에 부착된 바이오-올리고머의 무작위 라이브러리를 만들고 각 고형상 서포트는 단일 바이오-올리고머에 부착되고 바이오-올리고머의 모노머 서브유닛의 모든 가능한 조합이 수득되고 무작위 라이브러리를 유도하고, 상기 수용체 분자와 같은 소요의 분자 또는 기질분자는 고형상 서포트/바이오-올리고머 종을 인지하고 결합하고 라이브러리 또는 기질분자는 라이브러리내의 하나이상의 고형성 서포트/바이오-올리고머종에 의해 화학반응을 촉매하고 소요의 특징을 발휘하는 고형상 서포트/바이오-올리고머 복합물을 분리하고 분리된 고형상 서포트/바이오 올리고머의 바이오-올리고머를 서열화한다. 또다른 구체예에서는 바이오-올리고머의 일부가 고형상 서포트/바이오-올리고머 복합체에서 해리되어 소요의 생물학적 활성을 감지할 수 있다. 한 구체예에서 바이오-올리고머는 펩티드이다. 또다른 구체예에서 바이오-올리고머는 올리고뉴클레오티드 특히 DNA 또는 RNA 이다. 또다른 구체예에서 바이오-올리고머는 키메릭 펩티드/올리고뉴클레오티드이다.
본 발명은 전술한 방법에 따라 결정된 바이오-올리고머 서열로 구성된 치료요법적 그리고 진단약물을 제공한다.
도 1는 말단 트립토판이 첨가된 랜덤 3펩티드의 스플리트 합성을 사용한 무작위 펩티드합성 조직표이다. X-X-X-W(X=S,A 또는 V 가능성 33=27).
도 2는 사이클릭 펩티드의 구조도이다. n=0,1,2,3,…m=1,2,3,…n과 m은 동가일 수도 있고 아닐수도 있다. 굵은 선은 직선 펩티드의 결합을 나타내고 점선은 교차결합을 나타낸다. A와 B는 교차결합 서브유닛쌍이 되고 A는 A와 B는 B와 결합한다. (a) 바스켓 모티프, (b) 래드 모티프, (c) 라리아트 모티프.
도 3는 무작위 4가 펩티드(X-X-X-W, X=S,A 또는 V)의 크로마토그램이다(C18역상 HPLC Vydac). 사용방법은 (A) 새로운 방법, (B) 표준 고형상 펩티드 합성 크로마토그램은 아세토니트릴의 직선농도 컬럼에서 용출하여 얻을 수 있다. 용매 A : 0.1% 트리플로로아세트산과 5% 아세토니트릴 용매 B : 0.1% 트리플로로아세트산과 100% 아세토니트릴.
도 4는 'long v-mos' 펩티드/비드의 포토그라프-항-v-mos 항체와 제 2 항체로 라벨시킴.
도 5는 항-v-mos 항체와 제 2 항체로 라벨된 'long v-mos' 비드와 'short v-mos' 혼합물의 포토그래프.
도 6는 항-v-mos 항체와 제 2 항체로 라벨된 'long v-mos' 비드와 'short v-mos' 혼합물의 포토그래프.
도 7는 일반적인 펩티드 리간드 라이브러리 스크리닝 포토그래프. 양성(검청색) 비드는 수천 음성(무색) 비드에서 용이하게 확인할 수 있다.
도 8는 스트렙타아비딘-알칼린 포스파타제에 의한 LHPQF-수지 미모토프비드의 착색에 의한 농도 의존성 저해효과를 나타내는 포토마이크로 그래프이다. A:100nM; B:10nM; C:1nM; n:0.1nM 바이오틴 블랙비드(β-알라-아미노카프론산-수지)는 내부음성 콘트롤로 작용하는 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제로 배양시키기전에 LHPQFD-수지로 1:1 혼합한다.
5. 발명의 상세한 설명
본 발명의 적절한 구체예는 상세히 참고문헌에 만들었다.
여기에서 '라이브러리'는 무작위 바이오-올리고머의 수집물을 말한다. '바이오-올리고머'는 100개 서브유닛보다 작은 중합물을 이야기한다. 본 발명의 바이오-올리고머는 펩티드로 아미노산 서브유닛 또는 올리고핵산 또는 펩티드-올리고 핵산 키메라로 될 수 있다.
5.1. 무작위 바이오-올리고머 라이브러리의 생성방법
상기 언급한 것과 같이, 본 발명은 무작위 서브유닛 서열의 바이오-올리고머를 합성함으로써 바이오-올리고머 라이브러리를 만드는 방법과 관계한다. 여기에서 '무작위 단량체 서브유닛 서열'이란 불특정 단량체 소단위가 앞선 또다른 단량체 소단위에 이어지는 것을 말한다.
한 구체예에서 단량체 소단위는 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티도미메틱일 수 있다. '펩티도미메틱'이란 두 개이상의 아미노산으로된 펩티드를 화학적 그리고 구조적으로 닮은 분자를 의미한다. 또다른 구체예에서 단량체 소단위는 뉴클레오시드일 수 있는데 뉴클레오시드는 리보핵산 또는 데옥시리보 핵산이 된다. 또다른 구체예에서는 단량체 소단위가 아미노산과 뉴클레오시드일 수 있다. 바이오-올리고머는 펩티드(아미노산으로 구성) RNA 올리고핵산(리보핵산으로 구성) DNA 올리고핵산(데옥시리보핵산으로 구성), DNA-RNA 키메릭 올리고핵산 또는 펩티드-올리고 핵산 키메라일 수 있다. 펩티드, 올리고핵산, 또는 펩티드-올리고핵산 키메라로 구성된 라이브러리 다음과 같은 단계를 반복하여 생성할 수 있다:
(i) 무작위 소단위 서열을 SPS의 적어도 2개에 제공하고;
(ii) SPS의 엘리코트에 소단위로 별도로 도입하고;
(iii) SPS의 모든 부분에 소단위에 완전히 결합하여 SPS/소단위 조합이 형성되고;
(iv) 결합의 정도를 추정하고, 그리고 필요한 경우 완전한 결합이 되도록 하고;
(v) SPS/신규 소단위 조합을 완전히 혼합시키고; 그리고 소요의 횟수만큼 (i)-(v)를 반복하고 최종단계로 (vi) SPS에 결합되어 있는 바이오 올리고머 보호그룹을 제거한다. 구체예에서 무작위 바이오-올리고머 라이브러리는 동일한 소단위로 모든 고형상 서포트와 결합시켜 준비하고 적어도 다른 단계에서 두 개의 서브유닛을 SPS에 결합시킨다. 무작위 바이오-올리고머 라이브러리는 상기 (i)-(v) 단계의 1회 반복으로 생성될 수 있는데 또다른 구체예에서 무작위 바이오-올리고머 라이브러리는 상기 (i)-(v) 단계의 1회 이상 반복으로 생성할 수 있다. SPS는 하나이상의 소단위가 결합된 것을 사용한다.
바이오-올리고머 라이브러리는 예정한 수의 제한된 소단위로 구성된다. 또다른 구체예에서 무작위 바이오-올리고머 라이브러리는 모든 가능한 소단위로 구성될 수 있다.
또다른 구체예에서 소요의 바이오-올리고머는 연속적인 공정에 의해 확인할 수 있는데 우선 라이브러리를 만들고 소요의 특징을 가진 바이오-올리고머 서열을 확인한다. 확인된 바이오-올리고머 서열로 구성된 서포트를 준비한다. 단량체 소단위 서열을 이전의 확인된 서열에 첨가하고 공지된 서열을 포함한 신규서열과 소요의 특징을 가진 무작위 서열을 확인한다. 이와 같은 일련의 적정화 무작위 전략은 소요의 바이오-올리고머의 신속한 확인을 가능하게 한다.
본 발명의 바이오-올리고머는 실제로 동량으로 라이브러리에 존재한다. 본 기술분야에 숙지된 자는 물질의 그람당 1몰라량의 농도를 용액 1리터에 용해시켜 만들 수 있다. 여기에서 바이오-올리고머의 '동일 몰라량'은 동일 농도에 있는 단량체 종을 말한다. 따라서 150,000 바이오-올리고머 수득에서 바이오-올리고머A는 리터당 200 p몰이 있고 150,000 바이오-올리고머종의 나머지는 대략 200pmole/리터가 있다. 그러나 여기에서 동량 몰라농도는 고형서포트 크기를 헤아리는데 사용할 수 있다. SPS의 이형성이 서포트에 부착될 수 있는 바이오-올리고머의 양을 다양하게 할 수 있게 된다.
본 발명의 방법에서 SPS의 적어도 두 개의 엘리코트를 사용하는데 있어서 고형상 서포트의 수와 합성될 바이오-올리고머의 수가 상응한다. 이것은 각 고형상 서포트에 원비드-원 바이오 올리고머와 같이 단일 바이오-올리고머종을 포함하는 라이브러리를 만든다. '엘리코트'란 전체 SPS의 양을 일정하게 나눈 부분을 나타낸다.
5.2. 무작위 펩티드 라이브러리
특정구체예에서 무작위 바이오-올리고머는 펩티드로 구성된다. 펩티드란 광의의 의미에서 두 개이상의 아미노산, 아미노산 유사체 또는 펩티도미메틱스를 말한다. 소단위는 펩티드 결합으로 연결될 수 있다. 또다른 구체예에서 소단위는 에스테르, 에테르등과 같은 다른 결합으로 연결될 수 있다. '아미노산'의 의미는 클리신과 D와 L 광학 아이소머와 자연 또는 비자연계 합성 아미노산과 펩티도미메틱스를 말한다. 세 개이상의 사슬이 짧은 아미노산 펩티드를 통상적으로 올리고 펩티드라 한다. 펩티드 사슬이 긴 경우에는 폴리펩티드 또는 단백질이라 한다.
본 발명은 합성 펩티드 화학에 기초하고 증폭 또는 스크린등의 어떤 생물체에 의존하지는 않는다. 따라서 본 발명의 펩티드는 D 아미노산, D와 L-아미노산의 복합과 라이브러리내에 펩티드에 특정 성질을 주는 '디자이너' 아미노산 (예로 β-메틸 아미노산, Cα-메틸 아미노산과 Nα-메틸 아미노산등)으로 구성된다. 또한 특이한 결합단계에서 α-헤릭스, β-턴, β-쉬트-턴과 원형 펩티드등이 생성될 수 있다.
본 발명의 라이브러리에는 펩티드를 구성하는 아미노산의 모든 가능한 조합이 포함된다. 두 개 아미노산 글리신(g)과 프롤린(P)으로 만들어진 2가 펩티드를 사용하면 4개의 조합이 가능하다: g-g, g-p, p-g과 p-g 그리고 무작위 라이브러리에는 4개의 조합이 포함된다.
제 1 아미노산을 각 엘리코트에 별도로 도입한다. 펩티드 합성에 사용되는 아미노산은 Nα-아미노 보호된 9-플로로에닐메톡시카보닐(Fmoc) 아미노산이 된다(Carpino와 Han 1972, J. Org. Chem. 37:3403-3409). 본 발명의 방법은 Boc-아미노산(Nα-아미노 보호된 Nα-t-부틸옥시카보닐)을 사용한다. Fmoc와 Boc Nα-아미노 보호 아미노산은 Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical Bachem 또는 Peninsula Lab 에서 얻을 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 본 기술분야에 숙지된 다른 Nα-보호 그룹을 사용할 수 있다.
상기 설명한 이가펩티드로 도입된 아미노산은 g-p으로 구성되고 각 엘리코트는 Nα-Fmoc-g 또는 Nα-Fmoc-p를 수용한다.
도입후에 제1아미노산은 SPS의 모든 부위에 완전히 결합될 수 있다. 여기에서 사용된 '완전한 결합'은 결합반응이 각 아미노산의 결합속도의 상이성과는 관계없이 유도되는 것을 의미한다. 또한 아미노산은 SPS의 모든 결합부위를 이용하여 결합할 수 있고 각 SPS는 실제로 펩티드 한종만을 포함한다. 완전한 결합은 고형상 서포트/제1아미노산 조합이 된다. 상기 설명한 이가 펩티드를 사용하여 결합이 완전할 때 비드-g 복합물과 비드-p 복합물이 생성된다.
아미노산 결합은 Stewart 와 Young 에 의해 실행되었다. 본 기술분야에 숙지된 자에 의해 SPS에서의 펩티드 합성 과정은 카르복실 또는 C-단부에서 펩티드가 만들어지고 C-단부 아미노산의 α-아미노기는 고형상 중합물에 부착되어 있다. 보호기를 절단해내고 그다음 아미노산을 보호하여 고형서포트에 부착된 아미노산의 α-아미노기를 펩티드 결합에 의해 결합된다. 이전 아미노산의 비보호 반복과 추가 아미노산의 결합은 펩티드가 완전히 형성될때까지 반복한다. 아미노산의 반응 곁사슬은 화학기에 의해 보호되어 결합과 Nα-비보호에 저항하게 되고 이것은 합성의 말기에 제거할 수 있다.
성장하는 합성사슬에 아미노산을 결합시키기 위해 차단시킨 아미노산의 C-그룹을 활성화시킨다. 본 발명에서는 활성화에 다양한 방법이 포함될 수 있는데 PSA, PMA, 염산, 활성 에스테르와 카르복실산 활성등이 되고 Fields 와 Noble (1990, 'Solid Phase peptide synthesis utilizing 9-fluorenylmethoxy carbonyl amino acids' Int. J. Pept. Protein Res. 35:161-214)가 될 수 있다.
Fmoc 아미노산의 사용은 펩티드 합성의 한 방법이 된다. Boc 방법도 고형상 서포트에 결합된 펩티드 라이브러리를 만드는데 사용할 수 있다(Geysen et al., 1987, J. Immunol. Methods 102:259-274).
결합의 완전성도 추정할 수 있다. 본 기술분야에 숙지된 자는 닌히드린, 피크릭산, 2,4,6-트리니트로벤젠설폰산, 플로레스카민과 클로로닐과 같은 공지된 정량 검사방법에 숙지되어 있고, 이는 발색성분물을 생산하는 아미노산과 시약반응을 기초로 하는 것이다. 아미노산(Pro와 Hyp)이 사용될 경우 이사틴 검사방법이 적절하다. 반응 완전성의 정량은 Salisbury et al (International Patent Publication, No WO91/03485)에 상술한 것과 같이 반응과정 동안에 감지할 수 있다.
Fmoc 합성에서는 카이져 테스트가 적절하다. 카이져 테스트에서는 각 튜브의 시료는 Sarin et al에서 제시된 Pierce Chemical에서 수득한 닌히드린 시약으로 검사할 수 있다(1981, Anol. Biochem. 117:147-157).
이 검사에 의해 정량한 경우 결합반응이 불완전할 경우 반응은 본 기술분야에 숙지된 몇가지 방법으로 완전화시키는데 (a) 보호아미노산의 1-5배를 사용하여 제2결합시키고, (b) 상이한 또는 추가의 용매 트리플로로에탄을 사용하여 추가 결합시키고 또는 (c) NaCTO 또는 LiBr (Klis and Stewart 1990, 'Peptides : Chemistry, Structure and Biology 'Rivier and Marshall, eds, ESCOM Publ., p. 904-906)와 같은 염을 추가한다.
결합반응이 완전히 종료된 후 고형 서포트/제1아미노산 복합물을 완전히 혼합한다. 단일 반응용기에서 엘리코트를 일정하게 혼합한다. 본 발명의 영역에서 완전한 혼합과 방법의 다양성은 숙지된 자가 잘 인지할 수 있으나 예로써 통상적으로 이용할 수 있는 볼텍스 또는 쉐이킹 또는 질소 또는 아르곤과 같은 비활성기체에 의한 버블링등이 포함된다.
생성된 혼합물은 적어도 2개의 엘리코트 파트로 나눌 수 있다. 이와 같은 엘리코트는 동일이 되고 혼합이 완전하게 되면, 고형상 서포트/제1아미노산 복합물이 동량 포함된다. 이가펩티드를 사용할 경우 각 엘리코트는 비드-글리신과 비드-플로린 복합물질이 동량 포함된다.
이와 같은 엘리코트는 제2아미노산에 별도로 도입한다. 제2아미노산 세트는 (a) 제1세트 예로 글리신 또는 플로린에 첨가된 동일한 아미노산; (b) 트립토판 또는 루이신과 같은 상이한 아미노산; (c) 이소루이신과 같은 한종의 아미노산으로 구성될 수 있다.
제1아미노산 세트와 같이 제2아미노산 세트는 각 엘리코트의 고형상 서포트/제1아미노산 복합물질에 각각 완전히 결합되어 제1아미노산과 제2아미노산으로 구성된 펩티드를 형성한다. 이전의 결합에서와 같이 결합은 공지된 기술을 사용하여 실행할 수 있다. 상기 언급한 2가 펩티드를 이용하여 (a) 동일한 아미노산 세트를 첨가하여 생성된 펩티드는 g-g, g-p, p-g 또는 p-p가 되고; (b) 상이한 아미노산을 사용하여 생성된 펩티드는 Gly-Trp, Gly-Leu, Pro-Trp 또는 Pro-Leu이 된다; (c) 한종의 아미노산을 사용하여 생성된 아미노산은 Gly-Ile 또는 Pro-Ile이 된다.
아미노산을 첨가하는 것을 수회 반복하는 방법이다. 소요의 펩티드가 X-X-X-Trp일 경우 X-X-X-Trp 4가 펩티드를 얻기 위해 3회 반복한다. 아미노산의 제1, 제2 그리고 제3도입에서 Nα-Fmoc 발린, Nα-Fmoc 세린 또는 Nα-Fmoc 알라닌을 고형상 서포트에 첨가하여 27개의 동량의 상이한 펩티드를 얻을 수 있다(제1도). 6가 펩티드가 필요한 경우 이 과정을 6회 반복한다. 6가 펩티드는 5개 상이한 아미노산으로 구성되어 5개 엘리코트를 이용하여 각 결합단계에서는 상이한 아미노산을 가지고 있다. 그러나 12개 아미노산으로 구성된 6가 펩티드일 경우 각 결합단계에서 12개 엘리코트를 이용해야 한다.
본 발명의 펩티드 합성의 방법은 아미노산이 이미 부착되거나 그렇지 않는 고형상 서포트로 사용할 수 있다. 또한 고형상 서포트에 이미 부착된 링커를 이용할 수 있다. 아미노산이 부착된 통상적인 서포트는 β-알라닌-PAM-수지(Bachem Biochemical)이다. 이와 같은 수지는 펩티드 합성분야에 공지된 실험실 또는 통상적인 소스로 이용할 수 있다.
고형상 서포트/아미노산 복합물 또는 고형상/서포트-링커를 초기 시약으로 사용할 경우 두 개의 엘리코트로 나눌 수 있는데 각각이 제1아미노산 세트에서 아미노산을 수용할 수 있다. 상기 설명한 것과 같이 제1아미노산 세트는 고형상 서포트/아미노산 복합 또는 고형상 서포트/링커의 모든 결합부위에 완전히 결합된후 신규의 첨가 아미노산을 포함하는 엘리코트를 완전히 혼합한다. 상기 언급한 것과 같이 결합반응은 펩티드를 만들기 위해 반복한다. 이 과정은 소요의 펩티드가 생성될때까지 수회 반복한다.
이 방법은 무작위 펩티드를 합성하는데 사용되고 또한 예정된 서열을 가진 펩티드 라이브러리의 합성에도 사용된다. 예정된 서열의 합성은 특이 결합단계동안에 특이 Nα-Boc, Nα-Fmoc- 또는 다른 적절한 보호 아미노산을 이용한다. 예로써 특이 결합단계에서 아미노산을 선택하면 생성된 펩티드는 특정2차 구조 예로 β-쉬트, α-헤릭스, β-턴등의 구조를 가질 수 있다. Glu, Ala, Leu, His, Trp등이 사용될 경우 α-헤릭스가 적절하고 β-쉬트의 경우에는 Val, Ile, Tyr, Met의 사용이 적절하다. 또한 Gly, Asn, Ser, Pro, Asp 이 사용될 경우 β-턴 구조가 적절하다. N-단부부근에 산성아미노산이 C-단부부근에 염기성 아미노산이 있을 경우에 α-헤릭스 구조가 안정하다. D-아미노산은 특정턴을 안정화시키고 상당수의 다른 구조 모티프에 결합될 수 있다. 이황화 락탐, 락톤 또는 다른 링 클로징 모티프와 사이클 펩티드 라이브러리를 만들 수 있다.
본 발명의 방법으로 레진 비드와 같은 고형상 서포트에는 단 한종의 펩티드를 포함하는 펩티드를 합성할 수 있다. 이 방법은 각 개별수지 비드는 각 결합 사이클 동안에 단 하나의 Fmoc 아미노산과 접촉하고 결합을 완전하게 유도한다. 원-비드 원-펩티드 합성은 결합하는데 특이적인 펩티드를 분리하고 효능을 증가시킨다.
본 발명은 105내지 107의 상이한 펩티드종의 무작위 펩티드를 합성하는데 사용할 수 있다.
본 발명에서 라이브러리의 펩티드는 글리신 또는 글리신-아미드기를 가장하기 위해 CO2H 또는 CONH2곁사슬이 결합되어 있는 C-단부에 특이 아미노산으로 구성될 수 있다. 특이잔기가 비드에 결합되거나 또는 링커로 구성된 곁사슬과 D 또는 L 아미노산 유사체일수도 있다. 한 구체예에서 허위-C-단부 잔기가 D 또는 L 광학적 모양일 수 있고 또다른 구체예에서는 D 와 L-아이소머의 라세믹 혼합물이 사용될 수 있다.
또다른 구체예에서 피로글루타메이트는 라이브러리의 펩티드 N 단부로 포함될 수 있다. 피로글루타메이트를 에드만 분해, N-단부 피로글루타메이트 비드의 펩티드 50%의 치환에 의해 수정될 수 없는 경우에는 서열화를 위해 비드에 비-피로글루타메이트 펩티드를 충분히 남기게 한다. 숙지된 자는 이 기술이 N단부에서 에드만 분해에 저항성이 있는 잔류물이 결합될 수 있는 특징 펩티드의 서열화에 사용할 수도 있다. 각 펩티드를 특징화시키는 다른 방법으로는 상술한 소요의 활성을 설명할 수 있다. 특이활성 펩티드가 N-단부그룹 예로 피로글루타메이트로 구성될 경우 특정 N-단부그룹은 50% 펩티드에 있고 비-차단성 펩티드(0%)와 완전-차단성 펩티드(100%)의 활성을 비교하여 설명할 수 있다.
본 구체예에서 유용한 화학적 그리고 구조적 특징을 가진 펩티드 소단위를 선택할 수 있다. 예를 들면 D-아미노산으로 구성된 펩티드는 L-아미노산 특이적 단백질 분해효소에 저항성이 있다. 또한 본 발명은 구조적 특징을 가진 펩티드 라이브러리를 만들거나 펩티도미메틱스의 사용 에스테르 결합과 같은 펩티도미메틱 결합을 이용하여 신규한 특징을 가진 라이브러리를 만들 수 있다. 또다른 구체예에서 펩티드 라이브러리는 R1-CH2-NH-R2와 같이 환원된 펩티드 결합이 첨부되어 만들어지고 이때 R1과 R2는 아미노산 잔기 또는 서열이 된다. 환원 펩티드 결합은 2가펩티드 서브유닛으로 도입될 수 있다. 이와 같은 분자는 단백질 분해효소 활성화 같은 펩티드결합 가수분해에 저항성이 있다. 이와 같은 라이브러리는 메타볼릭 분해에 저항성이 있거나 또는 단백질 분해효소 활성에 저항성이 있기 때문에 생체내에서 증가된 반감기와 같은 독특한 기능과 활성의 리간드를 제공할 수 있다. 또한 펩티드를 수용하는 특정시스템은 기능활성을 강화시키고(Hruby 1982, Life Science 31:189-199; Hruby et al., 1990, Biochem J. 268:249-262) 본 발명은 모든 위치에서 무작위 서열을 결합시키는 한정 펩티드를 사용하는 방법을 제공한다.
5.2.1. 한정된 사이클릭 펩티드
한정된 사이클릭 또는 리지드 펩티드는 하기 설명하는 방법에 따라 만들 수 있는데 모든 라이브러리의 모든 펩티드 서열의 두 위치에 아미노산 또는 아미노산 유사체를 삽입하여 교차결합을 형성시키기 위해 처리한 후에 펩티드를 제한하고 원형화 또는 리지드 시키기 위한 교차결합 가능한 기능기를 제공한다. 원형화는 회전-유도성 아미노산이 결합될 때 유리하다. 펩티드를 교차결합시킬 수 있는 아미노산으로는 이황화결합을 만드는 시스테인, 락톤 또는 락탐을 형성하는 아스파르트산과-카르복실-글루타민산과 같은 킬레이트등이 된다(전이금속으로 교차결합을 형성할 수 있고 보호된-카르복실 글루타민산은 Zee-Cheng과 Olson에 의한 방법을 변형시켜 준비할 수 있다(1980, Biophys, Biochem. Res. Commun. 94:1128-1132). 교차결합을 만드는 적어도 두 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 서열에서 시스테인 잔기를 산화시켜 이황화 결합 또는 금속이온을 첨가하여 킬레이트를 만들어 펩티드를 교차결합시키고 제한된 사이클 또는 리지다이즈 펩티드를 형성한다.
본 발명은 라이브러리를 만드는데 이용하는 일반적인 견고성 모티프 세트를 제공한다. 구체예에서(도면 2a) 교차결합 잔기의 두쌍은 '바스켓'을 만들기 위해 배열하였다. 이와 같은 '바스켓' 모티프는 촉매진과 같은 특정상황에 사용할 수 있고, 또한 제한된 구조에서 신규한 결합능을 가질 수 있다. 도면 2b 에 나타난 또다른 구체예에서 '사다리' 모티프와 같은 교차결합 잔기 두쌍을 만들 수 있다. '사다리' 모티프의 D와 L-아미노산을 교대 사용하여 모든 곁사슬을 한면으로 할 수 있고 글라미시딘에서 볼 수 있는 β-장벽과 유사한 것도 만들 수 있다. 이와 같은 면을 유일한 촉매 부위를 제공할 수 있다. 또다른 구체예에서 단순한 '밧줄' 모티프를 만들 수 있는데 도면 2c 에서 볼 수 있다. 펩티드 루프를 제공하는데 있어 짧은 '밧줄' 모티프는 구조적으로 한정된 직선 펩티드를 만들게 되고 알파 헤릭스와 같은 제2차 구조를 안정화시키게 된다.
인터 펩티드 교차결합은 리지드 펩티드 메트릭스를 만들게 한다.
본 발명은 체계적인 교차결합제를 만드는 전략을 제공한다. 예로써 펩티드 서열에 4개의 시스테인 잔기가 결합될 경우 상이한 보호기가 사용된다(Hiskey 1981, The Petpides : Analysis, Synthesis, Biology Vol 3, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press : Ney York, pp 137-167; Ponsanti et al., 1990, Tetrahedron 46:8255-8266). 시스테인의 첫쌍은 보호되지 않고 산화되며 그다음 둘째 세트가 보호되지 않고 산화된다. 이와 같은 한정된 이황화 결합 교차-결합이 형성될 수 있다. 또한 시스테인 쌍과 킬레이팅 아미노산 유사체쌍이 결합되어 교차결합물은 상이한 화학특정을 가진다.
5.2.2. 구조적 한정을 유도하는 비-표준성 아미노산
다음의 비-표준성 아미노산은 특정 구조적 모티프를 유도하기 위해 무작위 펩티드 라이브러리에 결합될 수 있다: 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실레이트(Kazmierski et al., 1991, J. Am. Chem. Soc. 113:2275-2283); (2S,3S)-메틸-페닐알라닌, (2S,3R)-메틸-페닐알라닌, (2R,3S)-메틸-페닐알라닌과 (2R,3R)-메틸-페닐알라닌(Kazmierski and Hryby, 1991, Tetrahedron Lett); 2-아미노테트라헤드론펜탈렌-2-카르복실산(Landis, 1989, Ph. D. Thesis, University Of Arizona); 하이드록시-1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카르복실레이트(Miyake et al., 1989, J. Takeda. Res. Labs, 43:53-76); β-카르볼린(D와 L)(Kazmierski, 1988, Ph. D. Thesis, University Of Arizona); HIC(Zechel et al., 1991, Int. J. Pep. Protein Res. 43); HIC(Dharanipragada).
다음의 아미노산 유사체와 펩티드미메틱스는 특정 2차구조를 유도하기 위해 선택된 라이브러리에 결합될 수 있다. LL-Acp, β-턴 유도 유사체(Kemp 1985, J. Org. Chem. 50:5834-5838); β-쉬트유도체(Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:5081-5082); β-턴유도 유사체(Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett 29:5057-5060); α-헤릭스 유도체(Kemp et al., 1988, Tetrahedron Lett 29:4935-4938);-턴 유도 유사체(Kemp 1989, J. Org. Chem. 54:109-115)와 다음의 참고문헌에서 제공되는 유사체 : Nagai and Sato, 1985, Tetrahedron Lett, 26:647-650; DiMaio et al., 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans, p 1687; Gly-Ala턴 유사체(Kahn et al., 1989, Tetrahedron Lett. 30:2317); 아미드결합 이소스테르(Jones et al., 1988, Tetrahedron Lett. 29:3853-3856); 트레트라졸(Zabrocki et al., 1988, J. Am. Chem. Soci 110:5875-5880) DTC(Samanen et al., 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35:501-509)와 Olson, 1990, J. Am. Chem. Sci. 112:323-333과 Garvey 1990 J. Org. Chem. 56:436에 지시한 유사체.
전술한 비-표준 펩티드와 펩티도미메틱스는 표준 에드만 분해서열 분석에서 수정될 수는 없지만 잔류사슬의 아미노산 분석이 따르는 에드만 분해로써 소요의 활성을 가진 펩티드 구조를 결정하는데 사용할 수 있다. 또한 다량의 스펙트럼 분석이 이용될 수 있다.
5.2.3. 유도된 변형 펩티드
본 발명은 라이브러리에 변형 또는 유도성 펩티드를 제공한다. 펩티드의 변형은 공지 기술분야의 숙지된 자가 잘 알 수 있고 포스포릴화반응, 카복시메틸화 반응과 아실레이션등이 포함된다. 변형은 화학적 또는 효소적 수단으로 실행할 수 있다.
또한 글리코실화된 또는 지방산 아실화 펩티드 유도체로 이용할 수 있다. 글리코실화 또는 페티아실화 펩티드의 준비는 다음의 참고문헌에 예시되어 있다.
1. Garg and Jeanloz, 1985, in Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press.
2. Kunz, 1987, in Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308.
3. Horvat et al., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 31:499-507.
4. Bardaji et al., 1990, Ang. Chem. Int. Ed. English, 23:231.
5. Toth et al., 1990, in Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshal, eds., ESCOM Publ., Leiden, pp. 1078-1079.
6. Torres et al., 1989, Experientia 45:574-576.
7. Torres et al., 1989, EMBO J. 8:2925-2932.
8. Hordever and Musiol, 1990, in Peptides: Chemistry, Structure and Biology, loc. cit., pp. 811-812.
9. Zee-Cheng and Olson, 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun. 94:1128-1132.
10. Marki et al., 1977, Helv. Chem. Acta. 60:807.
11. Fuju et al., 1987, J. Chem. Soc. Chem. Commun., pp. 163-164.
12. Ponsati et al., 1990, Peptides 1990, Siralt and Andreu, eds., ESCOM Publ., pp. 238-240.
13. Fuji et al., 1987, 1988, Peptides: Chemistry and Biology, Marshall, ed., ESCOM Publ., Leiden, pp. 217-219.
펩티드-카르보하이드레이트 연결의 두가지 종류가 있다. 첫째 세린 또는 트레오딘 하이드록실과 설탕의 하이드록실에 결합된다. 둘째는 아미노결합이 슈가의 아미노그룹의 글루타메이트 또는 아스파라테이트 카르복실기와 결합된다. 특히 참고문헌 1과 2에서는 펩티드-카보하이드레이트 에테르와 아미드를 만드는 방법을 제공한다. 아세틸과 케탈결합은 펩티드에 카보하이드레이트를 결합시킬 수 있다.
페티 아실 펩티드 유도체를 만들 수 있다. 예를 들면 자유 아미노기(N-말단 또는 리신)가 아세틸화 즉 미리스토릴화 된다. 또다른 구체예에서 (CH2)nCH3구조의 알리파틱 곁사슬로 구성된 아미노산이 라이브러리의 펩티드에 결합될 수 있다. 본 발명에 사용된 펩티드-지방산 결합물이 U.K 특허 GB-8809162.4 와 PCT/AU89/00166에 상술되어 있다.
5.3. 무작위 올리고핵산 라이브러리
핵산으로 구성된 선택성 라이브러리의 합성 방법은 Caruthers에 의해 개발된 포스포라이데이트 방법에 의한 DNA의 고형상 합성에 적합할 수 있다(1985, Science 230:281; Caruthers et al., 1987, Methods in Enzymology 154:287-313).
실리카 비드 비수용성 중합 서포트와 보호된 데옥시핵산을 상업적으로 이용할 수 있다(Peninsula Lab, Inc). 보호된 디옥시핵산의 예로는 5'-0-디메톡시트리틸데옥시티미딘, 5'-0-디메톡시트리틸-4-N-벤조일데옥시시티딘, 5'-0-디메톡시트리틸-N-벤조일데옥시아데노신과 5'-0-디메톡시트리틸-N-이소 부틸 데옥시구아노신이다. 다른 특이 보호기는 이용시마다 달리 사용할 수 있다. 이에 상응하는 데옥시뉴클레오시드 3'-포스포람디다이트는 Caruthers에 따른 고형 서포트에 결합시켜 합성할 수 있다. 예로써 제1데옥시뉴클레오시드를 데옥시아데노신으로 고정시킬 수 있다. 트리틸레이션후에 디클로로메탄으로 세척한 후 아세토니트릴로 세척하고, 고형 서포트는 4개의 동등한 엘리코트로 나누어 4개의 별도 반응용기에 옮긴다. 4개의 데옥시뉴클레오시드 3'-포스포라미다이트를 4개의 별도 반응용기에 첨가한다. 4개의 반응용기에서 고형-서포트의 결합이 종료된 후 완전히 혼합하고 I2/H2O/루티딘/THF 혼합물로 산화시킨다. 산화후 고형서포트는 아세토니트릴로 완전히 세척한 후 상기 사이클을 반복한다. 무작위 폴리데옥시핵산 사슬 합성이 종료된후(11개 결합단계후) 메틸 에스테르기는 티오페놀로 절단하고 DMT기는 트리클로로아세트산으로 절단한다. 보호안된 폴리뉴클레오티드 사슬은 고형 서포트에 공유결합시켜 두고 선택적인 선별방법을 사용한다.
본 발명은 포스포디에스테르 결합보다는 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것이 된다. 예로 올리고핵산이 포스포오티오네이트 결합에 삽입될 수 있다. 다른 변형된 포스포디에스테르 결합 또는 유사체등이 공지되어 있다. 이와 같은 변형된 결합은 엑소핵산 분해효소와 엔도효소 활성에 저항성이 있다.
12개 핵산과 라이브러리에서 각 결합단계에서 단지 4개의 DNA 또는 RNA만 사용되기 때문에 4개 가능한 핵산서열이 형성되고 총 1.68×10의 가능성이 있다. 또한 올리고핵산은 DNA와 RNA 뉴클레오시드를 이용하여 합성될 수 있다. 본 기술분야에 숙지된 자는 주요 뉴클레오시드, 특수/변형된 뉴클레오시드를 이용하는 것을 알 수 있다. 특수/변형된 뉴클레오시드에는 어떠한 리보 뉴클레오시드와도 생성될 수 있는 이노신, 메틸화된 퓨린 뉴클레오시드, 유리딘 유도체와 2'-0-메틸리보스를 포함한다.
5.4. 무작위 바이오-올리고머 라이브러리에 고형상 서포트와 링커의 사용
본 발명에 이용되는 고형상 서포트는 바이오-올리고머 합성 즉 펩티드 합성 또는 올리고핵산 합성등의 반응조건에서 삽입될 수 있다. 본 발명에 이용된 고형상 서포트는 단량체 소단위가 결합할 수 있도록 반응기를 가져야 하고 링커의 부착 또는 단량체 소단위의 개시 결합부위를 조절하기 위해 반응기가 있어야 한다. 한 구체예에서 고형상 서포트는 바이오-올리고머 라이브러리(예로 TentaGel, Rapp Poymere, Tubingen, Germany)의 직접 응용의 서포트 또는 운반자로 사용할 수 있다. 특정 구체예에서 고형상 서포트는 구강으로 소모할 수 있다. 또다른 구체예에서 고형상 서포트는 크로마토그래피 서포트로 유용한다.
여기에서 고형상 서포트는 특수형태의 서포트에 한정하지 않는다. 이 분야에 공지되어 있는 대다수의 서포트를 이용할 수 있다. 고형상 서포트에는 실리카겔 수지 유도성 플라스틱 필름, 글라스비드, 코튼, 플라스틱 비드, 알루미나 겔등이 포함된다. 적절한 고형상 서포트는 소요의 최종물에 기초하여 선택할 수 있다. 예로써 펩티드 합성시에는 고형상 서포트는 폴리스티렌(PAM수지:Bachem Inc 수득) POLYHIPE 수지(Aminotech에서 수득) 폴리아미드수지(페니슐라 Lab에서 수득) 폴리에틸렌글리콜이 결합된 폴리스티렌수지(TentaGel, Rapp Poymere, Tubingen) 또는 폴리디메틸아크릴아미드수지(밀리겐/바이오리서치에서 수득)와 같은 수지가 적절하다. 펩티드 합성의 구체예에서 고형상 서포트는 폴리디메틸아크릴아미드수지가 적절하다.
본 발명의 고형상 서포트는 링커로 구성될 수 있다. 여기에서 링커는 서포트와 합성될 펩티드 사이에 일정 공간을 제공할 수 있는 분자를 의미한다. 링커는 고형상 서포트에 공유결합으로 부착시키고 Nα-Boc 또는 Nα-Fmoc 또는 다른 적절한 보호성 아미노산으로 결합시킨다. 다양한 링커는 고형상 서포트에 올리고머를 결합시키는데 사용할 수 있다. 링커로는 아미노부틸산, 아미노카프론산, 7-아미노헵톤산 그리고 8-아미노캐프릭산등이 포함될 수 있다. Fmoc-아미노카프론산은 Bachem, Biochem에서 상업적으로 이용할 수 있고 구체예에서 링커는 스페이스로써 하나이상의 β-알라닌이 추가로 구성된다. 또한 고형 서포트는 바이오에서 또는 감지의 목적에 맞게 변성될 수 있다. 고형상 서포트의 변형은 특이링커의 결합으로 만들어질 수 있다. 예로써 변형된 고형상 서포트는 산-민감성, 염기-민감성, 뉴클레오필릭 민감성, 전자친화민감성, 광민감성, 산화 민감성 또는 환원 민감성으로 만들어질 수 있다.
상기 설명한 링커에 추가하여 선택적인 절단형 링커가 이용될 수도 있다. 자외선 민감성 링커 ONb를 사용하는 것을(Barany and Albenicia, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107:4936-4942) 단락 12에서 설명한다. 다른 절단형 링커에는 가수분해 또는 광분해가 요구된다. 광민감성(광절단성) 링커는 Wang (1976, J. Org. Chem. 41:32-58), Hammer et al (1990, Int. J. Pept. Protein Res. 36:31-45)와 Kreib-Cordonier et al (1990, in Peptides-Chemistry Structure and Biology, Ravier and Marshall, eds, pp. 895-897)에서 볼 수 있다. Landen (1977, Methods Enzym 47:149)에서는 수용성 포름산을 이용하여 Asp-Pro 결합을 절단하고 이와 같은 방법으로 Geysen 합성방법과 연결된 T-세포 결정부위를 특징화하는데 사용한다(Van der Zee et al., 1989, Eur. J. Immuno. 191;43-47). 염기성 조건에서 절단성이 있는 링커그룹은 P-(하이드록시메틸) 벤젠산 (Atherton et al., 1981, J. Chem. Soc. Perkin I:538-546)과 하이드록시아세트산(Baleaux et al., 1986, Int. J. Pept. Protein Res 28:22-28)등이 포함된다. Geysen et al (1990, J. Immunol. Methods 134:23-33)에서는 디케토피페라진 메타니즘에 의한 펩티드 절단을 보고하였다. 효소는 민감한 또는 효소 절단물질 예로 단백질 분해효소의 펩티드 절단; 올리고핵산의 엔도뉴클레아제의 절단과 같은 민감서열로 구성된 링커를 특이하게 절단한다. 예로써 절단형 링커로 치환된 수지의 10-50%를 유도하면 비절단형 링커로 치환된 나머지 50-90%는 링커의 절단후에 남아있는 펩티드가 충분하게 된다. 절단형 링커의 결합은 단일비드에서 연속적으로 절단하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 고형상 서포트는 소요의 바이오-올리고머로 구성되고 무작위 소단위 서열이 추가될 수 있다. 미리 결합된 바이오-올리고머는 여기의 전술한 방법에 따라 선택되거나 또는 소요의 특징을 가진 공지된 서열로 구성될 수 있다.
올리고 핵산방법에서는 실리카 비드고형 서포트가 적절하다. 5.3에서 언급한 것과 같이 실리카 비드 고형서포트는 상업적으로 이용할 수 있다(Peninsula Lab Inc에서 수득).
5.5. 소요의 바이오-올리고머의 확인과 감지방법
완전한 무작위 라이브러리를 제공하며 그 합성방법과 동시에 본 발명은 라이브러리내에 바이오-올리고머를 확인하기 위해 바이오-올리고머 라이브러리를 선별하는 방법에는 결합, 자극, 저해, 독성 맛등이 된다. 다른 바이오-올리고머 라이브러리는 효소활성, 효소저해활성 화학적 물리적 특징과 상술한 방법에 따라 선별할 수 있다.
최초 선별동안에 발견된 바이오-올리고머는 최종 리간드일 필요는 없다. 사실 제1차 선별동안에 선택되는 리간드의 통상적인 서열을 기초한 2차 라이브러리를 합성하는 것이 적절하다. 이와 같이 해서 좀더 엄격한 환경하에서 2차 스크린이 일어날 수 있도록 좀더 활성이 큰 리간드를 확인하는데 사용할 수 있다.
5.5.1. 결합검사
본 발명은 수용체 분자가 결합할 수 있는 바이오-올리고머 리간드의 확인할 수 있다. 여기에서 '수용체 분자'는 바이오-올리고머 리간드가 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 수용체 분자는 항체, 수용체 또는 바이러스와 같은 생물학적 거대분자일 수 있다. 또한 수용체분자는 단백질, 카보하이드레이트, 핵산, 지질, 약물, 금속 또는 소분자와 같은 화학성분물일 수 있다.
본 발명의 바이오-올리고머 라이브러리는 많은 상이한 수용체 분자와 결합할 수 있다. 특이 수용체 분자가 결합할 수 있는 특정 바이오-올리고머종을 확인함으로써, 소요의 바이오-올리고머 종을 생리적으로 분리시키는 것이 가능하다.
스크린/감지/분리단계동안에 소수의 비드를 제거하기 때문에 대부분의 비드는 남아있게 된다. 그러므로 무작위 바이오-올리고머 라이브러리는 여러번 사용할 수 있다. 상이한 수용체 분자에 사용되는 색상 또는 구조가 상이한 경우(수용체에 부착된 플로로레신(그린색) 텍사스레드(적색)와 DAPI(청색)과 같은 형광성 보고집단)과 형광현미경 또는 형광감지기의 적절한 여과 필터를 사용하는 경우 상이한 수용체가 펩티드 라이브러리에 결합되고 그리고 특이 리간드의 신속한 선별을 실행할 수 있다. 이와 같은 방법은 비용도 절감시키고 선별될 수용체 분자의 수도 증가된다.
본 발명의 방법에서 소요의 수용체 분자를 바이오-올리고머 라이브러리에 도입시키면 그것은 라이브러리내에 있는 하나이상의 바이오-올리고머종을 인지하고 결합한다. 수용체 분자가 결합하는 각 바이오-올리고머종은 단일 고형상 서포트에서 발견될 수 있고 바이오 올리고머는 확인되고 분리될 수 있다.
바이오-올리고머는 본 기술분야에 숙지된 자에 의해 공지된 통상적인 방법으로 분리될 수 있으나 본 발명의 방법에는 한정을 두지 않는다. 예로써, 특이 수용체 분자와 가장 강력한 물리-화학적 상호작용을 나타내는 고형상서포트/바이오-올리고머를 분리할 수도 있다. 물리-화학적 상호작용에 기초한 구체예에서 특이 수용체 분자용액을 105내지 107상 서포트와 등가인 무작위 펩티드 라이브러리에 첨가한다. 수용체분자는 항체와 펩티드사이에 결합이 일어날 수 있는 충분한 시간 예로써 22℃에서 1시간동안 수지로 배양시킨다. 그다음 바이오-올리고머/고형상 서포트로 피복된 수용체분자를 분리한다. 다음의 방법에서는 가용성 수용체 분자로 단클론 항체의 이용을 설명한다. 이와 같은 방법은 어떠한 수용체분자의 결합을 감지하는 적절한 것이 된다. 또한 다음은 펩티드 라이브러리에 관계하는 것으로써 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드-올리고뉴클레오티드 키메라 라이브러리를 검사할 수도 있다.
(i) 본 기술분야의 숙지된 기술에 의해 형광분자 또는 '발광분자'로 단클론 항체를 라벨시킨다. 1㎍/㎖ 농도항체를 펩티드 라이브러리에 도입시키고 1시간동안 22℃에서 서서히 혼합시켜 고형상 서포트는 세척하고 형광성 항체 고형상 서포트/펩티드 복합물을 확인하고 형광 활성화된 세포 분류기로 회수한다. 또한 형광물질 항체 고형상 서포트/펩티드 복합물을 확인하고 마이크로 조작기를 사용하여 형광물질 부착된 현미경하에 물리적으로 분리할 수 있다. 형광의 상대적인 강도는 단클론 항체에 펩티드-리간드 친화력에 일반적으로 비례한다.
(ii) 단클론 항체는 공지된 기술을 사용하여 페로-마그네틱 비드와 결합시킨다. 1㎍/㎖ 농도의 결합된 항체는 22℃에서 1시간 라이브러리와 배양시킨다. 마그네틱 비드는 강한 자석에 의해 물리적으로 분리될 수 있는 고형상 서포트/펩티드 주변에 로젯트를 형성한다.
(iii) 공지된 기술을 사용하여 단클론항체는 알칼린 포스파타제와 같은 효소로 결합시킨다. 항체-효소결합물을 22℃에서 30분 내지 1시간동안 무작위 펩티드 라이브러리와 배양한다. 세척후 전체 라이브러리를 알칼린 포스파타제의 기질 예로 5-브로모-4-클로로-3-인돌 포스페이트(BCIP) 또는 NBT를 포함한 페트리 디쉬에 넣고 몇분간 배양하면 고형상 서포트에 전환된 기질의 침전으로 인해 항체-고형상 서포트/펩티드 결합의 색이 변화된다. 따라서 현미경하에서 물리적으로 확인하여 분리할 수 있다. 색깔반응의 상대적인 강도는 단클론 항체와 펩티드의 친화력에 비례한다.
(iv) 단클론항체를 양고추냉이 퍼옥시다제와 같은 효소로 결합시킨다. 항체-효소결합물은 22℃에서 30 내지 1시간동안 무작위 펩티드 라이브러리로 배양한다. 세척후 총 라이브러리에 DAB, TME 또는 4CN과 같은 기질을 포함하는 배양접시에 넣는다. 몇분간 배양시킨 후에 항체-고형상 서포트/펩티드 복합물은 색이 변하고 현미경하에서 물리적으로 확인 분리할 수 있다. 색깔반응의 상대적인 강도는 단클론항체와 펩티드 사이에 친화성과 비례한다.
(v) 단클론항체는 공지된 기술을 이용하여 바이오틴으로 라벨링시킬 수 있다. 그다음 22℃에서 30분 내지 1시간동안 무작위 펩티드 라이브러리로 배양시킨다. 세척후에는 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제 또는 스트렙타아비딘-양고추냉이 산화제 복합물을 첨가하고 30분간 배양한다. 서포트를 세척하고 색은 (iii)의 효소방법과 같이 나타날 수 있다. 소요의 펩티드/고형상 서포트는 상기와 같이 물리적으로 분리될 수 있다.
가용성 수용체 분자를 이용하는 것에 추가하여, 다른 구체예에서는 고유세포를 사용하여 세포표면 수용체에 결합하는 바이오-올리고머를 감지할 수도 있다. 완전한 세포를 이용하면 다수-소단위 또는 라벨된 수용체의 용도에 적절하거나 또는 기능적으로 세포막의 리피드 도메인을 요구하는 수용체에 적절하다. 본 기술에 사용되는 세포는 살아있는 또는 고정된 세포일 수 있다. 세포는 표식세포와 이와 관련된 고형상 서포트/펩티드 사이에 '로젯트'를 형성하기 위해 라이브러리에서 특정 펩티드에 결합될 수도 있고 무작위 펩티드 라이브러리와도 배양할 수 있다. 로젯트는 현미경하에서 분리할 수 있고 상이한 원심분리에 의해 분리할 수도 있다.
또한 세포주로 패닝과정을 이용하여 라이브러리를 선별할 수도 있는데 세포주는 (i) 세포표면에는 소요의 수용체가 없는 '어미' 세포주와 (ii) 소요의 수용체를 코드하는 유전자로 어미세포주에 감염시켜 유도한 세포주 수용체-양성세포주가 된다. 다음과 같은 방법으로 라이브러리를 스크린할 수 있다. (i) 수용체-특이적 비결합 비드 또는 비관련성 비-결합비드를 없애기 위한 '패닝기술'에 의해 어미세포주 단층을 유도함으로써 수용체 분자가 없는 세포와 결합하는 비특이 라이브러리를 제거하고, (ii) 수용체-특이적 또는 비관련 비드를 포함하는 비-결합 비드를 제거하고 수용체-특이적 비드가 수용체 양성세포주에 결합될 수 있는 수용체 양성세포주 단층에 넣고, (iii) 부드러운 세척과 제거에 의해 비관련성 비-결합 비드를 제거하고, 그리고 (iv) 현미경 조작으로 수용체 특이 비드를 제거한다.
기능적 세포주의 리피드 도메인이 요구되는 수용체 또는 막결합 수용체의 검사에 의해 수용체 분자는 리포좀으로 재구성되고 보고그룹 또는 효소가 부착될 수 있다.
전술한 실시예가 펩티드 리간드에 관계하나 5.1., 5.2., 5.3 에 설명한 바이오-올리고머는 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서 수용체 분자는 비-표준적 원형화 구조적 영향 또는 구조적 한정 펩티드는 올리고핵산 또는 펩티드-올리고핵산 키메라에 결합할 수 있다.
한 구체예에서 수용체 분자는 직접 라벨링시킬 수 있다. 또다른 구체예에서 라벨된 제2시약은 소요의 바이오-올리고머를 포함하는 고형상 서포트에 수용체 분자의 결합을 감지하는데 사용할 수 있다. 결합은 효소라벨에 의해 크로모포어의 형성으로 감지할 수 있다. 적절한 효소는 알칼린 포스파타제와 양고추냉이 과산화제가 포함된다. 구체예에서, 소요의 상이한 수용체 분자에 두 개의 효소의 라벨된 두 개의 크로모제닉기질을 이용할 수 있다. 교차-반응성과 단일-반응성 리간드는 두가지-색검사로 확인할 수 있다.
본 발명에 사용되는 라벨로는 발색 라텍스 비드, 마그네틱 비드, 형광 라벨(FITC, PE, TR, 로다민, 프리 또는 킬레이트 란탄니드염, Eu3+), 체미루미네슨트 분자, 방사선 동위원소 또는 마그네틱 레조넌스 라벨등이 포함될 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 2색검사는 두 개이상의 발색 라텍스비드 또는 상이한 파장을 나타내는 형광포어등으로 실행할 수 있다. 라벨된 비드는 손으로 또는 기계적 수단으로 분리할 수 있다. 기계적 방식에는 FACS와 현미경 조작등의 형광활성화 분리등이 포함될 수 있다.
특이적 예로써 FITC를 이용할 수 있다.
생활성비드는 색강도, 형광강도, 마그네틱크기 또는 방사능 활성과 같은 라벨링에 기초하여 분리할 수 있다. 가장 강하게 라벨된 비드는 거대 스펙트럼 분석에 의해 선택하고 서열화하거나 또는 특징화한다. 또다른 구체예에서 아미노산 조성 결정과 같은 성분물 분석에 선택된 특정 라벨강도를 결정하는 비드가 된다. 성분분석에서 중요한 것과 같은 단량체 소단부의 세트 라이브러리를 만들어 선별할 수 있다.
또다른 구체예에서 결합상수와 같은 최상 결합 친화력과 바이오-올리고머는 라이브러리의 고형상 서포트가 감지될때까지 소요의 수용분자를 점진적으로 희석하여 확인할 수 있다. 또한 결합용액에서 또는 수용체 분자와 같은 표식 핵산과의 하이브리드가 증가한다. 결합 또는 라이브리드 전략은 (i) 이온력이 용액에서 증가하고; (ii) 요소와 같은 변성물질의 농도의 증가; (iii) 중성(pH7)에 관련된 pH 증가 또는 감소; (iv) 핵산의 경우에 Tm의 근접으로 증가할 수 있다. 고친화력의 상호작용의 결합을 한정시키는 용액상태의 변화방법은 공지되어 있다. 고형상서포트/바이오-올리고머에 수용체분자의 결합의 증가 또는 고도의 희석은 제한된 라이브러리 또는 모든 가능한 단량체 서브유닛으로 구성된 무작위 라이브러리에서 소요의 리간드를 감지하는데 사용될 수 있다.
또다른 구체예에서 낮은 친화성 결합을 설명하는 바이오-올리고머도 흥미있다. 이들은 우선 모든 고친화성 합바이오올리고머를 제거하고 그다음 낮은 스트랜젼시 또는 약한 희석상태에서의 결합을 감지하여 선택한다.
적절한 구체예에서 이중라벨 검사가 이용될 수 있다. 제1라벨은 수용성 리간드의 존재하에 비드와 수용체 분자의 비-특이적 결합의 감지에 사용된다. 라이브러리에서 라벨된 비드를 제거하고 수용성 리간드를 제거한다. 남아있는 비드에 특이결합 수용체 분자를 감지한다. 이와 같은 비드에 바이오-올리고머는 소요의 리간드와 같은 동일한 결합부위에 수용체 분자와의 결합을 기대할 수 있고 소요의 리간드를 모방할 수 있다. 이중 라벨검사는 검사의 제1단계에서 비-특이적 양성반응 비드의 제거가 있기 때문에 소요의 수용체 분자를 정제할 필요가 없는 장점이 있다.
5.5.2. 생활성검사
본 발명은 합성에서 남아있는 어떠한 독성분자를 제거하기 위해 처리한 라이브러리에서 바이오-올리고머의 생물학적 활성을 검사하는데 사용된다. 예로 증류수와 배양배지와 용매로 중화반응 또는 과다한 세척한다. 검사할 생물학적 활성에는 독성, 치사성, 자극 그리고 성장촉진과 생리학적 변화등이 포함될 수 있다.
적절한 구체예에서 라이브러리의 바이오-올리고머는 고형상 서포터에서 선택적으로 절단될 수 있는데 이를 '비드'라 한다. 한 구체예에서 비드는 선택적으로 절단된 바이오-올리고머의 부분이 될 수 있다. 선택적인 바이오-올리고머, 링커와 비드의 절단은 5.4에서 논의된바 있다. 바이오-올리고머의 부분 절단이 발생할 수 있는 절단제로 라이브러리를 처리한다. 절단제에는 UV, 산, 염기, 효소 또는 촉매등이 포함될 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 한 구체예에서 라이브러리는 바이오-올리고머 10-90%가 해리되도록 처리한다. 적절한 구체예에서 바이오-올리고머의 25-50% 가 해리된다. 모든 바이오-올리고머가 절단될 때 비-정량성 절단은 절단제에 한정하여 영향을 받는다. 한편 UV의 노출시간과 강도에 의해서도 한정받는다. 또다른 구체예에서, 약물의 농도로 제한한다. 효과적인 절단처리후 라이브러리는 중화반응 처리되어 서요의 검사에 적응할 수 있는 것으로 만든다. 실제로 공지된 기술에 숙지된 자는 고형상에 링크에 의해 부착된 라이브러리의 모든 바이오-올리고머를 절단할 수 있는 적절한 조건을 결정할 수 있을 것이다. 본 기술에 숙지된 자는 해리된 바이오-올리고머의 상대적인 농도가 다양한 절단조건에 의해 영향을 받을 수도 있다.
라이브러리의 비드를 고정화시킬 때 특정 바이오-올리고머의 농도의 경사가 형성된다. 바이오-올리고머의 고농도는 해리된 비드에서 발견될 수 있다. 따라서 소요의 생물학적 활성에서 비드에 근접하여 바이오-올리고머의 다른 특징 또는 서열화와 비드의 확인과 동정에 사용할 수 있다. 서열화 또는 다른 특징화에 의해 부분적인 절단후에도 비드에 충분히 남아있기 때문에 바이오-올리고머의 확인이 가능하다. 또다른 구체예에서 비드는 미량적정웰에서 분리되고(10비드/웰) 생물학적인 활성을 검사하여 확산에 의한 문제를 제거할 수 있다. 상기 설명하는 것과 같이 바이오-올리고머의 상이한 부분이 고형상 서포트에 결합되거나 또는 연속적인 검사를 위한 상이한 절단형 링커를 통해 비드에 결합될 수 있다. 이러한 실시예에서 '비드'는 고형성 서포트를 말한다.
다음의 실시예는 어떻게 생물학적 검사를 실행할 것인가를 설명한다.
(i) 단일 세포현탁액에 있는 세포를 무작위 바이오-올리고머 라이브러리를 포함하는 액상 배지 또는 반고형 매트릭스에 깐다. 한 구체예에서 이 과정은 세포현탁액과 함께 웰당 하나이상의 비드로 96웰 조직배양 플레이트에서 실시한다. 또다른 구체예에서 장애물 매트릭스 또는 '쿠키-컷터'에 라이브러리 비드와 세포현탁액을 사용하여 각각의 챔버를 형성하게 한다. 각 비드에 있는 펩티드의 비율은 물분해성(예로 디켑토피페라진) 또는 광분해 링커로 연결될 수 있다. 충분한 펩티드가 생물학적 효과를 발휘하면서 해리되고 서열화를 위해 비드에는 여전히 충분한 펩티드가 남아있다. 세포현탁액은 용액 또는 반고형 매트릭스일 수 있다. 적절한 배양과정후에 세포집단은 콜로니 확인과 같은 것으로 성장 또는 증식을 검사할 수 있다. 또다른 구체예에서 테트라졸리움염 MTT를 첨가한다(Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 65:55-63; Niks and Otto, 1990, J. Immunol. Methods 130:140-151). 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 발견할 수 있는 숙시네이트 디하이드로게나제는 MTT로 전환되어 포르마잔 청색이 된다. 따라서 농축된 청색은 대사활성세포를 나타낸다. 또다른 구체예에서 방사능라벨, 예로써 트리테이트 티미딘이 결합이 세포증식을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 유사하게 단백질 합성은 S-메티오닌의 결합으로 볼 수 있다. 세포성장을 저해하거나 또는 촉진시키는 펩티드를 해리하는 비드는 회수하여 서열화한 후 표식세포형에 대해 확인배양에서 확인된 펩티드 서열을 재검사한다.
(ii) (i) 구체예에서 각 웰에 10개의 비드를 포함하는 미량적정웰에 라이브러리 비드를 분포한다. 용액에서 비드를 현탁시킨다. 각 비드에서 충분한 펩티드가 해리되어 생물학적 활성을 나타내고 서열화할 비드에도 충분한 펩티드가 남아있다. 해리된 펩티드를 포함하는 상층액을 복제 플레이트에 옮기거나 또는 비드웰에 남겨둔다. 세포주의 성장 또는 증식과 같은 생물학적 활성을 결정한다. 생물학적 활성을 가진 비드를 서열화하고 각 서열화를 준비한 후 서열의 생물학적 활성을 결정하기 위해 검사한다.
(iii) (ii) 구체예에서 바이오-올리고머는 비드에 부착되어 있고 바이오-올리고머의 1/3이 제1단계에서 1/3은 제2단계에서 나머지 1/3은 비드에 남아있게 된다. 연속적인 해리는 두 개의 상이한 절단형 링커의 사용에 의한 것이고 또한 각 단계에서 바이오-올리고머의 일부만을 해리할 수 있는 절단제를 사용하여 얻을 수 있다. 후자의 경우에 광분해 링커의 조절된 방사가 적절하고 화학 또는 효소절단제에 신중하게 노출시켜도 부분적인 절단을 얻을 수 있다. 연속적인 바이오-올리고머의 절단 라이브러리를 만들어 미량적정판의 웰에 분배하고 각 웰에는 비드가 50개이상 더욱 적절하게는 웰당 비드가 50 내지 250개를 포함한다. 비드는 바이오-올리고머 1/3을 절단하기 위해 처리한다. 상층액은 복제 검사에서 생물학적 활성을 검사한다. 생물학적 활성을 나타내는 웰당 비드는 현탁되어 미량적정웰에 분배하고 각 웰에는 1 내지 10개 비드를 포함한다. 비드는 나머지 바이오-올리고머 1/3을 해리하도록 처리하고 상층액은 생물학적 활성검사를 한다. 생물학적 활성을 설명하는 웰당 비드를 분리하여 부착된 바이오-올리고머를 서열화한다. 하나이상의 비드가 발견되면 모든 확인된 서열을 준비하고 각 생물학적 활성을 검사한다. 이들 2단계 연속 생물학적 검사는 특이 생물학적 활성을 가진 바이오-올리고머의 거대 라이브러리를 선별하는 효과적이고 강력한 방법을 제공한다.
(iv) 사이토킨 해리의 촉진은 아가로스겔과 같은 반고형 매질에 고정된 단일세포 현탁액을 첨가하여 검사할 수 있다. 본 발명의 바이오-올리고머는 림포킨, 성장인자, 호르몬등과 같은 사이토킨의 해리를 유도하고 사이토킨의 존재는 표식세포주의 활성에 의해 감지될 수 있다. 표식세포주의 특이검사는 (i)의 설명과 같이 만들어진다. 구체예에서 세포의 자극에 의해 해리되는 사이토킨은 니트로셀룰로오스와 같은 막에 블랏팅된다. 면역검사 또는 수용체 결합검사에 의해 사이토킨을 감지한다.
(v) 또다른 구체예에서 바이오-올리고머의 독성을 관찰할 수 있다. 바이오-올리고머 라이브러리에 깔린 형질전환된 또는 종양세포주와 같은 비성장 플락 또는 부위는 세포독성 활성을 나타낸다. 특이예에서 반고형 매트릭스에 두 개의 세포집단이 즉 하나가 다른 하나위에 깔려있다. 이와 같이 표식세포에 특이적으로 세포독성을 나타내는 바이오-올리고머는 인접 세포에는 독성이 없는 것으로 확인되었다. 이 검사에서 화학 치료요법제로써의 바이오-올리고머의 용도 확인이 된다. 세포독성 바이오-올리고머에는 독성 펩티드와 안티-센서 올리고 뉴클레오티드가 포함된다.
(vi) 생리학적 변화를 검사할 수 있다. 한 구체예에서 심근세포 현탁액을 라이브러리 위에 깐다. 또다른 구체예에서 특정효소의 상위조절은 플로로포어 또는 케미루미네슨트 크로모겐(MTT)과 같은 적절한 기질을 이용할 수 있을 경우에 특정효소 활성의 증가를 감지함으로 검사할 수 있다. 또한 효소의 상위조절은 면역학적으로 검사하여 감지할 수 있다. 또다른 구체예에서 조직학적 기술은 바이오-올리고머의 라이브러리에 의한 생리학적 또는 모양적 변화를 지적할 수 있다.
(vii) 본 발명용 염기성과 루미날면의 세포와 같은 극성을 띈 세포에서의 바이오-올리고머 라이브러리의 활성검사방법을 제공한다. 극성세포 배양은 루우멘에 상응하는 반-투과성막에서 만들 수 있다. 반고형 매질에 라이브러리를 첨가하여 루미날면 또는 염기성 면을 만든다. 본 발명의 바이오-올리고머의 극이동, 증식, 세포내 교신등과 같은 다양한 효과를 검사한다. 특히 방사능 라벨 또는 플로로포어와 같은 것으로 바이오-올리고머를 라벨링함으로써 이동성 바이오-올리고머를 확인할 수 있다. 이것은 특이적 흡수분자의 필요에 따른 것이다. 특히 이와 같은 분자는 약제의 구강 또는 비강주입에 유용하며 내피세포의 관강면에서 바소면으로의 이동이 바람직하다.
절단안된 바이오-올리고머의 생물학적 검사를 계획할 수 있다. 전체 바이오-올리고머가 코팅된 비드위 생물학적 활성을 선별할 수 있다. 라이브러리는 동물에 유도할 수도 있다. 소요의 비드는 특이조직에서 분리할 수 있다. 비드는 구강 또는 비강 또는 피하주입후에 특이적으로 흡수된 비드를 분리할 수 있다. 구체예에서 비드는 마그네틱일 수 있고 또는 다른 특징을 가질 수 있고 따라서 조직에서 분리할 수 있다.
펩티드 올리고핵산 또는 펩티드-올리고핵산 키메라로 구성된 바이오-올리고머에 응용할 수 있는 전술한 생물학적 검사는 본 기술분야에 숙지된 자에 의해 이해될 수 있다. 펩티드와 펩티드 유사체는 성장프로모터, 성장 저해자와 조절분자로 공지될 수 있다. 펩티드는 프로모터, 인헨서, 조절단백질의 효과에 길항 또는 저해하는 유전자에서 서열을 조절하여 결합함으로써 유전자 조절자로 작용할 수 있다. 유사하게 핵산은 저해제로 작용할 수 있고 유전자의 발현을 전사단계에서(예로써 프로모터, 인헨서, 전사 종료부위에 결합 또는 차단) 프로세싱(mRNA 프로세싱에 간섭) 그리고 해독으로 조절할 수 있다. 또한 올리고핵산 또는 올리고핵산 유도체를 특이 mRNA의 해독의 차단에 사용할 수 있다. 상기 모든 라이브러리는 생물학적 활성을 검사한다.
조직배양에서 유지할 수 있는 세포는 생물학적 검사에 사용될 수도 있다. 여기에서 사용된 '세포'는 진핵, 원핵(박테리아성) 세포, 이스트, 몰드와 곰팡이등이 포함될 수 있다. 1차세포 또는 세포주를 사용할 수 있다. 또한 출원인은 바이러스에서 생물학적 검사는 바이러스로 감염시킴으로써 실행할 수 있다. 예로써, 람다 박테리오파아지의 해리활성을 저해하는 바이오-올리고머 활성은 감염된 깨끗한 플라크에서 형성되지 않은 감염된 대장균 콜로니를 확인하여 검사할 수 있다.
바이오-올리고머의 라이브러리의 활성을 검사하는 본 발명의 방법은 다음의 실시예에 한정하지는 않는다. 출원인은 본 발명에 나타난 어떠한 검사 시스템도 변형할 수 있도록 한다. 단 본 발명의 영역내에서 가능하다.
5.5.2.1. 에리트로포에틴 동근의 생검사
구체예에서 본 발명은 에리트로포에틴의 바이오-올리고머 동근의 검사방법을 제공한다. 여기에서 설명하는 특정방법은 성장인자, 호르몬, 사이토킨 림포킨과 다른 세포내 메신저의 동근과 같은 불특정 동근을 확인하는데 유용하다.
본 실시예에서, 바이오-올리고머 라이브러리는 19개 통상적인 아미노산(시스텐 제외)으로 만들어진 펜타펩티드로 구성된다. 펩티드의 이론상 숫자는 2,476,099 이다. 라이브러리는 선별효과를 실행하기 위한 19단계에서 생성될 수 있다. 이것은 각 단계에서의 C-단부의 단일 아미노산을 선별함으로써 실행할 수 있고 단 4개의 아미노산 위치만이 무작위가 된다. 따라서 각 단계의 서열은 XXXXY-링커-수지이고 Y는 각 단계에서 선택되고 X는 무작위 아미노산 결합을 나타낸다. 이러한 접근방식은 각 단계에서의 가능 펩티드의 수를 감소시켜 130,321 이 된다. 96개 미량적정 플레이트의 각 웰에 10개 비드(펩티드)의 분포로 소요되는 플레이트의 수는 136이다(하나의 추가 플레이트는 생검에서 요구되고, 총 137개의 콘트롤이 소요된다). 이 방법은 하루작업시 플레이트수에 라이브러리를 분포해야 한다.
비드에서 합성되는 펩티드의 주요부분(50-80%)은 생검을 위해 절단하고 적어도 50pmol 펩티드는 각 비드에서 해리된다. 광분해 링커가 사용되지만, 절단형 링커로는 디케토피페라진 연결이 적절하다. 이 연결은 약산상태(0.1-1.0mM HCl)에서 안정하여 6-8시간동안 비드의 분포를 허용한다. 각 웰에 1.0-10mM HEPES 완충액(pH 8.5) 20ul의 추가로 절단이 촉진된다. 24시간 절단은 최종웰 용적을 유지시킬 수 있다. 기화는 습윤실에서 플레이트를 저장하여 조절한다.
라이브러리 비드의 절단으로 인한 펩티드 용액은 실제로 멸균하지 않아도 무균상태가 된다. 무균상태는 용액이 최종 배양 용적의 25%로 구성되고 그리고 배양시간이 적어도 24시간이기 때문에 반드시 필수적이다. 무균상태는 (1) 합성후에 멸균수에서 비드를 수화시키고, (2) 산성화된 멸균수에서 최초 비드 현탁액을 희석하고 그리고, (3) 멸균기술을 사용하여 멸균 배양 플레이트로 비드를 분포시켜 얻을 수 있다. 최종 비드 현탁액은 소수성 펩티드의 용해를 돕기 위해 20% 이하의 DMSO를 포함한다. DMSO를 첨가할 수도 있고 초기의 수화에 의해 수용화되기 위해 실행한다. 최종 비드 현탁액은 10비드/50ul 농도가 된다. 피펫팅 동안에 현탁액에서의 비드의 유지는 메틸 셀룰로스의 첨가에 의해 0.8-3.2%가 된다. 메틸 셀룰로스의 이용으로 용해를 촉진시키는데 사용되는 DMSO의 환원이 되게 한다. 배양시에 메틸 셀룰로스의 최종농도는 생검을 저해하지 않도록 0.8% 이하로 유지시킨다.
해리된 펩티드는 50ul 시료로 배양 플레이트로 검사를 위해 이동하고, 시료 플레이트와 배양 플레이트 사이에 정확하게 유지된다. 멸균상태는 이동시 동안에도 유지된다. 사람 재조합 EPO는 플레이트의 선택웰에 첨가하여 양성 콘트롤을 유지시키고 표준 곡선을 만든다(제1과 최종 플레이트). 콘트롤웰은 0.1IU EPO를 수용하고 1.0-100 밀리유닛 EPO를 수용한 6개 2중웰에서 표준 곡선을 얻을 수 있다(D'Andrea et al. 1991, Mol. Cell Biol. 11:1980-1987).
생검은 에리스로포에틴 수용체(EPO-R)를 발현하는 Ba/F3-T 재조합 세포주로 만들 수 있다. 이들 세포는 IL-3 또는 EPO의 존재에 관계한다. IL-3 존재하에 이들 세포의 배양은 생검배지에서 EPO 간섭을 저해할 수 있다. Ba/F3-T 세포의 염기성 성장배지는 2.0g/L NaHCO310% fbs, 1x 페니실린-스트렙토마이신, 5ul β-ME/L와 10mM HEPES (최종농도)를 포함하고 pH가 4.0인 RPMI 1640 배지이다. 이 배지에는 IL-3을 공급하는 10%(V/V) WHEI-조건화배지가 보충되어야 한다. WHEI-조건화배지는 WHEI 세포를 배양하여 만들 수 있고 동일한 염기성 배지에 합류시킬 수 있다. 조건화 배지는 세포를 제거하기 위해 원심분리하고 0.22um 필터를 통과시킨 후 냉동 보관한다. Ba/F3-T 세포는 배양하여 1.31×107세포가 되게 하고 전술한 것과 같이 150ul 용적에서 1×103세포/웰이 분포된다(Yoshimura et al., 1990, PNAS, U.S.A. 87:4139-4143).
Ba/F3-T 세포는 롤러보틀에서 거대(250㎖) 멸균 원심분리병으로 옮긴다. 세포는 5분간 500xg로 원심분리하여 수득한다. 세포 카운팅을 위해 IL-3 없는 200㎖의 신선한 염기성 배지로 세포를 재현탁시킨다. 최종용적을 6.67×103세포/㎖(1×103세포/150ul)로 적정한다. 장시간 분배과정동안에 배양기에서 저장하기 위해 4-8 엘리코트에 최종세포 현탁액을 나눌 필요가 있다. 세포수와 생존수는 분배과정의 시작과 끝에 수득한 시료에서 결정할 수 있고 살아있는 세포수를 확인할 수 있다. 해리된 펩티드 상층액을 포함한 배양 플레이트에 세포를 분배하고 3일간 배양한다.
각 배양웰에 있는 살아있는 세포수를 헤아리는 것이 생검의 목적이다. 이것은 Niks와 Otto(1990, J. Immunol. Methods 130:140-151)에 의해 수정된 Mosmann의 MTT 검사를 이용하여 정량할 수 있다. 이 변형된 검사는 배양배지의 제거없이 살아있는 세포수를 측정할 수 있다.
PBS(약 270㎖ 소요)에 5㎎/㎖ 용액으로 MTT를 만든다. 생검 플레이트의 각웰에 이 용액 20ul를 수용하고 플레이트를 37℃에서 4시간 배양한다. 이 다음에 추출용액 100ul를 각 웰에 첨가하고 플레이트는 120초가 배스 소니케이터에 둔다. 추출용액은 50%(V/V) N,N-디메틸포름아미드/SDS 20% 용액으로 구성되는데 상기 설명한 방식으로 아세트-HCl로 pH 4.7을 조절한다. 이 처리로 마이크로플레이트 리드에 의해 570㎚에서 OD 측정을 위해 MTT 메타볼리즘의 포르마잔 생성물을 용해시킨다.
생검에서 수득한 OD 데이타를 95% 신뢰도로 평균값을 결정하기 위해 모든 시료웰을 평균한다. 웰당의 OD 값은 Studentst 테스트 결정에 사용될 수 있다. 중요한 값은 EPO 표준곡선과 비교하여 IU와 EPO의 상관성처럼 포턴스 측정을 얻을 수 있다. 표준곡선은 로지스틱 공식을 사용하여 비-직선 퇴화분석에 의해 결정한다. 두 개의 표준곡선에서의 자료를 분석하고 생검과정의 양단부에서 측정된 반응에서 상당히 차이가 날 경우 별도로 측정한다. 전체 검사에서 각 플레이트당 측정된 콘트롤 값의 비교는 검사반응의 일정한 변화가 있을 경우에 정량하는데 사용된다. Ba/F3-T 세포에 있는 두 개의 성장 인자 수용체(IL-3R과 EPO-R)가 있다는 것과 이들의 활성화가 양성 생검반응을 만드는 것을 인지하는 것은 중요하다. 따라서 전술한 생검은 IL-3와 EPO 수용체 동근을 선택할 수도 있다. 이 문제에는 두가지 해결방식이 있다. 하나는 페닐하이드라진 처리한 쥐의 지라세포 또는 상이한 세포주를 사용하는 것이다(Krystal 1983, Exp. Hematol. 11:649-660). 둘째는 제2생검에서 EPO와 IL-3 활성의 합성 펩티드를 검사하거나 또는 방사능 리간드 결합방법으로 검사할 수 있다.
5.5.3. 효소 유사/효소 저해제
본 발명은 공-효소로 작용하거나 효소반응을 저해시킬 수 있는 효소 라이브러리와 같은 반응을 촉매할 수 있는 바이오-올리고머로 구성된다. 따라서 본 발명은 효소 또는 공효소 또는 효소활성의 저해를 검사하는 방법을 제공한다.
효소활성은 감지가능한 반응 생성물의 형성에 의해 관찰할 수 있다. 특이 구체예에서 바이오-올리고머 라이브러리는 BCIP와 같은 알칼라인 포스포타제 기질의 효소반응의 촉매하고, 고형상 서포트에 청색, 비수용성 반응 생성물을 형성한다.
또다른 구체예에서 색 또는 형광물과 같은 관찰가능한 생성물이 반고형 매트릭스에서 형성될 수 있다. 아가로스겔과 같은 반고형 매질에 라이브러리를 깔고 크로모제닉 또는 다른 지시물질을 첨가한다. 바이오-올리고머/고형상 서포트에는 소요의 효소활성이 나타나고 생성물 구역이 형성된다. 예로써 양고추냉이 퍼옥시다제의 바이오-올리고머 유사체는 아미노안티피렌(0.25㎎/㎖; Kodak), 페놀(8㎎/㎖)과 H2O2(0.005%)/0.1M 인산완충액(pH 7.0)의 용액을 첨가하여 확인할 수 있다. 효소활성 비드는 자주색으로 나타난다. 또다른 구체예에서 단백질 분해효소 활성의 바이오-올리고머/비드는 지된 발색 단백질 분해효소 기질의 첨가로 확인한다.
공-효소활성은 공효소에 의해 조절되는 효소활성을 검사하여 관찰하고 이때 자연적 또는 통상의 공효소는 없다.
효소저해 활성은 부분적으로 해리되는 바이오-올리고머의 해리는 5.4와 5.5.2에서 논의한 바 있다. 예로써 바이오-올리고머 라이브러리는 효소를 포함하는 반-고형 매질에 깐다. 라이브러리는 부분적으로 바이오-올리고머를 해리하도록 처리한다. 바이오-올리고머가 효소활성을 저해할 때 생성물이 부족한 지역을 확인할 수 있다. 구체예에서는 효소기질이 크로모젠이고 발색 생성물이 형성된다. 따라서 효소 저해제의 존재는 색이 없는 부위가 나타남으로써 알 수 있다. 또다른 구체예에서 헤모글로빈의 단백질 가수분해 또는 알칼린 포스포타제와 같은 지시효소는 반고형 매질에서 불투명 지역에 의해 감지될 수 있다. 이것은 단백질 가수분해 저해제의 존재가 헤모글로빈의 분해 또는 지시효소를 저해하기 때문이다.
본 기술에 숙지된 자는 효소활성, 공효소활성 또는 효소활성을 저해하는 바이오-올리고머가 펩티드, 올리고핵산 또는 펩티드-올리고핵산 키메라임을 알 수 있다. 특히 제한된 원형 펩티드일 경우에는 독특한 촉매 결합주머니 또는 면에서 생성될 수 있다. 펩티드-올리고핵산 키메라는 효소, 공효소 활성과 같은 독특한 화학적 특징을 나타낼 수 있는데 각의 기능기에 있는 독특한 병렬 때문이다. 바이오-올리고머/고형상 서포트는 효소 또는 공효소활성을 설명할 수 있고 자유 바이오-올리고머는 활성이 없다. 이는 바이오-올리고머의 고농도가 바이오-올리고머/고형상 서포트에 독특한 화학적 특징을 제공하기 때문이다. 바이오-올리고머는 비드에서 해리될 때 효소 또는 공효소 활성을 나타낸다. 공지된 공효소(조인자)는 제한된 바이오-올리고머에 화학적으로 결합하여 전자전달 사슬과 같은 것을 포함한 단순한 또는 복합적인 효소를 가장할 수 있다.
5.6. 바이오-올리고머를 특징화하는 방법
본 발명의 5.5중 하나의 방법으로 바이오-올리고머를 포함하는 소요의 비드를 선택한 후 본 발명은 바이오-올리고머의 구조와 서열을 정하는 방법을 제공한다.
바이오-올리고머가 펩티드일 때 적절한 서열화 방법은 에드만 분해이다. 특히 적절한 방법은 Applied Biosystems 477A 단백질 서열기를 이용한다. 펩티드의 아미노산 서열은 FAB-MS 또는 다른 분석적 방법에 의해 정량할 수 있다.
펩티드는 고형세포에 부착시키거나 절단시켜서 서열화할 수 있다. 펩티드 절단을 위해 분리된 펩티드-비드는 공지된 통상적인 방법을 이용하여 고형상 서포트에서 중합물질을 분리해낸다.
절단물질의 선택은 이용하는 고형상 서포트에 따라 달라진다. 예로써, Wang 수지에서 펩티드를 절단하고자 할 때, 디클로로메탄에서 50% TFA를 사용하는 것이 적절하다.
또한 본 발명의 영역내 다른 구체예에서는 비드와 같은 단일 고형상 서포트를 바이오-올리고머 부착한 상태로 분리할 수 있고 그리고 비드에서 바이오-올리고머의 절단없이 비드를 서열기에 넣을 수도 있다. 예로써 바이오-올리고머가 펩티드일 경우, 0.5mEq/g 수지치환의 단일 100㎛ 직경수지에도 펩티드가 약 200pmole이 포함되어 있다. 0.5mEq/g 수지치환된 단일 250㎛ 직경의 PAM 수지에는 약 3125pmol의 펩티드가 포함된다. 펩티드 서열기에는 적절한 서열에 요구되는 농도는 5-10pmole이다. 그러므로, 하나의 표준크기인 100㎛ 직경의 단일 PAM 수지 서포트에는 펩티드 서열화에 필요한 적정량의 몇배를 가지고 있다.
펩티드에 에드만 분석에 의해 수정되지 않는 아미노산 또는 펩티드 이믹스로 구성된 경우에, 비드는 펩티드의 10-50%가 서열화안된 부분에 결합되지 않게 만들어진다. 잔류 서열을 결정하고, 이 서열에는 서열화안된 부분을 추측해야 한다.
서열화안된 부분에 대한 또다른 접근방식은 라이브러리 합성동안에 비서열화 부분의 결합이전에 펩티드에 일시적인 캡을 씌우는 것이다. 서열의 구조확인 동안에 에드만 분해로 서열화 안된 부분을 실행하고 그다음 비서열화 부분에 일시적인 캡을 제거하고 서열화 단부를 추정한다.
올리고핵산의 경우에 서열화는 자동화된 올리고핵산 서열기에서 실시한다. 또한 Maxam과 Gilbert 기술을 이용할 수 있다(1977, PNAS, U.S.A. 74:560-564). 공지된 다른 핵산서열화 방법을 사용할 수도 있다.
FIBMS로 가장 강력한 구조분석을 할 수 있다. 단편과 바이오-올리고머의 감지로 서열이 재구성될 수 있다. Finnigan MAT로 구조와 서열의 자료를 제공할 수 있다.
선택된 바이오-올리고머의 서열이 일단 결정되면, 자동 펩티드 합성기 또는 바이오 또는 화학합성수단을 사용하여 다량을 합성할 수 있다. 또한, 바이오-올리고머 서열이 확인되면 소단위 유사체는 특이적 바이오-올리고머의 활성을 강화하기 위해 치환될 수도 있다.
5.7. 무작위 바이오-올리고머 라이브러리에서 치료와 진단시약
소요의 바이오-올리고머의 서열이 결정되며, 본 발명은 질병을 진단하거나 또는 치료에 사용되는 바이오 올리고머 서열로 구성된 분자를 제공한다. 바이오-올리고머의 서열은 진단 또는 치료제로 제공될 수도 있고 거대 분자에 결합될 수도 있다. 생물학적 또는 결합 활성을 가진 바이오-올리고머 서열로 구성된 분자를 '효과분자'라고 한다. 본 발명은 다양한 응용시에 사용할 수 있는 라이브러리를 제공한다. 전술한 효과분자의 '효과'기능은 여기에서 상술하는 것중 하나가 될 수 있다.
여기에서 설명하는 방식은 잠재적인 진단 또는 치료가치의 특이 리간드를 찾는 신규한 도구를 제공하고 1차서열 또는 화학적 성분이 매우 상이한 그러면서도 동일한 수용체 분자에 물리적인 작용을 할 수 있는 일련의 리간드에 대한 정보를 제공한다. 분자의 모델링과 그리고 현재의 컴퓨터 기술과 같은 정보를 총합하여 신규의 기본적인 리간드-수용체 상호작용의 이해를 제공한다.
본 발명의 치료요법제는 사이토킨, 성장인자 또는 호르몬제의 생물학적 활성부위에 결합할 수 있는 효과분자로 구성되어 전사 또는 해독을 차단하거나 혹은 강화하고 이들의 활성을 증화시키거나 증가시킬 수 있다.
본 발명의 치료요법제에는 성장인자, 신경전달수용체 또는 호르몬 수용체와 같은 제약학적 소요의 수용체에 결합할 수 있는 효과분자를 포함한다. 이와 같은 효과분자는 자연 수용체 리간드의 활성에 길항 또는 항근으로 사용될 수 있다. 수용체에 결합할 수 있는 효과분자는 정상 세포수용체에 결합하거나 중화시킴으로써 세포에 근접하여 얻을 수 있는 바이러스 또는 미생물의 흡착을 차단하기 위한 결합에 사용될 수 있다. 이러한 현상의 예로써 CD4 수용체에 HIV의 결합이 포함되고 섬유아세포 성장인자 수용체를 점령하는 효과분자는 표식세포의 바이러스 감염을 차단시키는 제약물질로 사용될 수 있다. 세포의 기생충 감염도 본 발명에 따른 적절한 효과분자를 이용하여 이와 같이 저해할 수 있다.
또다른 구체예에서 소요의 수용체 분자에 결합할 수 있는 바이오-올리고머 서열로 구성된 효과분자는 약물 또는 독소의 표식에도 이용한다. 구체예에서 소요의 수용체 분자가 종양세포, 동물기생충, 박테리아, 바이러스와 같은 미생물, 단세포기생충, 단세포 병원균, 곰팡이 또는 몰드의 표면에서 발견되는 수용체 또는 항원이 된다.
또한, 수많은 바이오-올리고머는 생물학적 활성을 지닌 서열을 가진다. 항종양, 항-동물기생충, 또는 항-곰팡이, 항-박테리아성, 항-단세포기생충, 항-단세포병원균, 또는 항-바이러스 활성과 같은 항미생물 특징을 가진 바이오-올리고머를 분리할 수 있다. 또한 몇몇 바이오-올리고머는 에리스로포에틴, 상피성장인자, 섬유아세포 성장인자, 종양성장인자와 호르몬, 신경전달물질, 면역조절물질 또는 다른 조절분자의 길항 또는 항근으로 작용할 수도 있다. 한 구체예에서는 바이오-올리고머가 펩티드이다.
본 발명의 치료학제에는 디옥신, 벤조디아제팜, 헤로인, 코카인 또는 테오필린과 같은 약물에 고도의 친화성을 나타내는 바이오-올리고머 서열로 구성된 효과분자가 포함된다. 이와 같은 펩티드는 상기 약물의 과오용시에 해독제로도 사용할 수 있다. 또한 치료요법제에는 소분자 또는 금속이온에 결합할 수 있는 효과분자도 포함된다. 비리루빈에 고친화성이 있는 바이오-올리고머 서열은 과빌리루빈혈증의 치료에 효과적이다.
일반적으로 본 발명은 Product Category Index of The Physicians Desk Reference(PDR, 1991, 45th, Medical Economics Data; Oradell, NJ. pp. 201-202)에 리스트된 질병의 치료용 바이오-올리고머 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 예로써 항구충제, 항응고제, 항응고길항제, 항당뇨병제, 항-진정제, 항-억제제, 제사제, 해독제, 항-고나트로핀제, 항-히스타민제, 항고혈압제, 항-파킨슨병제, 항-소판제, 항소양제, 항-냉각제, 항-발열제, 항독소(예로 만티베늄), 기관지확대제, 근육이완제, 항글루코마투스제 또는 진정제와 같은 효과분자를 확인할 수 있다.
본 발명의 치료요법제에는 제약학적으로 수용가능한 수용체, 희석제 그리고 어쥬번트등이 포함될 수 있다. 이와 같은 제약학적 수용체에는 물과 석유, 동물성, 식물성 또는 합성유, 땅콩유, 콩유, 미네랄유등과 같은 오일등의 멸균액이 포함될 수 있다. 제약학적 성분물을 정맥내 투여할 경우에는 물이 적절한 운반체가 된다. 염용액과 수용성 덱스트로스 그리고 글리세롤 용액은 주사용액시에 액체운반체로 적절하다. 적절한 제약학적 부형제로는 스타치, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 말트, 쌀, 플로로, 쵸크, 실리카겔, 마그네슘, 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 쇼듐 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 이와 같은 성분물은 용액, 현탁액, 정제필, 캡슐, 분말, 지속배출제등의 형태가 될 수 있다. 적절한 제약학적 수용체는 E.W. 마팅의 'Remington's Pharmaceutical Science'에 상술한다. 이와 같은 성분물에는 적절한 운반체와 활성성분의 치료에 효과량을 포함하여 환자에게 주입하기에 적당한 형이 제공된다. 주사는 정맥내가 가장 효과적이다. 다른 방법, 구강, 비강 또는 모체주입등이 이용될 수도 있다.
본 발명에 따르는 바이오-올리고머 서열로 구성된 분자는 진단시약의 형태로 이용될 수도 있다. 진단시약은 본 발명이 올리고머 서열의 하나이상으로 만들어지는데 또한 진단시약은 상기와 같은 치료제에서 설명한 수용체를 포함할 수도 있다.
여기에서, '진단시약'이란 상기 언급한 감염성 질환과 T 또는 B 세포종양과 같은 암의 상태를 감지하는데 이용하는 시약을 말한다. 광의의 의미에서 감지는 상태의 심각성을 지적하거나 또는 질병이 관련된 신체에서의 위치와 질병의 유무등을 지시하는 것을 의미한다. 예로써 펩티드-양고추냉이 이뮤노퍼옥시다제 복합물질 또는 이와 관련된 면역조직적 시약은 조직, 혈청 또는 체액에서 특이수용체 또는 항체분자를 감지하고 정량화하는데 사용될 수 있다. 진단시약은 시험관에서 또는 생체내에서도 적절히 사용할 수 있다. 특히, 본 발명은 면역검사 서든 또는 노던 하이브리드 반응에 유용한 진단시약을 제공한다.
또한 진단시약에는 방사성동이원소, 형광물질, 파라마그네틱 물질 또는 상증가물질등과 같은 하나이상의 표식이 포함될 수 있다. 이 기술에 숙지된 자는 진단시약을 형성하기 위해 이 시약에 이들 표식을 결합시키는 방법을 인지할 수 있을 것이다.
본 발명의 진단시약과 치료시약은 동물, 사람과 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 기니아피그, 쥐를 포함한 포유류의 진단과 치료에 특히 유용하다. 치료 또는 진단시약은 식물의 질병을 치료 또는 진단시에도 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 바이오-올리고머의 진단 또는 치료에 적절한 질병과 질환상태는 매우 다양할 수 있다. 다음의 실시예로 설명하나 이에 한정하지는 않는다.
5.7.1. 세포독성 성분물
바이오-올리고머 서열로 구성된 분자는 자신만의 특이한 세포독성 활성을 가질 수 있다. 또한 소요의 수용체에 결합할 수 있는 바이오-올리고머는 약물 또는 방사능 핵산과 같은 세포독성 성분물의 결합시킴으로써 세포독성분자를 만들 수 있다. 펩티드와 같은 바이오-올리고머는 세포독성 성분물에 '표식'할 수 있고 특정 수용체 분자를 가지는 세포를 특이적으로 파괴할 수 있다. 예로써 세포독성 펩티드 결합물질은 직접적으로 B 세포집단, B 세포종양, T 세포집단 또는 T 세포종양을 환자에서 제거할 수 있다. 잠재적인 임상응용에는 자가면역질환, 임파종, 그리고 조직이식과 같은 특이적 면역억제 치료등이 포함된다. 유방암 또는 자궁암과 같은 리간드의 결합을 중재하는 수용체가 있는 종양세포형의 암에서는 EGF 인자가 중요한 역할을 하는 것으로 보인다.
종양세포, 또는 바이러스 감염세포, 조직 또는 기관과 같은 표식세포에 특이적인 세포독성물질은 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있다. 종양과 같은 결정세포의 표식화에 추가하여 이들 특이적 독소는 박테리아치사성, 항-바이러스성, 항-기생충 또는 곰팡이 제거 활성을 가진다. 유사하게 살충 또는 제초제 활성을 가진 독소도 확인할 수 있다.
한 구체예에서 바이오-올리고머는 펩티드이다. 펩티드는 독소가 부착된 표식제로 사용할 수 있다. 펩티드 자체가 세포를 표식화하고 독소로 작용할 수도 있다. 또다른 구체예에서는 바이오-올리고머는 올리고 핵산이다. 올리고핵산은 세포생존에 필수적인 전사 또는 해독의 간섭에 의해 독소효과를 조절할 수 있다.
5.7.2. 면역조절자
본 발명은 면역조절자로서의 성분물과 분자를 제공한다. '면역조절자'는 면역체계에서 효과를 변화시킬 수 있는 분자 또는 성분물로 구성된다. 특히, 면역조절자는 T 세포반응, B-세포반응 또는 대식세포, 폴리몰포핵산 대식세포와 메이엘로이드 리니지 세포의 작용에 의해 조절되는 것과 같은 비-특이적 면역반응을 자극 또는 저해시킨다. 효과분자는 다음의 면역질병을 치료한다. 1) 마이스테디아 그라비스, 다발성 경색, 그레이브 질환, 류마티스 관절염, SLE, 펨피구스 버귤라리스, 자가면역 용혈성 빈혈, 그리고 면역성 혈전증빈혈을 한 다양한 자가면역성 질환. 2) 비-흡킨스 임파종과 다양한 암. 3) 알레르기 4) 면역 복합성 질환 5) 이식조직 거부반응 6) 감염성 질환 7) 당뇨병
면역조절자는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, CSF, 대식세포-CSF, 임상/대식세포-CSF와 같은 자극적 림포킨의 활성을 모방함으로써 면역활성을 촉진시킨다. 림포킨 수용체에 리간드의 펩티드 결합에 의해 또는 세포전사기작의 활성을 중재하는 올리고 핵산에 의해 자극이 발생될 수도 있다. 면역 조절자는 Fc 수용체, LAF-1, LAF-2와 같은 임파세포등에 결합함으로써 작용할 수도 있고 세포독성을 해리하거나 대식분해하는 활성이 포함된다. 본 발명의 효과문자는 케오탁신으로 작용한다.
특이 구체예에서 바이오-올리고머로 구성된 분자가 항원을 모방한다. 이와 같은 바이오-올리고머는 특정 병원균에서 특이적인 T 세포 또는 B 세포 활성을 유도하는 백신으로 유용하다. 또한 에피토프와 같은 항원은 특이적 면역반응을 일으키는데 유용하다.
본 발명의 효과분자는 해리된 형에서 효과가 있다. 그러나 특정 바이오-올리고머는 고형상 서포트에 결합되어 있을 때 효과가 더 큰 것으로 보인다. 특히, 고농도의 에피토프는 막의 이뮤노글로블린에 결합함으로써 또는 다른 수용체 조절반응에 의해 B 세포반응을 촉진시킨다.
본 발명의 라이브러리는 다양한 에피토프를 나타내는 병원균의 백신으로써 유용하다. 예를 들면, 트립판노좀의 VSG의 1차서열은 감염동안에 다변한다. VSG 에피토프의 변화시킴으로써 트립판노좀은 면역 인식계를 침입한다. 유사하게, 말리리아 기생충은 라이프 사이클의 상이한 단계에서 다양한 항원 에피토프를 발현하는 것을 알 수 있다. 따라서, 제한된 다양성의 펩티드 라이브러리는 프립판노좀 또는 말라리아 기생충에 의해 나타나는 다양한 항원성에 대해 면역화된다.
효과분자는 면역반응을 저해시킬 수 있는데 (i) 항체 또는 T 세포항원 수용체에서 특이적 면역인식을 차단함으로써, (ii) Fc 또는 다른 면역수용체에 의해 차단하거나 (iii) 림포킨과 사이토킨의 활성을 저해하거나 차단시키거나 (iv) 면역세포에 대한 음성 피이드백 시그날을 제공하여 가능하게 한다. 효과분자는 면역 시스템을 완화시키는데 특히 자가면역 항원에 사용될 수 있다. 예로써 DNA에 대한 면역내성은 올리고 핵산 또는 올리고 핵산라이브러리에 의해 영향을 받을 수 있다. SLE의 치료에도 유용하다. 또한, 면역 저해는 5.7.1에 설명한 기작에 의해 영향을 받을수도 있다.
또한, 본 발명의 치료약물은 자가면역에 상응하는 치료 또는 억제를 위한 항원에 대해 내성을 유도하기 위해 면역 시스템을 조절할 수 있는 선택적인 항원성 펩티드를 포함한다. 특이한 합성 항원성 펩티드와 함께 다가의 면역 복합체의 형성을 저해하는 것이 가능하고 특이적 면역-복합체 질환을 예방할 수 있다.
종양-특이적 단클론 항체에 결합하는 펩티드를 분리하고 서열화하고 종양에 대한 활성면역성을 유도하기 위해 이뮤노겐으로 이용하도록 합성한다.
Fc 수용체에 고친화성이 있는 특이펩티드는 세포망 내피세포 시스템의 Fc 수용체를 차단하기 위해 치료제로 사용할 수 있고 혈소판 감소증과 자가면역용혈성 빈혈과 같은 자가면역 질환환자에 유용할 수 있다.
이와 같은 펩티드의 치료는 매우 중요하다. 기관에 침입하는 에피토프와 유사한 펩티드가 기관에 의한 침입을 차단하는데 이용될 수 있다. 예로써 최근에 AIDS의 연구에서는 AIDS 바이러스에 의한 감염이 AIDS 바이러스의 외피에 있는 gp120과 세포에 있는 CD4 표면수용체 사이에 결합과 인식에 의해 시작할 수 있다. gp120을 닮은 펩티드의 주입으로 CD4 수용체를 차단하여 AIDS 바이러스의 세포의 결합을 차단하고 세포의 감염을 저해시킨다. 유사하게 기생충의 감염도 저해할 수 있다.
5.7.3. 신경활성 길항근과 동근
본 발명의 효과분자는 호르몬, 신경전달물질, 무통제, 마취제, 항-정신요법제, 항-혈압 강하제, 또는 마취제의 효과를 길항 또는 동항하는 효과를 가진다. 이와 같은 효과분자는 식욕조절제, 신경성 약물, 응급치료와 조절제를 배우고 기억을 돕는데 유용하다. 본 발명은 '인공' 감미제, 염과 향료와 같은 맛의 소스를 제공할 수 있다.
5.8. 리미티드 라이브러리
본 발명의 리미티드 라이브러리는 저가비용 또는 향으로 인한 알레르기 효과없이 양념과 같은 복합 향료를 제공한다. 이와 같이, 사프론과 같은 향료가 대체할 수 있다. 새로운 종류의 향료가 만들어질 수 있다.
또다른 구체예에서 리미티드 라이브러리는 독특한 크로마토그래픽 서포트를 제공한다. 일반적인 화학적 특성을 가지면서 다양한 서열을 가지는 펩티드와 같은 바이오-올리고머의 라이브러리는 현재 이용하는 것보다 훨씬 더 유용한 크로마토그래픽 서포트일 수 있다. 크로마토그래픽 서포트는 이온교환 또는 역상서포트보다 더 선택적이다. 정제한 수용체 분자는 면역-친화성서포트보다 훨씬 더 부드러운 조건에서 서포트에서 용출되어 변성과 같은 것이 감소한다. 구체예에서 서포트는 특이 수용체 분자의 고농도가 결합되어 있거나 중개물질의 라벨링과 같은 중간 친화성이 있는 바이오-올리고머의 조성과 구조에 기초하여 준비될 수 있다. 또한 정제된 물질없이도 신속하게 확인할 수 있다.
또다른 구체예에서, 저-친화성 결합 비드를 선택하여 선택된 비드의 성분물을 바탕으로 리미티드 라이브러리를 만들 수 있다. 또다른 구체예에서, 발명에 의해 제공되는 수만 수열에서 확인된 하나 혹은 몇 개의 바이오-올리고머 서열로 구성된 저친화성 또는 고친화성 서포트도 크로마토그래피에 이용될 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예로 명확히 설명하고 이하는 본 발명의 예시일 뿐이다.
실시예
6. 실시예: 4가 펩티드 라이브러리의 합성
본 발명의 방법으로 X-X-X-Trp의 4가 펩티드를 만들 수 있는데 X는 발린, 세린 또는 알라닌일 수 있고 제 1 아미노산은 항상 트립토판이 된다. 트립토판은 OD260에서 스펙트로포토메터릭 모니터를 실시하기 위해 c-단부에 결합된다.
Wang(1974, J. Amer. Chem. 95:1328-1333)에 상술된 Nα-Fmoc-트립토판-알콕시메틸 폴리스티렌 수지는 Bachem. Inc.에서 수득하여 표준 고형상 펩티드 합성용기에 넣어둔다. 첨가될 아미노산은 역시 Bachem Inc에서 수득한 Fmoc-수정 아미노산이다. 사용된 다른 시약은 Austen에서 제시한 고형상합성(1988, 'Peptide Synthesis' Molecular Biology, Vol.3, pp.311-331)에 사용된 것과 동일하다.
Teflon 라이닝 캡이 있는 반응용기를 결합반응에 사용한다. 표준 고형상 단백질 합성반응 용기는 결합반응후에 엘리코트를 혼합하는 혼합실로 사용한다. 수지는 DCM으로 2회 세척후 DCM과 DMF가 1:1로 혼합물로 세척하고 DMF로 3회 세척한다. 수지는 DMF에 20%(v/v) 피레리딘으로 탈보호시킨다. DMF(3회), DCM(3회), DCM/DMF/1:1(2회)로 탈보호된 수지를 완전히 세척시킨후에 수지는 약 7.5㎖ DMF로 재현탁시키고, 각각 2.5㎖씩 세 개로 분리하여 세 개의 결합 튜브에 나누어 넣는다.
첨가된 보호된 아미노산의 양은 수지에 이미 부착된 트립토판의 몰수로 계산한다. 첨가될 각 아미노산에서, 약 5배몰의 아미노산을 세척된 수지에 엘리코트를 가지는 반응용기에 첨가한다. 각 반응용기에는 5X 량의 상이한 아미노산을 수용한다. 각 용기는 2분간 흔들고 DCM 3㎖에 DIC 5배량을 첨가한 후 1시간 교반시킨다.
결합반응의 완전성을 검사하기 위해 각 튜브에서 시료를 Sarin이 제시한 방법(1981, Anal. Biochem. 117:147-157)으로 Pierce Chemical에서 구입한 닌히드린 시약으로 검사한다. 테스트결과 결합반응이 불완전할 경우, 반응은 다음과 같은 몇가지 방법으로 완전하게 한다. a) 1 내지 5배 과량의 보호 아미노산으로 2차 결합하고, b) 상이한 또는 추가의 용매를 사용하여 추가 결합을 실시하고 또는 c) NaClO 또는 LiBr(Klis and Stewart, 1990. 'Peptides:Chemistry, Structure and Biology' River and Marshell, eds, ESCOM Publ. p904-906)을 첨가한다.
결합후에 세 개의 결합 튜브에서 수지를 조심스럽게 이동하여 단일 혼합실에서 결합시킨다. 수지는 DCM/DMF(1:1)로 2회, DCM으로 3회, DMF로 3회 세척후 20%(v/v) 피레리딘/DMF로 탈보호시킨다. 상기와 같이 DCM과 DMF로 완전히 세척한후 혼합물은 세 개의 엘리코트로 나누어 세 개의 별도 반응용기에 넣는다. 제 2 세트 아미노산을 첨가하여 결합이 종료된후 수지를 DCM, DMF로 세척한후 20% 피페리딘으로 탈보호시킨다. 제 3 세트 아미노산을 동일한 방법으로 첨가한다.
고형상 서포트에서 펩티드를 절단하기 위해 50%(v/v) TFA+5%(V/V) 아니졸 30㎖과 DCM에 0.9%(v/v) 에탄에디톨을 수지에 첨가한다. 혼합물은 4시간 교반하여 펩티드 상층액을 수득한다. 펩티드 상층액은 로터리 이베퍼레이터로 농축시키고 펩티드는 에테르에 침전시킨다. 완전히 세척후 펩티드 침전물을 건조시키고 다음의 분석단계를 준비한다. 분말형의 펩티드는 동결보관한다.
7. 실시예: 본 발명의 펩티드 합성 방법과 통상적인 합성방법의 비교
7.1. 물질과 방법
무작위 4가 펩티드라이브러리를 상기 실시예 6 에 따라 만든다. 또한, SPPS 기술을 사용하여 4가 펩티드 라이브러리를 만든다. Bachem. Inc에서 수득한 Nα-Fmoc-트립토판-알콕시메틸수지를 고형상 서포트/아미노산 성분물로 사용한다. 5X 량의 Nα-Fmoc-발린, Nα-Fmoc-세린(O-Bu)과 Nα-Fmoc-알라닌 동량은 결합단계 동안에 반응용기에 첨가한다. 세단계 연속 결합후에 4가 펩티드는 Austin이 설명한 것과 같이 50%(v/v) TFA, 5%(v/v) 아니졸, 0.9%(v/v) 에탄디톨/DCM으로 절단한다.
7.2. 결과
양쪽 펩티드 라이브러리를 C-18 역상 HPLC 크로마토그래피(Vydac)로 분석하여 라이브러리에서의 단백질 종의 수(피크수), 펩티드의 상대적인 농도(피크 면적)와 펩티드의 상대적인 친수성정도(컬럼에서의 초기 또는 후기용출)를 설명한다. 결과는 도면 3에 나타나 있다. 상부(도면 3A)의 크로마토그램은 본 발명의 방법에 따라 만들어진 펩티드 라이브러리에서 수득한 패턴이고, 도면 3B는 SPPS에 의해 수득한 패턴이다.
두 개의 패턴에서 21개의 피크가 나타나는데 이것은 각 라이브러리내에 적어도 21개의 상이한 펩티드 종이 있음을 나타낸다. 그러나 SPPS 패턴은 #1,2,3,4,5,6,7에서 상당히 큰 피크를 나타내고, 이것은 SPPS 라이브러리에는 펩티드 8-21 보다는 펩티드 1-7 의 농도가 더 많이 있음을 알 수 있다. 펩티드 1-7 의 수의 증가는 이들 펩티드가 나머지 펩티드보다 더 잘 합성됨을 말하는 것이다. 또한 주된 피크는 일찍 용출되어 컬럼내에 보유시간이 짧아지고 이것은 이들 펩티드가 친수성을 나타내는 것으로 알 수 있다.
이 결과는 SPPS 시스템으로는 기대할 수 없다. 발린은 소수성이고 거대분자이어서, 알라닌 또는 세린에서보다 상당히 늦은 결합속도를 가진다. 따라서 여기에서 실시한 통상적인 무작위 펩티드 합성동안에 발린은 알라닌과 세린의 결합부위를 두고 경쟁하게 되어 합성된 펩티드에는 발린이 적고, 생성된 펩티드는 무작위 펩티드의 동량 분포를 나타내지는 않는다.
대조적으로 본 발명의 방법에 따라 생성된 무작위 펩티드 라이브러리 패턴은 펩티드의 동량 분포를 알 수 있다. 비록 3,6,12,13,18 피크가 다른 피크의 면적의 두배를 나타내나 이것은 이점에서 두 개의 펩티드가 있음을 나타내고, 나머지 16개 피크는 거의 동일한 패턴을 가진다. 또한 21개 피크 모두 보유시간이 일정하여 펩티드의 동량분포를 알 수 있다.
#8 = Val-Ala-Ser-Trp
#8 = Val-Ser-Ala-Trp
#21 = Val-Val-Val-Trp
#6 = (Ser-Var)-(Ser-Ala)-(Ser-Ala)-Trp
발린 포함하는 서열은 본 발명의 방법이 공지된 늦은-결합 아미노산을 사용하여도 펩티드의 무작위 합성이 가능함을 알려주는 것이다.
피크 #6의 서열은 피크에 하나이상의 아미노산이 있기 때문에 결정적인 것은 아니다. 대부분 두 개의 피크는 Ser-Ala-Ala-Trp과 Val-Ser-Ser-Trp이 된다.
7.3. 결론
결과에서 본 발명의 무작위 펩티드 합성방법도 표준 SPPS 기술과 비교할 때 실제로 동량의 무작위 펩티드 라이브러리의 합성을 가능하게 하고 신속한 결합속도를 가진 아미노산을 포함하는 펩티드 세트가 우세하다.
8. 실시예: 수용체 분자에 결합된 펩티드 리간드의 분리
특정 펩티드의 분리를 위해 본 발명의 방법을 이용하여 설명하면 V-mos 유전자 생성물에서 예정된 서열의 12개 아미노산을 합성한다. V-mos는 마우스 육종에서 분리한 온코겐이고, Molarey murine 육종 바이러스와 관계한다. V-mos 유전자 생성물은 세린/트레오닌 카이나제 활성을 가진 것으로 공지된다.
8.1. 물질과 방법
Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala 는 Nα-Pmos 화학과 SPPS 시약과 기술을 사용하여 폴리아크릴 아미드 비드(-300㎛ 직경)에서 합성한다. 곁사슬 보호기는 5-%TFA로 제거하고, 나머지 펩티드를 링커인 아미노카프론산-에틸렌디아민으로 폴리아크릴아미드 수지에 연결되어 최종구조인 Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala-아미노카프론산-에틸렌디아민수지(이하 'long-V-mos 비드')가 된다. 이 펩티드 서열은 v-mos 유전자 생성물의 100-111에 상응한다.
동일한 방법을 사용하여 V-mos 유전자 생성물의 106-111(Gly-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala)은 동일한 링커를 사용하여 폴리아크릴 아미드 비드에서 합성한다(이하 'Short V-mos 비드'). 이 펩티드는 음성 콘트롤로 이용한다.
항-v-mos로 공지된 long v-mo 펩티드에 대한 특이적 쥐 단클론 항체를 만드는 하이브리도마 세포주(Hybridoma No. 165-28E7, SCRF 354, Lot No. 165-119)는 Microbiological Associates Inc에서 수득한다. ELISA 검사에서 이항체는 v-mos, MOS, neu HER-1, HER-2, 유전자 생성물의 동일한 서열을 감지한다. 이항체는 Short v-mos 펩티드에 약간의 친화력을 가진다. 알칼라인 포스파타제로 라벨된 항-쥐-IgG을 Sigma에서 수득한다.
Methods in Enzymology Vol 121(1981)에서 제시한 통상적인 기술을 사용하여 단클론 항체는 복수에서 형성되고 Pharmacia에서 수득한 단백질 G-컬럼에서 정제할 수 있다.
8.2. 결론
long v-mos 비드는 수천배의 Short v-mos 비드와 혼합한다. 0.1% Tween 20과 PBS의 정제된 항-v-mos 단클론 항체(1㎍/㎖) 2㎖을 long/short v-mos 비드 혼합물에 첨가하고, 서서히 혼합시키면서 1시간동안 실온에서 배양한다. 비드는 혼합하면서 1시간동안 세척한다. 비드는 작은 폴리프로필렌 디스포즈블 컬럼(Isolab)에서 세척한후, 비드는 다시 회수된다. 비드는 1시간동안 1:2000 희석으로 2㎖ 2차 항체와 배양시키고 세척후 폴리스티렌 배양접시에 넣은후 세트시킨다. 상층액은 제거하고, 5-브로모-4-클로로-3-인도일 포스페이트와 니트로 블루 테트라 졸리움 용액을 기질로써 서서히 첨가한다.
15분간 실온에서 배양한후 long v-mos 비드는 자주색으로 변하고 Short v-mos 비드는 무색으로 남아 있는다. 이것으로 무색 비드 수천개내에서 단일의 검은색 비드를 즉시 감지하는 것이 가능하게 된다. 비드사이의 구별은 도면 2-4에서 구분되고 모두다 배양접시에 분포된 비드는 40X 비율로 사진을 찍은 것이다. 도면 2 는 단클론 항체로 라벨된 long v-mos 비드를 나타내고, 제 3 도는 항-v-mos 단클론 항체로 라벨된 long-short v-mos 비드 혼합물을 나타내고 제 4 도는 무색비드에 단일 청색 비드를 감지하는 것이다. 따라서, 소요의 펩티드 서열을 가진 비드는 라이브러리에서 다른 비드와 구별되어 분리하기 쉽다.
분리후, Applied Biosystem 473A 단백질 서열기는 단일 'long-v-mos' 수지비드의 N-단부 아미노산 서열을 결정하기 위해 이용된다.
8.3. 결론
이 실시예에서는 펩티드의 경우에 수천의 비결합, 무관한 비드에서 소요의 바이오-올리고머 리간드를 포함하는 비드를 선별하는 방법을 설명한다. 또한 이 실시예는 반응성 비드를 분리하고 펩티드 서열을 결정하는 것을 설명한다.
9. 실시예: 반응분자의 결합하는 짧은 펩티드 리간의 분리
특정펩티드를 분리하기 위한 본 발명의 방법을 이용하여 설명하면 예정된 서열 Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr의 6가 펩티드는 SPPS와 Nα-Fmoc 화학을 이용하여 100㎛ PAM 수지에서 합성한다.
9.1. 물질과 방법
8.1.의 설명에 따라 결합반응을 실행한다. Alpha-아미노-차단기는 20% 피페라진으로 제거하고 곁사슬 보호기는 50% TFA로 제거한 후 아미노카프론산 β-알라닌 링커에 의해 폴리스티렌 수지에 공유결합된 남아있는 펩티드는 최종 구조 Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr-아미노카프론산-β-Ala 수지가 된다. 이것은 실시예 8에서 설명한 v-mos 유전자 생성물증 104에서 109 잔기에 해당된다.
실시예 8 에서와 같이, 항-v-mos 항체는 v-mos 펩티드에 대한 특이적 쥐 단클론 항체를 만드는 하이브리도마 세포주에서 수득한다. 라벨된 제 2 차 염소-항-쥐 IgG-알칼라인 포스파타제는 시그마에서 얻을 수 있다.
9.2. 결과
상기 설명한 PAM 수지/v-mos 펩티드 0.1㎎을 Bachem. Inc에서 수득한 Nα-Fmoc-알리닌 PAM 수지와 혼합한다. 0.1% Tween 20과 PBS/정재된 단클론 항체(1㎍/㎖) 2㎖을 펩티드/서포트 혼합물에 첨가하고 45분간 부드럽게 혼합하면서 실온에서 배양한다.
비드를 가지는 작은 폴리프로필렌 디스포즈블 컬럼에서 비드를 세척한다. 비드는 1시간동안 알칼라인 포스포타제-라벨된 2차항체(1:100)로 혼합한다. 세척후에 비드는 글라스 필터에 스프레드하고 H2O2와 ABTS를 흡수시킨다. 실온에서 15분간 배양한후 PAM수지/v-mos 펩티드 비드는 검은 그린색으로 변한다. 글라스필터에는 좀더 밝은 녹색을 둘러싼 작은 후광이 형성된다. v-mos 펩티드가 부족한 고형상 서포트는 단클론 항체와 반응하지 않아 색의 변화가 없다. V-mos 비드는 뚜렷이 구별된다.
9.3. 결론
이 실시예는 소요의 수용분자가 고형상 서포트와 비-특이적으로 반응하지 않고 다만 고형상 서포트/펩티드 복합물에 특이적임을 설명한다. 실시예 8 에서와 같이 양성의 반응 비드를 분리하고 부착된 펩티드를 서열화했다.
10. 실시예: 스트렙토아비딘과 항-β-엔드로핀 MAB의 리간드 결정
이번 실시예는 본 발명의 펩티드 리간드 확인시에 상이한 접근방법을 설명하는 것이다. 무작위 라이브러리의 발생시키는 생물학적 시스템(예로써 퓨젼 필라멘트형 파아지)의 의존대신에 본 발명은 각각의 비드에 상이한 펩티드와 거대펩티드 라이브러리의 화학 합성을 이용하는 것이다. 각각의 특이적 결합 펩티드 비드는 비드에서 물리적으로 분리하고 부착된 펩티드의 서열을 결정화한다.
이 접근방식은 거대 무작위 펩티드 라이브러리를 화학적으로 합성하는 능력에 의존하는데 이는 적절한 감지분리와 구조결정 시스템과 연결된다.
본 발명에서 제기되는 이 문제의 제거수단은 각 커플링 사이클 동안에 각각의 엘리코트에 수지비드를 분리할 수 있고 개별 활성화된 아미노산과 반응을 허용한다. 완전한 결합후에 수지의 다양한 엘리코드는 완전히 혼합하고, 세척하고, 탈보호하여 세척하고 다시 새로운 결합 사이클을 위해 엘리코트로 분리한다. 따라서 한 수지비드는 결합 싸이클에 있는 하나이상의 아미노산에 노출되고 각 단계에서 각 비드는 단일의 독특한 펩티드 서열을 포함한다. 이 방법에 의해 발생되는 펩티드 라이브러리는 이론적으로 완전히 무작위가 된다. 따라서 각 펩티드종의 동일몰비율을 얻을 수 있다. 교환수와 펩티드의 수는 각 결합단계에서 선택된 엘리코트의 수와 아미노산에 따라 달라지고 합성에서의 결합단계수에 따라 다르다.
방대한 배열의 펩티드를 동시에 합성하는 새로운 방법은 완전히 무작위의 동일몰량의 라이브러리를 제공하고 또한 고형상 펩티드 수지비드의 라이브러리가 되는데 각 비드는 단하나의 독특한 펩티드 서열을 가진다. 최종 특징은 각 펩티드 합성동안에 확실해진다. 각 비드는 한번에 하나의 펩티드와 접하여 하나의 결합반응이 완전하게 된다. 원비드-원펩티드 개념은 현재 방법의 성공에 아주 중요한 사실이 된다.
합성방법에서 실제로 어떠한 펩티드 라이브러리도 잘 정의된 성분물로 합성될 수 있다. 예로써 각 엘리코트에 20개 L-아미노산이 모든 결합단계에서 사용될 경우 특정 결합단계에서는 하나 또는 몇 개의 아미노산이 이용될 수 있다.
10.1. 재료와 방법
10.1.1. 펩티드 라이브러리의 합성
거대 라이브러리 X-X-X-X-X-β-알라-아미노카프론산-에틸렌디아민-수지가 합성되었다(X = 시스테인을 제외한 19개 아미노산). 펩티드 합성에 선택된 고형상 수지비드는 폴리디메틸아크릴아미드(PDA)이다.
이 수지로 화학적 그리고 펩티드의 합성은 Atherton 과 Sheppard 의 방법에 따라 실행한다(1988, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach. IRL Press). 수지 3g(약 2만비드)를 에틸렌 디아민과 18시간 정도 부드럽게 혼합한다. 완전히 세척후 아미노카프론산과 β-알라닌으로 링크없이 Fmoc를 이용해 수지에 결합시킨다. 다음의 5개 결합단계에서 무작위반응을 실행한다. 시스테인을 제외한 Fmoc-아미노산-OPfp는 각 단계에서 별도로 사용된다. 다섯 개 결합단계가 종료된후 Fmoc기는 DMF/20% 피페라진(v/v)에서 제거한다. 곁사슬 보호기는 90% TFA(v/v), 1% 아니졸(v/v)과 0.9% 에탄에디톨(v/v) 혼합물로 제거한다. 수지는 10% 디이소프로필에틸아민(/DMF)으로 중성화시키고 4℃에서 DMF에 저장한다.
링커인 β-알라닌-아미노카프론산-에틸렌디아민은 총 11개 C 원자와 4N 원자로 최대 길이가 17.6A 이다. 19개의 상이한 아미노산이 다섯 개 결합단계에 사용되기 때문에 이론상의 펩티드수는 195 또는 2,476,099 이다.
이미 언급한 것과 같이, 방법에서의 일반적인 단계는 각각의 고형상 수지 비드에 무작위 펩티드의 거대 라이브러리를 합성하고 각 비드에는 단일 펩티드 종이 포함되어 있다. 수용체 분자와 반응하는 개별 수지 비드는 확인하고 물리적으로 분리하고 펩티드 리간드의 아미노산 서열은 에드만 분해에 의해 결정한다. 그러므로 방법의 성공을 위해서는 각 단일 비드에 펩티드 서열의 정확한 확인이 필요하다. 자동 단백질 서열기(모델 477A-01 펄스 리퀴드 오토매틱 단백질/펩티드 서열기, Applied Biosystem)로, 펩티드 50-500mol을 각 비드에서 회수할 수 있다. 또한 서열 데이타의 분석(MiMarch et al., 1990 'Peptides: Chemistry, Structure and Biology', Proceedings of 11th American Peptide Symposium, 1988. 7. 9-14: La Jolla, Ca., ESLOM, Leiden p229-230)에서는 고형상 펩티드의 합성결합능이 98% 이상이었다.
10.1.2. 라이브러리에서 펩티드 리간드의 특이적 확인과 선택
무작위 라이브러리에서 특이적 펩티드 리간드의 확인과 선택은 ELISA, 면역형광 또는 면역자성 비드와 같은 면역학적 기술을 이용하여 용이하게 실행할 수 있다. 여기에서 설명하는 실험에서 감지 시스템에서는 면역조직학 기술이 이용된다. 본 연구에 사용된 특이적-결합 수용체 분자는 (i) 바이오틴-결합된 단백질 스트렙타아비딘 (ii) 항-β-엔드로핀 단클론 항체(MAb)이다. 융합 필라멘트형 파지 에피토프 라이브러리 시스템을 이용하여 펩티드 리간드는 이들 두 개의 수용체 분자 모두 확인하는데 성공하였다.
면역조직학적 기술은 스트렙타아비딘 결합 비드의 감지에도 사용된다. 펩티드 무작위 라이브러리는 희석된 DMF에 그중 증류된 증류수를 증가시키면서 서서히 혼합시킨다. 결과적으로 비드는 PBS로 완전히 세척하고 젤라틴(0.1% w/v)은 비특이적 결합을 차단하는데 사용할 수 있다. 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제 1:200,000은 한시간동안 서서히 교반시키면서 비드에 첨가한다. 비드를 완전히 세척한후 기질인 BCIP/NBT를 첨가한다. 기질용액과 비드를 15개 폴리스트린 배양접시(100×20㎚)에 옮긴다음 두시간 반응시킨다. 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제가 결합된 비드는 검청색으로 변하고 라이브러리의 대부분 비드는 무색으로 남아 있다.
10.1.3. 펩티드 리간드의 친화력결정
항-β-엔드로핀 단클론 항체의 펩티드 리간드 결합 친화력은 용액상태에서 결정한다. 항-β-엔드로핀 결합검사는 5.0nM[3H][Leu]유키팔린(특이 활성 = 39.0 Ci/mmole. New England Nuclear)의 펩티드 리간드 저해를 검사하는데 1.0㎎/㎖ BSA, 0.1%(v/v)Tween 20과 0.5%(v/v) 소듐 아지드를 포함하는 40mM 트리스-염산, 150mM 염화나트륨 완충액 1.0㎖(pH 7.4)에 125-200ng/㎖ 항-β-엔돌핀 MAb의 결합으로 알 수 있다. 특이적 결합은 1.0μM 라벨안된 [Leu] 유키팔린 유 또는 무 상태에서 측정한 결합의 상이성이 된다. 바이오리간드의 결합은 10X 단백질-G 세파로스(Pharmacia)를 추가하여 23-24℃에서 18시간 배양하면 침전된다. 단백질-G 세파로스는 원심분리(13000xg 5분)로 수득되고 리키드 신틸레이트 카운팅 바이알에 옮기기전에 펠렛은 250㎕ 5%(v/v) 아세트산으로 현탁시킨다. Kd값(n=3)은 각각의 총결합시료와 비특이적 결합의 2배와 [3H][Leu] 유키팔린에 대해 5 방사능리간드 농도(1.87-30nM)를 이용하여 포화도 분석에 의해 결정한다. 측정된 평균 Kd 값은 9.79±4.63mM이다. 펩티드 리간드 저해곡선은 400배 범위에서 8개 펩티드 농도에서 생산된다. 포화와 저해 연구에서 결합 데이타는 Knapp에 의해 보고된 한 부위 모델을 이용하여(1990, J. Pharmacol, Exp. Ther. 255:1278-1282) 중량-비직선적 억제방법에 의해 분석할 수 있다. 저해결합 상수인 Ki 값은 Cheng과 Prusoff의 방법을 이용하여 계산한다(1973, Biochem. Pharmacol. 22:3099-3102). 각 Ki 값은 3 내지 4개 독립변수로 계산한다.
10.2. 결과
거대 합성 무작위 펩티드 라이브러리(X-X-X-X-X-수지 X는 19개 아미노산(시스테인 제외). 총 195=2,476,099)를 선별한다. 약 2만개 비드가 선별된 라이브러리 부분에 있다. 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제 이온의 제 1 단계 스크린에서 약 75개 비드가 다양한 색으로 착색되어 물리적으로 선택하고 현미경 조작하에서 제거할 수 있다. 각 비드는 8M 구아니딘 하이드로 클로리드로 세척하여 결합된 스트렙타아비딘 효소 결합물을 제거한다. 결과적으로 각 비드는 ABI 카트리지의 글라스 필터에 깔려 있다. 표 1 에서는 75개 비드중 28개 서열을 나타내었다. 도면 5 의 사진을 양성(검청색)비드가 수많은 음성비드(무색)의 백그라운드하에 용이하게 확인될 수 있다.
스트렙타아비딘과 결합하느 각 비드의 펩티드서열
HPQFV(b0.8, 1120) GHPQG(0.44, 250) PLHPQ(2.5, 48)
HPQGP(0.35, 60) MYHPQ ALHPQ
HPQAG(1.5, 53) REHPQ(0.56, 112) AAHPQ(0.9, 476)
LHPQF(0.47, 286) IQHPQ(1.8, 192) dTPHPQ(0, 158)
FHPQG(0.23, 72) GNHPQ(0, 222) WNHPM(2.5, 59)
GHPQN(0.5, 44) TVHPQ(0, 96) WTHPM(1.4, 202)
THPQN(0.5, 44) IGHPQ VHPMA(0.6, 21)
QHPQG(2.3, 60) WMHPQ(2.7, 257) dMHPMA(0.31, 140)
JHPQG(2.1, 57) GAHPQ
a - 이들 리간드는 2,476,009 펩티드 라이브러리에 의해 확인됨.
b - ()의 처음 숫자는 에드만 분해의 5회의 %.
c - ()의 둘째숫자는 서열화동안의 제거되는 단백질의 량(pmole)
d - 2개 TPHPQ와 2개 MHPMA 서열이 확인되고 다른 반복서열은 없음.
HPQ 서열이 스트렙타아비딘의 바이오틴 결합부위에 실제 결합을 증명하기 위해 LHPQF-β-Ala-아미노카프론산-에틸렌디아민-수지(LHPQF-수지)를 합성하였다. LHPQ-수지는 다양한 바이오틴 농도하에 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제와 혼합한다. 결과는 도면 6 에 나타나 있다. 100nM에서 바이오틴이 LHPQF-수지의 착색을 저해한다. 10과 1.0nM에서 바이오틴은 부분적으로 착색을 저해하고, 0.1nM 농도에서는 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제에 의한 LHPQF-수지의 착색에 효과가 없다. 저해연구는 HPQ 서열이 스트렙타아비딘의 바이오틴 결합부위에 결합함을 알 수 있다.
항-β-엔돌핀 MAb와 스크린하기 위해 동일한 무작위 펩티드 라이브러리를 사용하기 전에 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제로 착색된 모든 청색비드가 제거된다. 나머지 비드는 8M 구아니딘 하이드로클로리드로 처리하여 결합된 단백질을 제거한다. 리사이클된 라이브러리는 16시간동안 바이오틴화된 항-β-엔돌핀 MAb(항-β-엔돌핀, 클론 8-7 Boehringer Mannheim에서 수득)로 혼합한다. 세척후에 스트렙타아비딘-알칼린 포스포타제의 제 2 단계는 ELISA로 착색반응을 촉진시켜서 사용한다. 자연 리간드와 유사한 6개 펩티드 서열은 : VGGMV, VGALQ, YGGLS, YGGFA, YGGFT 와 YGGFQ를 확인한다. 이들 리간드의 다양한 카복시 단부와 유사한 펩티드를 합성하고 라벨된 리간드와 라벨안된 펩티드로써 [3H]-Leu-유카팔린을 이용하여 이들의 Ki를 결정한다. 이 연구결과는 표 2 에 요약한다.
항-β-엔돌핀 단클론 항체에 대한 펩티드 리간드의 친화력
Ki, nMCarboxyl Terminus
Peptide -OH -NH2 -β-OH -βA-NH2
YGGFL 17.5±3.2 27.9±2.3 17.1±1.8 13.7±1.7
YGGFA 32.9±2.0 72.0±16.4 82.3±8.8 93.6±34.7
YGGFT 36.9±7.7 65.2±16.8 50.6±8.9 43.3±2.3
YGGFQ 15.0±1.7 40.1±6.0 39.4±2.3 45.4±11.6
YGGLS 726±134 991±52 916±182 1150±247
YGGLQ 1980±303 2910±695 1470±120 1910±504
YGGMV 8780±1500 14000±1110 5140±885 7160±1010
YGGL is [Leu] enkaphalin, the native ligand for the anti-β-endorphin MAb.
10.3. 토의
민감성과 특이적 감지 그리고 선택시스템과 결합된 각 비드에서의 각 펩티드의 합성하는 능력은 본 발명의 방법에 중요한 열쇠가 된다. 새로운 방법은 'Selectide Process'이다.
라이브러리에서 각 개별 펩티드 비드를 선택하고 그리고 8M 구아니딘 하이드로클로리드로 처리하고, 정제하고 수지에 공유결합으로 남아있는 펩티드로 선별한다. 자동펩티드 서열은 5-10pmol과 같은 낮은 농도의 펩티드 서열화 할 수 있다. 또한, 비가역적으로 비드에 결합된 청색은 서열화에 저해되지 않는다. 무작위화의 각 단계에서 다량의 Nα-Fmoc-아미노산을 사용하는 것을 포함한 합성방법을 적절화한다. 서열화의 자료에서 볼 때 합성 화학반응의 결합능이 98%가 초과한다.
착색된 비드는 무색비드(도면 7)에서 두드러지게 나타나기 때문에, 10-15 배양접시에서 현미경하에서 2만개 비드를 스크린할 수 있고 서열화를 위해 반응비드를 선택한다. 또한, 각 양성비드의 상대적인 착색강도를 검사함으로써 다양한 리간드의 상대적인 친화성을 측정할 수 있다. 이러한 특징은 서열화를 위해 특이적 색체의 비드를 선택하는데 사용할 수 있다.
Devlin은 (1990, Science 259:404-406 Section 2) 융합 필라멘터형 파지 기술로 분리한 20개 스트렙타아비딘 결합 리간드에서 HPQ, HPM과 HPN의 중요성을 보고하였다. 20개 분리체에서, 15개가 HPQ, 4개가 HPM, 1개가 HPN 서열을 가진다. 흥미롭게도 펩티드 라이브러리는 28개 상이한 펩티드를 생산하고 이들중 5개가 HPM 서열을 가진다(표 1). 5가 펩티드에서 HPQ/HPM 위치는 스트렙타아비딘-결합에 중요하지 않다. 모든 HPQ 또는 HPM 5가 펩티드중 확인된 것은 2개이다(TPHPQ 와 MHPMA). Devlin에서 보고한 자료를 비교해보면 이들 20개 분리체중에서 다수 반복되는 것은 생합성 방법에서의 선택을 기초한 것이다.
항-β-엔돌핀 시스템에서, 리간드 YGGFL의 것과 유사한 서열의 6개 펩티드를 확인한다(표 2). 이러한 결과는 퓨젼 필라멘트형 파지 기술로 수득될 수 있다(클론 3-E7)(Cwirla, 1990, PNAS, U.S.A. 87:6378-6382). 펩티드 라이브러리는 Cwirla에 의해 수득한 몇 개 리간드 서열을 만든다. 수득된 리간드의 50%는 파지기술에서 선택된 것보다 항체에 더 큰 친화성을 가진다.
11. 실시예: 리미티드 펩티드 라이브러리
다른 실험에서 본 발명은 다른 항체와 검사하고 N-단부보다는 펩티드 중간부분에 에피토프가 위치한다(β-엔돌핀의 경우). 사용된 항체는 항-v-mos 펩티드 단클론 항체(항-v-mos-MAb)이다. 이와 같은 항체는 v-mos 온코겐 생성물의 100 내지 111에 상응하는 12개 아미노산 펩티드(LGSGGFGSVYKA)로 쥐를 면역화시킨다. 이 펩티드를 면역화시키기 전에 수용체 단백질에 결합시킨다. ELISA 테스트에서 항-v-mos MAb는 v-mos, MOS, neu/HER-1과 HER-2 유전자 생성물의 서열과 유사한 것을 감지한다.
11.1. 물질과 방법
겹쳐지는 펩티드(4가, 5가, 6가 펩티드)를 합성하기 위해 에피토프 멥키트(Cambridge Research Biochemical. Hoston)의 상업적인 멀티-핀 시스템(Geysen 1986, Mol. Immunol. 23:709-715)을 이용하여 항-v-mos MAb에 의해 인지되는 12개 아미노산 v-mos 펩티드내에 에피토프를 5가 펩티드 서열(FGSVY 예로써 v-mos 12가 펩티드중 6-10)로 매핑한다.
본 실험에서 v-mos 에피토프에 있는 아미노산 발린 세린을 사용한 제한 무작위 라이브러리를 제거한다. 이와 같은 제한된 무작위 라이브러리는 다음과 같다. G-X-X-X-X-X-β-Ala-아미노카프론산-에틸렌디아민-수지, X=Glu, Pro, Asn, Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly, Tyr, Ala, Met, Arg, Trp이 된다. 발린과 세린을 제외하고 모든 곁사슬 기능기를 포함한 이들 14개 아미노산을 선택하고 즉 (i) Asn은 선택되고, Gln은 선택이 안되고, (ii) Glu은 선택되고 Asp은 선택안되며 (iii) Thr은 선택되고 Ser은 선택되지 않으며 (iv) Len은 선택되며 Ile 또는 Val은 선택되지 않으며 (v) Met은 선택되고, Cys은 선택되지 않는다. 5개 무작위 결합단계중 하나에서 14개 아미노산이 선택되고 이론적인 펩티드수는 145 또는 537,824 펩티드가 된다.
항-v-mos 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주는 Microbiological Associated Inc.,에서 구입할 수 있다(Hybridoma No. 165-38E7, SCRF 354 Lot No. 165-119).
항-v-mos mAb의 펩티드 리간드 친화력은 [3H]아세틸 v-mos 펩티드([3H]Ac-v-mos)를 사용하여 용액상 결합연구에 의해 측정한다. [3H]소듐 아세테이트의 방사능 리간드는 곁사슬의 탈보호전에 v-mos 펩티드의 N-말단 아세틸화에 의해 준비할 수 있다. 역상 HPLC에 반응안된 v-mos 펩티드에서 분리한 [3H]Ac-v-mos 생성물은 2.50Ci/mmole의 특이활성을 가진다. 항-v-mos MAb의 [3H]Ac v-mos의 결합친화력은 3시간 배양후에 23-24℃에서 1.0㎖ PBS-젤라틴 완충액(0.05% 젤라틴/PBS)에서 측정한다. 특이적 결합은 각 [3H]Ac-v-mos 농도에서 100μM 라벨안된 v-mos 펩티드 유(비특이적) 또는 무(전체)에서 [3H]Ac-v-mos 결합사이의 상이성으로 정의한다. 결합된 바이오리간드는 단백질-G 세파로스(Pharmacia)의 10X초과량(사용된 이뮤노글로블린에 관계된 결합능)을 사용하여 원심분리에 의해 분리한다. 135-500nM 농도범위에서 포화 결합분석에서 [3H]Ac-v-mos는 850±160nM의 Kd 값으로 항-v-mos mAb에 결합한다. 펩티드 리간드의 결합 친화력은 상기 설명한 조건에서 20nM[3H]Ac-v-mos와 10㎍/㎖ 항-v-mos MAb와 7개 펩티드 농도를 사용하여 결합 저해도 연구를 한다. 총결합의 50%가 저해연구에서 특이적이다. 포화와 저해 결합 상수는 이전에 설명한 것과 같은 비-선형 억제분석에 의해 단일부위에서 결정한다(Knapp와 Yamamura, 1990, Life Sci 46:1457-1463).
11.2. 결과
약 230,000 비드가 항-v-mos 알칼리 포스파타제 결합에 의해 선별한다. 그러므로 43% 이하가 검사된다. 기질과 배양후 비드중 50개가 강렬한 청색으로 착색된다. 이들 비드중 24개가 물리적으로 선택되고 이들중 7개 아미노산 서열을 정량한다. 또한 무색의 17개 비드를 서열화를 위해 선택한다.
항-v-mos 리간드 서열 결과를 표 3 에 나타내었다. 이 펩티드 라이브러리에는 발린과 세리너이 포함되지 않기 때문에 11개 펩티드 리간드 서열중 어느것도 에피토프(FGSVY)와 유사하지 않다. 11개 펩티드 리간드에 반복성이 없기 때문에 이들 서열은 무작위성이 아니다. 아르기닌과 티로신이 이들 서열에 빈번히 발생한다. 또한 각 펩티드 리간드의 각각에 2째 또는 셋째 위치에 하나 또는 두 개의 아르기닌이 있다. 한편 음성비드는 통상적인 아미노산 서열을 가지지 않는다. 시료크기가 한정되어 있어 음성비드에서 서열의 카이스퀘어는 중요성이 없기 때문에(X2=18.27 df=13, p-0.15) 비-착색 무작위 펩티드 비드의 불균일 분포의 증거를 가지지 못했다.
항-v-mos 단클론 항체와 상호 작용하는 각 비드의 펩티드 서열
A. Interactive Beads
GRRGME GRYMPK
GRRPYG GFRHMA
GRRAYE GFRYHN
GRREGP GHRYFH
GRYAKH GWREKE
GRKTYY
B. Non-interactive Beads
GKELAG GFEKHP
GPYLMW GWGAYP
GTKMNF GAARPP
GEKMEF GLFGME
GYEEPK GRLNTL
GKKPNP GMTHAY
GEYAPP GPYGMA
GGFMEF GHYNNL
GPKFMA
양성 리간드 몇 개가 합성되고 항-v-mos MAb의 친화성이 용액상 결합연구에 의해 결정된다. 이 연구 결과는 표 4 에 요약한다. 표 4A 에서 항-v-mos 단클론 항체의 v-mos 에피토프의 결합 친화력을 요약하였다. 카르복실 단부의 변화효과를 보여준다. 표 4B 에는 v-mos 에피토프에 있는 몇가지 아미노산이 없는 펩티드 라이브러리에서 확인된 미모토프의 결합 친화력을 요약한다. β-알라닌 아미드는 시험된 리간드중에 포함되어 비드에 항체가 결합된 확인 리간드의 구조를 가정할 수 있다.
항-v-mos MAb의 펩티드 리간드의 결합친화력
Peptide Ki, μM
A. LGSGGFGSVYKA (v-mos peptide) 3.2±0.4
GFGSVY-NH2(v-mos epitope) 246-337
GFGSVY-OH 1000
GFGSVY-βA-NH2 409-442
GFGSVY-βA-OH 529-770
B. GRRAYE-OH 6.79±2.31
GRRAYE-NH2 24.70±7.00
GRRAYE-βA-OH 15.10±0.50
GRRAYE-βA-NH2 9.02±20.10
GRRGME-OH 100
GRRGME-βA-NH2 24.00±8.40
GRREGP-βA-NH2 26.90±6.20
GRRPYG-OH 1000
GRRPYG-βA-NH2 20.50±4.50
표 4 에 있는 최상 항-v-mos 미모토프의 친화력은 원 펩티드의 것보다 2.5배 적다. 시험한 펩티드 리간드중 원래 v-mos 리간드만큼 낮은 Ki 값을 가진 것은 없으나 결과에서는 원래의 에피토프에 있는 아미노산중 몇 개가 부족한 무작위 라이브러리를 사용하여 설명하면, 수용체 분자 항-v-mos MAb에 친화성이 있는 구조적으로 상이한 미모토프를 확인할 수 있다.
11.3. 토론
본 연구에 사용된 항-v-mos MAb는 v-mos 펩티드에 상대적으로 낮은 친화력을 가진다. v-mos 선형 에피토프에 세린과 발린이 있기 때문에 사용된 스크린 라이브러리에서 생략한다. 전부 상이한 서열과 아미노산 성분물의 선형 미노토프의 한정하는 방법이므로 항체의 친화력을 비교할 수 있다. 이것으로 복합성과 거대분자-펩티드 상호작용을 설명한다.
12. 실시예: 선택적 절단형 링커:ONb
UV-절단형 링커 ONb에 결합되는 4개의 펩티드를 준비하여 검사한다.
12.1. 물질과 방법
다음의 4개 펩티드는 SPPS 기술을 사용하여 두 개의 수지를 만든다.
i) Fmoc-Trp-Tyr(OBut)-Phe-ONb-βAla-ACA-EOA-PepSyn K
ii) TRP-Tyr-Phe-ONb-βAla-ACA-EDA-PepSyn 1
iii) Fmoc-Typ-Tyr(OBut)-Phe-ONb-βAla-ACA-4-MBHA
iv) Trp-Tyr-Phe-ONb-βAla-ACA-4-MBHA
각 펩티드는 0.3㎖ 물 또는 3/7 클로로에탄올:디클로로메탄에서 UV와 VIS로 1시간과 3시간으로 방사한다. 16+16 실험을 하고 검사한다.
노출된 상층액은 여과하고 냉동 분말 건조하여 MeOH(0.3㎖)의 동량에 용해시킨다. 생성물은 HPLC에서 분석한다.
12.2. 결과
HPLC에 의한 분석에서 물에서의 방사에는 3가 펩티드가 해리되지 않았고, 1시간동안 UV 방사하면 3가 펩티드가 완전히 해리되었다.
특히, 물에서의 펩티드 1 은 단일 생성물이 절단되었다. 특정 경우에 두가지 생성물은 HPLC에서 용출됨을 관찰하였다. 장시간 노출시킬 때 (UV) 두가지 생성물사이의 전환은 몇가지 경우에만 관찰할 수 있었다.
12.3. 토의
UV-민감성 링커는 수용성 용액에서 펩티드를 해리하는 역할을 한다. 노출시간이 1시간이면 불완전한 펩티드를 해리하는데 적절하다. 그결과는 폴리아미드 수지는 수용성 시스템에서 적절하고 적응성이 있다.
13. 실시예: 효소의 확인
13.1. 물질과 방법
20개 아미노산중 19개(시스테인 제외)로 구성된 5가 펩티드의 무작위 라이브러리는 본 발명에 따라 준비한다(10.1 참고).
펩티드 라이브러리는 생성물 형성을 유도하는 조건하에서 NBT 클로리드에 노출시킨다. 그리고 양성비드를 확인한다. 이들 비드를 선택하고 서열화한다.
13.2. 결과
5개 비드서열은 NTB 환원 반응 촉매에 의해 검청색 이가 포르마잔 생성물이 됨을 나타내고 표 5 에 나타내었다.
효소활성이 있는 펩티드비드의 서열화
PNNNH
WNNNM
PNNN
MNNNR
QNNNR
13.3. 토의
다음의 결과는 펩티드 PNNNH-비드가 NBT 환원작용을 시켜 효소적 또는 화학적으로 검청색 디포르마잔 단편을 형성하게 한다. 이와 같이 펩티드 또는 펩티드-비드는 '인공효소' 또는 '유사효소'로써의 활성을 가짐을 설명한다.
14. 실시예: 항-암 펩티드 서열의 선별
글루타민산, 세린, 발린, 글리신, 아루지닌과 아스파라진으로 구성된 아미노산에서 선택한 다섯 개 아미노산으로 구성된 무작위 서열에 의해 티로신 성분물의 5가 펩티드로 구성된 리미티드 라이브러리는 항-암 세포주 활성을 가진 펩티드 서열이다.
14.1. 물질과 방법
본 발명의 무작위 펩티드 라이브러리는 가수분해성 디케토피페라진 링커로 합성된다. 96-웰 플레이트는 항암제를 선별하는데 사용한다.
곁사슬기와 Nα-Fmoc 기의 탈보호후 펩티드 비드 라이브러리는 DIEA로 중성화하고 DMF로 세척하여 잔류한 잠재적 독성화학물을 제거한다. 라이브러리는 점진적으로 0.01M 염화나트륨(링커가 안정한 상태)에서 교환되고 0.001M 염화나트륨으로 최종적으로 세척한다. 대략 10개 라이브러리 비드를 플레이트 각 웰에 옮긴다. 50㎕ RPMI 배지(25mM HEPES 완충액)를 각 웰에 첨가하여 용액 pH를 중화시킨다. 중성 또는 약 알칼리성 pH에서 펩티드는 해리된다(16-24시간후).
(1) 배지의 전체 또는 일부를 특이적 암세포주가 있는 분리플레이트에 옮기거나 (2) 종양세포주를 비드가 있는 웰에 직접적으로 참가한다. 약 2500 폐암세포/웰을 사용하였다. 플레이트는 7일간 37℃에서 배양하고 MTT 검사는 각 웰에 있는 해리된 펩티드의 상대적인 세포독성을 정량화한다.
다양한 사람 암, 육종, 마이엘로마와 백혈병 세포주를 이용한다. 예에서는 NCI 종양: L1210 임파종:B16 흑색종: 루이스 폐암:M5076 육종:콜론 38 암:MX-1 사람유방육종이 사용되었다. 다른 예에서는 MCF-7 유방암과 호킨스 비-소 세포 폐암이 사용되었다.
14.2. 결과
서열 YXXXXX-비드의 8000 펩티드로 구성된 라이브러리를 스크린하였다. 이때 Y는 트립신 X는 글루타민산, 세린, 발린, 글리신, 아르기닌 또는 아스파라진이다. 이들 두 실험에서 수천개의 해리된 펩티드를 포함하는 3-4 상층액은 호킨스 비-소 세포 폐암주의 성장저해를 나타낸다. 약 10개 비드를 포함한 각 웰에서 8000 가능서열 모두를 검사하였고 3개 활성펩티드 비드를 확인하였다. 세포와 비드를 동시에 배양하거나 해리된 펩티드 상층액의 전이에서도 모두 동일한 형의 결과가 나타났다.
14.3. 토의
이 결과에서 펩티드의 리미티드 라이브러리는 세포독성 활성이 있는 몇가지 펩티드 서열을 포함할 수 있다고 본다. 전술한 예에서 가능한 서열의 약 0.05%가 항암 세포 활성을 가진다고 본다. 여러회 검사에서 해리된 펩티드를 포함하는 상층액을 검사함으로써 다른 종양세포와 정상세포에 대한 독성을 결정하였다.
이와 같은 방식으로, 종양세포에 대한 광범위한 독성의 펩티드 서열 또는 특이 종양세포주에 대한 독성을 확인할 수 있고 정상세포에 대해 독성이 낮은 서열이 치료제로써 적절하다. 이 방법은 항미생물성, 항기생충성 그리고 성장인자 길항의 선별에도 이용할 수 있다.
성장인자 길항에 대한 유사한 선별방법이 성장인자 의존성 세포주를 사용한다. 이 검사에서, 성장인자 길항 활성의 펩티드 서열은 필수적인 성장인자 없이 세포배양물의 성장을 촉진시킬 수 있다.
본 발명은 여기에서 설명하는 특이구체예의 영역에 한정하지 않는다. 또한 여기에서 설명한 것에 추가하여 본 발명의 다양한 변형을 본 기술분야에 숙지된 자에게는 분명히 인지할 수 있을 것이고 이와 같은 변형은 본 발명의 영역에 속한다.
본 발명은 전술한 방법에 따라 결정된 바이오-올리고머 서열로 구성된 치료요법적 그리고 진단약물을 제공한다.

Claims (27)

  1. 수용체 분자에 대한 바이오-올리고머 리간드의 서열을 결정하는 방법에 구성에 있어서,
    (a) 바이오-올리고머 라이브러리를 제공하는데,
    이때 바이오-올리고머는 바이오-올리고머의 화학적인 합성을 위한 반응 조건에 적합한 다양한 종의 생물학적으로 활성이 있고, 보호기가 제거된 바이오-올리고머와 다양한 고형상 서포트가 완전하게 혼합되어 있고, 이때, 각 고형상 서포트는 단일 보호기가 제거된 바이오-올리고머종에 부착되어 있어, 고형상 서포트와 바이오-올리고머 복합물이 형성되어 있고, 각 라이브러리종에서 바이로-올리고머의 임의 위치에 있는 서브유닛의 정체(identify)는 바이오-올리고머의 다른 위치에 있는 서브유닛의 정체와는 통계학적으로 별개의 것이고, 소요의 수용체분자는 라이브러리내에 있는 하나이상의 고형상 서포트/바이오-올리고머 종을 인지하여 결합하게 되고;
    (b) 소요의 수용체분자에 결합된 고형상 서포트/바이오-올리고머를 분리하고;
    (c) b)단계에서 분리된 고형상 서포트/바이오 올리고머의 바이오 올리고머의 서열을 결정하는 단계로 구성된 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 수용체 분자는 항체, 리셉트(receptor), 바이러스, 박테리아, 단백질, 탄수화물, 핵산, 기질약물, 금속과 소분자로 구성된 집단에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 수용체 분자가 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 수용체 분자가 리셉트(receptor)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 생물학적으로 활성이 있는 바이오-올리고머 리간드의 서열을 결정하는 방법의 구성에 있어서,
    (a) 바이오-올리고머 라이브러리를 만들고, 바이오 올리고머의 일부가 해리되도록 하고,
    이때, 바이오-올리고머는 바이오-올리고머의 화학적인 합성을 위한 반응 조건에 적합한 다양한 종의 생물학적으로 활성이 있고, 보호기가 제거된 바이오-올리고머와 다양한 고형상 서포트가 완전하게 혼합되어 있고, 이때, 각 고형상 서포트는 단일 보호기가 제거된 바이오-올리고머종에 부착되어 있어, 고형상 서포트와 바이오-올리고머 복합물이 형성되어 있고, 각 라이브러리종에서 바이로-올리고머의 임의 위치에 있는 서브유닛의 정체(identify)는 바이오-올리고머의 다른 위치에 있는 서브유닛의 정체와는 통계학적으로 별개의 것이고;
    (b) 해리된 바이오-올리고머의 원하는 생물학적 활성을 검사하고,
    (c) 원하는 생물학적 활성을 나타내는 고형상 서포트/바이오-올리고머 복합물을 분리하고, 그리고
    (d) c) 단계에서 분리한 고형상 서포트, 바이오 올리고머에 남아있는 바이오 올리고머의 서열을 결정하는 단계로 구성된 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 고형서포트는 산-감응성, 염기-감응성, 뉴클레오필-감응성, 광감응성, 친전가기-감응성, 산화반응-감응성 또는 환원반응-감응성인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 고형서포트는 산-감응성, 염기-감응성, 뉴클레오필-감응성, 광감응성, 친전가기-감응성, 산화반응-감응성 또는 환원반응-감응성인 링커로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5 항에 있어서, (a) 단계의 해리는 효소적 절단, 화학적 절단 또는 광학적 절단에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 5 항에 있어서, (b)에서 감지되는 생물학적 활성은 세포독성, 항종양활성, 항박테리아활성, 항곰팡이활성, 성장인자활성, 성장저해활성, 호르몬활성, 신경전달인자활성, 면역조절활성과 제어활성으로 구성된 집단에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 5 항에 있어서, (b)단계에서 감지되는 생물학적 활성은 효소 저해인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 효소 저해 활성을 가지는 바이오-올리고머 리간드는 올리고핵산인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 효소 저해 활성을 가지는 바이오-올리고머 리간드는 글리신, 비-천연 아미노산, 천연 아미노산 D-이성체, 아미노산 유사체 및 아미노산모방물질에서 선택된 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 치료요법제가 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 진단시약이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 세포독성 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 항종양 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 항미생물 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 생장인자 작용제 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 생장인자 길항작용제 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 호르몬 작용제 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 호르몬 길항작용제 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 적혈구 조혈 작용제 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 세포독성 활성을 가지는 올리고핵산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 항종양 활성을 가지는 올리고핵산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 항미생물 활성을 가지는 올리고핵산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1 항 또는 5 항에 있어서, 바이오-올리고머 리간드는 면역 활성을 가지는 펩티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 반응을 촉매하는 바이오-올리고머 서열을 결정하는 방법에 있어서,
    (a) 감지할 수 있는 반응 산물을 얻기 위해 원하는 반응을 촉매하는 바이오-올리고머의 기질을 바이오-올리고머 라이브러리에 첨가하고,
    이때, 바이오-올리고머는 바이오-올리고머의 화학적인 합성을 위한 반응 조건에 적합한 다양한 종의 생물학적으로 활성이 있고, 보호기가 제거된 바이오-올리고머와 다양한 고형상 서포트가 완전하게 혼합되어 있고, 이때, 각 고형상 서포트는 단일 보호기가 제거된 바이오-올리고머종에 부착되어 있어, 고형상 서포트와 바이오-올리고머 복합물이 형성되어 있고, 각 라이브러리종에서 바이로-올리고머의 임의 위치에 있는 서브유닛의 정체(identify)는 바이오-올리고머의 다른 위치에 있는 서브유닛의 정체와는 통계학적으로 별개의 것이고;
    (b) 원하는 반응을 촉매하는 바이오-올리고머종을 가지는 고형상 서포트를 분리하고, 그리고
    (c) b) 단계에서 분리한 고형상 서포트에 부착된 바이오 올리고머의 서열을 결정하는 단계로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
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