SK281490B6 - Banka oligomérov, spôsob jej vytvárania a spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu - Google Patents

Banka oligomérov, spôsob jej vytvárania a spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu Download PDF

Info

Publication number
SK281490B6
SK281490B6 SK4073-92A SK407392A SK281490B6 SK 281490 B6 SK281490 B6 SK 281490B6 SK 407392 A SK407392 A SK 407392A SK 281490 B6 SK281490 B6 SK 281490B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
bio
oligomer
peptide
bank
solid support
Prior art date
Application number
SK4073-92A
Other languages
English (en)
Other versions
SK407392A3 (en
Inventor
Kit Sang Lam
Sydney E. Salmon
Viktor J. Hruby
Evan M. Hersh
Fahrad Al-Obeidi
Original Assignee
The Arizona Board Of Regents
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Arizona Board Of Regents filed Critical The Arizona Board Of Regents
Publication of SK407392A3 publication Critical patent/SK407392A3/sk
Publication of SK281490B6 publication Critical patent/SK281490B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
    • C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/665—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans derived from pro-opiomelanocortin, pro-enkephalin or pro-dynorphin
    • C07K14/70—Enkephalins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1062—Isolating an individual clone by screening libraries mRNA-Display, e.g. polypeptide and encoding template are connected covalently
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00585—Parallel processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/0059—Sequential processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00592—Split-and-pool, mix-and-divide processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00702—Processes involving means for analysing and characterising the products
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00722—Nucleotides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00729—Peptide nucleic acids [PNA]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/817—Entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Polyethers (AREA)
  • Macromolecular Compounds Obtained By Forming Nitrogen-Containing Linkages In General (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Opísaná banka bio-oligomérov zahŕňa veľké množstvo rôznych typov biologicky aktívnych bio-oligomérov a veľké množstvo tuhých nosičov, ktoré sa dokonale miešajú a vyhovujú podmienkam reakcie chemickej syntézy bio-oligomérov; a v ktorej jediný typ bio-oligomérov zbavený ochrany sa pripája ku každému tuhému nosiču a vytvára tak kombináciu tuhý nosič/bio-oligomér. Bio-oligoméry môžu byť peptidy zbavené ochrany alebo oligonukleotidy zbavené ochrany. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov zahŕňa: aspoň toľko podielov tuhého nosiča, ako je počet rôznych typov pridávaných podjednotiek bio-oligomérov, avšak aspoň dva, za vzniku bio-oligomérov; samostatné zavedenie sady podjednotiek k podielom tuhého nosiča tak, aby sa ku každému podielu zaviedla jedna podjednotka; úplné naviazanie podjednotiek v podstate na všetky miesta tuhého nosiča za vzniku kombinácie tuhý nosič/nová podjednotka; stanovenie úplnosti väzby, a ak je to potrebné, dovedenie reakcie k úplnosti; dôkladné premiešanie podielov kombinácie tuhý nosič/nová podjednotka; a po zopakovaní krokov a) až e) toľkokrát, ako to je potrebné, záverečný krok; odstránenie ochranných skupín tak, aby každý bio-oligomér zbavený ochrany ostal naviazaný na tuhý nosič.ŕ

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka banky oligomérov na tuhom nosiči, v ktorej je každý tuhý nosič spojený s jediným typom biooligoméru a v banke sú uložené všetky existujúce kombinácie monomémych podjednotiek. Bio-oligomérom podľa vynálezu môže byť peptid, oligonukleotid alebo chiméma konštrukcia peptid-oligonukleotid. Vynález sa týka aj spôsobu výroby takejto banky. Predmetom vynálezu je taktiež spôsob použitia bio-oligomérov v banke na identifikáciu a charakterizáciu ligandov, schopných viazať molekulu akceptora alebo sprostredkovať požadovanú biologickú účinnosť. Bio-oligoméry banky môžu taktiež katalyzovať chemické reakcie.
Doterajší stav techniky
Rozpoznávanie a väzba ligandov riadi takmer všetky biologické pochody, napríklad rozpoznávanie imunologického popudu, bunkové signály a komunikácie, intracelulárny signál a katalýza, t. j. enzymatické reakcie. V danej oblasti techniky dlho pretrváva záujem identifikovať molekuly, pôsobiace ako látky, schopné agonistickej reakcie alebo antagonizmu účinnosti ligandov, napríklad hormónov, rastových faktorov a nervových prenášačov, môže tiež ísť o látky, indukujúce B-bunky (sprostredkovanie protilátkou), alebo T-bunky (bunková cesta) pri imunologickej odpovedi, ďalej o látky, katalyzujúce chemické reakcie alebo riadiace expresiu génu na úrovni transkripcie alebo translácie.
Zvlášť zaujímavé sú Ugandy typu bielkovín alebo peptidov. Ide o väčšinu hormónov, rastových faktorov, neuroaktívnych molekúl a imunologických epitopov. Okrem toho, ako bude ďalej podrobnejšie diskutované, väčšina snáh vytvoriť agonisty alebo antagonisty biologickej účinnosti, sprostredkovanej receptormi, sa sústredila na peptidy. Vývoj farmaceutických prostriedkov, ktoré boli kľúčovými látkami pre miesta väzby na receptoroch však bol do značnej miery brzdený ťažkosťami pri stanovení peptidových ligandov. Nesmierny počet týchto peptidových reťazcov spôsobil, že tento cieľ je nedosiahnuteľný akýmkoľvek iným spôsobom ako prácnou izoláciou špecifického komplexu, identifikáciou uloženia epitopu a analýzou jeho reťazca. Problém je ďalej komplikovaný tým, že epitopy sú tvorené reťazcom aminokyselín, ktorý sa v primárnom reťazci neprenáša.
Niektorí výskumní pracovníci v danej oblasti techniky sa pokúšali obísť tento pracný pochod stanovenia reťazca aminokyselín v proteíne na základe zodpovedajúceho oligonukleotidového reťazca. Proteíny sú veľké peptidy, pozostávajúce z aminokyselín. Každá aminokyselina je kódovaná jedným alebo väčším počtom kodónov, ktoré sú tvorené vždy troma zvyškami nukleových kyselín. Napríklad peptid A, obsahujúci aminokyselinu glutamín, bude kódovaný kodónom troch nukleových kyselín: cytozín, adanín a guanín. Komplementom pre tento kodón by bol guanín, ktorý sa viaže na cytozín, tymín, ktorý sa viaže na adenín a cytozín, tento kodón by bol kódom pre peptid B. Na základe teórie komplementarity by sa peptid B viazal na peptid A. V publikácii Bost a Blalock, 1989, Methods in Enzymology, 168: 16 až 28 sa uvádza, že pravdepodobne akýkoľvek peptid sa bude viazať na iný peptid, ktorý je kódovaný komplementárnym reťazcom zvyškov nukleových kyselín. Na základe tejto informácie bolo možné predpovedať reťazec aminokyselín komplementárneho peptidu. Autori použili uvedený reťazec na syntézu peptidu a na skúšky jeho schopnosti väzby.
Tento postup však nevyriešil vyššie uvedený problém, pretože afinita väzby medzi komplementárnymi peptidmi bola všeobecne veľmi nízka a boli potrebné komplementárne peptidy dlhšie ako 15 zvyškov. Okrem toho tento prístup vyžaduje znalosť buď reťazca aminokyselín alebo reťazca nukleových kyselín príslušnej bielkoviny alebo jej väzbového partnera. Okrem toho nie je tento postup použiteľný pre epitopy, tvorené zvyškami aminokyselín, ktoré sa neprenášajú v primárnom reťazci.
V poslednom čase sa objavilo niekoľko správ o príprave bánk peptidov a ich použitie pri identifikácii peptidových ligandov, ktoré sa môžu viazať na akceptory. Pri jednom z týchto postupov bol použitý rekombinantný bakteriofág na získanie veľkých bánk. Pri použití “ffigovej“ metódy (Scott a Smith, 1990, Science 249:386 až 390, Cwirla a ďalší, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378 až 6382, Devlin a ďalší, 1990, Science 249: 404 až 406) je možné získať veľké banky (106 až 108 jedincov v chemickom zmysle), avšak genetický kód a biologický systém tieto systémy postupne obmedzujú, pokiaľ ide o ich využitie. Pri ďalšom prístupe boli použité predovšetkým chemické metódy, ako príklad je možné uviesť Geysenovu metódu (Geysen a ďalší, 1986, Molecular Immunology 23: 709 až 715, Geysen a ďalší, 1987, J. Immunologic Method 102:259 až 274) a v poslednom čase metódu Fodora a ďalších (1991, Science 251, 767 až 773). Pri použití metódy Geysena a ďalších je možné syntetizovať obmedzené množstvo peptidov (103 až 104) na polyetylénovom nosiči v priebehu niekoľkých dni. Pri postupe podľa Fodora a ďalších sa využíva „svetlom smerovaná priestorovo cielená paralelná chemická syntéza“. Tento postup je taktiež obmedzený relatívnou nevyvinutosťou fotochemickej syntézy peptidov.
Bola tiež vyvinutá paralelná syntéza peptidov vo veľkom meradle. Houghton podáva správu o syntéze stoviek analogických peptidov súčasne na polypropylénovej sieti (metóda čajových sáčkov), postup bol opísaný v Houghton, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131 až 5135. Berg a ďalší (1989, J. Amer. Chem. Soc. 111: 8024 až 8026) podali správu o novom nosiči na báze polyetylénového filmu s naočkovaným polystyrénom, ktorý je vhodný na uskutočňovanie paralelnej syntézy peptidov. Pri uskutočňovaní oboch postupov bola použitá štandardná živica s Bocaminokyselinou a bežný postup, spočívajúci v odstránení ochrannej skupiny, neutralizácia, väzba a premývanie tuhej fázy spôsobom podľa publikácie Marrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 až 2154, 1963).
Furka a ďalší (1988, 14Λ Intemational Congress of Biochemistry, zv. 4, Abstrakt FR:013) opísali postup na výrobu zmesi peptidov oddeleným naviazaním každej z troch rôznych aminokyselín s následným zmiešaním živice. Uvedený postup neposkytuje uspokojivú metódu na izoláciu požadovaného peptidu z veľkého množstva získaných peptidov.
Aj napriek tomu, že ide o použiteľný postup, dovoľujú postupy podľa Geysena, Fodora, Houghtona, Berga a Furky so spolupracovníkmi syntézu a uskutočňovanie skúšok len v prípade niekoľko sto až niekoľko tisíc peptidov súčasne. Ide teda o veľmi obmedzené postupy vzhľadom na milióny možných peptidových reťazcov, z ktorých aspoň jeden by mohol odpovedať väzbovým miestom pre skúmané látky. Vzhľadom na existenciu 20 známych bežných aminokyselín je v reťazci piatich aminokyselín 205 alebo približne 3,2 x 10δ možných kombinácií aminokyselín. Žiadny z uvedených postupov neumožňuje syntézu takého veľkého množstva peptidov súčasne. K ďalšiemu zmnoženiu možných peptidov dochádza, ak sa berie do úvahy možnosť rôznej dĺžky reťazca. Je teda zrejmé, že bežná syntéza peptidov, tak ako bola zhrnutá v publikácii Stewart a Young, 1984, Solid Phase Synthesis, 2. Vydanie, Pierce Chemical
SK 281490 Β6
Co., Rockford, IL) nie je metódou, ktorou by bolo možné súčasne získať tisíce až milióny peptidov súčasne.
Okrem toho žiadna z dosiaľ známych metód na syntézu peptidov neumožňuje syntézu banky peptidov, viazanej na tuhú podložku v skutočne náhodnom usporiadaní. Peptidová banka so skutočne náhodným usporiadaním musí mať dobrú štatistickú distribúciu všetkých typov prítomných molekúl tak, aby banka obsahovala všetky typy prítomných peptidových reťazcov v približne ekvimolámom množstve.
Syntézu skutočne náhodných peptidov zvyčajne nie je možné uskutočniť za súčasného pridania rôznych aminokyselín do jedinej reakčnej nádoby vzhľadom na to, že sa rýchlosť väzby jednotlivých aminokyselín od seba nesmieme líši pri syntéze peptidov v tuhej fáze SPPS (Ragnarson a ďalší, Acta Chem. Scand. 25: 1487,1489, Ragnarson a ďalší, 1974, J. Org. Chem. 39: 3837 až 3842). Napríklad rýchlosť väzby Fmoc-glycínu na tvoriaci sa peptid je oveľa vyššia ako rýchlosť väzby Fmoc-valínu, pravdepodobne v dôsledku sférickej zábrany, ktorá je spôsobená veľkým bočným reťazcom valínu. V prípade zmiešania všetkých 20 aktivovaných eukaryotických L-aminokyselín so živicou v priebehu každého cyklu väzby by došlo k prednostnému zaradeniu najrýchlejšie reagujúcich aminokyselín do peptidu a nebolo by možné získať ekvimolárne množstvo každého typu peptidu. Okrem toho by mal každý z možných nukleofilov odlišnú reaktivitu.
Okrem toho tiež žiadny z postupov, dosiaľ známych na syntézu peptidov nemôže poskytnúť banku s viac ako 105 peptidov tak, aby vždy jeden typ peptidu bol viazaný na jeden typ tuhej fázy. V prípade, že by toto bolo možné dosiahnuť, bolo by tiež možné oveľa ľahšie od seba izolovať jednotlivé peptidy.
Je teda zrejmé, že by bolo potrebné získať banku peptidových reťazcov so skutočne náhodným rozdelením a banku oligonukleotidových reťazcov, t. j. bio-oligomérov, z ktorej je možné ľahko a rýchlo izolovať jeden z reťazcov od reťazcov ostatných. Bolo by tiež potrebné navrhnúť postup, ktorým by bolo možné rýchlo a lacno syntetizovať tisíce až milióny týchto skutočne náhodne distribuovaných reťazcov bio-oligomérov.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvorí banka oligomérov (bio-oligomérov), obsahujúca všetky možné kombinácie podjednotiek. Podstatu vynálezu tvorí aj spôsob získania takejto banky a spôsob jej použitia.
Vynález spočíva predovšetkým v spôsobe prípravy banky uvedeného typu, ktorý spočíva v tom, že sa opakujú stupne, pri ktorých sa získajú aspoň dva podiely tuhej fázy (nosiča), k týmto podielom tuhej fázy sa pridá skupina podjednotiek, tieto podjednotky sa úplne viažu na v podstate všetky väzbové miesta tuhej fázy za vzniku kombinácie tuhej fázy a novej podjednotky, dokáže sa úplnosť väzby a v prípade sa reakcia doplní, podiely kombinácií tuhej fázy a novej podjednotky sa dôkladne premiešajú a opakovaním uvedených stupňov v príslušnom počte sa odstránia ochranné skupiny tak, že biooligomér zostane viazaný na tuhú fázu. V jednom uskutočnení postupu môže byť podjednotkou aminokyselina a bio-oligomérom môže byť peptid. V ďalšom možnom uskutočnení môže byť podjednotkou nukleozid a bio-oligomérom môže byť oligonukleotid. V ešte ďalšom možnom uskutočnení je nukleozidom kyselina deoxyribonukleová. V inom uskutočnení je nukleozidom kyselina ribonukleová. V ďalšom uskutočnení môže byť podjednotkou aminokyselina a bio-oligomérom môže byť peptid alebo je podjednotkou nukleozid a bio-oligomérom chimémy oligonukleotid.
Podstatu vynálezu tvorí aj spôsob stanovenia reťazca bio-oligomémeho ligandu pre akceptorovú molekulu, ktorý spočíva v tom, že sa vytvorí banka oligomérov s náhodným usporiadaním, viazaná na tuhej fáze, pričom každý typ tuhej fázy je viazaný na jediný typ bio-oligoméru a banka obsahuje všetky možné kombinácie monomémych podjednotiek, z ktorých je oligomér vytvorený, k tejto banke s náhodným usporiadaním bio-oligomérov sa pridá molekula skúmaného akceptora alebo substrátu, takže táto molekula akceptora rozpozná a bude sa viazať na jeden alebo väčší počet typov tuhej fázy a bio-oligomérom v banke alebo sa uvedená molekula substrátu zúčastňuje chemickej reakcie, katalyzovanej jedným alebo väčším počtom typov bio-oligomérov na tuhej fáze v banke, izoluje sa kombinácia tuhej fázy a bio-oligoméru, ktorá má požadované vlastnosti a analyzuje sa reťazec bio-oligoméru v izolovanej kombinácii tuhej fázy a bio-oligoméru. V inom uskutočnení sa postupuje tak, že sa časť bio-oligoméru uvoľní z kombinácie tuhej fázy a oligoméru in situ a in situ sa tiež stanoví biologická účinnosť. V jednom z možných uskutočnení je bio-oligomérom peptid. V ďalšom možnom uskutočnení je bio-oligomérom oligonukleotid, najmä DNA alebo RNA. V ešte ďalšom možnom uskutočnení je bio-oligomérom chimémy peptid/oligonukleotid.
Reťazce bio-oligomérov, identifikované uvedenými postupmi sú vhodné ako súčasti prostriedkov na diagnostické a liečebné použitie.
V ďalších odsekoch budú podrobnejšie objasnené jednotlivé výhodné uskutočnenia vynálezu
Pojem „banka“, ako je tu používaný, znamená zostavu v podstate náhodných bio-oligomérov. Pod pojmom „bio-oligomér“ sa rozumie polymér smenej ako 100 podjednotkami. Môže ísť o peptid, tvorený podjednotkami aminokyselín alebo o polynukleotid z nukleozidových podjednotiek, alebo o chimémy peptid-oligonukleotid.
Spôsob tvorby banky náhodných bio-oligomérov
Ako už bolo uvedené, vynález sa týka spôsobu vytvárania banky bio-oligomérov tak, že sa tieto oligoméry syntetizujú z náhodných reťazcov monomémych podjednotiek. Pod týmto pojmom sa rozumejú reťazce, v ktorých môže ktorákoľvek monoméma podjednotka nasledovať za akoukoľvek inou monomémou podjednotkou alebo ju môže predchádzať.
V jednom z možných uskutočnení môže byť monomérnou podjednotkou aminokyselina, jej analóg alebo molekula, podobná peptidu, čím sa rozumie molekula, ktorá štruktúrne a chemicky peptid napodobňuje a je zložená z dvoch alebo väčšieho počtu zvyškov aminokyselín. V inom uskutočnení môže byť podjednotkou nukleozid, a to kyselina ribonukleová alebo deoxyribonukleová. V ešte ďalšom uskutočnení môže byť podjednotkami aminokyseliny a nukleozidy. Bio-oligomérom môže byť peptid, obsahujúci aminokyseliny, RNA-oligonukleotid, obsahujúci ribonukleozidy, DNA-oligonukleotid, obsahujúci deoxyribonukleozidy, DNA-RNA-chitnémy oligonukleotid alebo chimémy peptid oligonukleotid. Banka s obsahom peptidov, oligonukleotidov alebo chimémych peptid-oligonukleotidov môže byť získaná tak, že sa opakujú nasledujúce stupne:
i) pripravia sa aspoň dva podiely tuhého nosiča pre náhodné reťazce podjednotiek, ii) oddelene sa privedú skupiny podjednotiek k podielom tuhého nosiča,
SK 281490 Β6 iii) tieto podjednotky sa úplne viažu na v podstate všetky väzbové miesta tuhého nosiča za vzniku novej kombinácie tuhého nosiča a novej podjednotky, iv) dokáže sa úplnosť väzby a v prípade potreby sa zaistí dovŕšenie reakcie,
v) dôkladne sa premiešajú podiely tuhého nosiča s kombináciou tuhého nosiča a novej podjednotky a potom sa opakujú stupne i až v) v požadovanom počte opakovaní, v konečnom stupni vi) sa potom odstránia ochranné skupiny, pričom bio-oligomér zostáva viazaný na tuhý nosič.
V ďalšom uskutočnení je možné banku náhodných biololigomérov pripraviť tak, že sa aspoň v jednom stupni viaže tá istá podjednotka na všetky typy tuhého nosiča a aspoň v jednom ďalšom stupni sa na tento tuhý nosič viažu aspoň dve podjednotky. Banka bio-oligomérov môže byť pripravená jedným opakovaním stupňov i) až v), v inom uskutočnení viac ako jedným opakovaním stupňov i) až v). Tuhý nosič je možné pripraviť už s naviazanou jednou jednotkou alebo väčším počtom jednotiek.
Banka oligomérov môže byť tvorená vopred stanoveným obmedzeným počtom podjednotiek. V inom uskutočnení môže byť tvorená všetkými dostupnými podjednotkami.
V ďalšom uskutočnení je možné identifikovať biooligomér tak, že sa najskôr pripraví banka a identifikuje sa režazec bio-oligoméru, ktorý má požadované vlastnosti. Pripraví sa tuhý nosič s takto identifikovaným biooligomérom. K identifikovanému reťazcu sa pridá nový segment monomérnej podjednotky a identifikuje sa nový reťazec, obsahujúci známy reťazec a náhodný reťazec, tento výsledný reťazec má taktiež požadované vlastnosti. Týmto spôsobom je možné rýchlo identifikovať požadovaný bio-oligomér.
Bio-oligoméry, ktoré banka obsahuje v nej môžu ale nemusia byť obsiahnuté v ekvimolámom množstve. Ako je všeobecne známe, moláme množstvo je koncentrácia, v ktorej sa molekulová hmotnosť, vyjadrená v gramoch určitej látky, rozpustí v rozpúšťadle tak, že vznikne 1 liter roztoku. Pod pojmom „ekvimolámy“ sa rozumie, že podjednotky sú prítomné v približne rovnakej molámej koncentrácii. To znamená, že v prípade, že v banke s obsahom 150 000 bio-oligomérov je bio-oligomér A prítomný v množstve 200 pmol/1, mali by byť tiež všetky ostatné biooligoméry prítomné v koncentrácii približne 200 pmol v 1 litri. Tento pojem však zahrnuje v sebe aj heterogenitu tuhých nosičov. Táto heterogenita trocha mení skutočné množstvo bio-oligoméru a záleží tiež na tom, aké množstvo oligoméru môže byť viazané na určitý nosič.
Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa pripravujú aspoň dva podiely tuhého nosiča, pričom počet týchto tuhých nosičov výhodne aspoň zodpovedá počtu biooligomérov, ktoré majú byť syntetizované. To dovoľuje prípravu banky, v ktorej každý z tuhých nosičov viaže aspoň jeden typ bio-oligoméru. Pod pojmom „podiel“ sa rozumie určitá frakcia celého množstva tuhých nosičov.
Banky náhodných peptidov
V zvláštnom uskutočnení môže banka náhodných biooligomérov obsahovať peptidy. Pod pojmom „peptid“ sa rozumie v najširšom slova zmysle zlúčenina, obsahujúca dve alebo väčší počet aminokyselín analógov aminokyselín alebo látok, peptidom podobných. Podjednotky môžu byť viazané peptidovými väzbami. V inom uskutočnení však môžu byť viazané tiež inými väzbami ako esterovými, éterovými a inými väzbami. Pod pojmom „aminokyselina“ sa rozumie prírodná alebo neprírodná, napríklad syntetická aminokyselina vrátane glycínu a D a L-izomérov, analógov aminokyselín a látok, podobných peptidom. Peptid s troma a s väčším počtom aminokyselín je zvyčajne označovaný ako oligopeptid v prípade, že je peptidový reťazec krátky.
V prípade, že je reťazec dlhý, používa sa zvyčajne názov polypeptid alebo bielkovina.
Vynález je založený na syntetickej chémii peptidov a nezávisí od žiadneho živého systému, pokiaľ ide o amplifikáciu alebo analýzu. Peptidová banka môže obsahovať neprírodné aminokyseliny. Peptidy podľa vynálezu môžu teda obsahovať D-aminokyseliny, kombinácie D- a L-aminokyselín a rôzne „značkové“ aminokyseliny (napríklad betametylaminokyseliny, C-alfa-metylaminkyseliny a N-alfa-metylaminokyseliny a podobne) tak, aby peptidy v banke mali špecifické vlastnosti. Okrem toho je možné pri použití špecifických aminokyselín v určitých väzbových stupňoch pripraviť peptidové banky s alfa-skrutkovicou, beta-závitom, gama-závitom a tiež cyklické peptidy.
Banka peptidov podľa vynálezu obsahuje všetky možné kombinácie aminokyselín, ktorými sú peptidy tvorené. Napríklad v prípade dipeptidu pri použití aminokyselín glycínu a prolínu existujú štyri možnosti: glycín-glycin, glycín-prolín, prolín-glycín a prolín-prolín, banka náhodných peptidov bude obsahovať všetky tieto kombinácie.
Do každého podielu tuhého nosiča sa najskôr oddelene privedú prvé aminokyseliny. Zvyčajne sú aminokyselinami, použitými na syntézu peptidov v bázickom prostredí labilné na α-aminoskupine chránené 9-fluorenylmetoxy-karbonyl (Fmoc) aminokyseliny, prvýkrát opísané v publikácii Carpino a Han, 1972, J. Org. Chem. 37: 3403 až 3409. pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu je taktiež možné použiť Boc-aminokyseliny (N-alfa-chránené terc.butyloxykarbonylovou skupinou). Tak aminokyseliny, chránené na alfa-aminoskupine skupinou Fmoc, ako aj tie, ktoré v sú v tej istej polohe chránené skupinou Boe je možné získať od Fluka, Bachem, Advanced Chemtech, Sigma, Cambridge Research Biochemical, Bachem, alebo Peninsula Labs alebo aj od iných firiem, zaoberajúcich sa touto oblasťou techniky. Okrem toho je pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu možné použiť aj aminokyseliny, chránené na N3^3 a inak, ako je v danej oblasti techniky všeobecne známe.
V prípade opísaného príkladu dipeptidu by teda prvá skupina zavádzaných aminokyselín obsahovala glycín a prolín, každý podiel tuhého nosiča by bol uvedený do styku buď s N^-Fmoc-glycínom alebo s N^-Fmoc-prolmom.
Táto prvá aminokyselina sa potom viaže na tuhý nosič tak, aby došlo k väzbe v podstate na všetky väzbové miesta na tuhom nosiči. To znamená, že je potrebné doviesť väzbovú reakciu až do konca bez ohľadu na rozdiely v rýchlosti väzby pre jednotlivé aminokyseliny. Okrem toho sa aminokyseliny viažu na v podstate všetky väzbové miesta na tuhom nosiči tak, že každý tuhý nosič bude obsahovať v podstate len jeden typ peptidu. Úplnou väzbou vznikne kombinácia tuhého nosiča a prvej aminokyseliny.
V prípade uvedeného dipeptidu pôjde o kombinácie nosičglycín a nosič-prolín alebo aj častice nosiča-glycín a častice nosiča-prolín.
Väzbu aminokyselín je možné uskutočniť zvyčajným spôsobom tak, ako bolo uvedené napríklad v publikácii Stewart a Young, 1984, Solid Phase Synthesis, 2. vydanie, Pierce Chemical Co„ Rockford, ÍL. Ako je odborníkom známe, zahrnuje spôsob syntézy peptidov na tuhom nosiči postupné budovanie peptidu od karboxylového alebo C-terminálneho zakončenia, na ktorom je C-terminálna aminokyselina so svojou alfa-aminoskupinou pripojená na tuhý polymémy nosič. Alfa-aminoskupina je chránená a po ukončení syntézy je odštiepená, potom sa nasledujúca aminokyselina, taktiež chránená, naviaže peptidovou väzbou na alfa-aminoskupinu aminokyseliny, viazanej na tuhý nosič. Potom sa opakuje cyklus deprotekcie predchádzajúcej aminokyseliny a naviazanie ďalšej aminokyseliny až do úplnej dostavby peptidu. Akékoľvek reaktívne bočné reťazce na aminokyseline sa chránia chemickými skupinami, ktoré znesú väzbu a odstránenie ochrannej skupiny N31*’, avšak je možné ich odstrániť na konci syntézy.
Aby bolo možné naviazať aminokyselinu na rastúci reťazec pri syntéze, je nutné karboxylovú skupinu chránenej aminokyseliny aktivovať. Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu je možné použiť rad aktivačných postupov vrátane napríklad vytvorenia symetrického anhydridu (PSA), vytvorenia zmesného anhydridu (PMA), chloridu kyseliny, aktívneho esteru a aktivácie karboxylovej kyseliny in situ, ako bolo opísané v publikácii Fields and Noble, 1990, „Solid Phase peptide Synthesis utilizing 9-fluorenylmetoxycarbonyl Amino Acids“, Int, J. Pept. protein a Res. 35: 1601 -214.
Použitie Fmoc-aminokyselín je len jedným zo spôsobov syntézy peptidov. Je možné použiť aj Boc-aminkyseliny, chránené terc.butylkarbonylovou skupinou na prípravu banky peptidov, viazaných na tuhý nosič (napríklad Geysen a ďalší, 1987, J. Immunol. Methods 102: 259 až 274).
Je nutné dokázať úplnosť väzby. Všeobecne je známy rad testov, používaných na dôkaz úplnosti reakcie, ide napríklad o ninhydrínový (Kaiserov) test, test s použitím kyseliny pikrovej, 2,4,6-trinitrobenzénsulfónové (TNBS), fluorescamínu a chlóranilínu, tieto testy sú založené na reakcii reakčného činidla a voľnou aminokyselinou za vzniku chromofomej zlúčeniny. V prípade, že sa použijú iminokyseliny, napríklad Pro a Hyp, je výhodné použitie istinu podľa uvedenej publikácie Fields a Noble. Kvantifikáciou úplnosti reakcie je možné sledovať v jej priebehu, napríklad podľa PCT zverejnenej patentovej prihlášky WO91/03485, Salisbury a ďalší.
Pri syntéze Fmoc je výhodný Kaiserov test. Pri jeho uskutočnení je možné vzorku z každej skúmavky skúšať ninhydrínovým reakčným činidlom (Pierce Chemical) podľa publikácie Sarin a ďalší, 1981, Anál. Biochem. 117: 147 až 157.
V prípade, že väzbová reakcia nie je celkom dovŕšená, je možné ju dovŕšiť niekoľkými možnými známymi spôsobmi, napríklad
a) druhou väzbou, pri ktorej sa použije až päťnásobný prebytok chránenej aminokyseliny,
b) ďalšou väzbou pri použití odlišných alebo prídavných rozpúšťadiel (napríklad trifluóretánu) a
c) pridaním chaotropickej soli, napríklad NaC104 alebo LiBr (Klis a Steward, 1990, peptides: Chemistry, Structure and Biology, Riviér and Marshall eds., ESCOM Publ., str. 904 až 906.
Po dovŕšení väzbovej reakcie sa dôkladne premiešajú podiely kombinácii tuhého nosiča a prvej aminokyseliny. Toto dôkladné premiešanie je možné dosiahnuť napríklad miešaním v jedinej reakčnej nádobe bežným automatickým zariadením alebo aj prebublávaním inertného plynu, napríklad dusíka alebo argónu.
Výsledná zmes sa rozdelí aspoň do dvoch podielov, ktoré by v prípade, že miešanie bolo skutočne účinné, mali obsahovať v podstate rovnaké množstvo kombinácie tuhého nosiča a prvej aminokyseliny. Napríklad v prípade uvedeného dipeptidu by každý podiel obsahoval v podstate rovnaké množstvo kombinácie častica nosiča-glycín a častica nosiča-prolín.
Ku každému podielu sa potom oddelene pridá druhá skupina aminokyselín. Táto druhá skupina môže byť tvorená
a) tými istými aminokyselinami ako v prvom prípade, t. j. glycínom alebo prolínom,
b) odlišnými aminokyselinami, napríklad tiyptofán alebo leucín
c) len jedným typom aminokyseliny, napríklad izoleucínom.
Rovnako ako v prípade prvej skupiny aminokyselín sa druhá skupina aminokyselín jednotlivo viaže na kombináciu tuhého nosiča a prvej aminokyseliny v každom z podielov za vzniku peptidov, obsahujúcich prvú aminokyselinu a druhú aminokyselinu. Rovnako ako v prvej väzbe je možné väzby možné dosiahnuť akýmkoľvek známym spôsobom. Na príklade uvedeného dipeptidu môže ísť o nasledujúce prípady:
a) v prípade pridania tých istých aminokyselín je výsledkom peptid buď glycín-glycín, glycín-prolín, prolín-glycín alebo prolín-prolín,
b) pri pridaní odlišných aminokyselín je výsledným peptidom Gly-Trp, Gly-Leu, Pro-Trp alebo Pro-Leu a
c) pri pridaní jedného typu aminokyseliny je výsledným peptidom Gly-Ile alebo Pro-Ile.
Tento postup je možné opakovať mnohokrát, pokiaľ sú k dispozícii aminokyseliny, ktoré je možné pridávať.
V prípade, že má byť získaný tetrapeptid X-X-X-Trp, kde X znamená valín, serín alebo alanín, je napríklad možné postup opakovať trikrát za vzniku tetrapeptidu X-X-X-Trp. Pri prvom, druhom a treťom pridaní aminokyselín, i e možné k podielu nosiča pridať buď Nal&-Fmoc valín, N“1 -Fmoc serín (O-Bu); alebo Nalf“-Fmoc alanín za vzniku .27 rôznych peptidov v približne ekvimolámych množstvách (Obr. 1). V prípade, že je požadovaný hexapeptid, opakuje, sa postup šesťkrát. V prípade, že hexapeptid má byť tvorený piatimi aminokyselinami, je možné postup uskutočniť s piatimi podielmi, z ktorých každý obsahuje rôznu aminokyselinu v každom väzbovom stupni. Avšak v prípade, že hexapeptid má byť vytvorený z akýchkoľvek základných dvadsiatich aminokyselín, bolo by možné postup uskutočniť pri použití dvadsiatich podielov v každom väzbovom stupni.
Spôsob syntézy peptidov podľa vynálezu je možné uskutočniť pri použití nosiča, ku ktorému aminokyselina už je alebo ešte nie je viazaná. Okrem toho je možné použiť väzbový reťazec, ktorý už bol naviazaný na nosič. Jedným z bežných nosičov, na ktorom už je aminokyselina viazaná je beta-alanín-PAM-živica (Bachem Biochemical). Tieto živice sú dodávané z mnohých komerčných zdrojov alebo sa vyrábajú v laboratóriu.
V prípade, že sa ako počiatočný materiál použije kombinácia nosiča a aminokyseliny alebo kombinácia nosiča a väzbovej látky, rozdelí sa tento materiál na dva podiely alebo aspoň na dva podiely, z ktorých ku každému sa pridá aminokyselina z prvej skupiny aminokyselín. Ako už bolo uvedené, je potrebné viazať túto aminokyselinu na všetky väzbové miesta na kombináciu tuhého nosiča a aminokyseliny alebo tuhého nosiča a väzbovej látky a podiely, obsahujúce túto novo pridanú aminokyselinu sa dôkladne premiešajú. Ako už bolo uvedené, zmes sa rozdelí na aspoň dva podiely, z ktorých sa ku každému pridá aminokyselina z druhej skupiny a väzbová reakcia sa opakuje, čím vzniká rastúci peptid. Ako už bolo uvedené, postup je možné opakovať toľkokrát, koľkokrát je požadované na vznik požadovaného peptidu.
Uvedený postup je možné použiť na syntézu náhodných peptidov rovnako ako na syntézu peptidovej banky, obsahujúcej vopred stanovené reťazce. Syntéza vopred sta novených reťazcov v sebe zahrnuje použitie špecifických Nalfa-Boc, Nalfa-Fmoc alebo iných príslušne chránených aminokyselín. Je napríklad možné voliť v špecifických stupňoch väzby aminokyseliny tak, aby výsledný peptid mal určitú pravdepodobnosť alebo aby výhodne vznikla určitá sekundárna štruktúra, napríklad beta-reťazec, alfahelix, beta-závit a podobne. Napríklad alfa-helix sa ako výhodná štruktúra vyvinie v prípade, že sa ako aminokyseliny výhodne použijú Glu, Ala, Leu, His, Trp. Beta-reťazce vznikajú pri prevažnom použití aminokyselín Val, íle, Tyr a Met. V prípade, že sa použijú prevažne aminokyseliny Gly, Asn, Pro a Asp, vzniká pravdepodobnosť beta-závitu. Je možné uviesť ešte ďalšie príklady, napríklad aminokyseliny kyslej povahy v blízkosti N-terminálneho zakončenia a bázické aminokyseliny v blízkosti C-terminálneho zakončenia stabilizujú alfa-helix. D-aminokyseliny môžu stabilizovať niektoré závity, okrem toho je možné včleniť ešte rad ďalších štruktúrnych prvkov, ako bude ďalej uvedené v odsekoch 2.1 a 2.2. Môže byť dokonca pripravená aj banka cyklických peptidov s disulfldovými laktámovými, laktónovými skupinami alebo inými skupinami, uzatvárajúcimi kruh, ako bude ďalej uvedené.
Je nutné zdôrazniť, že spôsobom podľa vynálezu je možné získať peptidy tak, že každý nosič, napríklad častica živice, bude obsahovať len jeden typ peptidu. Spôsob zaistí, že každá jednotlivá častica živice sa dostane do styku len s jednou Fmoc-aminokyselinou v priebehu každého stupňa väzby a že táto reakcia dôjde do konca.. Týmto spôsobom vzrastá možnosť oddeliť s vysokou citlivosťou a účinnosťou peptid, ktorý je špecifický pre určitú látku, na ktorej sa viaže.
Spôsob podľa vynálezu dovoľuje syntézu banky náhodných peptidov, obsahujúcej 105 až 107 rôznych druhov peptidov.
V jednom z možných uskutočnení môžu peptidy určitej banky napríklad obsahovať na C-terminálnom zakončení zvláštnu aminokyselinu, ktorá v bočnom reťazci obsahuje CO2H alebo COHN2, takže simuluje voľný glycín alebo glycínamidovú skupinu. Ďalšou cestou k vzniku tohto zvláštneho zvyšku je použitie analógu D- alebo L-aminokyseliny s bočným reťazcom tvoriacim väzbu k častici živice.
V jednom z možných uskutočnení môže mať zdanlivo voľný C-terminálny zvyšok optickú konfiguráciu D alebo L.
V inom možnom uskutočnení je možné použiť racemickú zmes D- alebo L-izomérov.
V ďalšom možnom uskutočnení je možné ako N-terminálny zvyšok peptidov banky použiť pyroglutamát. Aj napriek tomu, že pyroglutamát nie je možné dokázať pri analýze Edmanovou degradáciou, čo obmedzuje substitúciu na 50 % peptidov na danom nosiči N-terminálnym pyroglutamátom, zostáva ešte dostatočné množstvo peptidov bez pyroglutamátu na analýzu reťazca. Je zrejmé, že túto techniku by bolo možné použiť na analýzu akéhokoľvek peptidu s obsahom zvyšku, odolného pri Edmanovej degradácii na N-terminálnom zakončení. Ďalšie postupy na stanovenie vlastností jednotlivých peptidov s požadovaným účinkom budú ďalej podrobnejšie uvedené. Špecifická účinnosť peptidu, obsahujúceho chránenú N-terminálnu skupinu, napríklad pyroglutamát, v 50 % peptidov by sa ihneď dokázala porovnaním účinnosti peptidu, blokovaného na 100 % s neblokovaným (0 %) peptidom.
V ďalšom možnom uskutočnení je možné voliť podjednotky peptidov, ktoré sú príčinou vzniku užitočných chemických alebo štruktúrnych vlastností. Napríklad peptidy, obsahujúce D-aminokyseliny budú in vivo odolné proti pôsobeniu proteáz, špecifických pre L-aminokyseliny. Okrem toho poskytuje spôsob podľa vynálezu možnosť prípravy bánk peptidov s lepšie definovanými štruktúrnymi vlastnosťami a pri použití látok, podobných peptidom a ich väzieb, napríklad esterových väzieb, je možné pripraviť banky s novými vlastnosťami. V ďalšom možnom uskutočnení je možné vytvoriť banku peptidov, obsahujúcu redukovanú peptidovú väzbu, t. j. R'-CH2.NH-R2, kde R1 a R2 sú zvyšky alebo reťazce aminokyselín. Redukovanú peptidovú väzbu je možné zaviesť ako dipeptidovú podjednotku. Takáto molekula potom bude odolná proti hydrolýze peptidovej väzby, napríklad proti pôsobeniu proteáz. Banky tohto typu by poskytovali väzbové látky s jedinečnou funkciou a účinkom, napríklad s predĺženým biologickým polčasom vzhľadom na odolnosť proti metabolickému odbúravaniu alebo s odolnosťou proti pôsobeniu proteáz, Okrem toho je známe, že v určitých systémoch majú peptidy podobného typu vyššiu účinnosť (Hrubý, 1982, Life Science 31? 189 až 199, Hrubý a ďalší, 1990, Biochem. J., 268:249 až 262). Vynález poskytuje spôsob získať peptidy s uvedenou väzbou, obsahujúce vo všetkých ostatných polohách celkom náhodné reťazce.
Usmernené a cyklické peptidy
Usmernené, cyklické alebo rigidizované peptidy je uvedeným spôsobom taktiež možné pripraviť za predpokladu, že v aspoň dvoch polohách reťazca vo všetkých peptidoch banky bude včlenená aminokyselina alebo analóg aminokyseliny, poskytujúci chemickú funkčnú skupinu, schopnú zosietenie na usmernenie, cyklizáciu alebo rigidizáciu peptidu po spracovaní na vznik zosietenia. Cyklizácia bude výhodná v prípade zaradenia aminokyseliny, indukujúcej vznik závitu, príkladom aminokyselín, schopných spôsobiť zosietenie peptidu môžu byť cysteín (za vzniku disulfidových mostíkov), kyselina asparagová (za vzniku laktámu alebo laktónu) a chelatačné zlúčeniny, napríklad kyselina gama-karboxyglutámová (Gla) (Bachem) na chelatáciu prechodného kovu s tvorbou zosietenia. Chránenú kyselinu gama-karboxyglutámovú je možné pripraviť tak, že sa modifikuje syntéza, opísaná v publikácii Zee-Cheng a ďalší, 1980, Biophys. Biochem. Res. Commun, 94: 1128 až 1132. Peptidovú banku, v ktorej peptid obsahuje v reťazci aspoň dve aminokyseliny, schopné zosietenia je možné napríklad oxidáciou cysteínových zvyškov za vzniku disulfidu alebo adíciou kovového iónu za vzniku chelátu za súčasného zosietenia peptidu a vzniku usmerneného, cyklického alebo rigidizovaného peptidu.
Vynález poskytuje súbor všeobecne rigidných motívov na použitie pri príprave bánk podľa vynálezu. V jednom z uskutočnení, ktoré je znázornené na obr. 2a dávajú dva páry zvyškov, schopných zosietenia vznik „košíka“. Tento motív „košíka“ môže mať svoje zvláštne použitie ako katalytické miesto okrem väzbových vlastností, ktoré sú dôsledkom tejto usmernenej konfigurácie. V Ďalšom možnom uskutočnení vytvárajú dva zvyšky, schopné zosietenia „rebrík“ tak, ako je znázornené na obr. 2b. V prípade, že sa v motíve „rebrík“ striedajú D- a L-aminokyseliny, je možné pripraviť peptid, v ktorom všetky bočné reťazce aminokyselín budú orientované smerom na jeden povrch tak, ako je tomu napríklad pri beta-konfigurácii gramicidínu. Takýto povrch môže potenciálne tvoriť jedinečné katalytické miesto. V ešte ďalšom uskutočnení je možné vytvoriť jednoduchý motív „lasa“, v ktorom dva zvyšky vytvárajú priečnu väzbu tak, ako je to znázornené na obr. 2c. Okrem tvorby peptidovej slučky je možné dosiahnuť aj motív kratšieho „lasa“ pri usmernenom lineárnom peptide, čím dôjde k stabilizácii sekundárnej štruktúry, napríklad alfa-helixu.
Je ďalej pravdepodobne možné vytvoriť aj medzipeptidové priečne väzby, čo vedie k vytvoreniu rigidnej peptidovej matrice.
Vynález poskytuje stratégiu na systematickú prípravu zosietenia. Napríklad v prípade, že sa do peptidového reťazca zaradia štyri cysteínové zvyšky, je možné použiť rôzne ochranné skupiny (Hiskey, 1981 v The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3, Gross and Meinhofer eds., Academic Press, New York, str. 137 až 167, Ponsanti a ďalší, 1990. Tetrahedron 46? 8255 až 8266). Prvý pár cysteinových zvyškov je možné zbaviť ochranných skupín a oxidovať, potom je možné odstrániť ochranné skupiny z druhej dvojice zvyškov a taktiež ich oxidovať. Týmto spôsobom je možné vytvoriť definovaný súbor disulfidových priečnych väzieb. Je tiež možné do reťazca zaradiť dvojicu cysteinových zvyškov a dvojicu chelatačných analógov aminokyselín, takže priečne väzby potom budú mať odlišnú chemickú povahu.
Neklasické aminokyseliny, ktoré indukujú usmerňovanie štruktúry
Do banky náhodných peptidov je možné zaradiť aj nasledujúce neklasické aminokyseliny na zavedenie zvláštnych tvarových motívov: l,2,3,4-tetrahydroizo-chinolín-3-karboxylát (Kazmierski a ďalší, 1991, J. Am. Chem. Soc. 113: 2275 až 2283), (2S, 3S)-metylfenylalanín, (2S,3R)-metylfenylalanín, (2R,3S)-metylfenyl-alanín a (2R,3R)-metylfenylalanín (Kazmierski a Hrubý, 1991, Tetrahedron Letters), kyselinu 2-aminotetrahydronaftalén-2-karboxylovú (Landis, 1989, Ph. D. Thesis, University of Arizona), hydroxy-l,2,3,4-tetrahydroizochinolín-3-karboxylát (Miyaice a ďalší, 1989, J. Takeda Res. Labs., 43: 53 až 76), betakarbolín (D a L), (Kazmierski, 1988, Ph. D. Thesis, University of Arizona), HIC (kyselina histidinizochinolinkarboxylová (Zechel a ďalší, 1991, Int. J. Pep. Protein Res. 43) a HIC (histidín-cyklická močovina) (Dharanipragada).
Nasledujúce analógy aminokyselín je možné zaradiť do vybraných bánk na indukciu alebo na uprednostnenie určitých špecifických sekundárnych štruktúr: LL-Acp (kyselina LL-3-amino-2-propendón-6-karboxylová), dipeptidový analóg, indukujúci beta-závit (Kemp a ďalší, 1985, J. Org. Chem. 50: 5834 až 5838), analógy, indukujúce betaštruktúru (Kemp a ďalší, 1988, Tetrahedron Lett 29: 5081 až 5082), analógy aminokyselín, indukujúce vznik betazávitu (Kemp a ďalší, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 5057 až 5060) analógy, indukujúce vznik alfa-helixu (Kemp a ďalší, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 4935 až 4938), analógy, indukujúce gama-závit (Kemp a ďalší, 1989, J. Org. Chem. 54: 109 až 115) a analógy, ktoré boli opísané v nasledujúcich publikáciách: Nagai a Sato, 1985, Tetrahedron Lett, 26: 647 až 650, DiMaio a ďalší, 1989, J. Chem. Soc. Perkin Trans, str. 1687; tiež analógy Gly-Ala (Kahn a ďalší, 1989, Tetrahedron Lett, 30: 3217), izoster amidovej väzby (Jones a ďalší, 1988, Tetrahedron Lett. 29: 3853 až 3856), tetrazol (Zabrocki a ďalší, 1990, Int. J. Protein Pep. Res. 35: 501 až 509) a analógy, ktoré boli opísané v publikáciách Olson a ďalší, J. Am. Chem. Soc. 112: 323 až 333 a Garvey a ďalší, 1990, J. Org. Chem. 56: 436).
Aj napriek tomu, že uvedené neklasické peptidy a látky, peptidom podobné nemusia byť prístupné klasickej analýze reťazca Edmanovou degradáciou, je možné použiť kombináciu počiatočnej Edmanovej degradácie s následnou analýzou aminokyselín zvyšného reťazca na stanovenie štruktúry peptidu s požadovanou účinnosťou. Je tiež možné na analýzu použiť spektrálnu analýzu.
Derivatizované a modifikované peptidy
Vynález ďalej poskytuje možnosť modifikácie a derivatizácie peptidov v banke. Modifikácie peptidov sú v danej oblasti techniky známe, ide napríklad o fosforyláciu, karboxymetyláciu a acyláciu. Modifikáciu je možné uskutočniť chemickým alebo aj enzymatickým spôsobom.
Je možné pripraviť aj glykozylované peptidy alebo peptidy, acylované alifatickými kyselinami. Príprava týchto peptidových derivátov je v danej oblasti techniky známa a bola opísaná napríklad v nasledujúcich publikáciách. Garg a Jeanloz, 1985, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, zv. 43, Academic Press, Kunz, 1987, Ang. Chem. Int. Ed. English 26: 294 až 308, Horvat a ďalší, 1988, Int J. Pept. Protein Res, 31:499 až 507, Bardaji aďalší, 1990, Ang. Chem. Int. Ed. English 23: 231, Toth a ďalší, 1990, Peptides, Chemistry, Structure and Biology, Riviér a Marshall eds., ESCOM Publ., Leiden, str. 1078 až 1079.
Torres a ďalší, 1989, Experienria 45: 574 až 576, Torres a ďalší, 1989, EMBO J., 8: 2925 až 20)932, Hordever a Musiol, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, tiež tam, str. 811 až 812,
Zee-Cheng a Olson, 1989, Bichem, Biophys, Res. Commun. 94: 1128 až 1132,
Marki a ďalší, 1977, Helv. Chem. Acta 60: 807, Fuju aďalší, 1987, J. Chem. Soc. Chem. Commun. Str. 163 až 164,
Ponsati a ďalší, 1990, Peptides 1990, Giralt a Andreu eds., ESCOM Publ. Str. 238 až 240,
Fuji a ďalší, 1987, 1988, Peptides, Chemistry and Biology, Marshall ed., ESCOM Publ., Leiden str. 217 až 219.
Existujú taktiež dve skupiny väzieb medzi peptidmi a uhľohydrátmi. Prvá z nich, éterová väzba, spája serín alebo teronín hydroxylovou skupinou na hydroxylovú skupinu cukru. Druhá, amidová väzba viaže karboxylovú skupinu glutamátu alebo aspartátu na aminoskupinu cukru. Najmä v uyedených citátoch 1 a 2 sa uvádzajú postupy na prípravu peptid-uhľohydrátových éterov a amidov. Uhľohydrát môže byť. viazaný na peptid aj acetálovými a ketálovými väzbami. .
Je možné pripraviť aj alifatické acylpeptidové deriváty. Je napríklad možné acylovať voľnú aminoskupinu (N-terminálnu alebo lysyl), napríklad kyselinou myristovou. V ďalšom možnom uskutočnení je možné zaradiť do peptidu banky aminokyselinu, obsahujúcu alifatický bočný reťazec so štruktúrou (CH2)nCH3. Tieto a ďalšie konjugáty peptidu a alifatickej kyseliny, vhodné na použitie pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu boli opísané v britskom patentovom spise č. 8809162.4, v PCT/AU89/00166 a v publikácii 5.
Banky náhodných oligonukleotidov
Spôsob syntézy bánk reťazcov nukleových kyselín je možné upraviť podľa syntézy DNA na tuhej fáze fosfoamidátovou metódou podľa publikácie Caruthers, 1985, Science 230: 281, Caruthers a ďalší, 1987, Methods in Enzymology 154: 287 až 313.
Nerozpustné polyméme nosiče na báze oxidu kremičitého, tak aj chránené desoxynukleotidy sa bežne obchodne dodávajú (napríklad Peninsula Laboratories Inc., California, Applied Biosystems, Inc.). Príkladom chránených deoxynukleotidov môžu byť 5'-O-dimetoxytrityldeoxytymidín, 5'-O-dimetoxytrityl-4-N-benzoyldeoxy-cytidín, 5'-O-dimetoxytrityl-N-benzoyldeoxyadenozín a 5'-O-dimetoxytrityl-N-izobutyldeoxyguanozín. Je možné použiť aj ďalšie špecifické ochranné skupiny v závislosti od použitia. Zodpovedajúci deoxynukleozid-3'-fosforamidity je možné syntetizovať a postupne naviazať na tuhý nosič podľa uvedenej publikácie Caruthersa a ďalších, 1987. Prvý deoxynukleozid jc možné fixovať, napríklad môže ísť o deoxyadenozín. Po detritylácii a premytí dichlórmetánom a potom acetonitrilom sa tuhý nosič rozdelí na štyri rovnaké podiely a
SK 281490 Β6 tie sa prenesú do štyroch reakčných nádob. Potom sa jednotlivo do štyroch reakčných nádob pridajú štyri deoxynukleotid-3'-fosformidity. Po ukončení väzby sa tuhé nosiče zo štyroch reakčných nádob premiešajú, dôkladne sa premyjú a potom sa podrobia oxidácii pôsobením zmesi I2/H2O/lutidin/THF. Po oxidácii sa tuhý nosič dôkladne premyje acetonitrilom a uvedený cyklus sa opakuje. Po ukončení syntézy náhodného polydeoxynukleotidového reťazca (napríklad po 11 stupňoch väzby) sa metylesterové skupiny odštiepia pôsobením tiofenolu a DMT-skupiny sa odštiepia kyselinou trichlóroctvou. Polynukleotidové reťazce, zbavené ochranný skupín môžu zostať kovalentne viazané na tuhý nosič (v prípade, že sa použijú vhodné väzbové skupiny), pripravené na použitie v testoch, ktoré budú ďalej podrobnejšie vysvetlené.
Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu je možné použiť oligonukleotidy s inými ako fosfodiesterovými väzbami. Oligonukleotid môže napríklad obsahovať fosfotionátovú väzbu. V danej oblasti techniky sú známe aj iné modifikované fosfodiesterové väzby alebo analógy takýchto väzieb. Tieto modifikované väzby sú odolné proti pôsobeniu exonukleáz i endonukleáz.
Vzhľadom na to, že sa použijú vždy len štyri DNAalebo RNA-nukleozidy v jednom väzbovom stupni, v banke s 12-timi nukleozidovými bázami sa bude nachádzať 412 možných polynukleotidových reťazcov, čo znamená 1,68.107 možností. Okrem toho môže byť oligonukleotid syntetizovaný pri použití tak DNA-, ako aj RNA-nukleozidov. Je zrejmé, že okrem hlavných nukleozidov je možné použiť aj nezvyčajné alebo modifikované nukleozidy, napríklad inozín, metylované purínové nukleozidy, deriváty uridínu a 2'-O-metylribózu, ktorá sa môže vyskytovať v akomkoľvek ribonukleozide.
Tuhé nosiče a väzbové reťazce na použitie v banke náhodných bio-oligomérov
Tuhý nosič na použitie podľa vynálezu bude za reakčných podmienok inertný, vzhľadom na syntézu biooligoméru, napríklad syntéze peptidov alebo oligonukleotidov alebo oboch typov týchto látok. Tuhý nosič na použitie podľa vynálezu musí mať reakčné skupiny na väzbu monomémej podjednotky alebo na väzbu väzbového reťazca alebo akejkoľvek skupiny, ktorá môže slúžiť ako počiatočné väzbové miesto pre monomému podjednotku. V jednom z možných uskutočnení môže byť tuhý nosič vhodný na použitie in vivo, to znamená, že môže slúžiť ako nosič na priamu aplikáciu banky bio-oligomérov (napríklad TentaGel, Rapp Polymere, Tubingen, SRN). Vo zvláštnom uskutočnení môže byť ako tuhý nosič použitý chromatografický materiál.
Tuhý nosič nie je obmedzený na použitie špecifického typu nosiča. Dostupný je veľký rad týchto nosičov, ako je všeobecne známe. Ide napríklad o rôzne typy silikagélov, živíc, derivatizovaných plastických filmov, guľôčok z plastov a gélov oxidu hlinitého. Vhodný tuhý nosič je možné voliť vzhľadom na konečné použitie a jeho vhodnosť pre rôzne predpokladané postupy v priebehu syntézy. Napríklad pri syntéze peptidov je možné ako tuhý nosič použiť napríklad živicu, ako je polystyrén (napríklad živicu P AM, Bachem Inc., Peninsula Laboratories a podobne), živicu typu POLYHIPE (Aminotech, Kanada), polyamidovú živicu (Peninsula Laboratories), polysterénovú živicu, očkovanú polyetylénglykolom (TentaGel, Rapp Polymere, Tubingen, SRN) alebo polydimetylakrylamidovú živicu (Milligen/Biosearch, Califomia). Vo výhodnom uskutočnení na syntézu peptidov sa ako tuhý nosič použije polydimetylakrylamidová živica.
Tuhý nosič podľa vynálezu môže taktiež obsahovať väzbový reťazec. Pod týmto pojmom sa v priebehu prihlášky rozumie akákoľvek molekula, ktorá zaisťuje priestorovú vzdialenosť medzi tuhým nosičom a syntetizovaným peptidom. Väzbové reťazce môžu byť kovalentne viazané na tuhý nosič pred väzbou N“1*“ -Boe- alebo Nalfe-Fmoc- alebo akokoľvek inak chránených aminokyselín. Na spojenie oligoméru a tuhého nosiča je možné použiť rôzne väzbové reťazce. Príkladom väzbových reťazcov môžu byť kyselina aminomaslová, amino-kaprónová, 7-aminoheptánová a 8-aminokaprylová. Kyselina Fmoc-amino-kaprónová sa bežne dodáva (Bachem Biochem) a je veľmi vhodná. V ďalšom možnom uskutočnení môžu väzbové reťazce ešte obsahovať jednu alebo väčší počet molekúl beta-alanínu ako látky, zvyšujúcej vzdialenosť. Okrem toho je možné modifikovať tuhý nosič tak, aby splnil požiadavky, špecifické na určitý účel biologickej skúšky alebo detekcie. Modifikáciu tuhého nosiča je možné uskutočniť zaradením špecifického väzbového reťazca. Modifikovaný tuhý nosič je napríklad možné urobiť citlivým na pôsobenie kyselín, báz, nukleofilných látok, elektrofilných látok, svetla, oxidačných alebo redukčných podmienok.
Okrem uvedených väzbových reťazcov je možné použiť najmä selektívne odštiepiteľné väzbové reťazce. Napríklad ďalej bude vysvetlené použitie väzbového reťazca, citlivého na pôsobenie ultrafialového svetla (Barany a Albenicia, 1985, J. Am. Chem. Soc. 107: 4936 až 4942). Ďalšie odštiepiteľné väzbové reťazce môžu na svoje odštiepenie vyžadovať hydrogenolýzu alebo fotolýzu. Príkladom fotosenzitívnych (svetlom odštiepiteľných) väzbových reťazcov sú reťazce, ktoré boli opísané v publikáciách Wang 1976, J. Org. Chem. 41: 32 až 58, Hammer a ďalší, 1990, Int. J. Pept. Proteín Res. 36: 31 až 45 a Kreib-Cordonier a ďalší, 1990 v Peptides-Chemistry, Structure and Biology, Riviér and Marshall eds., str. 895 až 897. Landen (1977, Methods Enzým. 47: 145 až 149) použil vodnú kyselinu mravčiu na odštiepenie väzby Asp-Pro a tento prístup bol použitý na charakterizáciu determinantov T-buniek v spojení s Geysenovou metódou syntézy (Van der Zee a ďalší, 1989, Eur. J. Immunol. 191: 43 až 47). Ďalšie potenciálne väzbové reťazce, odštiepiteľné za bázických podmienok zahrnujú tie reťazce, ktoré sú založené na kyseline p(hydroxymetyl)benzoovej (Atherton a ďalší, 1981, J. Chem. Soc., Perkin 1: 538 až 546) a kyseline hydroxyoctovej (Baleaux a ďalší, 1986, Int. J. Pept. Proteín Res. 28: 22 až 28). Geysen a ďalší (1990, J. Immunol. Methods 134: 23 až 33) opísali štiepenie peptidu diketopiperazínovým mechanizmom. Enzým môže špecificky odštiepiť väzbový reťazec, ktorý obsahuje reťazec, ktorý je citlivý na pôsobenie enzýmu alebo substrát na pôsobenie enzýmu, ide napríklad o štiepenie peptidu pôsobením proteázy alebo o štiepenie nukleotidu pôsobením endonukleázy. V niektorých prípadoch je možné derivatizovať 10 až 50 % živice substitúciou odštiepiteľným väzbovým reťazcom a zvyšných 50 až 90 % substituovať neodštiepiteľným väzbovým reťazcom, aby bolo možné zaistiť, že bude k dispozícii dostatočné množstvo peptidu po odštiepení väzbového reťazca pre následnú analýzu reťazca. Je možné použiť aj kombinácie odštiepiteľných väzbových reťazcov, aby bolo možné postupné odštiepenie z jedinej častice nosiča.
Tuhý nosič na použtie podľa vynálezu môže obsahovať príslušný bio-oligomér, ku ktorému je možné pridať reťazec náhodných podjednotiek. Tento bio-oligomér je možné voliť na základe opísaných postupov alebo môže obsahovať reťazec, ktorý má požadované vlastnosti.
Pri syntéze oligonukleotidov môže byť výhodné použitie nosiča na báze oxidu kremičitého. Ako už bolo uvedené, sú
SK 281490 Β6 nosiče na báze oxidu kremičitého bežne dostupné (napríklad Peninsula Laboratories Inc., a Applied Biosystems, Inc.).
Spôsoby detekcie a identifikácie bio-oligomérov
Okrem prípravy banky skutočne náhodných biooligomérov a spôsobov ich syntézy tvorí podstatu vynálezu aj spôsob analýzy banky bio-oligomérov na identifikáciu tých oligomérov v banke, ktoré majú určitý typ biologickej účinnosti, ako je väzba, stimulácia, inhibícia, toxicita, chuť a podobne. Iné banky bio-oligomérov je možné analyzovať ďalej uvedenými spôsobmi na prítomnosť enzymatickej účinnosti, inhibičnej účinnosti na enzýmy a chemickej a fyzikálnej vlastnosti určitého typu.
Bio-oligoméry s určitými vlastnosťami, ktoré sú nájdené pri počiatočnej analýze nemusia byť konečnými ligandami. V skutočnosti je výhodné syntetizovať druhú banku na základe spoločných reťazcov ligandov, vybraných pri prvej analýze. Týmto spôsobom je možné identifikovať ligandy s najvyššou účinnosťou za predpokladu, že druhá analýza je uskutočnená za ešte vymedzenejších podmienok.
Väzbové skúšky
Vynález dovoľuje identifikáciu ligandov typu biooligomérov, ktoré viažu molekuly akceptora. Pod pojmom „molekula akceptora“ sa rozumie akákoľvek látka, ktorá sa viaže na bio-oligomér. Akceptorovou molekulou môže byť biologická makromolekula, napríklad protilátka, receptor alebo vírus. Okrem toho môže byť akceptorovou molekulou chemická zlúčenina, napríklad bielkovina, uhľohydrát, nukleová kyselina, lipid, liečivo, kov alebo menšia molekula.
Banka bio-oligomérov podľa vynálezu môže vstupovať do interakcie s mnohými rôznymi molekulami akceptora. Identifikáciou určitého typu bio-oligoméru, na ktorý sa viaže špecifická molekula akceptora je potom možné fyzikálne izolovať tento typ bio-oligoméru.
Vzhľadom na to, že len malé množstvo častíc nosiča bude v každom analytickom alebo detekčnom stupni odstránené, zostáva v zmesi stále ešte prevažná väčšina nosičov s naviazanými oligomérmi. Z tohto dôvodu je banku náhodných bio-oligomérov možné použiť mnohokrát. V prípade, že sa použije rôzna farba alebo iné identifikačné sfarbenie pre rôzne molekuly akceptora (napríklad fluorescenčným farbením ako napríklad použitím fluoresceínuzelená, Texasovej červenej - červená a DAPI- modrá aj po spojení s akceptorom) a pri použití vhodných excitačných filtrov vo fluorescenčnom mikroskope alebo detektore fluorescencie je možné pridať rôzne akceptory napríklad k peptidovej banke a súčasne uskutočniť rýchle vyhodnotenie na špecifické typy ligandov. Tento postup nielen znižuje náklady, ale tiež zvyšuje množstvo akceptorových molekúl, ktoré je možné týmto spôsobom nájsť.
Pri uskutočňovaní spôsobu podľa vynálezu sa pridá molekula akceptora do banky bio-oligomérov, kde bude rozpoznaná a bude sa viazať na jeden alebo väčší počet typov bio-oligomérov v banke. Každý typ bio-oligoméru, na ktorý sa molekula akceptora viaže, bude sám viazaný na jedinom type tuhého nosiča, takže je možné nosič a s nim aj bio-oligomér ľahko identifikovať a izolovať.
Bio-oligomér je možné izolovať akýmkoľvek bežným spôsobom, známym v danej oblasti techniky a vynález preto nie je obmedzený na určité spôsoby izolácie. Je napríklad možné fyzikálnym spôsobom izolovať kombináciu tuhého nosiča a bio-oligoméru s najsilnejšou fyzikálnochemickou interakciou so špecifickou molekolou akceptora. V jednom uskutočnení, ktoré je založené na fyzikálnochemickej interakcii sa pridá roztok so špecifickou molekulou akceptora k banke náhodných peptidov, ekvivalentný približne 105 až O7 typov tuhého nosiča. Molekula akceptora sa inkubuje so živicou na čas, dostatočný na dosiahnutie väzby medzi napríklad peptidom a protilátkou, napríklad 1 hodinu pri teplote 22 °C. Potom sa molekula akceptora, potiahnutá kombináciou bio-oligoméru a tuhej fázy izoluje. Jednotlivé špecifické uskutočnenia budú uvedené ďalej pri opise jednotlivých modifikácií, ktoré opisujú napríklad použitie monoklonálnej protilátky ako rozpustenej molekuly akceptora. Je zrejmé, že tieto metódy je možné ľahko upraviť na detekciu väzby akejkoľvek molekuly akceptora. Okrem toho, aj keď v nasledujúcich odsekoch sa hovorí o bankách peptidov je zrejmé, že tým istým spôsobom je možné analyzovať banky oligonukleotidov alebo peptidoligonukleotidových chimémych zlúčenín.
i) Monoklonálna protilátka sa najskôr označí fluorescenčnou skupinou spôsobom, ktorý sa v danej oblasti techniky bežne uskutočňuje a je všeobecne známy. Potom sa protilátka v koncentrácii 1 pg/ml pridá k banke peptidov a po opatrnom premiešaní pri teplote 22 °C jednu hodinu sa tuhá fáza premyje a identifikuje sa fluorescenčná kombinácia tuhého nosiča a peptidu a tento podiel sa izoluje s použitím automatického zariadenia, oddeľujúceho fluorescenčné molekuly. Je tiež možné fluorescenčnú kombináciu tuhého nosiča a peptidu identifikovať a fyzikálne oddeliť po mikroskopom s fluorescenčnými doplnkami pri použití mikromanipulátora. Relatívna intenzita fluorescencie je zvyčajne úmerná afinite peptidového ligandu k monoklonálnej protilátke.
ii) Monoklonálna protilátka sa najskôr konjuguje s feromagnetickými časticami zvyčajným spôsobom. Potom sa konjugovaná protilátka v koncentrácii 1 μΐ/rnl inkubuje s bankou 1 hodinu pri teplote 22 °C. Magnetické častice vytvoria okolo zodpovedajúceho peptidu na nosiči rozefy, ktoré je potom možné od zmesi oddeliť silným magnetom?1 iii) Monoklonálna protilátka sa najskôr konjuguje s enzýmom, napríklad s alkalickou fosfatázou spôsobom, ktorý- sav danej oblasti techniky používa. Získaný konjugát protilátky a enzýmu sa potom inkubuje s bankou náhodných peptidov 30 minút až jednu hodinu pri teplote 22 °C. Po premytí sa celá banka vleje do Petriho misky, ktorá obsahuje substrát na alkalickú fosfatázu, napríklad 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfát (BC1P) a nitrotetrazoliovú modrú (NBT). Po inkubácii niekoľko ďalších minút zmení kombinácia protilátky, nosiča a peptidu farbu (zmodrie) vzhľadom na vyzrážanie premeneného substrátu na tuhom nosiči a túto kombináciu je potom možné ľahko identifikovať a fyzikálne oddeliť pod mikroskopom pri použití mikromanipulátora. Relatívna intenzita farebnej reakcie je všeobecne proporcionálna afinite peptidu vzhľadom na príslušnú monoklonálnu protilátku.
iv) Monoklonálna protilátka sa najskôr konjuguje s enzýmom, napríklad s peroxidázou z chrenu zvyčajným spôsobom. Tento konjugát protilátky a enzýmu sa potom inkubuje 30 minút až jednu hodinu s bankou náhodných peptidov pri teplote 22 °C. Po premytí sa celá banka vleje do Petriho misky, ktorá obsahuje substrát pre peroxidázu, napríklad 3,3',4,4'-diaminobenzidin (DAB), 3,3',5,5'-tetrametylbenzidín (TMB) alebo 5-chlór-l-naftol (4CN). Po inkubácii niekoľko minút zmení kombinácia protilátky, tuhého nosiča a peptidu farbu a je možné ju identifikovať a ľahko fyzikálne izolovať pod mikroskopom pri použití mikromanipulátora. Relatívna intenzita farebnej reakcie je zvyčajne priamo úmerná afinite peptidu pre použitú monoklonálnu protilátku.
v) Monoklonálna protilátka sa najskôr označí biotínom (biotinyluje sa) spôsobom, ktorý je v danej oblasti techniky známy a potom sa inkubuje s bankou náhodných peptidov 30 minút aj jednu hodinu pri teplote 22 °C. Po premytí
SK 281490 Β6 banky sa pridá zmes streptavidínu a alkalickej fosfatázy alebo komplex streptavidínu a peroxidázy z chrenu a potom sa zmes inkubuje 30 minút. Potom sa nosič premyje a farba sa vyvinie podobným spôsobom ako v predchádzajúcom odseku iii) pri použití enzymatickej metódy. Kombináciou tuhého nosiča a peptidu je potom možné izolovať fyzikálnym spôsobom rovnako, ako je uvedené.
Okrem použitia rozpustných molekúl akceptora je tiež podľa iného uskutočnenia možné vykonávať detekciu biooligomérov, schopných sa viazať na receptory na povrchu buniek pri použití neporušených buniek. Použitie neporušených buniek je výhodné v prípade receptorov, ktoré sú tvorené väčším počtom podjednotiek alebo sú labilné alebo v prípade receptorov, ktoré vyžadujú pre svoju funkciu prítomnosť lipidovej oblasti bunkovej membrány. Bunky, použité pri tomto uskutočnení môžu byť bunky živé alebo fixované. Tieto bunky sa inkubujú s bankou náhodných peptidov a budú sa viazať na určité peptidy, čo sa prejaví tvorbou „rozety“ medzi cieľovou bunkou a príslušnou kombináciou peptidu a tuhého nosiča. Vytvorené rozety je potom možné izolovať diferenciálnym odstredením alebo je možné ich oddeliť fyzikálne pri použití mikroskopu.
Pri ďalšom možnom uskutočnení je možné banku analyzovať aj prepieraním pri použití bunkových línií, napríklad
i) línie, v ktorých receptor na povrchu buniek nie je prítomný a ii) línia, ktorá bola od predchádzajúcej bunkovej línie odvodená jej transfekciou génom, ktorý je kódom pre príslušný receptor.
Potom je možné analyzovať banku nasledujúcim spôsobom:
iii) Najskôr sa banka zbaví nešpecifických častíc nosiča, ktoré by sa viazali na bunky bez receptora tak, že sa použije súvislá vrstva pôvodnej bunkovej línie bez receptora, na ktorej sa uvedené častice naviažu, iv) nenaviazané častice, ktoré sú zmesou častíc, špecifických pre receptor a irelevantných častíc sa uvedú do styku so súvislou vrstvou bunkovej línie, pozitívnej vzhľadom na receptor, na ktorej sa bude viazať kombinácia tuhého nosiča a látky, špecifickej pre receptor.
v) odstránia sa zvyšné irelevantné kombinácie jemným premytím a zliatím a vi) špecifická kombinácia receptora, peptidu a tuhého nosiča sa oddelí pomocou mikromanipulátora.
Ako alternatíva na použitie celých buniek pri výskume receptorov, viazaných na membránu alebo receptorov, vyžadujúcich k svojej funkcii lipidovú oblasť membrány je možné rekonštituovať molekuly receptora do lipozómov, kde je možné naviazať zodpovedajúcu skupinu alebo enzým.
Aj napriek tomu, že uvedené príklady boli uvedené pre ligandy typov peptidov, je možné použiť pri praktickom uskutočnení týchto skúšok všetky bio-oligoméry, ktoré boli uvedené v odsekoch 1, 2 a 3. Znamená to, že sa molekula akceptora môže viazať na neklasickú, cirkularizovanú, konformačne pozmenenú alebo štruktúrne usmernenú molekulu peptidu, oligonukleotidu alebo chimémeho peptiduoligonukleotidu.
V jednom z možných uskutočnení je možné priamo označiť molekulu akceptora. V ďalšom možnom uskutočnení je možné použiť označenú sekundárnu reakčnú zložku na detekciu väzby molekuly akceptora na tuhý nosič, obsahujúci hľadaný bio-oligomér. Väzbu je možné dokázať in situ tvorbou chromoforu pomocou enzymatického označenia. Vhodným enzýmom na toto použitie je napríklad alkalická fosfatáza alebo peroxidáza z chrenu. V ďalšom možnom uskutočnení je možné použiť dve farby pri použití dvoch chromogénnych substrátov a dvojakého enzymatického označenia na rôznych hľadaných akceptorových molekulách. Týmto spôsobom je možné identifikovať tiež priamo a skrížené reagujúce ligandy.
Ďalšie označenie, ktoré je možné použiť pri uskutočňovaní vynálezu sú latexové farebné častice, magnetické častice, flurescenčné označenie, napríklad fluoresceínizotiokyanátom FITC, fycoerytrínom PE, Texasovou červenou TR, rodemínom, voľnými alebo chelatovanými lantanidmi, najmä Eu+X ďalej je možné použiť chemiluminiscenčné molekuly, rádioizotopy alebo označenie v magnetickej rezonancii. Dve farebné skúšky je možné uskutočniť pri použití dvoch alebo väčšieho počtu farebných latexových častíc alebo fluorescenčných látok, emitujúcich pri rôznych vlnočtoch. Označené častice je možné izolovať manuálne alebo mechanickými prostriedkami. Mechanickými prostriedkami sú napríklad postupy, pri ktorých k deleniu dochádza pomocou fluorescenčnej aktivácie, t. j, analogicky ako pri FACS a tiež mikromanipulátormi.
V špecifických príkladoch, ktoré budú ďalej uvedené bolo použité označenie pomocou enzýmu-chromogénu a fluorescenčného označenia.
Relatívne častice je možné izolovať na základe intenzity označenia, napríklad intenzity sfarbenia, fluorescencie, magnetizmu alebo rádioaktivity, uvedené boli len niektoré kritéria. Najintenzívnejšie označené častice je možné oddeliť a reťazec materiálu analyzovať alebo materiál inak charakterizovať, napríklad hmotnostným spektrom. V inom uskutočnení je možné vykonať selekciou častíc s intenzitou označenia nad určitú úroveň a materiál, na tieto častice viazaný analyzovať. Potenciálne je tiež možné použiť moderné metódy zobrazovania pod mikroskopom na kvantitatívne určenie intenzity sfarbenia, a tým aj identifikovať relatívnu afinitu ligandu k molekule receptora pred analýzou reťazca materiálu, viazaného na časticu. Podobne je tiež možné použiť aj kvantitatívne analýzy vo fluorescenčnom mikroskope v prípade akceptora s fluorescenčným označením. V ešte ďalšom uskutočnení je možné oddeliť častice s určitou intenzitou označenia pre analýzu zloženia na nich viazaného materiálu, napríklad môže ísť o zloženie aminokyselín. Je tiež možné banky, obsahujúce vymedzenú skupinu monomémych podjednotiek, ktoré boli identifikované ako dôležité a túto banku potom podrobiť analýze.
V ďalšom uskutočnení je možné identifikovať biooligoméry s najväčšou väzbovou aktivitou, t. j. väzbovou konštantou tak, že sa postupne riedi príslušná molekula ákceptora tak dlho, až k väzbe dochádza len na niekoľkých časticiach tuhého nosiča v banke. Je tiež možné postupovať tak, že sa použijú obmedzujúce podmienky v roztoku, v ktorom k väzbe dochádza alebo v prípade nukleových kyselín hybridizácie pri použití cieľovej nukleovej kyseliny, t. j. molekuly akceptora. Obmedzenie väzby alebo hybridizácie je možné dosiahnuť:
i) zvýšením iónovej sily roztoku, ii) zvýšením koncentrácie denaturačných látok ako močoviny, iii) zvýšením alebo znížením pH od neutrálnej hodnoty 7, iv) v prípade nukleových kyselín priblíženie k teplote topenia Tm.
Je možné použiť aj iné zmeny podmienok v roztoku tak, ako je to v danej oblasti techniky bežne známe. Vysoké riedenie alebo väzba akceptorovej molekuly za vysoko vymedzených podmienok na komplex tuhého nosiča a biooligoméru môže byť použitá na detekciu príslušného ligandu v banke náhodných látok, obsahujúcej všetky alebo takmer všetky možné monoméme podjednotky alebo v banke vymedzené skupiny zlúčenín.
V ďalšom uskutočnení môžu byť stredom záujmu biooligoméry, ktoré majú nízku afinitu väzby. Tieto látky je možné izolovať tak, že sa najskôr odstránia všetky biooligoméry s vysokou afinitou väzby a potom sa uskutoční detekcia väzby za málo vymedzených podmienok alebo v menej zriedenom prostredí.
Vo výhodnom uskutočnení je možné použiť postup s dvojakým označením. Prvé ooznačenie je možné použiť na detekciu nešpecifickej väzby molekuly akceptora na častice nosiča v prítomnosti rozpustného ligandu. Potom sa označené častice od banky oddelia a odstráni sa taktiež nerozpustný ligand. Potom sa zistí špecifická väzba molekuly akceptora na zvyšné častice. Je tiež možné očakávať, že bio-oligoméry na časticiach budú viazať molekulu akceptora na tom istom väzbovom mieste ako príslušný ligand a budú ho teda určitým spôsobom napodobňovať. Skúška s dvojakým označením má tú výhodu, že príslušnú molekulu akceptora nie je nutné čistiť, pretože prvý stupeň skúšky dovoľuje odstránenie nešpecifický reagujúcich častíc nosiča.
5.2 Skúšky na biologickú účinnosť
Podľa vynálezu je možné uskutočniť skúšky na biologickú účinnosť bio-oligoméru z banky po odstránení akýchkoľvek toxických molekúl, zostávajúcich po syntéze, napríklad neutralizáciou a dôkladným premytím pomocou rozpúšťadla, sterilnej vody a živného prostredia. Biologická účinnosť, ktorú je možné dokázať, zahrnuje toxicitu až do zničenia cieľového objektu, stimuláciu a podporu rastu a fyziologické zmeny.
Vo výhodnom uskutočnení je možné bio-oligoméry banky selektívne odštiepiť od tuhého nosiča alebo jeho častice.
V jednom z možných uskutočnení sa častice nosiča pripravia tak, že len frakciu bio-oligoméru jc možné selektívne odštiepiť. Selektívne odštiepiteľné bio-oligoméry, väzbové reťazce a častice nosiča už boli opísané. Na banku sa pôsobí štiepnym činidlom, čím dôjde k odštiepeniu frakcie biooligomérov. Príkladom štiepnych činidiel môže byť UV-svetlo, kyselina, báza, enzým alebo katalyzátor. V jednom uskutočnení sa týmto spôsobom z banky uvoľní 10 až 90 % bio-oligomérov. Vo výhodnom uskutočnení sa uvoľní 25 až 50 % bio-oligomérov. V prípade, že sú odštiepiteľné všetky bio-oligoméry, je možné uskutočniť nekvantitatívne štiepenie obmedzením množstva štiepneho činidla. Je napríklad možné obmedziť čas expozície a intenzitu ultrafialového svetla.
V inom uskutočnení je možné znížiť koncentráciu reakčného činidla. Po uskutočnenom štiepení je možné banku ďalej spracovávať napríklad neutralizáciou na dosiahnutie biologickej kompatibility, pokiaľ ide o požadovanú skúšku. Odborník ľahko stanoví podmienky pri štiepení pre čiastočné štiepenie v prípade, že všetky bio-oligoméry banky sú viazané na častice nosiča štiepiteľnými väzbovými reťazcami alebo väzbami. Je ďalej všeobecne známe, že relatívnu koncentráciu uvoľneného bio-oligoméru je možné ovplyvniť zmenami podmienok pri štiepení.
Vzhľadom na to, že častice nosiča v banke sú imobilizované, vytvorí sa koncentračný gradient určitého biooligoméru. Vysokú koncentráciu bio-oligoméru bude možné dokázať v blízkosti častice, z ktorej bol uvoľnený, To znamená, dôkaz hľadanej biologickej účinnosti v blízkosti častice dovolí identifikáciu a izoláciu častice a stanovenie reťazca alebo inej vlastnosti bio-oligoméru. Identifikácia bio-oligoméru je možná z toho dôvodu, že po čiastočnom odštiepení bude na častici k dispozícii ešte dostatočné množstvo pre analýzu reťazca alebo stanovenie niektorej vlastnosti bio-oligoméru. V ďalšom možnom uskutočnení je možné častice deliť do vyhĺbenín mikrotitračnej platne (napríklad 10 častíc/vyhĺbenie) a určitý podiel bio-oligo méru uvoľniť a podrobiť skúškam na biologickú účinnosť, čím je možné vylúčiť potenciálny problém difúzie. Ako bude ďalej opísané, je možné na tuhý nosič viazať rôzne frakcie bio-oligoméru rôznymi odštiepiteľnými väzbovými reťazcami pre nasledujúcu analýzu reťazca. V ďalších príkladoch znamená „častica“ časticu tuhého nosiča.
Ďalej budú uvedené príklady, ako je možné uskutočniť biologické skúšky bez toho, aby mal byť vynález na tieto príklady obmedzený.
i) Populácia buniek vo forme suspenzie jednotlivých buniek sa navrství na kvapalné prostredie alebo polotuhú matricu, obsahujúcu banku náhodných bio-oligomérov. V jednom uskutočnení sa tento postup vykonáva v mikrotitračnej platni pre tkanivové kultúry s 96 vyhĺbeninami s jednou alebo väčším počtom častíc v každom vyhĺbení, každé vyhĺbenie taktiež obsahuje suspenziu buniek. V ďalšom uskutočnení sa k suspenzii buniek pridá bariérová matrica častice banky, podiel peptidu na každej častici sa viaže na vodou odštiepiteľný (napríklad diketopiperazin) alebo svetlom odštiepiteľný väzbový reťazec. Je možné odštiepiť dostatočné množstvo peptidu na biologický účinok, pričom zostáva ešte dostatočné množstvo peptidu, viazaného na časticu, na analýzu reťazca. Suspenzia buniek môže byť v roztoku alebo v polotuhej matrici. Po vhodnom čase inkubácie sa populácia buniek skúma na rast alebo proliferáciu napríklad identifikáciou kolónií. V ďalšom uskutočnení je možné pridať tetrazoliovú soľ MTT (3-(4,5-dimefyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazóliumbromid) podľa publikácie Mossman, 1983, J. Immunol. Methods 130: 140 až 151). Sukcinátdehydrogenáza, ktorú je možné dokázať v mitochondriách života-schopných buniek premieňa MTT na formazanovú modrú. To znamená, že koncentrácia modrého sfarbenia bude znamenať prítomnosť metabolický ak-. tívnych buniek. V ďalšom možnom uskutočnení je možné., stanoviť včlenenie rádioaktívneho označenia, napríklad triciovaného tymidínu ako ukazovateľ proliferácie buniek. Podobne je možné dokázať syntézu bielkovín zaradením 35S-metionínu. Častice, ktoré uvoľnia peptid, ktorý stimuluje alebo spôsobuje inhibíciu rastu buniek sa potom izolujú a analyzuje sa reťazec materiálu, identifikovaný reťazec peptidu sa potom znova podrobí skúškam v roztoku proti indikátorovému typu buniek.
ii) V ďalšom uskutočnení postupu i) sa častice banky rozdelia do vyhĺbenia mikrotitračnej tak, že každé vyhĺbenie obsahuje približne 10 častíc. Častice sa uvedú do suspenzie v kvapalnej fáze. Z každej častice sa uvoľni dostatočné množstvo peptidu na vyvolanie biologického účinku, zatiaľ čo zostáva dostatočné množstvo peptidu na analýzu jeho reťazca. Supematant, obsahujúci uvoľnený peptid je možné preniesť na replikačnú platňu alebo ponechať vo vyhĺbení spoločne s časticami. Stanoví sa biologická účinnosť, napríklad rast alebo proliferácia bunkovej línie. Častice z vyhĺbení s biologickou účinnosťou sa analyzujú a každý analyzovaný reťazec sa pripraví a testuje, aby bolo možné dokázať, ktorý z reťazcov má biologickú účinnosť.
iii) V ďalšom uskutočnení postupu ii) sa bio-oligoméry viažu na častice tak, že približne 1/3 bio-oligomérov je možné uvoľniť v prvom stupni, ďalšiu 1/2 v druhom stupni a zvyšná 1/3 zostane na častici. K postupnému uvoľneniu môže dôjsť pri použití dvoch odlišných odštiepiteľných väzbových reťazcov alebo použitím obmedzeného množstva štiepneho činidla, ktoré môže v každom stupni odštiepiť len určitý podiel bio-oligoméru. V tomto prípade je výhodné použitie riadeného ožiarenia väzbového reťazca, citlivého na svetlo, hoci aj pri použití starostlivo voleného času pôsobenia chemického alebo enzymatického činidla je možné dosiahnuť čiastočné odštiepenie. Banka postupne odštiepiteľných bio-oligomérov sa pripraví a rozdelí do vyhĺbení mikrotitračnej platne tak, že každé vyhĺbenie obsahuje viac ako 50, výhodne 50 až 250 častíc. Častice sa spracujú tak, aby došlo k odštiepeniu približne 1/3 biooligomérov. Supematant sa sleduje na biologickú účinnosť v opakovaných skúškach. Častice z vyhĺbenín s biologickou účinnosťou sa potom uvedú do suspenzie a rozdelia sa do vyhĺbenín mikrotitračnej platne tak, že každá platňa obsahuje 1 až 10 častíc. Na častice sa pôsobí tak, že sa uvoľní ďalšia 1/3 bio-oligoméru a supematant sa opäť skúša na biologickú účinnosť. Častice z vyhĺbenín s biologickou účinnosťou sa izolujú a naviazaný bio-oligomér sa analyzuje na určenie reťazca. V prípade, že účinná je viac ako jedna častica, pripravia sa všetky identifikované reťazce a jednotlivo sa skúšajú na biologickú účinnosť. Táto dvojstupňová biologická skúška sa javí ako veľmi účinný spôsob na vyšetrenie veľkej banky ba bio-oligomérov so špecifickým biologickým účinkom.
i v) Stimuláciu uvoľnenia cytokínu je možné sledovať tak, že sa suspenzia jednotlivých buniek pridá vo forme, imobilizovanej na polotuhej matrici, napríklad na agarózovom géli. V prípade, že bio-oligomér podľa vynálezu spôsobuje uvoľnenie cytokínu, napríklad lymfokínu, rastového faktora, hormónu a podobne, je možné prítomnosť cytokínu dokázať aktivitou indikátorovej bunkovej línie. Špecifické testy s použitím indikátorovej bunkovej línie je možné vykonať spôsobom podľa odseku i). V inom uskutočnení je možné cytokín, uvoľnený stimulovanými bunkami dokázať blotom na membránu, napríklad z nitrocelulózy a potom cytokín dokázať imunologický alebo dôkazom väzby na receptor.
v) V ďalšom možnom uskutočnení je možné sledovať toxicitu bio-oligoméru. Zóny alebo plaky bez rastu, napríklad v prípade transformovanej alebo nádorovej bunkovej línie, prevrstvenej na banku bio-oligomérov v tomto prípade je indikátorom biologickej účinnosti. Vo zvláštnom uskutočnení je možné navrstviť na polotuhú matricu dve populácie buniek jednu na druhú. Týmto spôsobom je možné identifikovať cytotoxický bio-oligomér, špecifický pre cieľovú bunku, avšak netoxický pre iné bunky. Touto skúškou je možné rýchlo identifikovať bio-oligoméry, vhodné na použitie ako chemoterapeutiká. Cytotoxické bio-oligoméry zahrnujú toxické peptidy a antimediátorové oligonukleotidy.
vi) Pozorovať je možné aj fyziologické zmeny. V jednom z možných uskutočnení sa na banku navrství suspenzia myokardiálnych buniek. Potom je možné pozorovať zmeny fyziológie buniek, stimulované bio-oligomérom. V inom uskutočnení je možné sledovať riadenie určitého enzýmu tak, že sa sleduje vzostup účinnosti určitého enzýmu v prípade, že je k dispozícii príslušný substrát, napríklad chromogén (napríklad MTT, ako bolo uvedené v odseku i), fluorofor alebo chemiluminiscenčná látka. Riadenie enzýmu je možné sledovať aj imunologický. V ešte ďalšom možnom uskutočnení je možné pomocou histologickej techniky dokázať fyziologické alebo morfologické zmeny, vyvolané bio-oligomérom z banky.
vii) Vynález poskytuje postup na dôkaz účinnosti biooligoméru v banke na polarizované bunky, napríklad na bunky s bazolaterálnou a luminálnou plochou. Poláme bunky a kultúry týchto buniek je možné pripraviť na semipermeabilnej membráne, podľa veľkosti otvorov. Banka sa pridá na polotuhej matrici k bazolaterálnej ploche alebo k luminálnej ploche. Potom je možné dokázať rôzne účinky bio-oligoméru podľa vynálezu, napríklad polárny transport, proliferáciu, intercelulámu komunikáciu a podobne. Zvlášť je možné označením bio-oligoméru, napríklad rádioaktívne alebo pomocou fluoroforu identifikovať transportovateľné bio-oligoméry. V danej oblasti techniky existuje tiež dlho dobá potreba špecificky absorbovatcľných molekúl. Tieto molekuly by boli zvlášť vhodné na podanie farmaceutických látok perorálne a do nosa tam, kde je žiadúci transport z povrchu sliznice na opačnú stranu epitelu.
Je tiež možné uskutočniť biologické skúšky pri použití neodštiepených bio-oligomérov. Potom je možné sériovo sledovať biologickú účinnosť celých častíc s viazaným biooligomérom. V jednom z možných uskutočnení je možné aplikovať celú banku živočíchovi a častice potom izolovať zo špecifických tkanív. Je možné izolovať častice, ktoré boli vstrebané po perorálnom, nosnom alebo kožnom podaní. Vo výhodnom uskutočnení sa použijú magnetické častice alebo častice, ktoré majú inú identifikovateľnú vlastnosť ,a tak je možné ich ľahko z tkanív izolovať.
Je zrejmé, že všetky uvedené biologické skúšky sa týkajú bio-oligomérov, zahrnujúcich peptidy, oligonukleotidy alebo chiméme peptid-oligonukleotidy. Peptidy a analógy peptidov sú dobre známe ako látky, podporujúce rast, inhibítory rastu a regulátorové molekuly. Peptidy môžu pôsobiť ako regulátory génov tak, že sa viažu na riadiace reťazce génu a napríklad agonizujú alebo antagonizujú účinky promotórov, zosilňovačov transkripcie a riadiacich bielkovín. Podobne môžu aj nukleové kyseliny pôsobiť ako inhibítory alebo látky indukujúce expresiu génu na úrovni transkripcie (napríklad väzbou alebo blokovaním promótorov, zosilňovačov transkripcie stop kodónov a podobne), pri spracovaní (napríklad interferovaním alebo spoluprácou pri spracovaní mRAN) a pri translácii. V danej oblasti techniky je dobre známe, že je možné použiť oligonukleotid alebo analóg oligonukleotidu na blokovanie špecifickej mRNA. Všetky banky, ktoré boli opísané v odsekoch 1 až 3, je možné skúmať na takúto biologickú účinnosť.
Ďalej je zrejmé, že je možné použiť na biologické sledovanie akúkoľvek bunku, ktorú jc možné udržovať v tkanivovej kultúre počas kratšieho alebo dlhšieho času. Pod pojmom „bunka“ sa rozumie prokaryotická (napríklad bakteriálna) a eukaryotická bunka, kvasinky, pliesne a huby. Je možné použiť primáme bunky alebo bunkové línie, udržované v kultúre. Okrem toho bude pravdepodobne možné uskutočňovať aj pokusy s vírusmi tak, že sa bunky infikujú alebo transformujú vírusom. Bolo by napríklad možné sledovať schopnosť bio-oligoméru, spôsobiť inhibíciu lyzogénnej účinnosti bakteriofágu lambda identifikáciou kolónií E. coli po transfekcii, ktoré by v prípade infekcie nevytvárali zreteľné plaky.
Postupy pre skúšky na účinnosť bio-oligoméru v banke náhodných bio-oligomérov nie je možné obmedziť na uvedené príklady. Je totiž možné modifikovať akýkoľvek systém zaradením vynálezu, takže taktiež bude patriť do jeho rozsahu.
Biologická skúška na antagonisty erytropoetínu
V zvláštnom uskutočnení sa vynález týka skúšky na biooligomér, ktorý je agonistom erytropoetínu. Je však zrejmé, že postup, ktorý bude s týmto cieľom opísaný môže byť využitý na identifikáciu akéhokoľvek agonistu, napríklad agonistu rastových faktorov, hormónov, cytokínov, lymfokínov a iných intercelulámych mediátorov, ako boli opísané.
V danom uskutočnení môže byť banka bio-oligomérov tvorená peptapeptidmi, pripravenými z 19 bežných aminokyselín s výnimkou cystínu. Teoretické množstvo možných vzniknutých peptidov je 2 476 099. Banku je možné získať v 19 stupňoch na uľahčenie analýzy banky. Postupuje sa tak, že sa v každom stupni pre C-terminálne zakončenie volí jediná aminokyselina, takže len ďalšie štyri sú volené náhodne. Vzniknutý peptid má teda všeobecný vzorec XXXXY, kde Y je aminokyselina, zvolená pre uvedený
SK 281490 Β6 stupeň a X znamená náhodne naviazanú aminokyselinu. Týmto spôsobom je možné znížiť počet potenciálnych peptidov v každom stupni na 130 321. Pri rozdelení materiálu po 10 časticiach (peptidov) do každého vyhĺbenia platne s 96 vyhĺbeninami je počet potrebných platní 135, ďalšie platne sú potrebné na biologické skúšky (štandardy a kontroly), takže celkový počet potrebných platni je 137. Spôsob dovoľuje distribúciu celého stupňa tvorby banky v celom počte platní v priebehu jediného pracovného dňa.
Hlavný podiel 50 až 80 % peptidu, syntetizovaného na časticiach nosiča je možné odštiepiť na uskutočnenie biologických skúšok tak, že sa z každej častice nosiča uvoľní aspoň 50 pmol peptidu. Ako odštiepiteľný spojovací reťazec je vhodná najmä diketopiperazínová väzba, aj napriek tomu, že je možné použiť aj spojovací reťazec, odštiepiteľný pôsobením svetla. Väzba je dostatočne stála v miernom kyslom prostredím, napríklad 0,1 až 1,0 mM HCI na distribúciu častíc nosiča v priebehu 6 až 8 hodín. Odštiepenie je možné vyvolať pridaním 20 μΐ 1,0 až 10 mM Hepes s pH
8,5 do každého vyhĺbenia. Štiepenie prebieha cez noc (12 až 18 hodín) pri udržovaní konečného objemu vyhĺbenia na stálej hodnote. Odparovaniu je možné zabrániť uložením platní vo vlhkej komore.
Roztok peptidu, získaný štiepením banky by mal byť aseptický alebo skôr sterilný. Aseptické podmienky sú nutné vzhľadom na to, že roztok bude tvoriť 25 % konečného objemu kultúry a kultivácia bude trvať aspoň 24 hodín. A-septické podmienky je možné dosiahnuť tak, že sa
1. hydratujú častice po syntéze v sterilnej vode,
2. počiatočná suspenzia častíc sa riedi okysličenou sterilnou vodou,
3. použije sa sterilná technika na rozdeľovanie častíc do jednotlivých vyhĺbenín mikrotitračných platní.
Konečná suspenzia častíc môže obsahovať menej ako približne 20 % DMSO na uľahčenie solubilizácie hydrofóbnych peptidov. DMSO by mal byť pridaný v prípade potreby v časovom štádiu spoločne s vodou na uľahčenie rozpúšťania. Konečná suspenzia častíc by mala obsahovať 10 častíc/50 μΐ. Udržanie častíc v suspenzii v priebehu pipetovania je možné dosiahnuť pridaním približne 0,8 až 3,3 % metylcelulózy. Použitie metylcelulózy môže umožniť zníženie množstva DMSO, použitého na zvýšenie rozpustnosti. Konečná koncentrácia metylcelulózy v kultúre má byť udržovaná pod 0,8 % tak, aby nedochádzalo k interferencii s biologickými skúškami.
Uvoľnené peptidy je možné preniesť na platne pre biologické pokusy vo forme vzoriek s objemom 50 μΐ, pričom je nutné dbať na to, aby si zodpovedali platne pre vzorky a pre pestovanie. Je tiež nutné pri prenose zachovať sterilné podmienky. Do určitých vyhĺbenín platní je možné pridať ľudský rekombinantný EPO ako pozitívnu kontrolu (na každej platni) a pre konštrukcie štandardných kriviek (prvá a posledná platňa). Do kontrolných vyhĺbenín je možné vložiť 0,1 IU EPO a štandardné krivky je možné získať zo šiestich skúšok vždy s dvoma vyhĺbeninami pri použití 1,0 až 100 mjednotiek EPO (D'Andrea a ďalší, 1991, Mol. Celí Biol. 11: 1980 až 1987).
Biologickú skúšku je možné uskutočniť pri použití rekombinantnej bunkovej línie Ba/F3-T, pri ktorej dochádza k expresii receptora pre erytropoetín (EPO-R). Tieto skúšky sú závislé buď od prítomnosti interleukínu-3 (IL-3) alebo EPO. Pestovanie uvedených buniek v prítomnosti IL-3 (vo forme 10 % roztoku) v upravenom živnom roztoku WEHI môže zabrániť možnej interferencii EPO v prostredí s biologickou skúškou. Základným rastovým prostredím pre bunky Ba/F3-T je prostredie RPMI 1640 s obsahom 2,0 g/1 hydrogénuhličitanu sodného, 10 % fetálneho teľa cieho séra, 1 x penicilín-streptomycín, 5 μΐ beta-merkaptoetanolu/1 a 10 mM Hepes (konečná koncentrácia), pH sa upraví na 7,4. Toto prostredie je nutné doplniť 10 % upraveného prostredia WHEI, ktorým sa dodá IL-3. Upravené prostredie WHEI sa pripraví tak, že sa pestujú bunky WHEI v tom istom základnom prostredí až do vytvorenia súvislej vrstvy buniek. Potom sa prostredie odstredí na odstránenie buniek, nechá sa prejsť filtrom s priemerom otvorov 0,22 pm a skladuje sa v zmrazenom stave. Bunky Ba/F3-T sa pestujú až do koncentrácie 1,31 x 107 buniek, tieto bunky sa potom rozdelia po 1 x 103 buniek/vyhĺbeninu v objeme 150 μί podľa publikácie Yoshimura a ďalší, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:4139 až 4143.
Potom sa bunky Ba/F3-T prenesú z malých fliaš do sterilných fliaš do odstrediviek s objemom 250 ml. Potom sa bunky odstredia pri 500 g celkom 5 minút. Potom sa bunky uvedú do suspenzie v 200 ml čerstvého základného prostredia bez IL-3 na počítanie buniek. Konečný objem sa potom upraví tak, aby bolo dosiahnutých 6,67 x 103 buniek/ml (1 x 103 buniek/150 μί) pridaním ďalšieho živného prostredia. Zvyčajne je potrebné rozdeliť výslednú suspenziu buniek na 4 až 8 podielov a jednotlivé podiely skladovať v inkubátore v priebehu dlhého postupu delenia. Počet buniek a ich životnosť by mali byť stanovené na vzorkách, odobratých na konci a na začiatku delenia, aby bolo overené, že na prvej a na poslednej platni sa nachádza približne rovnaký počet životaschopných buniek. Bunky sa rozdeľujú do platní s obsahom supematantov s uvoľnený peptidom. Potom sa platne inkubujú tri dni (Yoshimura a ďalší, vyššie).
Konečným stupňom biologickej skúšky je zistenie počtu živých buniek v každom vyhĺbení platne. Tento počet je možné stanoviť skúškou MTT podľa publikácie Mosmann, 1983, J. Immunol, Methods 65: 55 až 63 vmodifr· kácii podľa publikácie Niks a Otto, 1990, J. Immunol; . Methods 130: 140 až 151. Modifikovaná skúška dovoľuje. stanovenie počtu živých buniek bez odstránenia živného prostredia. r
MTT, t. j. 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazóliumbromid sa pripraví vo forme roztoku v PBS, ktorý obsahuje 5 mg MTT/ml, potrebných je približne 270 ml roztoku. Do každého vyhĺbenia platne sa uloží 20 μΐ tohto roztoku a platňa sa inkubuje 4 hodiny pri teplote 37 °C. Po tomto čase sa do každého vyhĺbenia pridá 100 μί extrakčného roztoku a platňa sa uloží do kúpeľa s ultrazvukom na 120 sekúnd. Extrakčný roztok obsahuje 50 % objemových dimetylformamidu v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS) s koncentráciou 20 % hmotnostných, upravenom na pH 4,7 pridaním zmesi kyseliny octovej a chlorovodíkovej spôsobom podľa publikácie Hansen a ďalší, 1989, J. Immunol. Methods 119: 203. Týmto postupom dochádza k solubilizácii formazanového produktu metabolizmu MTT na meranie optickej hustoty pri 570 nm, zariadením na odčítanie priamo z mikrotitračných platni.
Údaje optickej hustoty, získané pri biologických skúškach sa použijú na vypočítanie priemeru zo všetkých vyhĺbenín, obsahujúcich vzorky na stanovenie 95 % medze spoľahlivosti pre priemernú hodnotu. Pre hodnoty optickej hustoty vo vyhĺbeninách vnútri uvedeného intervalu sa na stanovenie štatistickej významnosti použije Študentovo t. Štatisticky významné hodnoty sa porovnávajú so štandardnou krivkou EPO, čím sa získa údaj pre účinnosť v IU relatívne k EPO. Štandardná krivka sa stanoví nelineárnou regresnou analýzou pri použití logistickej rovnice. Údaje z oboch štandardných kriviek sa analyzujú spoločne aj oddelene za účelom zistenia, či existuje štatisticky významný rozdiel v odpovedi, meranej na oboch koncoch biologickej skúšky (test na pomer F). Porovnaním kontrolných hodnôt, meraných pre každú platňu v priebehu celej skúšky je možné určiť kvôli zisteniu, či existuje stála zmena v odpovedi pri biologickej skúške.
Je dôležité si uvedomiť, že existujú na bunkách Ba/F3-T dva receptory pre rastové faktory (IL-3R a EPO-R) a že aktivácia ktoréhokoľvek z nich vyvolá pozitívnu biologickú odpoveď. To znamená, že uvedenou biologickou skúškou je možné oddeliť agonisty receptorov IL-3 a EPO. Existuje dvojaké riešenie tohto problému. Jedným z nich je použitie inej bunkovej línie alebo slezinných buniek z myší po podaní fenylhydrazínu (Kryštál, 1983, Exp. Hematol. 11: 649 až 660). Druhým je skúška syntetických peptidov na účinnosť EPO a IL-3 v druhej biologickej skúške alebo pomocou rádioaktívne označených väzbových látok.
Látky, spolupôsobiace s enzýmami a inhibítormi enzýmov
Vynález sa týka aj bio-oligomérov, ktoré katalyzujú určité reakcie, napríklad banky enzýmov, ktoré môžu slúžiť ako koenzýmy alebo môžu spôsobiť inhibíciu enzymatických reakcií. Vynález teda tiež poskytuje spôsoby na skúmanie účinnosti enzýmov alebo koenzýmov a tiež na sledovanie inhibície enzymatickej účinnosti.
Enzymatickú účinnosť je možné sledovať na základe tvorby zistiteľného reakčného produktu. Vo zvláštnom uskutočnení katalyzuje bio-oligomér z banky enzymatickú reakciu, ktorej substrátom je substrát pre alkalickú fosfatázu, t. j. 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfát (BCIP), čim dôjde k modrému, nerozpustnému reakčnému produktu na tuhom nosiči, ako bude ďalej opísané v príklade 13.
V ďalšom uskutočnení sa môže tvoriť oblasť pozorovateľného produktu, napríklad zafarbenie alebo fluorescencia na polotuhej matrici. V tomto prípade sa banka navrství na polotuhú matricu, napríklad na agarózový gél a pridá sa chromogénny alebo iný indikátorový substrát. V prípade, že kombinácia tuhého nosiča a bio-oligoméru má požadovanú enzymatickú účinnosť, vytvorí sa zóna produktu. Napríklad je možné bio-oligomér, ktorý je analógom peroxidázy z chrenu identifikovať tak, že sa pridá roztok aminoantipyrénu (0,25 mg/ml, Kodak), fenolu (8 mg/ml) a H2O2 (0,005 %) v 0,1 M fosfátovom pufri s pH 7,0. Častice s enzymatickou účinnosťou budú tvoriť purpurovú zónu.
V ďalšom uskutočnení je možné identifikovať častice nosiča s bio-oligomérom s účinnosťou proteázy pridaním známych kolorimetrických substrátov pre proteázu.
Enzymatickú účinnosť je možné pozorovať tak, že sa sleduje enzymalická účinnosť, priaznivo ovplyvnená koenzýmom tam, kde nie je prítomný prírodný alebo zvyčajný koenzým.
Inhibičný účinok na enzymatickú reakciu je možné dokázať pri použití čiastočne uvoľneného bio-oligoméru. Uvoľňovanie bio-oligomérov bolo už opísané v odsekoch 4 a 5.2. V jednom z možných uskutočnení sa banka biooligomérov navrství na polotuhú matricu, ktorá obsahuje enzým. Z banky sa potom čiastočne uvoľní bio-oligomér.
V prípade, že bio-oligomér spôsobuje inhibíciu enzymatickej účinnosti, je možné identifikovať oblasť bez produktu.
V jednom z uskutočnení je substrát enzýmu chromogénny a vytvára sa farebný produkt. To znamená, že prítomnosť inhibitora enzýmu sa prejaví prítomnosťou oblasti bez zafarbenia. V ďalšom možnom uskutočnení je možné dokázať inhibíciu proteolýzy hemoglobínu alebo indikátorového enzýmu ako alkalickej fosfatázy prítomnosťou opaktnej zóny v polotuhej matrici. K tomuto javu dochádza preto, že prítomný inhibítor proteolýzy bráni degradácii hemoglobínu alebo indikátorového enzýmu.
Je dobre známe, že bio-oligomér s enzymatickou účinnosťou, účinnosťou koenzýmu alebo schopnosťou spôso bovať inhibíciu enzymatickej účinnosti môže byť peptid, oligonukleotid alebo chimémy peptid-oligonukleotid. Zvláštny význam majú usmernené alebo cirkularizované peptidy, ktoré môžu dať vznik katalytickým miestam alebo zónam, ako už bolo opísané. Je tiež možné očakávať, že chimémy peptid-oligonukleotid bude mať zvláštne chemické vlastnosti, napríklad enzymatickú účinnosť alebo účinnosť koenzýmu vzhľadom na zvláštnu vzájomnú polohu zodpovedajúcich funkčných skupín. Okrem toho je možné predpokladať, že bio-oligomér, viazaný na nosič môže mať enzymatickú účinnosť alebo účinnosť koenzýmu, zatiaľ čo voľný bio-oligomér môže byť neúčinný. To môže byť spôsobené aj tým, že molekuly bio-oligoméru sú prítomnosťou nosiča, na ktorý sú viazané, vlastne zhustené. Bio-oligomér tiež môže spôsobiť inhibíciu účinnosti enzýmu alebo koenzýmu po uvoľnení z častice nosiča. Bolo by tiež možné chemicky zabudovať známe enzýmy (kofaktory) do usmerneného bio-oligoméru na simuláciu jednoduchého alebo komplexného enzýmu vrátane, napríklad reťazca na transport elektrónov.
Spôsoby charakterizácie bio-oligoméru
Hneď, ako je identifikovaná častica nosiča s hľadanými vlastnosťami niektorou z metód podľa uvedeného odseku 5, je možné stanoviť štruktúru a celý reťazec identifikovaného bio-oligoméru.
V prípade, že bio-oligomér je peptid, je vhodnou metódou analýzy reťazca Edmanovej degradácie. Zvlášť výhodné je automatické analyzovanie reťazca, napríklad s použitím Applied Biosystems 477A Proteín Sequencer. Je možné tiež určiť reťazec aminokyselín v peptide buď bombardovaním iýchlymi atómami v hmotnostnej spektroskópii (FAB-MS) alebo ďalšími analytickými postupmi.
Reťazec peptidov je možné analyzovať buď na nosiči alebo po odštiepení z tuhého nosiča. Na odštiepenie peptidov sa na oddelené častice nosiča s peptidom pôsobí zvyčajnými činidlami na odštiepenie polymérov od tuhého nosiča. Voľba činidla na toto odštiepenie závisí od použitého tuhého nosiča. Napríklad na odštiepenie peptidov zo živice Wang je výhodné použitie 50 % kyseliny trifluóroctovej (TFA) v dichlórmetáne.
Je tiež možné postupovať tak, že sa izoluje jediná tuhá fáza nosiča, napríklad jeho častica s naviazaným bio-oligomérom, a táto častica sa privedie do analyzátora bez toho, aby bol bio-oligomér vopred od častice odštiepený. Napríklad v prípade, že bio-oligomérom je peptid, obsahuje jediná častica živice s priemerom 100 μιη so substitúciou živice 0,5 mekv./g približne 200 pmol peptidu. Jediná častica živice PAM s priemerom 250 pm a substitúciou 0,5 mekv./g živice obsahuje približne 3125 pmol peptidu. V prípade súčasných automatických analyzátorov reťazca je pre spoľahlivú analýzu potrebných len 5 až 10 pmol peptidu. Je teda zrejmé, že jediná častica živice PAM s priemerom 100 pm obsahuje viac ako dostatočné množstvo peptidu na analýzu reťazca.
V prípade, že peptidy obsahujú aminokyseliny alebo látky podobné peptidom, ktoré nie sú prístupné Edmanovej degradácii, je možné častice pripraviť tak, aby 10 až 50 % peptidov neobsahovalo zvyšok, ktorý uvedenej metóde odoláva. Zvyšný reťazec je možné potom stanoviť a reťazce s nestanoviteľným zvyškom odvodiť extrapoláciou.
Ďalším spôsobom, ktorý je možné použiť pre zvyšky, ktoré nie je možné bežným spôsobom analyzovať je dočasná ochrana časti peptidu pred väzbou uvedeného zvyšku v priebehu syntézy banky. V priebehu následnej identifikácie štruktúry sa použije Edmanova degradácia až k uvedenému zvyšku, potom sa odstráni ochranná skupina a
SK 281490 Β6 analyzuje sa druhá polovica (C-terminálna časť) reťazca až k uvedenému zvyšku.
V prípade oligonukleotidov je možné analýzu reťazca uskutočniť na automatickom zariadení (napríklad Applied Biosystems). Výhodný je postup podľa Maxama a Gilberta, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 560 až 564. Je však možné použiť aj iné známe postupy.
Pri spektrofotometrii s bombardovaním rýchlymi atómami je zrejme možné analýzu uskutočniť najúčinnejšie. Detekciou fragmentov a typu bio-oligoméru je možné rekonštruovať celý reťazec. Pri uskutočnení hmotnostnej spektrometrie (Finnigan MAT) je možné súčasne získať údaje o štruktúre a analýzu reťazca.
Hneď, ako je stanovený reťazec bio-oligoméru, je možné syntetizovať jeho veľké množstvo chemicky automatickým zariadením alebo inými biologickými alebo chemickými postupmi. Je v ňom tiež možné meniť niektoré časti na zvýšenie jeho špecifickej biologickej účinnosti.
Látky na liečebné a diagnostické účely z bánk náhodných bio-oligomérov
Hneď ako bol určený reťazec príslušného biooligoméru, je podľa vynálezu možné získať molekuly, ktoré obsahujú reťazec bio-oligoméru na použitie na liečebné alebo diagnostické účely. Reťazec bio-oligoméru môže sám o sebe byť diagnostickou alebo liečebnou látkou alebo je ho možné zabudovať do väčšej molekuly. Molekulu, obsahujúcu reťazec bio-oligoméru s biologickou alebo väzbovou účinnosťou je možné označiť ako „efektorovú molekulu“. Vynález ďalej poskytuje banky na použitie na rôzne účely. „Efektorová“ funkcia uvedenej efektorovej molekuly môže byť ktorákoľvek z funkcií, ktoré boli opísané alebo ktoré sú v danej oblasti techniky známe.
Opísaný postup je nielen novým nástrojom na vyhľadávanie špecifických väzbových reťazcov diagnostickej alebo liečebnej hodnoty, ale poskytuje aj dôležitú informáciu o celom rade väzbových reťazcov alebo potenciálne veľmi sa líšiacich primárnych reťazcov alebo chemických zlúčenín, ktoré môžu byť aj napriek tomu schopné interakcie s tou istou molekulou akceptora. Po integrácii takejto informácie s molekulovým modelovaním a modernou počítačovou technikou bude zrejme možné získať hlbšie porozumenie interakciou väzbových reťazcov a receptorov.
Liečivá podľa vynálezu zahrnujú molekuly efektora, ktorý sa viaže na biologicky aktívne polohy cytokínov, rastových faktorov alebo hormonálnych látok, a tým podporuje alebo neutralizuje ich účinok a môže blokovať alebo podporovať aj transkripciu a/alebo transláciu.
Liečivá podľa vynálezu zahrnujú aj efektorové molekuly, ktoré sa môžu viazať na receptor, farmakologicky zaujímavý, napríklad na receptor rastového faktora, nervového prenášača alebo hormónu. Tieto molekuly je možné použiť ako agonisty alebo antagonisty pôsobenia prírodných väzbových reťazcov.
Ďalším využitím efektorovej molekuly, schopnej sa viazať na receptory, je jej použitie na väzbu s cieľom blokovať väzby vírusov alebo mikroorganizmov, ktoré si získajú prístup do bunky väzbou na normálne bunkové receptory. Príkladom tohto javu môže byť vírus ľudskej imunodeficiencie na receptor CD4 a väzba virusu herpes simplex na receptor rastového faktora fibroblastov. Efektorové molekuly, ktoré „obsadia“ receptor je možné použiť ako farmakologicky účinné látky, ktoré blokujú vírusovú infekciu na cieľových bunkách. Podobným spôsobom by bolo možné dosiahnuť inhibíciu invázie parazitov do bunky po identifikácii vhodných efektorových molekúl spôsobom podľa vynálezu.
V ďalšom uskutočnení je možné použiť efektorovú molekulu, obsahujúcu reťazec bio-oligoméru, ktorý sa viaže na molekulu akceptora ako cieľ pre toxín alebo inú látku. Vo výhodnom uskutočnení je akceptorovou molekulou receptor alebo antigén na povrchu nádorovej bunky, živočíšneho parazita alebo mikroorganizmu, napríklad baktérie, vírusu, jednobunkového parazita, jednobunkového patogénneho mikroorganizmu, huby alebo pliesne.
Okrem toho je možné, že niekoľko bio-oligomérov z mnohých miliónov, prítomných v banke bude mať reťazec s biologickou účinnosťou. Je zásadne možné izolovať bio-oligoméry, ktoré majú protinádorovú, antiparazitickú alebo antimikrobiálnu, napríklad protihubovú, antibakterálnu, antiparazitickú alebo protivírusovú účinnosť. Okrem toho môžu byť niektoré z týchto bio-oligomérov agonisty alebo antagonisty rastových faktorov ako erytropoetinu, epidermálneho rastového faktora, rastového faktora nádorov, rastového faktora fibroblastov a tiež hormónov, nervových prenášačov, imunomodulátorov alebo iných riadiacich molekúl. V jednom z možných uskutočnení sú biooligomérom peptidy.
Liečivá podľa vynálezu tiež zahrnujú efektorové molekuly, obsahujúce reťazec bio-oligoméru s vysokou afinitou pre liečivá, napríklad pre digoxín, benzodiazepam, heroín, kokaín alebo teolylín. Takéto peptidy je možné použiť ako antidota pri predávkovaní takýmito liečivami. Podobne je možné efektorové molekuly s obsahom liečiv viazať na malé molekuly alebo aj na kovové ióny, vrátane iónov ťažkých kovov. Reťazce bio-oligomérov s vysokou afinitou k bilirubínu by mohli byť užitočné pri liečení hyperbilirubinémie novorodencov. ...
Všeobecne je možné uviesť, že vynález poskytujemožnosť identifikovať reťazce bio-oligomérov na liečebné, účely pri liečení choroby a chorobných stavov, tak ako sú uvedené napríklad vProduct Category Index of the Physician Desk Reference PDR, 1991, 45. Vydanie, MedicaLgr conomics Data: Oradall, NJ, str. 201 až 202. Je napríklad možné identifikovať efektorovú molekulu s účinkom antiparazitickým, antikoagulačným, antagonistickým proti antikoagulanciám, antidiabetickým protikŕčovým, antidepresívnym, protihnačkovým, antidotálnym, antigonadotropínovým, antihistaminovým, antihypertenzívnym, protizápalovým, protizvracivým, protimigrenóznym, antiparkinsonickým, proti zhlukovaniu doštičiek, protisvrbivým, antipsychorickým, antipyretickým, antitoxickým (napríklad protijedovým), bronchodilatačným, vazodilatačným, chelatačným, kontraceptívnym, relaxačným na svalové tkanivo, antiglaukomatóznym alebo sedatívnym.
Liečivé prostriedky podľa vynálezu môžu tiež obsahovať príslušné, z farmaceutického hľadiska prijateľné nosiče, riedidlá a pomocné látky. Farmaceutické nosiče môžu byť sterilné kvapaliny, napríklad voda a oleje vrátane ropy, a tukov živočíšneho, rastlinného alebo syntetického pôvodu, ako sú arašidový olej, sójový olej, minerálne oleje, sezamový olej a podobne. Voda je výhodnejším nosičom v prípade, že sa farmaceutický prostriedok podáva vnútrožilovo. Ako kvapalné nosiče je tiež možné použiť roztoky chloridu sodného, najmä fyziologický roztok a roztoky dextrózy a glycerolu vo vode, najmä pre injekčné roztoky. Vhodnými farmaceutickými pomocnými látkami sú škrob, glukóza, laktóza, sacharóza, želatína, slad, ryžová múka, krieda, silikagél, uhličitan horečnatý, stearan horečnatý, stearan sodný, glycerolmonostearát, mastenec, chlorid sodný, sušené odstredené mlieko, glycerol, propylénglykol, voda, etanol a ďalšie. Farmaceutické prostriedky môžu mať formu roztokov, suspenzií, tabliet, piluliek, kapsúl, práškov, liekových foriem so spomaleným uvoľňovaním účin
SK 281490 Β6 ných látok a podobne. Vhodné farmaceutické nosiče boli opísané v publikácii Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin. Zvyčajné farmaceutické prostriedky obsahujú účinné množstvo liečiva spolu s vhodným množstvom nosiča tak, aby vznikla lieková forma, vhodná na podanie chorému. Vnútrožilová injekcia je síce veľmi účinnou formou podania, je však možné použiť aj ďalšie formy, napríklad injekčné podanie inou cestou, perorálne, nosné alebo iné parenterálne podanie.
Molekula, obsahujúca reťazec bio-oligoméru, určený spôsobom podľa vynálezu môže byť použitá aj na výrobu diagnostického prostriedku. Diagnostický prostriedok môže obsahovať jeden alebo väčší počet reťazcov bio-oligomérov podľa vynálezu, napríklad viac, ako jeden peptidový alebo viac ako jeden oligonukleotidový reťazec. Okrem toho môže diagnostický prostriedok obsahovať ktorýkoľvek z nosičov, ktoré boli opísané pre farmaceutické liečebné prostriedky.
Pod pojmom „diagnostický prostriedok“ sa rozumie prostriedok, ktorý je možné použiť na detekciu určitého stavu alebo javu, ako napríklad nádoru, ako lymfómu z T alebo B-buniek alebo infekčného ochorenia, ako už bolo uvedené. Pojem detekcia sa používa v najširšom zmysle tak, aby zahrnoval dôkaz existencie stavu, miesta alebo časti tela, zúčastňujúceho sa stavu, alebo aby bolo možné rozpoznať závažnosť stavu. Napríklad je možné komplex imunoperoxidáza z chrenu a peptidu alebo podobnú imunochemicky účinnú látku použiť na detekciu a kvantifikáciu špecifického receptora alebo molekuly protilátky v tkanive, sére alebo inej telesnej tekutine. Diagnostické prostriedky je možné použiť in vivo a in vitro. Vynález poskytuje najmä použiteľné a užitočné diagnostické prostriedky na použitie v imunologických skúškach, hybridizácii Southem alebo Northem blot a na skúšky in situ.
Okrem toho môže diagnostické činidlo obsahovať jednu alebo väčší počet značiacich prostriedkov, napríklad rádioizotopy, fluorescenčné látky, paramagnetické látky alebo iné látky, uľahčujúce zobrazenie. Odborník pozná škálu týchto látok a spôsoby ich zaradenia do diagnostických prostriedkov.
Farmaceutické prostriedky, určené na liečenie a diagnostické prostriedky podľa vynálezu je možné použiť na liečenie a na diagnózu u živočíchov, výhodne cicavcov vrátane človeka, avšak aj psov, mačiek, koní, kráv, ošípaných, morčiat, myší a potkanov. Liečebné a diagnostické prostriedky je možné použiť aj na liečenie a/alebo diagnostiku rastlín.
Ochorenie a stavy, prístupné na liečenie alebo diagnózu pomocou bio-oligomérov podľa vynálezu sú veľmi rôzne, rovnako ako permutácie štruktúry banky náhodných biooligomérov. Na vysvetlenie niektorých uskutočnení, nie však na obmedzenie rozsahu vynálezu budú ďalej uvedené niektoré špecifické príklady použitia vynálezu.
Cytotoxické prostriedky
Molekula, tvorená reťazcom bio-oligoméru môže sama o sebe mať špecifickú cytotoxickú účinnosť. Bio-oligomér, ktorý sa viaže na príslušný akceptor môže tiež byť modifikovaný postupmi, ktoré sú v danej oblasti techniky bežne známe, napríklad konjugáciou s cytotoxickou zlúčeninou, ako drogou alebo rádionuklidom, čím vznikne cytotoxická molekula. Bio-oligomér, napríklad peptid, môže „zamerať“ účinok cytotoxickej zlúčeniny a špecificky sprostredkovať zničenie buniek, na ktoré sú viazané určité akceptorové molekuly. Je napríklad možné konjugovať cytotoxickú látku tak, aby došlo k odstráneniu nežiadúcich populácií B-buniek, napríklad v prípade lymfómu z B-buniek, populácie T-buniek alebo lymfómu z T-buniek u chorého. Potenciálna klinická aplikácia zahrnuje liečenie autoimunitných chorôb, lymfómov a špecifickú imunosupresívnu liečbu v prípade transplantácie orgánov. Týmto spôsobom by bolo pravdepodobne možné liečiť aj tie formy nádorov, pri ktorých nádorové bunky produkujú väzbový reťazec, schopný väzby na receptor, ako je tomu v prípade karcinómu mliečnej žľazy a vaječníkov, kde hrá svoju úlohu pravdepodobne receptor epidermálneho rastového faktora EFG.
Cytotoxické látky, špecifické pre cieľovú bunku, napríklad bunku zhubného nádoru alebo bunku, napadnutú vírusom, avšak nejedovaté pre okolité zdravé bunky, tkanivá alebo orgány by taktiež malo byť možné týmto spôsobom získať. Bude možné nielen cielene odstrániť nežiadúce bunky ako nádorové bunky, ale využiť niektoré toxíny tiež ako účinné antimikrobiálne látky. V tom prípade ide najmä o bakteriostatitá, bakteriocidné látky, protivirusové látky, antiparazitické látky alebo fúngicídne zlúčeniny. Podobne je možné identifikovať aj toxíny s insekticídnym alebo herbicídnym účinkom.
V jednom z možných uskutočnení môže byť bio-oligomérom peptid. Tento peptid môže byť látkou, napomáhajúcou zasiahnuť cieľ, ku ktorému je pripojený toxín. V inom možnom uskutočnení môže peptid splniť obe úlohy a účinkovať ako látka, zasahujúca cieľ aj ako toxín. V ďalšom uskutočnení môže byť bio-oligomérom oligonukletid, jeho vplyv môže byť vykonaný cez transkripciu alebo transláciu, podstatnú pre životnosť bunky.
Modifikátory imunity
Podľa vynálezu je možné získať molekuly a prostriedky na použitie na modifikáciu imunologickej odpovede: Pod týmto pojmom sa rozumejú molekuly alebo zlúčeniny, schopné spôsobiť zmeny v imunologickom systéme. Zvlášť môžu modifikátory imunity stimulovať alebo spôsobiť inhibíciu odpovede T-buniek, B-buniek a tiež nešpecifickej imunologickej odpovede tak, ako sú sprostredkované činnosťou makrofágov, neutrofilov, polymorfonukleámych fagocytámych buniek, granulocytov a iných buniek myeloidnej línie. Efektorové molekuly je možné použiť na ovplyvnenie nasledujúcich imunologických stavov:
a) rôzne autoimunologické ochorenia, ako je myasthenia gravis, roztrúsená skleróza, Graveho ochorenie, reumatoitná artritída, systemický lupus erythematosus (SLE), pemphigus vulgaris, autoimunologická hemolytická anémia a trombocytopénia,
b) lymfón iného ako Hodgkinovho typu a ďalšie zhubné ochorenia,
c) alergie,
d) komplex imunologických chorôb,
e) odmietnutie transplantovaných orgánov a
f) infekčné ochorenia a
g) diabetes mellitus.
Modifikátory imunologickej odpovede môžu stimulovať imunologickú aktivitu tak, že napodobňujú účinnosť lymfokínu ako interleukínu IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, faktora, stimulujúceho tvorbu kolónií granulocytov CSF alebo makrofágov a granulocytov/makrofágov a podobne. K stimulácii môže dôjsť účinnosťou peptidu, ktorý sa viaže na väzbový reťazec receptora lymfokínu alebo oligonukleotidom sprostredkovanú aktiváciu bunkového ústrojenstva na transkripciu. Modifikátor imunologickej odpovede môže pôsobiť väzbou na leukocyt alebo lymfocyt, ako F-receptor, LAF-1, LAF-2 a podobne, indukciou účinnosti, napríklad fagocytózy alebo uvoľnením cytotoxínov. Efcktorová molekula podľa vynálezu môže pôsobiť tiež ako chemotaxín.
V zvláštnom uskutočnení môže molekula, obsahujúca bio-oligomér napodobňovať antigén. Potom môže byť biooligomér vhodnou vakcínou na vyvolanie aktivity T-buniek alebo B-buniek, špecifickej pre určitý patogén. Antigén (epitop) je možné použiť aj na zosilnenie špecifickej imunologickej odpovede.
Je zrejmé, že efektorové molekuly podľa vynálezu budú účinné v uvoľnenej forme. Avšak určitý bio-oligomér môže mať vyšší účinok v prípade, že zostane viazaný na tuhý nosič. Najmä vysoká hustota napodobneného epitopu môže oveľa účinnejšie stimulovať odpoveď B-buniek svojou väzbou na imunoglobulin membrány alebo sprostredkovať inú odpoveď cez príslušný receptor.
Bude zrejme možné použiť aj obmedzené banky podľa vynálezu ako vakcíny v prípade patogénov, ktoré majú rôzne epitopy. Je napríklad známe, že primárna štruktúra (reťazec) VSG (variabilný povrchový glykoproteín) trypanozómy sa mení v priebehu infekcie s časom. Zmenou epitopu VSG unikne trypanozóma imunologickému rozpoznaniu. Podobne parazit vyvolávajúci maláriu má tú vlastnosť, že u neho dochádza k expresii rôznych antigénnych epitopov v rôznych jeho druhoch v rôznych fázach životného cyklu. Znamená to, že pomocou banky s obmedzenou diverzitou by bolo možné dosiahnuť imunizáciu proti variabilným antigénom, produkovaným parazitmi, vyvolávajúcimi maláriu a proti trypanozómam. Obmedzená banka môže mať svoje použitie ako vakcína v akomkoľvek prípade, keď je požadovaná imunita proti celej skupine antigénov.
Je pravdepodobné, že efektorové molekuly môžu tiež spôsobiť inhibíciu imunologickej odpovede tak, že
i) blokujú špecifickú imunologickú odpoveď na úrovni protilátky alebo receptora antigénu v T-bunke, ii) blokovaním receptora F alebo iného receptora, iii) väzbou na lymfokíny a cytokíny s následnou inhibíciou účinnosti týchto látok a iv) negatívnymi spätnými signálmi, privádzanými k bunkám, ktoré sprostredkujú imunologickú odpoveď.
Efektorové molekuly je možné použiť na dosiahnutie tolerancie imunologického systému napríklad pre autoimunné antigény. Napríklad toleranciu imunologického systému k DNA by bolo možné dosiahnuť pomocou oligonukleotidu alebo banky oligonukleotidov, tento postup by mohol byť úspešný pri liečbe SLE. Okrem toho by mohla byť dosiahnutá inhibícia imunitného systému opísaným spôsobom.
Okrem toho môžu farmaceutické prostriedky podľa vynálezu obsahovať vybrané syntetické peptidy s antigénnym účinkom, ktorým by bolo možné dosiahnuť toleranciu imunologického systému k určitému antigénu, a tak potlačiť alebo aj vyliečiť zodpovedajúce autoimunologické ochorenie. Podobne by bolo možné pri použití špecifických syntetických antigénnych peptidov, spôsobiť inhibíciu tvorby viaczložkových imunologických komplexov, a tým aj zabrániť vzniku zložitých imunologických ochorení.
Peptidy, schopné väzby na monoklonálne protilátky, špecifické pre nádory je možné izolovať, analyzovať ich reťazec a syntetizovať na použitie ako imunogény na indukciu aktívnej imunity proti nádoru.
Špecifické peptidy s vysokou afinitou vzhľadom na receptory Fc by mohli byť použité ako liečivá na blokovanie receptorov Fc retikuloendoteliálneho systému, čo by bolo priaznivé pre chorých s autoimunologickými chorobami, ako sú idiopatická trombocytopénia alebo autoimunologická hemolytická anémia.
Možnosti na použitie peptidov na liečebné účely by mohlo byť ešte širšie. Peptidy, napodobňujúce epitopy invadujúcich organizmov by mohli byť použité na zastavenie in fekcie organizmu. Napríklad súčasné výsledky štúdií s AIDS dokázali, že infekcia vírusom AIDS začína rozpoznaním a väzbou medzi špecifickým glykoproteínom (gpl 20) na obale vírusu AIDS a povrchovým receptorom CD4 bunky.
V prípade podania peptidu, napodobňujúceho gpl20 je možné dostatočným spôsobom blokovať receptor CD4, takže vírus AIDS sa na tento receptor nebude môcť viazať a nebude teda ani schopný infikovať bunku. Podobne by bolo možné dosiahnuť inhibíciu invázie parazitov a infekcií.
Neuroaktívne agonisty a antagonisty
Je pravdepodobné, že efektorové molekuly podľa vynálezu budú ogonizovať (alebo napodobňovať účinok) alebo antagonizovať (spôsobovať inhibíciu) účinky hormónov, nervových prenášačov, analgetík, anestetík, antipsychotík, antidepresívnych látok alebo narkotík. Takéto efektorové molekuly by mohli byť užitočné na získanie regulátorov chuti do jedla, psychiatrických liečiv, modulátorov schopnosti sa sústrediť a zapamätať si a podobne. Vynález je možné tiež využiť na modifikáciu vnímania určitých podnetov, bolo by napríklad možné navodiť pocity „sladkej“ alebo „slanej“ chuti a podobne.
Obmedzené banky
Ďalej je možné predpokladať, že obmedzené banky podľa vynálezu by mohli byť zdrojom komplexných chutí, napríklad typov rôznych koreni pri nižšej cene a bez prípadných alergických reakcií. Bolo by tiež možné nahradiť drahé korenia, napríklad šafran alebo vytvoriť nové kombinácie chuti.
V ďalšom uskutočnení môže byť obmedzená banka celkom zvláštnym chromatografickým materiálom. Je možné predpokladať, že banka bio-oligomérov, napríklad , peptidov s niektorými spoločnými chemickými vlastnos^ ťami, avšak s radom rôznych reťazcov bude vhodnejším, chromatografickým materiálom ako súčasne dostupné materiály. Tieto materiály napríklad budú selektívnejšie ako ionomeničové materiály alebo materiály v reverznej fáze. Čistenú molekulu by tiež bolo možné z nosiča vymyť ľahko a za šetrnejších podmienok, než aké je možné použiť pri uskutočňovaní imunoafinitnej chromatografie, čim súčasne bude menej pravdepodobná denaturácia čistenej látky.
V jednom z možných uskutočnení je možné pripraviť nosič na základe zloženia alebo štruktúry bio-oligoméru tak, aby došlo k požadovanému stupňu afinity alebo k väzbe na špecifické molekuly receptora vo vysokej koncentrácii. Okrem toho by bolo možné rýchlo identifikovať vysoko selektívny nosič bez použitia čisteného materiálu, ako bolo opísané.
V ďalšom možnom uskutočnení je možné pripraviť častice s nízkou afinitou a obmedzenú banku pripraviť s použitím určitých častíc nosiča. V ešte ďalšom možnom uskutočnení je možné na chromatografické účely použiť častice nosiča s nízkou alebo vysokou afinitou, nesúce jeden alebo niekoľko reťazcov bio-oligoméru, identifikovaných z miliónov reťazcov podľa vynálezu.
Vynález bude ďalej vysvetlený nasledujúcimi príkladmi, ktoré však nemajú slúžiť na obmedzenie rozsahu vynálezu opísané uskutočnenia.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Na obr. 1 je znázornená schéma syntézy peptidov s náhodným rozložením s použitím syntézy, prebiehajúcej v jednotlivých stupňoch, syntetizuje sa tripeptid s naviazaným terminálnym zvyškom tryptofánu: X-X-X-W (kde X znamená S, A alebo V), celkové množstvo možností je 33, t. j. 27.
Na obr. 2 je schematicky znázornený rad cyklických peptidov, n = 0,1, 2, 3.... a m = 1, 2, 3, pričom n a m môžu byť rovnaké, avšak nemusia. Plné čiary označujú väzby lineárneho peptidu, prerušené označujú priečne väzby. Páry špecifických podjednotiek, medzi ktorými môžu vznikať priečne väzby sú označené A a B. Zosietenie môže vznikať len medzi dvoma jednotkami A alebo len medzi dvoma jednotkami B. Na obr. 2a je znázornený takzvaný „košíkový“ motív, na obr. 2b motív „rebríka“ a na obr. 2c motív „lasa“.
Na obr. 3 sú znázornené chromatogramy (C18, reverzná fáza HPLC, Vydac) pre náhodné tetrapcptidy (X-X-X-W, kde X = S, A alebo V), syntetizované A) novým postupom a B) zvyčajnou syntézou peptidov na tuhej fáze. Chromatogram bol získaný elúciou stĺpca pri použití lineárneho gradientu acetonitrilu. Rozpúšťadlo A: 0,1 % kyselina trifluóroctová a 5 % acetonitril, rozpúšťadlo B: 0,1 % kyselina trifluóroctová a 100 % acetonitril.
Na obr. 4 je znázornená fotografia peptidu na časticiach nosiča (dlhé v-mos), označených protilátkou antimos a sekundárnou protilátkou.
Na obr. 5 je znázornená fotografia zmesi častíc nosiča (dlhé v-mos a krátke v-mos) po označení protilátkou anti-v-mos a sekundárnou protilátkou.
Na obr. 6 je znázornená podobná zmes ako na obr. 5, označená protilátkou proti v-mos a sekundárnou protilátkou.
Na obr. 7 je znázornená mikrofotografia typického peptidového ligandu v banke, v ktorej je možné pozitívny nosič (sfarbený takmer na modro) ľahko odlíšiť od pozadia, obsahujúceho mnoho tisíc negatívnych (bezfarebných) častíc nosiča.
Na obr. 8 je znázornená mikrofotografia, znázorňujúca na koncentrácii závislý inhibičný účinok biotínu na farbení častíc živice LHPQF kombináciou streptavidínu a alkalickej fosfatázy. A: 100 nM, B: 10 nM, C: 1 nM, D: 0,1 nM biotínu. Prázdne častice (živica + kyselina β-Ala-aminokaprónová) boli zmiešané 1:1 so živicou LHPQFD pred inkubáciou s kombináciou streptavidínu a alkalickej fosfatázy ako vnútorná kontrola.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Syntéza tetrapeptidovej banky
Spôsob podľa vynálezu bol použitý na prípravu tetrapeptidovej banky speptidmi vzorca X-X-X-Trp, kde X môže znamenať valín, serín alebo alanín, a prvou aminokyselinou je vždy tryptofán. Tryptofán bo zvolený pre karboxy-terminálne zakončenie na uľahčenie spektrofotometrického sledovania pri OD280.
N“lfa-Fmoc-tryptofán-alkoxymetylpolystyrénová živoca, opísaná v publikácii Wnag, 1973, J. Amer. Chem. 95: 1328 až 1333 (Bachem Inc., Torrence, Ca.) bola vložená do nádoby na bežné uskutočňovanie syntézy peptidov na tuhom nosiči. Na pridanie boli použité taktiež Fmocaminokyseliny (Bachem Inc.). Ďalšie reakčné zložky boli volené z bežných zložiek, zvyčajne používaných pri syntéze na tuhom nosiči tak, ako sú opísané napríklad v Austen, 1988, „Peptide Synthesis“, Methods in Moleculary Biology, zv. 3, str. 311 až331.
Pre väzbové reakcie bola použitá nádoba s vekom, potiahnutým teflonom a na miešanie jednotlivých podielov nosiča po uskutočnenej reakcii bola tiež použitá štandardná nádoba na uskutočňovanie syntézy na tuhom nosiči.
Približne 0,5 g Fmoc-Trp-alkoxymetylovej živice bolo napúčaných v 20 ml dichlórmetánu (DCM). Potom bola živica dvakrát premytá DCM, raz zmesou DCM a dimetylformamidu 1:1a trikrát dimetylformamidom (DMF). Potom bola živica zbavená ochranných skupín pôsobením 20 % piperidínu v DMF (objemové %). Po dôkladnom premytí živice, zbavenej ochranných skupín 3 x DMF, 3 x x DCM a 2 X zmesou DCM a DMF 1:1 bola živica znova uvedená do suspenzie v približne 7,5 ml DMF a rozdelená na tri podiely s približne 2,5 ml a potom rozdelená do troch očíslovaných skúmaviek na uskutočnenie ďalšej väzby.
Na živici už je naviazaný tryptofán, k materiálu sa teraz pridá množstvo chránenej aminokyseliny, zodpovedajúce množstvu viazaného tryptofánu. Pre každú aminokyselinu, ktorá má byť naviazaná sa použije päťnásobok molámeho prebytku aminokyseliny, ktorý sa pridá do nádoby, v ktorej sa už nachádza podiel premytej živice. Do každej nádoby sa pridá päťnásobný molárny prebytok inej aminokyseliny. Potom sa každá nádoba dve minúty pretrepáva, potom sa pridá päťnásobný molárny prebytok diizopropylkarbodiimidu (DIC) v 3 ml DCM, a potom sa zmes ešte 1 hodinu pretrepáva.
Aby bolo možné skontrolovať úplnosť väzby, bola vzorka z každej skúmavky skúšaná ninhydrínovým reakčným činidlom (Pierce Chemical) spôsobom, opísaným v Sarin a ďalší, 1981, Anál. Biochem. 117: 147 až 157. V prípade, že väzbová reakcia nie je celkom skončená, ako je možné týmto testom dokázať, pokračuje sa až do jej skončenia, čo je možné dosiahnuť niekoľkými známymi spôsobmi, napríklad
a) druhou väzbou pri použití jedno- až päťnásobného prebytku chránenej aminokyseliny,
b) ďalšou väzbou pri použití odlišných alebo prídavných rozpúšťadiel, napríklad trifluóretanolu alebo
c) pridaním chaotropických solí, napríklad NaC104 alebo LiBr (Klis a Stewart, 1990, „Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Riviér a Marshall eds. ESCOM Publ., str. 904 až 906.
Po dovŕšení väzby sa živice z troch skúmaviek, v ktorých bola väzba uskutočnená dôkladne prenesú a zmiešajú v jedinej miešacej nádobe. Potom sa živica dvakrát premyje DCM/DMF (1 : 1), 3 x DCM, 3 x DMF a potom sa odstránia ochranné skupiny pôsobením 20 % piperidínu v DMF (% objemové). Po dôkladnom premytí DCM a DMF uvedeným spôsobom sa zmes opäť rozdelí na tri podiely a tieto podiely sa prenesú do troch oddelených reakčných nádob. Potom sa pridá druhá skupina aminokyselín. Po skončení väzby sa opäť najskôr odstránia ochranné skupiny pôsobením 20 % piperidínu, potom sa živica dôkladne premyje DCM a DMF tak, ako bolo opísané. Potom sa rovnakým spôsobom uskutoční väzba tretej aminokyseliny.
Na odštiepenie peptidu z tuhého nosiča sa k časticiam živice pridá 30 ml 50 % (% objemové) kyseliny trifluóroctovej TFY, 5 % anizolu a 0,9 % (objemových) etánditiolu v DCM. Potom sa zmes štyri hodiny pretrepáva a supematant s obsahom peptidu sa oddelí. Potom sa supematant odparí na rotačnom odpaľovači a peptidy sa vyzrážajú éterom. Po dôkladnom premytí sa zrazenina peptidov suší a je pripravená na ďalšiu analýzu. Lyofilizovaný peptid (vo forme prášku) sa skladuje v zmrazenom stave.
Príklad 2
Porovnanie spôsobu podľa vynálezu s bežnou metódou syntézy peptidov
Materiály a metódy
Banka náhodných tetrapetidov bola pripravená opísaným spôsobom (príklad 1). Okrem toho bola pripravená
SK 281490 Β6 banka tetrapeptidov pri použití syntézy bežného typu na tuhom nosiči (ďalej SPPS) tak, ako bola opísaná vo uvedenej publikácii Austenovej. Ako kombinácia tuhého nosiča a aminokyseliny bola použitá Nalfa-Fmoc-tryptofán-alkoxymetylová živica (Bachem, Inc.). V priebehu každého stupňa väzby bolo do reakčnej nádoby pridané päťnásobné moláme množstvo N”lfa-Fmoc-valínu, Nalfa-Fmoc-serínu (O-Bu) a Nalfa-Fmoc-alanínu. Po troch po sebe nasledujúcich stupňoch väzby boli tetrapeptidy odštiepené pôsobením 50 % TFA, 5 % anizolu a 0,9 % etánditiolu (ide vždy o % objemové) v DCM spôsobom podľa uvedenej Austenovej publikácie.
Výsledky
Obe peptidové banky boli analyzované na HPLC chromatografickom stĺpci C-18 v reverznej fáze (Vydac), aby bolo možné dokázať počet rôznych peptidov v banke (počet vrcholov), relatívnu koncentráciu týchto peptidov (plocha vrcholov) a relatívnu hydrofilnú povahu peptidov (včasná alebo neskorá elúcia zo stĺpca). Výsledky sú znázornené na obr. 1. Chromatogram v homej časti (obr. IA) bol získaný pri použití banky peptidov podľa vynálezu, druhý chromatogram v spodnej časti (obr. 1B) bol získaný pri použití SPPS.
V oboch častiach je možné odlíšiť 21 vrcholov, čo ukazuje na prítomnosť aspoň 21 odlišných peptidov v každej banke. Avšak v chromatograme, získanom pri použití SPPS sú podstatne väčšie vrcholy 1, 2, 3, 4, 5, 6 a 7, čo znamená že banka obsahovala väčšiu koncentráciu peptidov 1 až 7 ako peptidov 8 až 21. Zvýšené množstvo peptidov 1 až 7 dokazuje, že tieto peptidy boli výhodne syntetizované na úkor peptidov 8 až 21. Okrem toho dochádzalo pri týchto vrcholoch k včasnej elúcii zo stĺpca, to znamená, že uvedené peptidy mali kratší čas retencie v stĺpci a mali teda hydrofilnejšiu povahu ako ostatné peptidy 8 až 21.
Tento výsledok nebol pri použití systému SPPS neočakávaný. Je známe, že valín je hydrofóbny a má podstatne pomalšiu rýchlosť väzby (zrejme vplyvom stérickej zábrany), ako je rýchlosť väzby alanínu alebo serínu. To znamená že pri bežnej náhodnej väzbe uvedeným spôsobom, pri ktorej sa valín dostáva do „kompetície“ pri väzbe spoločne s alanínom a serínom musí dôjsť k tomu, že syntetizované peptidy sú na valín chudobné a že teda v získanej banke nie je distribúcia náhodných peptidov ekvimolárna.
Na druhej strane je z chromatogramu banky náhodných peptidov, získanej spôsobom podľa vynálezu zrejmá ekvimoláma distribúcia peptidov v banke. Aj napriek tomu, že plocha vrcholov 3, 6, 12, 13 a 18 je približne dvojnásobná ako plocha vrcholov ostatných, čo ukazuje na prítomnosť dvoch peptidov na tomto mieste, väčšina zo zvyšných 16 vrcholov má takmer totožnú plochu. Okrem toho všetkých 21 vrcholov je rovnomerne rozložených po celkovej dobe retencie, čo taktiež dokazuje ekvimolámu ditribúciu jedotlivých peptidov.
Pri vybraných vrcholoch bol analyzovaný reťazec. Analýza reťazca bola uskutočnená pri menších vrcholoch 8, 9 a 21 a veľkom vrchole 6. Na analýzu bolo použité automatické zariadenie (Applied Biosystems 477A) s nasledujúcim výsledkom: vrchol 8: Val-Ala-Ser-Trp vrchol 9: Val-Ser-Ala-Trp vrchol 21: Val-Val-Val-Trp vrchol 6: (Ser-Val)-(Ser-Ala)-(Ser-Ala)-Trp
Tieto valín obsahujúce reťazce potvrdzujú, že spôsob podľa vynálezu umožňuje uskutočnenie skutočne náhodnej syntézy peptidov aj v prípade použitia aminokyselín, o ktorých je známe, že ich rýchlosť väzby je nízka.
Reťazec pre vrchol 6 nie je vyčerpávajúcim spôsobom uvedený vzhľadom na to, že vo vrchole sa nachádzalo pravdepodobne väčšie množstvo peptidov. Reťazce dvoch hlavných peptidov však zrejme sú Ser-Ala-Ala-Trp a Val-Ser-Ser-Trp.
Závery
Výsledky ukazujú, že spôsobom syntézy náhodných peptidov podľa vynálezu je možné získať banku náhodných peptidov v podstate s ekvimolámym množstvom jednotlivých peptidov na rozdiel od štandardného postupu SPPS, pri ktorom prevažuje v banke ten peptid, ktorý obsahuje zvyšky aminokyselín s vyššou rýchlosťou väzby.
Príklad 3
Izolácia peptidu ako väzbového reťazca, ktorý sa viaže na molekulu receptora
Aby bolo možné dokázať použiteľnosť spôsobu podľa vynálezu na izoláciu určitého peptidu, bol syntetizovaný peptid, obsahujúci 12 aminokyselín s vopred stanoveným reťazcom produktu génu V-mos. V-mos je onkogén, izolovaný z myšieho sarkómu a je príbuzný vírusu Moloneyovho sarkómu u myší. Je známe, že produkt génu V-mos má aktivitu serín/treonín-kinázy.
Materiály a metódy
Reťazec Leu-Gly-Ser-Gly-Gly-Phe-Ser-V al-Tyr-Lys-Ala bol syntetizovaný na polyakrylamidovej častici s priemerom približne 300 pm pri použití Nalfa-Fmocaminokyseliny a reakčných činidiel s postupmi, používaný pri bežnej syntéze peptidov na tuhom nosiči. Ochranné skupiny na bočnom reťazci boli odstránené 50 % TFA, peptid zostal kovalentne viazaný na polyakrylamidovú živicu pred väzbový reťazec, etyléndiamín-kyseliny amino— kaprónovej, čím bola získaná konečná štruktúra Leu-GlySer-Gly-Gly-Phe-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala-aminokaprónováikyselina-etyléndiamínová živica (ďalej bude tento materiál uvádzaný ako dlhá v-mos-častica). Tento reťazec peptidu zodpovedá zvyškom 100 až 111 v produkte génu v-mos.
Pri použití tej istej metódy bol syntetizovaný kratší peptid zo zvyškov 106 až 111 produktu génu v-mos s reťazcom Gly-Ser-Val-Tyr-Lys-Ala, taktiež na polyamidovej častici pri použití toho istého väzbového reťazca (krátka v-mos-častica). Tento peptid bol použitý ako negatívna kontrola.
Bunková línia hybridómu, produkujúca myšiu monoklonálnu protilátku, špecifickú pre dlhý v-mos-peptid, známu ako anti-v-mos (hybridom č. 165-28E7, SCRF 354, šarža č. 165-119) bola získaná od Microbiological Associates Inc., Maryland. Pri skúške Elisa deteguje táto protilátka homológny reťazec produktov génu v-mos, a to MOS,neu/HER-l a HER-2. Je známe, že uvedená protilátka má len zanedbateľnú afinitu pre krátky peptid v-mos. Sekundárna kozia protilátka proti IgG myši (špecifická pre ľahký a ťažký reťazec), označená alkalickou fosfatázou, bola získaná od Sigma.
Pri použití bežnej techniky na získanie monoklonálnych protilátok podľa publikácie Methods in Enzymology, zv. 121 (1986) boli získané monoklonálne protilátky vo forme ascitu a boli potom čistené na stĺpci G pre bielkoviny (Pharmacia).
Výsledky
Dlhé v-mos-častice boli zmiešané s tisícnásobným prebytkom krátkych v-mos-častíc. 2 ml čistenej monoklonálnej protilátky anti-v-mos (1 pg/ml) v PBS s 0,1 % Tween bolo pridaných k zmesi krátkych a dlhých častíc v-mos a zmes bola inkubovaná pri teplote miestnosti 1 hodinu za slabého miešania. Potom boli častice premyté na malom polypropylénovom stĺpci na jedno použitie (Isolab), v ktorom boli častice zachytené fritou. Potom boli častice zmiešané s 2 ml sekundárnej protilátky na 1 hodinu pri riedení 1:2000. Po premytí boli častice uložené do polystyrénovej Petriho misky a po usadení bol supematant odstránený a ako substrát bol opatrne pridaný roztok 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfátu a tetrazóliumnitro-modrej.
Po inkubácii zmesou 15 minút pri teplote miestnosti sa dlhé v-mos-častice sfarbili purpurovo na rozdiel od krátkych častíc, ktoré zostali bezfarebné. Týmto spôsobom bolo možné okamžite zistiť jedinú tmavú časticu medzi tisícimi bezfarebnými časticami. Možnosť odlíšenia je zreteľne znázornená na obr. 2 až 4, ide o fotografie zväčšené 40 x. Na obr. 2 sú znázornené skupiny dlhých v-mos-častíc, označené monoklonálnou protilátkou, na obr. 3 je znázornená zmes dlhých a krátkych v-mos-častíc, označených monoklonálnou protilátkou anti-v-mos a na obr. 4 je znázornená rýchla detekcia jedinej modrej častice vo veľkej skupine bezfarebných častíc. Častice, ktoré obsahovali hľadaný reťazec peptidu boli teda ihneď odlíšené a izolované od ďalších častíc v banke.
Po izolácii bol použitý automatický analyzátor Applied Biosystems 477A na stanovenie N-terminálneho reťazca aminokyselín z jedinej dlhej v-mos-častice.
Závery
Uvedený príklad dokazuje, že spôsobom podľa vynálezu je skutočne možné vyhľadať časticu, obsahujúci biooligomérový väzbový reťazec, v tomto prípade peptidový reťazec, v tisícnásobnom prebytku iných odlišných častíc. Okrem toho je z uvedeného príkladu zrejmé, že je možné túto časticu izolovať a analyzovať reťazec naviazaného peptidu.
Príklad 4
Izolácia kratšieho peptidového väzbového reťazca, ktorý sa viaže na molekulu receptora
Aby bolo možné ďalej dokázať použitie spôsobu podľa vynálezu na izoláciu určitého peptidu, bol syntetizovaný hexapeptid Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr na štandardnú živicu PAM s veľkosťou častíc 100 pm pri použití N^-Fmocaminokyselín a ďalších reakčných činidiel, bežne používaných pri syntéze na tuhom nosiči.
Materiály a metódy
Väzbové reakcie boli uskutočňované spôsobom, ktorý bol uvedený v príklade 3. Ochranné skupiny na alfaaminoskupine boli odstránené pôsobením 20 % piperidínu, ochranné skupiny na bočnom reťazci boli odštiepené 50 % TFA a peptid zostal kovalentne viazaný na polystyrénovú živicu cez väzbový reťazec kyselina aminokaprónová-betaalanín, čím bola získaná štruktúra Gly-Phe-Gly-Ser-Val-Tyr-kyselina aminokaprónová-beta-alanín-živica. Tento peptidový reťazec zodpovedá zvyškom 104 až 109 produktu génu v-mos tak, ako bolo opísané v príklade 3.
Rovnako ako v príklade 3 boli získané protilátky antiv-mos z bunkovej línie hybridomu, produkujúcej myšie monoklonálne protilátky, špecifické proti peptidu v-mos. Označená sekundárna kozia protilátka proti myšiemu IgG, označená alkalickou fosfatázou, bola získaná od Sigma.
Výsledky
Približne 0,1 mg peptidu v-mos, viazaného na živicu PAM bolo zmiešaných so stonásobným prebytkom častíc N^-Fmoc-alanín-PAM (Bachem Inc.). 2 ml čistenej monoklonálnej protilátky (1 pg/ml) v PBS s 0,1 % Tween 20 bolo pridaných k zmesi peptidu na nosiči a inkubovaného 45 minút pri teplote miestnosti za slabého miešania.
Potom boli častice premyté na malom polypropylénovom stĺpci na jedno použitie (Isolab), v ktorom boli častice zachytené na frite. Potom boli častice zmiešané s 2 ml sekundárnej, alkalickou fosfatázou označenej protilátky (riedenie 1 : 100) na 1 hodinu. Po premytí boli častice rozložené na sklenený filter a namočené do 2,2'-azinobis(3-etylbenztiazolínsulfónovej kyseliny) ABTS ako substrátu spolu s H2O2. Po inkubácii 15 minút pri teplote miestnosti sa komplex živice PAM a v-mos-peptidu sfarbil na tmavozeleno. Na sklenenom filtri sa vytvoril malý svetlejší zelený lem. Väčšina tuhého nosiča, neobsahujúceho v-mospeptid nereagovala s monoklonálnou protilátkou a nedošlo teda k zmene farby. Častice nosiča s v-mos-peptidom bolo preto možné ľahko identifikovať.
Závery
Tento príklad dokazuje, že hľadaná molekula akceptora nereaguje nešpecifický s tuhým nosičom, ale reaguje špecificky na kombináciu tuhého nosiča a peptidu. Rovnako ako je uvedené v príklade 3 je možné izolovať pozitívne reagujúce častice nosiča a analyzovať reťazec peptidu.
Príklad 5
Stanovenie väzbových reťazcov pre streptavidín a monoklonálnu protilátku proti β-endorfinu
V tomto príklade je ďalej ilustrovaný špecifický prístup vynálezu na identifikáciu peptidového väzbového reťazca. Namiesto využívania biologického systému, napríklad filamentózneho fágu sa na tvorbu banky využíva chemická syntéza veľkých peptidových bánk, v ktorých je každý peptid viazaný na jednotlivú časticu nosiča. Jednotlivé častice nosiča, špecifický viazané na peptid sa potom fyzikálne izolujú a analyzuje sa reťazec naviazaného peptidu.
Prístup závisí od schopnosti chemicky syntetizovať veľkú banku náhodných peptidov a spojiť ju s príslušnou izoláciou na detekciu a so systémom na analýzu štruktúry.
Prostriedkom, ktorý vynález používa na vyriešenie tohto problému je rozdelenie Častíc nosiča na skupiny jednotlivých podielov v priebehu každého väzbového cyklu, pričom každý podiel nosiča sa nechá reagovať s jedinou aktivovanou aminokyselinou. Po dovŕšení väzby sa rôzne podiely živice dôkladne premiešajú, premyjú, odstránia sa ochranné skupiny a po ďalšom premytí sa živica znova rozdelí na podiely pre nový cyklus väzby. Znamená to, že v jednom cykle nie je žiadna častica podrobená pôsobeniu viac než jednej aminokyseline a na konci niekoľkých takýchto stupňov bude každá častica obsahovať len jediný peptidový reťazec. Pcptidová banka, vytvorená uvedeným spôsobom bude teoreticky tvorená skutočne náhodnými peptidmi. Okrem toho bude obsahovať ekvimoláme množstvo všetkých peptidov. Celkové množstvo permutácií, a tým aj výsledné množstvo peptidov bude závisieť od počtu podielov a aminokyselín, zvolených pre každý väzbový stupeň a od celkového množstva väzbových stupňov pri syntéze (dĺžka peptidu).
Nový prístup pre súčasnú syntézu veľkého množstva peptidov súčasne nielen poskytuje možnosť získať banku skutočne náhodných peptidov v ekvimolámom množstve, ale vedie aj k získaniu banky peptidov na časticiach tuhého nosiča, kde každá častica nesie len jediný reťazec peptidu. Táto posledná vlastnosť je celkom zaistená tým, že sa pri každej väzbovej reakcii dostáva častica do styku s jedinou aminokyselinou, pričom reakcia je vždy dotiahnutá do konca. Toto pojatie reakcie má zásadný význam pre úspech nového postupu.
Pomocou nového syntetického spôsobu podľa vynálezu je možné syntetizovať prakticky akúkoľvek peptidovú banku s presne definovaným zložením. Je naprildad možné použiť až všetkých 20 prírodných L-aminokyselín v každom väzbovom stupni, každú pre iný podiel častíc, alebo je možné v každom stupni použiť len niekoľko aminokyselín.
Materiály a metódy
Syntéza peptidovej banky
Bola syntetizovaná veľká banka so štruktúrou X-X-XΧ-Χ-β-Ala-kyselina aminokaprónová-etyléndiamín-živica (X = 19 z 20 bežných aminokyselín s výnimkou cysteínu v každom väzbovom stupni. Častice tuhého nosiča, zvoleného na syntézu peptidov, boli častice polydimetylakrylamidu, t. j. PDA (Milligen Inc., USA).
Syntéza peptidov pri použití tejto živice bola uskutočnená spôsobom podľa publikácie Atherton a Sheppard, 1988, Solid Phase Peptid Synthesis, A Practical Approach, IRL Press. Postup bol uskutočnený tak, že vždy 3 g živice (približne 2 milióny častíc) boli šetrne miešané cez noc s etyléndiamínom. Po dôkladnom premytí bola na živicu naviazaná kyselina aminokaprónová a potom β-alanín pri použití Fmoc-ochranných skupín, avšak bez odštiepiteľného väzbového reťazca. V piatich nasledujúcich stupňoch bola syntéza uskutočnená náhodne a oddelene bolo v každom väzbovom stupni použitých všetkých 19 Fmocaminokyselín-OPfp s výnimkou cysteínu. Po ukončení piatich väzbových stupňov bola ochranná skupina Fmoc odstránená 20 % roztokom piperidinu (% objemové) v DMF. Ochranné skupiny na bočnom reťazci boli odstránené zmesou 90 % TFA, 1 % anizolu a 0,9 % etánditioíu (% objemové). Živica bola neutralizovaná 10 % diizopropyletylamínom v DMF a uložená v DMF pri teplote 4 °C,
Spojovník β-alanín-kyselina aminokaprónová-etyléndiamín je tvorený celkom 11 atómami uhlíka a 4 atómami dusíka a jeho najväčšia dĺžka je 17,6 x 10'10 m. Vzhľadom na to, že v každom väzbovom stupni bolo použitých 19 rôznych aminokyselín, je teoretické množstvo získaných peptidov pri piatich väzbových stupňoch 195, t. j. 2 476 099 peptidov v banke.
Ako už bolo uvedené, všeobecne postup spočíva v tom, že sa vytvorí veľká banka náhodných peptidov na jednotlivých časticiach tuhého nosiča tak, že každá častica obsahuje len jeden typ peptidu. Potom je možné ľahko identifikovať časticu, reagujúcu s molekulou akceptora, fyzikálne ju izolovať a analyzovať reťazec aminokyselín v peptide pomocou Edmanovej degradácie. Pre úspech postupu je teda nutná presná identifikácia peptidového reťazca na jedinej častici nosiča. Pri použití automatického analyzátora bielkovín (Model 477A-01 Pulsed Liquid Automatic Protein/Peptide Sequencer, Applied Biosystems, Foster City, Califomia) bolo bežne izolovaných 50 až 500 pmol peptidu z každej častice nosiča. Okrem toho bolo predbežnou analýzou (MiMarch a ďalší, 1990, Peptides: Chemistry, Structure and biology“ Proceeding of the Eleventh Američan Peptide Symposium, 9.-14. Júla 1988, La Jolia, Ca., ESCOM, Leiden, str. 229 až 230) dokázané, že účinnosť väzby peptidu na tuhý nosič pri syntéze bola vyššia ako 98 %.
Špecifická identifikácia a selekcia peptidových väzbových reťazcov z banky
Identifikáciu a selekciu špecifických peptidových väzbových reťazcov z banky náhodných peptidov j c možné ľahko uskutočniť imunologickými postupmi, napríklad skúškou ELISA, imunofluorescenciou alebo pri použití imunomagnetických častíc. Pri opísaných pokusoch boli pri detekcii použité imunohistochemické metódy. Špecificky sa viažucimi molekulami akceptora, ktoré boli pri týchto skúškach použité, boli
i) streptavidín, t. j. bielkovina, ktorá viaže biotín a ii) monoklonálna protilátka proti endorfinu Mab,
Pri použití bánk sepitopmi z filamentóznych fágov (Cwirla a ďalší, Devlin a ďalší, oddiel 2 vyššie) bolo možné peptidové väzbové reťazce ľahko identifikovať.
Pri detekcii častíc, na ktoré sa viaže streptavidín boli použité imunohistochemické postupy. Banka náhodných peptidov bola šetrne premiešaná s postupne sa zvyšujúcim množstvom bidestilovanej vody na zriedenie DMF. Potom boli častice dôkladne premyté PBS a na blokovanie akejkoľvek nešpecifickej väzby bola použitá želatína v koncentrácii 0,1 % hmotnostných. Potom bol k časticiam za hodinového šetrného miešania pridaný konjugát streptavidínu a alkalickej fosfatázy (Pierce, Rockford, Illinois). Potom boli častice dôkladne premyté a potom bol pridaný štandardný substrát, 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfát/tetrazóliovánitro-modrá (BCIP/NBT). Potom boli častice spolu s roztokom substrátu prenesené do polystyrénových Petriho misiek (15 misiek s rozmermi 100 x 20 nm) a reakcia sa nechala prebiehať 2 hodiny. Častice nosiča s naviazaným konjugátom streptavidínu a alkalickej fosfatázy zmenili farbu na tmavomodrú, zatiaľ čo väčšina častíc banky zostala bezfarebná.
Stanovenie afinity peptidového väzbového reťazca
Afinita peptidového väzbového reťazca pre monoklonálnu protilátku proti β-endorfinu bola stanovená v roztoku v kvapalnej fáze. Pri tejto skúške bola meraná inhibícia väzby 5,0 nM 3H-(Leu)enkefalínu (špecifická aktivita 39,0 Ci/mmol, New England Nuclear, Boston, Ma) na 125 až. 200 ng/ml Mab proti β-endorfinu pôsobením peptidového; väzbového reťazca v 1,0 ml 40 mM tris-HCl, 150 mM Na·*.-. Cl, pH 7,4 s obsahom 1,0 mg/ml albumínu zo séra hovädzieho dobytka, 0,1 % objemových Tween 20 a 0,05 % hmotnostných azidu sodíka. Špecifická väzba bola definovaná ako rozdiel medzi väzbou, nameranou v prítomnosti alebo v neprítomnosti 1,0 μΜ neoznačeného (Leu)enkefalínu. Naviazaný rádioaktívny väzbový reťazec bol vyzrážaný pridaním 10-násobného prebytku Protein-G-Sepharosy (Pharmacia) s následnou inkubáciou cez noc pri teplote 23 až 24 °C. Proteín-G-Sepharosa bola oddelená odstredením (13 000 x g na 5 minút), usadenina bola uvedená do suspenzie v 250 μί 5 % (objemové %) kyseliny octovej pred prenesením do fľaštičiek pre kvapalinovú scintiláciu. Hodnoty Kd (n=3) boli stanovené analýzou nasýtenia pri použití piatich koncentrácií rádioaktívneho väzbového reťazca (1,87 až 30 nM) pre 3H(Leu)enkefaIín, všetky skúšky boli uskutočnené dvakrát pri súčasnom uskutočnení nešpecifickej väzby ako kontroly. Priemerná hodnota Kd bola 9,79 až 4,63 nM. Krivky pre inhibíciu peptidového väzbového reťazca boli získané pre 8 koncentrácií peptidu. Údaje, získané pri skúškach na nasýtenie a inhibíciu boli analyzované váženou nelineárnou regresiou pri použití príslušných modelov podľa publikácie Knapp a ďalší, 1990. J. Pharmacol. Exp. Ther. 255: 1278 až 1282. Hodnoty Ki pre inhibičné väzbové konštanty boli vypočítané postupom podľa Cheng a Prusoff, 1973, Biochem. Pharmacol. 22: 3099 až 3102. Každá hodnota Ki bola vypočítaná z troch až štyroch nezávislých stanovení.
Výsledky
Bola analyzovaná banka náhodných syntetických peptidov vzorca X-X-X-X-X-živica, v ktorej X = všetkých 19 bežných aminokyselín (nebol použitý cysteín), celkom išlo o možný počet 195 - 2 476 099 permutácií. V podiele ban ky, na ktorom bola analýza uskutočnená sa nachádzalo približne 2 000 000 častíc nosiča. V prvom stupni, v ktorom bol použitý konjugát streptavidínu a alkalickej fosfatázy (odsek vyššie) došlo k zafarbeniu približne 75 častíc s rôznou intenzitou sfarbenia a tieto častice boli fyzikálne oddelené pod mikroskopom pomocou mikromanipulátora. Každá častica bola premytá v 8M guanidínhydrochloride na odstránenie viazaného streptavidínového konjugátu s enzýmom. Potom bola každá častica jednotlivo uložená na sklenený filter analyzátora Applied Biosystem Protein Sequencer (ABI). Reťazce 28 až 75 častíc sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 1. Všetky častice mali buď spoločný reťazec HPQ alebo HPM. Z mikrogotografie na obr. 5 je zrejmé, že tmavú časticu je možné ľahko identifikovať na pozadí mnohotisícich bezfarebných častíc v priebehu analýzy.
Tabuľka 1
Peptidové reťazce jednotlivých častíc nosiča, reagujúcich so streptavidínoma)
HPQFV(b0,8,cH20) GHPQG (0,44 250) PLHPQ (2,5 48)
HPQGP (0,36, 60) MYHPQ AIHPQ
HPQAG (1,5,53) REHPQ (0,56,112) AAHPQ (0,9,476)
LHPQF (0,47, 286) IQHPQ (1,8,192) dTPHPQ (0,158)
FHPQG (0,23,72) GNHPQ (0,222) WNHPM (2,5, 59)
GHPQN (0,5,44) TVHPQ (0, 96) WTHPM (1,4,202)
THPQN (0,5,44) IGHPQ VHPMA(0,6,21)
QHPQG (2,3, 60) WMHPQ (2,7,257) dMHPMA (0,31,140)
IHPQG (2,1, 57) GAHPQ
a) tieto väzbové reťazce boli identifikované v banke peptidov, obsahujúcej 195, t. j. 2 476 099 peptidov
b) prvé číslo v zátvorkách udáva predpoveď pre Edmanovu degradáciu v stupni 5 (t. j. množstvo zvyšku 5 cyklu 4/množstvo zvyšku 5 v cykle 5)
c) druhé číslo v zátvorkách znamená množstvo peptidu v pmol, izolovaného v priebehu analýzy reťazca
d) boli identifikované dva reťazce TPHPQ a dva reťazce MHPMA, nebolo možné dokázať žiadne ďalšie opakovanie
Aby bolo možné dokázať, že všetky reťazce, v ktorých sa opakuje HPQ sa skutočne viažu na miesto pre väzbu biotínu v streptavidine, bol syntetizovaný reťazec LHPQF-beta-Ala-kyselina aminokaprónová-etyléndiamín-živica (LHPQF-živica). Tento materiál bol potom zmiešaný skonjugátom streptavidínu a alkalickej fosfatázy za prítomnosti rôznych koncentrácií biotínu. Výsledky sú znázornené na obr. 6. Biotín v koncentrácii 100 nM úplne blokoval zafarbenie LHPQF-živice. V koncentrácii 10 a 1,0 nM biotín spôsobil čiastočnú inhibíciu sfarbenia a pri koncentrácii 0,1 nM nemal na zafarbenie žiadny účinok. Tento pokus jasne ukazuje väzbu reťazca HPQ na miesto pre väzbu biotínu v molekule streptavidínu.
Pred použitím tej istej banky náhodných peptidov na dôkaz väzby na protilátku anti-beta-endorfin-Mab, boli z banky odstránené všetky modré častice, sfarbené v predchádzajúcej skúške s konjugátom streptavidínu a alkalickej fosfatázy. Zvyšné častice nosiča boli potom spracované pôsobením 8M guanidín-hydrochloridu na odstránenie akejkoľvek väzbovej bielkoviny. Potom bola banka zmiešaná s biotinylovou anti-beta-endorfin-Mab (anti-beta-endorfin, kloň 3-E7 bol získaný od Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) na 16 hodín. Po dôkladnom premytí bol použitý sekundárny stupeň s konjugátom streptavidínu a alkalickej fosfatázy na zistenie farebnej reakcie. Týmto spôsobom bolo identifikovaných šesť peptidov s reťazcom, príbuzným natívnemu väzbovému reťazcu, Leu-enkefalínu YGGFL, a to: YGGMV, YGGLQ, YGGLS, YGGFA, YGGFT a YGGFQ. Boli syntetizované peptidové analógy týchto väzbových reťazcov s rôznym karboxy-terminálnym zakončením a bola stanovená ich afinita (Ki) pri použití 3Hleu-enkefalínu (New England Nuclear, Boston, Massachusetts) ako označeného väzbového reťazca a neoznačených peptidov v kompetícii s týmto reťazcom (ako bolo opísané v tomto príklade). Výsledky týchto štúdií sú zhrnuté v nasledujúcej tabuľke 2.
Tabuľka 2
Afinita peptidových väzbových reťazcov k monoklonálnej protilátke proti beta-endorfínu
Peptid Ki v nM, karboxyterminálne zakončenie
-OH -,nh2 -βΑ-ΟΗ -βΑ-NHj
YGGFĽ 17,5 ±3,2 27,9 ±2,3 17,1 ±1,8 13,7 ±1,7
YGGFA 32,0 ±2,0 72,0 ±16,4 82,3 ±8,8 93,6 ±34,7
YGGFT 36,9 ±7,7 65,2 ±16,8 50,6 ±8,9 43,3 ±2,3
YGGFQ 15,0 ±1,7 40,1 ±6,0 39,4 ±2,3 45,4 ±11,6
YGGLS 726±134 991 ±52 916±182 1150 ±247
YGGLQ 1980 ±303 2910 ±695 1470 ±120 1910±504
YGGMV 8780±1500 14000±1110 5140 ±885 7160±1010
a) YGGL je (Leu)enkefalín, prírodná väzbová látka pre anti-p-endorfín Mab
Diskusia
Možnosť syntetizovať určité peptidy len na jednotlivých časticiach nosiča spolu s citlivou a špecifickou detekciou je podstatou úspešnosti spôsobu podľa vynálezu. Ide o postup, pri ktorom je možné selektívne izolovať jedinú časticu nosiča z banky a po pôsobení 8M guanidínhydrochloridu na odstránenie väzbových bielkovín ju účinne čistiť, pričom peptid zostáva kovalentne viazaný na živici a je pripravený na analýzu reťazca. Súčasné automatické analyzátory peptidov sú schopné uskutočniť analýzu peptidu v koncentráciách len 5 až 10 pmol. Okrem toho modrá farba, ktorá sa ireverzibilné viaže na časticu nosiča, neinterferuje s analýzou reťazca peptidu. V priebehu každého cyklu náhodnej väzby boli vyvinuté všetky snahy na optimalizáciu spôsobu syntézy vrátane použitia veľkých prebytkov NalfaFmoc-aminokyselín. Podľa dosiahnutých výsledkov je celkom zrejmé, že účinnosť syntetickej reakcie v jednotlivých stupňoch náhodnej väzby bola vyššia ako 98 %.
Vzhľadom na to, že sfarbené častice je možné ľahko spozorovať na bezfarebnom pozadí (napríklad na obr. 7), je veľmi ľahké vizuálne skontrolovať 2 milióny častíc v mikroskope v sérii 10 až 15 Petriho misiek a oddeliť reaktívne častice pre analýzu reťazca. Okrem toho je možné stanoviť relatívnu afinitu rôznych väzbových reťazcov tak, že sa sleduje relatívna intenzita sfarbenia každej pozitívnej častice. Táto vlastnosť umožní izolovať častice so špecifickým sfarbením pre analýzu reťazca.
Devlin a ďalší (1990, Science 259: 404 až 406, oddiel 2) opísali dôležitosť reťazcov HPQ, HMP a HPN v 20 väzbových reťazcoch pre streptavidín, ktoré izolovali pomocou fágov. Z 20 izolovaných reťazcov ich 15 obsahovalo HPQ, 4 obsahovali HPM a jeden HPN. Bolo zaujímavé, že analýzou banky bolo získaných 28 rôznych peptidov, z ktorých 23 obsahovalo reťazec HPQ a 5 reťazec HPM (Tabuľka 1). Je tiež zrejmé, že poloha HPQ/HPM v pentapeptide nebola pre väzbu streptavidínu dôležitá. Zo všetkých identifikovaných pentapeptidových reťazcov s obsahom HPQ alebo HPM sa len dva opakovali (TPHQ a MHPMA). Táto skutočnosť je v ostrom kontraste s údajmi Devlina a ďalších, v materiáli ktorých sa rad reťazcov opakoval v 20 izolátoch, problém spočíva zrejme vtom, že biosyntetický postup nebol skutočne náhodný, takže dochádzalo k selekcii aminokyseín.
SK 281490 Β6
V anti β-endorfinovom systéme má 6 peptidov veľmi podobný reťazec s reťazcom prírodného YGGFL (Tabuľka
2). Tieto výsledky sú podobné tým, ktoré boli získané pomocou filamentóznych fágov pri použití tej istej monoklonálnej protilátky (kloň 3-E7) podľa Cwirla a ďalší, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378 až 6382). Aj napriek tomu, že analýzou peptidovej banky bol získaný menší počet reťazcov ako podľa publikácie, 50 % získaných reťazcov malo k protilátke oveľa väčšiu afinitu ako ktorýkoľvek z reťazcov, získaných pomocou fágu.
Príklad 6
Obmedzená peptidová banka
V ďalšej sérii pokusov bol použitý odlišný typ protilátky, v ktorom epitop bol uložený uprostred peptidového reťazca namiesto na jeho N-terminálnom zakončení (ako v príklade beta-endorfinu). Použitou protilátkou bola monoklonálna protilátka anti-v-mos Mab (nižšie). Táto protilátka bola získaná imunizáciou myší peptidom, obsahujúcim 12 aminokyselín, LGSGGFGSVYKA, ktorý zodpovedá zvyškom 100 až 111 onkogénu v-mos. Peptid bol konjugovaný s nosnou bielkovinou pred imunizáciou. Pri skúške ELISA je možné použiť anti-v-mos MAb na detekciu homológnych reťazcov vmos, MOS, neu/HER-1 a HER-2 génu.
Materiály a metódy
Pri použití komerčne dodávaného systému (Geysen a ďalší, 1986, Immunol. 23: 709 až 715) na mapovanie epitopov (Cambridge Research Biochemical, Boston) pri syntéze prekrývajúcich sa peptidov (skupiny tetrapeptidov, pentapeptidov a hexapeptidov) bol mapovaný epitop v rozsahu 12 aminokyselín v-mos, rozpoznávaný protilátkou anti· v-mos-MAb v porovnaní s pentapcptidovým reťazcom FGSVY (t j. zvyšku 6 až 10 v dodekapeptide v-mos).
Pokusy boli uskutočňované s obmedzenou bankou náhodných peptidov, v ktorej boli aminokyseliny valín a serín, prítomné vo v-mos peptide, úmyselne vypustené. Táto banka náhodných peptidov mala nasledujúce zloženie: G-Χ-Χ-Χ-Χ-Χ-β-Ala-aminokaprónová kyselina-etyléndiamín-živica, kde X = Glu, pro, Asn, Phe, His, Thr, Lys, Leu, Gly, Tyr, Ala, Met, Arg, Trp. Týchto 14 aminokyselín bolo zvolených tak, že valín a serín boli vynechané a všetky funkčné skupiny bočného reťazca boli zachované, to znamená, že í) bol použitý Asn, avšak nie Gin, ii) bol použitý Glu, avšak nie Asp, iii) bol použitý Thr, avšak nie Ser, iv) bol použitý Leu, avšak nie íle alebo Val a
v) bol použitý Met, avšak nie Cys.
Vzhľadom na to, že bolo v každom z piatich náhodných väzbových stupňoch použitých 14 aminokyselín, bolo teoretické množstvo peptidov 145, to znamená 537 824.
Bunková línia hybridómu, produkujúca monoklonálnu protilátku anti-v-mos bola získaná od Microbiological Associates Inc., Maryland (Hybridom No. 165-28E7, SCRF 354, šaržač. 165-119).
Afinita peptidového väzbového reťazca pre anti-v-mosMAb bola meraná väzbovými skúškami v kvapalnej fáze pri použití 3H-acetyl-v-mos-peptidu (3H-Ac-v-mos) ako rádioaktívneho väzbového reťazca. Táto rádioaktívna látka bola pripravená N-terminálnou acetyláciou v-mos pred odstránením ochranných skupín z bočného reťazca, pri použití ekvimolámeho množstva 3H-octanu sodného (špecifická aktivita = 2,52 Ci/mmol), New England Nuclear, Boston, MA). Produkt 3H-Ac-v-mos, ktorý bol oddelený od nezreagovaného v-mos-peptidu pomocou HPLC v reverznej fáze mal špecifickú aktivitu 2,50 Ci/mmol. Afinita väzby 3H-Ac-v-mos na Anti-v-mos-MAb (10 pg/ml) bola meraná v 1,0 ml PBS-pufra so želatínou (0,05 % želatína v PBS) pri teplote 23 až 24 °C po inkubácii tri hodiny. Špecifická väzba bola definovaná ako rozdiel medzi väzbou Ή-Ac-vmos v prítomnosti (nešpecifická väzba) a v neprítomnosti (celková väzba) 100 μΜ neoznačeného peptidu v-mos pre každú koncentráciu 3H-Ac-v-mos. Viazaný rádioaktívny väzbový reťazec bol oddelený odstredením pri použití 10-násobného prebytku (kapacita väzby relatívne k použitému imunoglobulínu) bielkovina G-Sepharosa (Pharmacia), na vyzrážanie protilátky. Analýza väzby do nasýtenia z piatich stanovení v rozsahu koncentrácie 125 až 5000 nM ukázala, že sa 3H-Ac-v-mos viaže na anti-v-mos-MAb s hodnotou Kd 850 ± 160 nM. Afinita väzby peptidového väzbového reťazca bola stanovená štúdiami na inhibíciu tejto väzby pri použití siedmich peptidových reťazcov vkompetícii s 10 pg/ml anti-v-mos-MAb s 10 nM 3H-Ac-v-mos za uvedených podmienok. Týmito štúdiami bolo dokázané, že vo viac ako 50 % celkovej väzby išlo o väzbu špecifickú. Konštanty pre nasýtenie väzby a na inhibíciu boli merané pre jediné miesto väzby pomocou nelineárnej regresnej analýzy, ako bolo opísané (Knapp a Yamamura, 1990, Life Sci. 46: 1457 až 1463).
Výsledky
Bolo analyzovaných približne 230 000 častíc pomocou konjugátu anti-v-mos a alkalickej fosfatázy. Bolo teda analyzovaných menej ako 43 % permutácii. Po inkubácii so substrátom sa približne 50 častíc sfarbilo intenzívne na modro. 24 týchto častíc bolo fyzikálne oddelených a bol analyzovaný reťazec aminokyselín na 11 týchto časticiach. Okrem toho bolo náhodne odobratých 17 bezfarebných, častíc na analýzu reťazca.
Výsledky analýzy reťazca pre častice s väzbovým reťazcom anti-v-mos sú zahrnuté v tabuľke 3. Vzhľadom na to, že úmyselne neboli použité aminokyseliny valín a serín v banke, nie je prekvapujúce, že ani jeden z reťazcov nezodpovedá natívnemu epitopu z 11 analyzovaných reťazcov (natívny reťazec zodpovedá reťazcu FGSVY). Aj napriek tomu, že v uvedených 11 reťazcoch nedošlo k žiadnemu opakovaniu, ich reťazce neboli náhodné. Vyskytuje sa v nich veľmi často arginín a tyrozín. Okrem toho sú aspoň jeden a niekedy dva arginínové zvyšky prítomné v polohe 2 a/alebo 3 týchto reťazcov. Na druhej strane náhodne zvolené nesfarbené častice nemajú žiadnu vlastnosť, spoločnú pre reťazce aminokyselín. Aj napriek tomu, že je rozsah vzorky obmedzený, hodnota chi2 nebola v porovnaní s reťazcami z negatívnych častíc nosiča štatisticky významná (chi2 = 18,27m df = 13, P = 0,15), čo dokazuje, že nieje k dispozícii žiadny dôkaz nerovnomernej distribúcie aminokyselín pre náhodne vytvorené reťazce na nesfarbených časticiach.
Tabuľka 3 Peptidové reťazce na jednotlivých časticiach nosiča, ktoré reagovali s monoklonálnou protilátkou anti-v-mos-MAb
A. Reťazce z reaktívnych častíc
GRRGME GRYMPK
GRRPYG GFRHMA
GRRAYE GFRYHN
GRREGP GHRYFH
GRYAKH GWREKE
GRKTYY
B. Reťazce z nereaktívnych častíc
GKELAG GFEKHP
GPYLMW GWGAYP
GTKMNF GAARPP
GEKMEF GLFGME
GYEEPK GRLNTL
GKKPNP GMTHAY
GEYAPP GPYGMA
GGFMEF GHYNNL
GPKFMA
Niektoré z pozitívnych väzbových reťazcov boli syntetizované a bola stanovená ich afinita pre anti-v-mos-MAb väzbu v kvapalnej fáze, ako bolo opísané v tomto príklade. Výsledky týchto skúšok sú zhrnuté v tabuľke 4.
V tabuľke 4 sú zhrnuté afinity v-mos-epitopv pre monoklonálnu protilátku anti-v-mos-MAb podľa výsledkov mapovania epitopov. Je tiež uvedený vplyv zmeny karboxyterminálneho zakončenia. V tabuľke 4B zhrňuje afinitu mimotópov, identifikovaných z peptidovej banky, v ktorej chýba niekoľko aminokyselín v v-mos-epitope. Niektoré skúmané väzbové reťazce obsahovali beta-alanínamid na napodobnenie štruktúry identifikovaného väzbového reťazca, ku ktorému sa protilátka viaže na častici nosiča.
Afinita najlepšieho anti-v-mos-mimotópu v tabuľke 4 je približne 2,5 krát menšia ako afinita natívneho peptidu. Aj napriek tomu, že žiadny zo skúmaných peptidových väzbových reťazcov nemal hodnotu Ki takú nízku ako natívny väzbový reťazec v-mos, výsledky zreteľne dokazujú, že pri použití banky náhodných peptidov, v ktorej chýbajú niektoré aminokyseliny, nachádzajúce sa v natívnom epitope, je možné identifikovať celý rad štruktúrne odlišných mimotópov, ktoré majú určitú afinitu k molekule akceptora, t. j. monoklonálnu protilátku anti-v-mos.
Tabuľka 4
Afinita väzby peptidového väzbového reťazca pre anti-vmos-Mab
Peptid Ki, μΜ
A. LGSGGFGSVYKA (v-mos-peptid) 3,2 ±0,4
GFGSVY-NH2 (v-mos-epitop) 246 -337
GFGSVY-OH 1000
GFGSVY-βΑ-ΝΉ, 409-442
GFGSVY-βΑ-ΟΗ 529 - 770
B. GRRAYE-OH 6,79+2,31
GRRAYE-NH2 24,70 ±7,00
GRRAYE-βΑ-ΟΗ 15,10 ±0,50
GRKAYE-pA-NH2 9,02 - 20,40
GRRGME-OH 100
GRRGME-βΑ-ΝΗ, 24,00 ±8,40
GRREPG-PA-NH2 26,90 ±6,20
GRRPYG-OH 1000
GRRPYG^A-NH2 20,50 ±4,50
Diskusia
Anti-v-mos-MAb, použité v tejto štúdii, mali pomerne nízku afinitu k imunogénu, t. j. v-mos-peptidu. V v-mos lineárnom epitope bol prítomný serín a valín (FGSVY), avšak tieto aminokyseliny boli úmyselne vynechané z použitej banky. Aj tak však bolo možné týmto spôsobom definovať lineárny mimotóp s úplne odlišným reťazcom a zložením aminokyselín, avšak s porovnateľnou afinitou pre protilátku. Tým bola celkom jasne dokázaná tak zložitosť, ako aj využiteľnosť interakcií medzi makromolekulámymi peptidmi.
Príklad 7
Selektíne odštiepiteľný väzbový reťazec: ONb
Bola pripravená skupina štyroch peptidov, obsahujúcich väzbový reťazec ONb, ktorý je možné odštiepiť pôsobením UV-svetla (odsek 4) a tieto peptidy boli použité na testy.
Materiály a metódy
Na dvoch živiciach boli pripravené nasledujúce štyri peptidy pri použití štandardnej syntézy na tuhom nosiči (napríklad príklad 1 a 2).
i) Fmoc-Trp-TyrtObu'j-Phe-Onb-betaAla-ACA-EDAPepSyn K ii) TRP-TyT-Phe-Onb-betaAla-ACA-EDA-PepSyn K iii) Fmoc-Trp-Tyr(Obu‘)-Phe-Onb-betaAla-ACA-4-MBHA iv) TRP-Tyr-Phe-Onb-betaAla-ACA-4-MBHA
Každý z peptidov bol ožarovaný 1 a 3 hodiny UV-žiarením a viditeľným (VIS) svetlom v 0,3 ml vody alebo zmesi chlóretanolu a dichlórmetánu 3:7. Celkom bolo uskutočnených a vyhodnotených 16 + 16 pokusov.
Po expozícii boli supematanty odfiltrované, lyofilizované a potom znova rozpustené v 0,3 ml metanolu. Produkty boli potom analyzované pomocou HPLC.
Výsledky
Analýza HPLC jasne dokázala, že po ožiarení VIS vo vode nedošlo k žiadnemu uvoľneniu tripeptidov za 1 hodinu, zatiaľ čo po ožiarení UV-svetlom došlo po tomto čase k takmer úplnému uvoľneniu tripeptidov.
Zvlášť peptid i) bol vo vode rozštiepený na jediný produkt. V niektorých prípadoch bolo možné pozorovať vymývanie dvoch produktov zo stĺpca HPLC. Pri dlhšom čase expozície UV-žiarenia bolo možné aspoň v niekoľkých prípadoch pozorovať vzájomnú premenu medzi dvoma produktami.
Diskusia
Je zrejmé, že pri použití väzbového reťazca, citlivého na UV-svetlo dochádza vo vodnom roztoku k uvoľneniu peptidu. Čas expozície 1 hodina je dostatočný na neúplné uvoľnenie peptidu. Výsledky tiež ukazujú, že polyamidová živica je kompatibilná s vodným systémom a je v ňom stála.
Príklad 8
Identifikácia látky, podobnej enzýmu
Materiály a metódy
Spôsobom podľa vynálezu bola pripravená banka náhodných pentapeptidov (príklad 5), bolo použitých 19 aminokyselín zo známych bežných 20 (bol vynechaný cysteín).
Peptidová banka bola vystavená pôsobeniu chromagénneho substrátu NBT (chlorid tetrazóliovej nitromodrej) v neprítomnosti exogénneho enzýmu za podmienok, vedúcich k tvorbe produktu a identifikujú sa pozitívne reagujúce častice. Tieto častice sa oddelia a reťazce produktu sa analyzujú.
Výsledky
V nasledujúcej tabuľke 5 sú uvedené reťazce z piatich častíc nosiča, ktoré zjavne katalyzovali redukciu NTB za vzniku tmavomodrého diformazánového produktu.
Tabuľka 5
Reťazce peptidov z častíc, napodobňujúcich pôsobenie enzýmu
PNNNH WNNNM
PNNNG MNNNR
QNNNR
SK 281490 Β6
Diskusia
Uvedené výsledky ukazujú, že spojenie PNNNH-častice môže redukovať NBT na tmavomodrý diformazánový pigment chemicky alebo enzymaticky. Peptid alebo spojenie peptidu a častice má teda účinnosť „arteficiálneho“ enzýmu alebo účinnosť enzýmu podobnú.
Príklad 9
Vyhľadávanie peptidových reťazcov s protirakovinovým účinkom
Obmedzená peptidová banka, obsahujúca pentapeptidy, v ktorých prvou aminokyselinou je tyrozín, za ktorým nasleduje reťazec náhodných zvyškov zo skupiny kyselina glutámová, serín, valín, glycín, asparagín a arginín bola vyšetrená na prítomnosť reťazcov s protirakovinovou účinnosťou pri použití rôznych bunkových línií nádorových buniek.
Materiály a metódy
Banka náhodných peptidov podľa vynálezu bola syntetizovaná pri použití hydrolyzovaného diketopiperazínového väzbového reťazca. Pri stanovení protinádorovej účinnosti boli použité platne s 96 vyhĺbeninami.
Po odstránení ochrannej skupiny z bočného reťazca a Nalfa-Fmoc-skupiny bola peptidová banka neutralizovaná pôsobením diizopropyletylamínu DIEA a dôkladne premytá DMF na odstránenie akýchkoľvek zvyšných potenciálne toxických látok. Potom bola postupne banka uvedená do suspenzie v 0,01 M HCI (podmienky, v ktorých je väzbový reťazec stály) a nakoniec premytá 0,001 M HCI. Potom bolo do každého vyhĺbenia prenesených približne 10 častíc nosiča z banky. Potom bolo do každého vyhĺbenia pridaných 50 μί prostredia RPMI (s 25 mM pufra Hepes) na neutralizáciu pH roztoku. Pri neutrálnom alebo slabo alkalickom pH dochádzalo k uvoľneniu peptidov napríklad v priebehu 16 až 24 hodín.
Potom sa postupovalo tak, že 1. buď bola časť prostredia prenesená na oddelenú platňu so špecifickou bunkovou líniou nádorových buniek alebo 2. tieto bunky boli pridané priamo do vyhĺbenia, obsahujúceho častice. Bolo použitých približne 2500 buniek pľúcneho nádoru/ml. Potom boli platne inkubované 7 dní pri teplote 37 °C, potom bola uskutočnená skúška MTT na kvantitatívne vyhodnotenie cytotoxicity uvoľnených peptidov v každom vyhĺbení.
Na túto skúšku je možné použiť rôzne stabilizované bunkové línie ľudského karcinómu, lymfómu, myelómu a tiež leukémie. Príkladom môžu byť nádorové bunky NCI, lymfoidná leukémia L1210, melanóm B16, Lewisov karcinóm pľúc, sarkóm M5076, karcinóm hrubého čreva 38 a karcinóm mliečnej žľazy človeka MX-1. Ďalšími príkladmi môžu byť karcinóm mliečnej žľazy MCF-7, bunková línia myelómu 8226, bunková línia leukémie myši P388 a bunková línia Hawkinsovho karcinómu pľúc (z buniek odlišných od karcinómu z malých buniek).
Výsledky
Bola analyzovaná banka, obsahujúca približne 8000 peptidov s reťazcom Y-XXXXX-častíca nosiča, kde Y znamená Tyr, X znamená Glu, Ser, Val, Gly, Arg alebo Asn. V dvoch pokusoch bolo možné dokázať pre 3 až 4 supematanty s obsahom uvoľneného peptidu inhibíciu bunkovej línie Hawkinsovho karcinómu pľúc. Vzhľadom na to, že každé vyhĺbenie obsahovalo približne 10 častíc, bolo podrobených skúške v podstate všetkých 8000 možných reťazcov a boli identifikované 3 účinné reťazce peptidov. Ten istý výsledok bolo možné dosiahnuť pri priamej inku bácii častíc s bunkami a pri prenose supematantu s uvoľneným peptidom.
Diskusia
Uvedené výsledky ukazujú, že obmedzená banka peptidov môže obsahovať niektoré peptidové reťazce s cytotoxickým účinkom. V predchádzajúcom príklade malo približne 0,05 % všetkých reťazcov protinádorovú účinnosť. Skúškami so supematantami, obsahujúcimi uvoľnené peptidy, je možné v sériových skúškach zistiť toxicitu aj proti iným nádorovým bunkám a tiež proti bunkám normálneho tkaniva.
Týmto spôsobom je možné identifikovať peptidové reťazce so širokou toxicitou proti nádorovým bunkám alebo s toxicitou proti špecifickým líniám nádorových buniek. Tie reťazce , ktoré majú nízku toxicitu pre normálne bunky by bolo možné použiť ako liečebné látky. Rovnaký postup je možné použiť aj pre antimikrobiálne a antiparazitické látky a pre antagonisty rastových faktorov.
Podobný postup na zistenie agonistov rastového faktora by mohol využiť bunkové línie, závislé od prítomnosti rastového faktora. Peptidy s agonistickým účinkom by v tomto prípade stimulovali rast týchto bunkových línií v neprítomnosti rastového faktora.
Vynález bol opísaný v súvislosti s jednotlivými výhodnými uskutočneniami, je však celkom zrejmé, že ho nie je možné na tieto uskutočnenia obmedziť. Je totiž možné vykonať ešte celý rad modifikácií, odborníkom v danej oblasti techniky zrejmých, ktoré by taktiež spadali do rozsahu vynálezu.

Claims (28)

  1. PATENTOVÉNÁROKV
    1. Banka bio-oligomérov, vyznačuj ú c a sa tým, že zahŕňa veľké množstvo rôznych typov biologicky aktívnych bio-oligomérov a veľké množstvo tuhých nosičov, ktoré sa dokonale miešajú a vyhovujú podmienkam reakcie chemickej syntézy bio-oligomérov a v ktorej jediný typ bio-oligomérov zbavený ochrany sa pripája ku každému tuhému nosiču a vytvára tak kombináciu tuhý nosič/bio-oligomér.
  2. 2. Banka bio-oligomérov podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že bio-oligoméry sú peptidy zbavené ochrany.
  3. 3. Banka bio-oligomérov podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že podjednotky sú vybraté zo skupiny pozostávajúcej z glycínu, L-aminokyselín, D-aminokyselín, neklasických aminokyselín a látok podobných peptidom - peptidomimetík.
  4. 4. Banka bio-oligomérov podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že peptidy zahrnujú aspoň dve aminokyseliny schopné sieťovania.
  5. 5. Banka bio-oligomérov podľa nároku 4, vyznačujúca sa tým, že peptidy sú opracované tak, aby sa sieťovali za vzniku obmedzených cyklizovaných alebo rigidizovaných peptidov.
  6. 6. Banka bio-oligomérov podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že tuhý nosič zahŕňa väzobný reťazec.
  7. 7. Banka bio-oligomérov podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že bio-oligoméry sú oligonukleotidy zbavené ochrany.
  8. 8. Banka bio-oligomérov podľa nároku 7, vyznačujúca sa tým, že, podjednotky sú volené zo skupiny pozostávajúcej z ribonukleotidov, dezoxyribonukleotidov a derivátov nukleotidov.
  9. 9. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych biooligomérov podľa nároku laž5, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje:
    a) aspoň toľko podielov tuhého nosiča, ako je počet rôznych typov pridávaných podjednotiek bio-oligomérov, avšak aspoň dva, za vzniku bio-oligomérov;
    b) samostatné zavedenie sady podjednotiek k podielom tuhého nosiča tak, aby sa ku každému podielu zaviedla jedna podjednotka;
    c) úplné naviazanie podjednotiek v podstate na všetky miesta tuhého nosiča za vzniku kombinácie tuhý nosič/nová podjednotka;
    d) stanovenie úplnosti väzby, a ak je to potrebné, dovedenie reakcie k úplnosti;
    e) dôkladné premiešanie podielov kombinácie tuhý nosič/nová podjednotka; a po zopakovaní krokov a) až e) toľkokrát, ako to je potrebné, záverečný krok;
    f) odstránenie ochranných skupín tak, aby každý bio-oligomér zbavený ochrany ostal naviazaný na tuhý nosič.
  10. 10. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že tuhý nosič je polydimetylakrylamid.
  11. 11. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že tuhý nosič je volený zo skupiny pozostávajúcej z polystyrénovej živice, živice typu polyhipe, polyamidovej živice, polystyrénovej živice naočkovanej polyetylénglykolom a polydimetylakrylamidovej živice.
  12. 12. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že tuhý nosič je oxid kremičitý.
  13. 13. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že tuhý nosič zahŕňa väzobný reťazec.
  14. 14. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že väzobný reťazec zahŕňa látku vybranú zo skupiny pozostávajúcej z kyseliny aminomaslovej, aminokaprónovej, 7-aminoheptánovej, etylénglykolu a β-aminokaprylovej.
  15. 15. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 13, vyznačujúci sa tým, že väzobný reťazec zahŕňa kyselinu aminokaprónovú.
  16. 16. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že banka bio-oligomérov sa pripravuje tak, že aspoň v jednom kroku sa tá istá podjednotka viaže ku všetkým tuhým nosičom a aspoň v jednom ďalšom kroku sa aspoň dve rôzne podjednotky samostatne viažu aspoň k dvom podielom tuhého nosiča.
  17. 17. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa kroky a) až e) vykonávajú jedenkrát.
  18. 18. Spôsob vytvárania banky biologicky aktívnych bio-oligomérov podľa nároku 9, vyznačujúci sa tým, že sa kroky a) až e) vykonávajú viac ako jedenkrát.
  19. 19. Spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu pre molekulu akceptora, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledovné kroky:
    a) zavedenie požadovanej akceptorovej molekuly do banky nároku 1 tak, aby uvedená akceptorová molekula rozpoznávala a viazala sa k jednému alebo viacerým tuhým nosičom/typom bio-oligomérov v danej banke;
    b) izoláciu tuhého nosiča/typ bio-oligoméru, ktorý sa viaže na molekulu akceptora; a
    c) určenie sekvencie bio-oligoméru tuhého nosiča/ bio-oligoméru izolovaného v kroku b).
  20. 20. Spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu pre molekulu akceptora podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že molekula akceptora sa volí zo skupiny pozostávajúcej z protilátok, receptorov, vírusov, baktérií, proteínov, uhľohydrátov, nukleových kyselín, lipidov, liečiv, kovov a malých molekúl.
  21. 21. Spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu pre molekulu akceptora, podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že molekula akceptora je protilátka.
  22. 22. Spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu pre molekulu akceptora podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že molekula akceptora je receptor.
  23. 23. Spôsob na určenie sekvencie biologicky aktívneho bio-oligomérového ligandu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa nasledovné kroky:
    a) in situ uvoľnenie časti bio-oligomérov z bio-oligomérovej banky podľa nároku 1;
    b) in situ stanovenie požadovanej biologickej aktivity uvoľneného bio-oligoméru;
    c) izolovanie tuhého nosiča/ bio-oligoméru, ktorý po naviazaní naň má typ bio-oligoméru, ktorý vykazuje požadovanú biologickú aktivitu; a
    d) určenie sekvencie typu bio-oligoméru zostávajúceho na tuhom nosiči izolovanom v kroku c).
  24. 24. Spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu pre molekulu akceptora podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že tuhý nosič je citlivý na pôsobenie kyselín, zásad, nukleofilných látok, je citlivý na svetlo, elektrofilné látky, na oxidáciu alebo redukciu.
  25. 25. Spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu pre molekulu akceptora podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že tuhý nosič zahŕňa väzobný reťazec, ktorý je senzitívny na pôsobenie kyselín, zásad, nukleofilných látok, elektrofilných látok, je citlivý na svetlo, oxidáciu alebo redukciu.
  26. 26. Spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu pre molekulu akceptora podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že in situ uvoľňovanie kroku a) sa vykonáva enzymatickým štiepením, chemickým štiepením alebo fotochemickým štiepením.
  27. 27. Spôsob podľa nároku 19 alebo 23, vyznačujúci sa tým, že bio-oligomérový ligand sa skladá z oligonukleotidovej sekvencie, ktorá má antimikrobiálnu aktivitu.
  28. 28. Spôsob určenia sekvencie bio-oligoméru, katalyzujúccj reakciu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa:
    a) pridanie substrátu do banky bio-oligomérov podľa nároku 1 tak, aby sa produkt reakcie dal zistiť;
    b) izolovanie tuhého nosiča s typom bio-oligoméru, ktorý má požadovanú aktivitu; a
    c) určenie sekvencie bio-oligoméru pripojeného k nosiču izolovanému v kroku b).
SK4073-92A 1990-07-02 1991-07-01 Banka oligomérov, spôsob jej vytvárania a spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu SK281490B6 (sk)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54684590A 1990-07-02 1990-07-02
US07/717,454 US5650489A (en) 1990-07-02 1991-06-19 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
PCT/US1991/004666 WO1992000091A1 (en) 1990-07-02 1991-07-01 Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK407392A3 SK407392A3 (en) 1994-08-10
SK281490B6 true SK281490B6 (sk) 2001-04-09

Family

ID=27068387

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK4073-92A SK281490B6 (sk) 1990-07-02 1991-07-01 Banka oligomérov, spôsob jej vytvárania a spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5650489A (sk)
EP (1) EP0542770B1 (sk)
JP (1) JP3552718B2 (sk)
KR (2) KR100222146B1 (sk)
AT (1) ATE176330T1 (sk)
AU (3) AU659091B2 (sk)
CA (1) CA2086672C (sk)
CZ (1) CZ289365B6 (sk)
DE (1) DE69130828T2 (sk)
DK (1) DK0542770T3 (sk)
ES (1) ES2126572T3 (sk)
FI (1) FI107995B (sk)
GR (1) GR3029443T3 (sk)
HU (1) HU218007B (sk)
IE (1) IE912299A1 (sk)
IL (1) IL98682A (sk)
MX (1) MX9100052A (sk)
NO (1) NO315002B1 (sk)
NZ (1) NZ238805A (sk)
PL (2) PL169616B1 (sk)
RO (1) RO112336B1 (sk)
SK (1) SK281490B6 (sk)
WO (1) WO1992000091A1 (sk)

Families Citing this family (619)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5747334A (en) * 1990-02-15 1998-05-05 The University Of North Carolina At Chapel Hill Random peptide library
US5498538A (en) * 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5639595A (en) * 1990-05-01 1997-06-17 Isis Phamaceuticals, Inc. Identification of novel drugs and reagents
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US6197529B1 (en) * 1990-11-21 2001-03-06 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Linear substituted oligoalkyleneimine libraries
US20050209121A1 (en) * 1990-12-05 2005-09-22 Novozymes A/S Proteins with changed epitopes and methods for the production thereof
US5646001A (en) * 1991-03-25 1997-07-08 Immunivest Corporation Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof
WO1993004204A1 (en) * 1991-08-23 1993-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthetic unrandomization of oligomer fragments
AU2580892A (en) * 1991-09-05 1993-04-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Determination of oligonucleotides for therapeutics, diagnostics and research reagents
AU669489B2 (en) * 1991-09-18 1996-06-13 Affymax Technologies N.V. Method of synthesizing diverse collections of oligomers
US5639603A (en) * 1991-09-18 1997-06-17 Affymax Technologies N.V. Synthesizing and screening molecular diversity
US6117974A (en) * 1991-10-02 2000-09-12 Peptor Limited Libraries of backbone-cyclized peptidomimetics
US20010021513A1 (en) * 1991-11-21 2001-09-13 Puijk Wouter Cornelis Test device comprising a plate containing a multiplicity of wells with an associated metering device, as well as a kit which comprises these devices and use of the devices
US5573905A (en) * 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ATE199726T1 (de) * 1992-04-15 2001-03-15 Univ Johns Hopkins Synthese von verschiedenen und nützlichen oligonukleotidsammlungen
US5541061A (en) * 1992-04-29 1996-07-30 Affymax Technologies N.V. Methods for screening factorial chemical libraries
AU4779493A (en) * 1992-07-21 1994-02-14 Bunsen Rush Laboratories Inc. Oligomer library formats and methods relating thereto
PT665897E (pt) * 1992-10-01 2003-11-28 Trustees Of Columbia U In The Bibliotecas quimicas combinatorias complexas codificadas com etiquetas
US5565324A (en) * 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5721099A (en) * 1992-10-01 1998-02-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US6503759B1 (en) 1992-10-01 2003-01-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5807683A (en) * 1992-11-19 1998-09-15 Combichem, Inc. Combinatorial libraries and methods for their use
DE4243770A1 (de) * 1992-12-23 1994-06-30 Behringwerke Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptiden und deren Verwendung
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
WO1994020521A1 (de) * 1993-03-12 1994-09-15 Jerini Bio Chemicals Gmbh Verfahren zur synthese und selektionierung von sequenzen aus kovalent verbundenen bausteinen
US6864048B2 (en) 1993-04-28 2005-03-08 Affymetrix, Inc. Factorial chemical libraries
US5840485A (en) * 1993-05-27 1998-11-24 Selectide Corporation Topologically segregated, encoded solid phase libraries
DK0705279T3 (da) * 1993-05-27 2003-06-10 Selectide Corp Topologisk adskilte, kodende fastfase-biblioteker
WO1994028424A1 (en) * 1993-05-28 1994-12-08 Chiron Corporation Method for selection of biologically active peptide sequences
US5846731A (en) * 1993-06-17 1998-12-08 Torry Pines Institute For Molecular Studies Peralkylated oligopeptide mixtures
US5480971A (en) * 1993-06-17 1996-01-02 Houghten Pharmaceuticals, Inc. Peralkylated oligopeptide mixtures
DK1156059T3 (da) * 1993-06-21 2007-11-12 Aventis Pharma Inc Selektivt spaltelige linkere baseret på en methioningruppe og en estergruppe
WO1995001800A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation Cyclic semi-random peptide libraries
AU7193494A (en) * 1993-07-21 1995-02-20 Oxford Glycosystems Ltd Saccharides, their synthesis and use
US6001982A (en) 1993-07-29 1999-12-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
WO1995005475A1 (en) * 1993-08-13 1995-02-23 Enzymed, Inc. Biocatalytic methods for synthesizing and identifying biologically active compounds
CN1525171A (zh) * 1993-10-01 2004-09-01 ŦԼ�и��ױ��Ǵ�ѧ���� 用标示物编码的多元组合化学库
US5922545A (en) * 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
US6165778A (en) * 1993-11-02 2000-12-26 Affymax Technologies N.V. Reaction vessel agitation apparatus
US5503805A (en) * 1993-11-02 1996-04-02 Affymax Technologies N.V. Apparatus and method for parallel coupling reactions
US6287787B1 (en) 1993-11-24 2001-09-11 Torrey Pines Institute For Molecular Studies Dimeric oligopeptide mixture sets
EP0733213A1 (en) * 1993-12-09 1996-09-25 Novartis AG Process for the production of combinatorial compound libraries
DE69406806D1 (de) * 1993-12-15 1997-12-18 Combichem Inc Kombinatorische Bibliotheken und Verfahren zu ihrer Verwendung
US5587471A (en) * 1994-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Method of making oligonucleotide libraries
WO1995019567A1 (en) * 1994-01-13 1995-07-20 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Synthetic receptors, libraries and uses thereof
US5593853A (en) * 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
US5541085A (en) * 1994-02-14 1996-07-30 Zymogenetics, Inc. Method for preparing orphan receptor ligands
US5539083A (en) * 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
EP0751765B1 (en) * 1994-03-11 2003-05-07 Pharmacopeia, Inc. Sulfonamide derivatives and their use
US6015880A (en) * 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US6936477B2 (en) 1994-04-13 2005-08-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5856083A (en) * 1994-05-06 1999-01-05 Pharmacopeia, Inc. Lawn assay for compounds that affect enzyme activity or bind to target molecules
US5846841A (en) * 1994-05-20 1998-12-08 Selectide Corporation Motif Libraries
IL109943A (en) 1994-06-08 2006-08-01 Develogen Israel Ltd Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
US6407059B1 (en) 1994-06-08 2002-06-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized peptide analogs
WO1995034813A1 (en) * 1994-06-14 1995-12-21 Smithkline Beecham Corporation Resins for solid state synthesis
US5663046A (en) * 1994-06-22 1997-09-02 Pharmacopeia, Inc. Synthesis of combinatorial libraries
US5817751A (en) * 1994-06-23 1998-10-06 Affymax Technologies N.V. Method for synthesis of diketopiperazine and diketomorpholine derivatives
WO1996000391A1 (en) * 1994-06-23 1996-01-04 Affymax Technologies N.V. Methods for the synthesis of diketopiperazines
US5939268A (en) * 1994-07-26 1999-08-17 The Scripps Research Institute Combinatorial libraries of molecules and methods for producing same
CA2195321A1 (en) * 1994-07-26 1996-02-08 Kim Janda Soluble combinatorial libraries
US5948693A (en) * 1994-09-01 1999-09-07 Wisconsin Alumni Research Foundation Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
US5463564A (en) * 1994-09-16 1995-10-31 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System and method of automatically generating chemical compounds with desired properties
US6558633B1 (en) 1994-09-21 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chemical reaction apparatus and methods
US5604097A (en) * 1994-10-13 1997-02-18 Spectragen, Inc. Methods for sorting polynucleotides using oligonucleotide tags
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
US5695934A (en) * 1994-10-13 1997-12-09 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel sequencing of sorted polynucleotides
US5846719A (en) 1994-10-13 1998-12-08 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide tags for sorting and identification
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
AU3599895A (en) * 1994-10-14 1996-05-06 Chiron Mimotopes Pty Ltd Method and apparatus for efficient mimotope discovery
US6974666B1 (en) 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5688696A (en) * 1994-12-12 1997-11-18 Selectide Corporation Combinatorial libraries having a predetermined frequency of each species of test compound
DE4444260A1 (de) * 1994-12-13 1996-06-20 Hoechst Ag Cyclohexapeptide und deren Mischungen, Verfahren zur Herstellung sowie deren Verwendung
AU5849796A (en) * 1994-12-27 1996-08-07 United Biomedical Inc. Peptide ratchet libraries for ctl-inducing vaccines and therapeutics
GB9502225D0 (en) * 1995-02-04 1995-03-22 Zeneca Ltd Method
AU5487496A (en) * 1995-05-03 1996-11-21 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5759865A (en) * 1995-05-03 1998-06-02 Eli Lilly And Company Combinatorial process for synthesizing azetidinone analogs
US5834318A (en) * 1995-05-10 1998-11-10 Bayer Corporation Screening of combinatorial peptide libraries for selection of peptide ligand useful in affinity purification of target proteins
US5830655A (en) 1995-05-22 1998-11-03 Sri International Oligonucleotide sizing using cleavable primers
US5750674A (en) * 1995-05-23 1998-05-12 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the stereoselective enrichment of oligonucleotide diastereomers and oligonucleotides thereby produced
AU5871196A (en) * 1995-05-23 1996-12-24 Hybridon, Inc. Methods and compounds for the synthesis of oligonucleotides and the oligonucleotides thereby produced
US20010053523A1 (en) * 1995-06-02 2001-12-20 M&E Biotech A/S. Method for identification of biologically active peptides and nucleic acids
US5770687A (en) * 1995-06-07 1998-06-23 Peptor Limited Comformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US6051554A (en) * 1995-06-07 2000-04-18 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
ES2174075T3 (es) * 1995-06-21 2002-11-01 Martek Biosciences Corp Librerias combinatorias de compuestos bioquimicos marcados y metodos para producir las mismas.
SE9502286D0 (sv) * 1995-06-22 1995-06-22 Pharmacia Ab Process for detection, quantification and/or identification of a peptide
JP4105763B2 (ja) * 1995-06-23 2008-06-25 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ，アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ アグーチシグナルタンパク質およびそのペプチドの脱色活性
GB9515070D0 (en) * 1995-07-22 1995-09-20 Zeneca Ltd Label
DE69637395T2 (de) * 1995-09-11 2008-12-18 La Jolla Cancer Research Foundation, La Jolla Moleküle, die sich in ausgewählten Organen oder Geweben in-vivo einfinden
AU728668B2 (en) * 1995-09-11 2001-01-18 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ or tissue in vivo and methods of identifying same
US6068829A (en) * 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US6743892B1 (en) 1995-09-11 2004-06-01 La Jolla Cancer Research Foundation Molecules that home to a selected organ in vivo
US7026114B1 (en) * 1995-09-13 2006-04-11 Affymetrix, Inc. Methods and compositions for monitoring polymer array synthesis
US6841533B1 (en) 1995-12-07 2005-01-11 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized interleukin-6 antagonists
US6147205A (en) * 1995-12-15 2000-11-14 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups and methods for their use
US20110028350A1 (en) * 1995-12-15 2011-02-03 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
ES2200084T3 (es) * 1995-12-18 2004-03-01 Praecis Pharmaceuticals Incorporated Metodos para identificar compuestos que se unen a una diana.
US6429317B1 (en) * 1996-01-22 2002-08-06 Eli Lilly And Company Indane derivatives for antipsychotic compositions
US6365344B1 (en) * 1996-01-23 2002-04-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and RNA molecules
WO1997027213A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for screening for transdominant effector peptides and rna molecules
US6277583B1 (en) * 1996-02-07 2001-08-21 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries and applications thereof
US6080719A (en) * 1996-02-23 2000-06-27 Hoechst Aktiengesellschaft Cyclohexapeptides and their mixtures, a process for preparing them, and their use
CA2248084A1 (en) 1996-03-04 1997-09-12 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
DE19610103A1 (de) 1996-03-15 1997-09-18 Basf Ag Cycloalkylderivate und ihre Synthese an fester Phase
EP0954601A4 (en) * 1996-03-20 2004-08-18 Genzyme Corp METHOD FOR DETECTING CYTOTOXIC T-CELL EPITOPES
EP0901629A4 (en) * 1996-03-21 2000-02-02 Univ Princeton CARBOHYDRATE LIBRARY, ASSAY AND METHOD
US5866341A (en) * 1996-04-03 1999-02-02 Chugai Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions and methods for screening drug libraries
EP0907889B1 (en) 1996-04-25 2007-07-04 BioArray Solutions Ltd. Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US6387707B1 (en) 1996-04-25 2002-05-14 Bioarray Solutions Array Cytometry
US7144119B2 (en) 1996-04-25 2006-12-05 Bioarray Solutions Ltd. System and method for programmable illumination pattern generation
US5958342A (en) * 1996-05-17 1999-09-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Jet droplet device
DE19621177A1 (de) 1996-05-24 1997-11-27 Basf Ag Kohlenhydratderivate und ihre Synthese an fester Phase
US6203978B1 (en) * 1996-05-31 2001-03-20 Du Vergier Ltd. Capture of single stranded nucleic acids
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6696251B1 (en) * 1996-05-31 2004-02-24 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
JP3734040B2 (ja) 1996-06-14 2006-01-11 明治乳業株式会社 Ｔ細胞エピトープペプチド
WO1997049430A1 (en) * 1996-06-26 1997-12-31 Antigen Express, Inc. Immunotherapy by modulation of antigen presentation
DE19626762A1 (de) 1996-07-03 1998-01-08 Basf Ag Enzymatisch spaltbare Linker für Festphasensynthesen
US6355613B1 (en) 1996-07-31 2002-03-12 Peptor Limited Conformationally constrained backbone cyclized somatostatin analogs
US5922872A (en) * 1996-08-01 1999-07-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Meta-benzylic and alpha-amido compositions and methods for preparing same
US5817489A (en) * 1996-08-01 1998-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Di-nitrogen heterocycle compositions
US6576239B1 (en) 1996-09-10 2003-06-10 The Burnham Institute Angiogenic homing molecules and conjugates derived therefrom
WO1998011437A1 (en) 1996-09-16 1998-03-19 Conjuchem, Inc. Affinity labeling libraries with tagged leaving groups
US5965363A (en) 1996-09-19 1999-10-12 Genetrace Systems Inc. Methods of preparing nucleic acids for mass spectrometric analysis
US5798035A (en) 1996-10-03 1998-08-25 Pharmacopeia, Inc. High throughput solid phase chemical synthesis utilizing thin cylindrical reaction vessels useable for biological assay
US20020022227A1 (en) * 1996-10-17 2002-02-21 Short Jay M. Morphatides: novel shape and structure libraries
US6838238B1 (en) * 1996-10-17 2005-01-04 Invitrogen Corporation Morphatides: novel shape and structure libraries
US6042789A (en) * 1996-10-23 2000-03-28 Glaxo Group Limited System for parallel synthesis of organic compounds
US6149869A (en) * 1996-10-23 2000-11-21 Glaxo Wellcome Inc. Chemical synthesizers
US6413724B1 (en) 1996-10-28 2002-07-02 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6025371A (en) * 1996-10-28 2000-02-15 Versicor, Inc. Solid phase and combinatorial library syntheses of fused 2,4-pyrimidinediones
US6571227B1 (en) 1996-11-04 2003-05-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system and computer program product for non-linear mapping of multi-dimensional data
US6453246B1 (en) 1996-11-04 2002-09-17 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for representing proximity data in a multi-dimensional space
JP2001507675A (ja) 1996-11-04 2001-06-12 ３―ディメンショナル ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 所望の特性を有する化合物を識別するシステム、方法、コンピュータ・プログラム製品
US6054325A (en) * 1996-12-02 2000-04-25 Glaxo Wellcom Inc. Method and apparatus for transferring and combining distinct chemical compositions with reagents
US6083761A (en) * 1996-12-02 2000-07-04 Glaxo Wellcome Inc. Method and apparatus for transferring and combining reagents
WO1998024760A1 (en) * 1996-12-03 1998-06-11 Graybill Todd L Aminobenzenedicarboxylic acid-based combinatorial libraries
JP2001524808A (ja) 1996-12-10 2001-12-04 ジーントレイス・システムズ・インコーポレイテッド 放出可能な不揮発性の質量標識分子
EP0975792B1 (en) * 1997-03-04 2007-10-10 Savient Pharmaceuticals, Inc. Isolation of tissue specific peptide ligands and their use for targeting pharmaceuticals to organs
US6045755A (en) * 1997-03-10 2000-04-04 Trega Biosciences,, Inc. Apparatus and method for combinatorial chemistry synthesis
US20030027126A1 (en) 1997-03-14 2003-02-06 Walt David R. Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US7622294B2 (en) 1997-03-14 2009-11-24 Trustees Of Tufts College Methods for detecting target analytes and enzymatic reactions
US6177464B1 (en) 1997-03-14 2001-01-23 Sepracor, Inc. Ring opening metathesis of alkenes
JPH10260223A (ja) * 1997-03-19 1998-09-29 Fujitsu Ltd 半導体検査装置及びこれを用いた検査方法
CA2286867A1 (en) * 1997-04-11 1998-10-22 Eli Lilly And Company Combinatorial libraries of peptidomimetic macrocycles and processes therefor
US6004823A (en) * 1997-05-07 1999-12-21 Smithkline Beecham Corporation Compounds
US5908960A (en) * 1997-05-07 1999-06-01 Smithkline Beecham Corporation Compounds
GB9710582D0 (en) 1997-05-22 1997-07-16 Oxford Glycosciences Uk Ltd A method for de novo peptide sequence determination
WO1998053093A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Bioarray Solutions Llc Color-encoding and in-situ interrogation of matrix-coupled chemical compounds
WO1998058256A1 (en) * 1997-06-16 1998-12-23 The University Of North Carolina At Chapel Hill PEPTIDO OLIGONUCLEOTIDES (PONs) AND THEIR COMBINATORIAL LIBRARIES
NZ516848A (en) 1997-06-20 2004-03-26 Ciphergen Biosystems Inc Retentate chromatography apparatus with applications in biology and medicine
EP1387390B1 (en) 1997-06-20 2009-02-18 Bio - Rad Laboratories, Inc. Retentate chromatography and protein chip arrays with applications in biology and medicine
US5874589A (en) * 1997-07-18 1999-02-23 Glaxo Wellcome, Inc. Methods for synthesizing diverse collections of tetramic acids and derivatives thereof
US6410342B1 (en) * 1997-08-19 2002-06-25 Pharmacopeia, Inc. Method and apparatus for controlled photoelution
US7252950B1 (en) 1997-09-04 2007-08-07 The Regents Of The University Of California Assays for detecting modulators of cytoskeletal function
US6960457B1 (en) 1997-09-04 2005-11-01 Stanford University Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
EP1056474B1 (en) 1997-11-07 2002-06-12 ConjuChem, Inc. Affinity markers for human serum albumin
US6228579B1 (en) * 1997-11-14 2001-05-08 San Diego State University Foundation Method for identifying microbial proliferation genes
US6083682A (en) 1997-12-19 2000-07-04 Glaxo Group Limited System and method for solid-phase parallel synthesis of a combinatorial collection of compounds
US6759243B2 (en) 1998-01-20 2004-07-06 Board Of Trustees Of The University Of Illinois High affinity TCR proteins and methods
US5968361A (en) * 1998-02-24 1999-10-19 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
US6497820B1 (en) 1998-02-03 2002-12-24 Arqule, Inc. Rapid method for separation of small molecules using reverse phase high performance liquid chromatography
AU2795399A (en) * 1998-02-27 1999-09-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Hplc fractionation of complex chemical mixtures
US6232287B1 (en) 1998-03-13 2001-05-15 The Burnham Institute Molecules that home to various selected organs or tissues
EP1062508A1 (en) 1998-03-20 2000-12-27 The Rockefeller University Assays for screening compounds which interact with cation channel proteins, mutant prokaryotic cation channel proteins, and uses thereof
AU767185B2 (en) 1998-03-23 2003-11-06 President And Fellows Of Harvard College Synthesis of compounds and libraries of compounds
CA2324060A1 (en) * 1998-03-30 1999-10-07 The Regents Of The University Of California Methods and compounds for modulating nuclear receptor activity
US6316616B1 (en) 1998-04-02 2001-11-13 President And Fellows Of Harvard College Parallel combinatorial approach to the discovery and optimization of catalysts and uses thereof
US6699969B1 (en) 1998-04-14 2004-03-02 The Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
US6872537B1 (en) 1998-04-14 2005-03-29 Regents Of The University Of California Assays for the detection of microtubule depolymerization inhibitors
EP1071943A4 (en) 1998-04-14 2005-08-10 Univ California TEST FOR THE DETECTION OF MICROTUBULUS DEPOLYMERIZATION INHIBITORS
HUP0101828A3 (en) 1998-05-04 2005-08-29 Fraunhofer Ges Forschung Electrical integrated nucleic acid isolation, purification and detection
DE19819889A1 (de) * 1998-05-04 1999-11-11 Fraunhofer Ges Forschung Verfahren zur Isolierung von Nucleinsäuren
US6872535B2 (en) 1998-05-20 2005-03-29 Aventis Pharmaceuticals Inc. Three-dimensional array of supports for solid-phase parallel synthesis and method of use
EP1138692A1 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Erasmus Universiteit Rotterdam Fragments of human chorionic gonadotropin (hcg) as immunoregulator
US6541211B1 (en) * 1998-05-20 2003-04-01 Selectide Corporation Apparatus and method for synthesizing combinational libraries
US7387779B2 (en) * 1998-06-17 2008-06-17 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic proteins and fragments and methods of use thereof
US7402400B2 (en) 2001-07-03 2008-07-22 Regents Of The University Of California Mammalian sweet taste receptors
US6602685B1 (en) 1998-08-17 2003-08-05 Phylos, Inc. Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules
US6633543B1 (en) * 1998-08-27 2003-10-14 Intel Corporation Multicast flow control
US6423493B1 (en) * 1998-10-26 2002-07-23 Board Of Regents The University Of Texas System Combinatorial selection of oligonucleotide aptamers
US20040242521A1 (en) * 1999-10-25 2004-12-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Thio-siRNA aptamers
WO2000027627A1 (en) * 1998-11-12 2000-05-18 Eli Lilly And Company Aryloxime linkers in the solid-phase synthesis of 3-aminobenzisoxazoles
US20030027214A1 (en) * 1999-02-17 2003-02-06 Kamb Carl Alexander Methods for substrate-ligand interaction screening
WO2000073799A1 (en) 1999-06-01 2000-12-07 Caliper Technologies Corp. Microscale assays and microfluidic devices for transporter, gradient induced, and binding activities
EP1187914B1 (en) 1999-06-14 2005-05-25 Genentech, Inc. A structured peptide scaffold for displaying turn libraries on phage
SE9902479D0 (sv) * 1999-06-30 1999-06-30 Amersham Pharm Biotech Ab Particle classification as marker
US7742877B1 (en) 1999-07-22 2010-06-22 Becton, Dickinson & Company Methods, apparatus and computer program products for formulating culture media
CA2382157C (en) * 1999-08-18 2012-04-03 Illumina, Inc. Compositions and methods for preparing oligonucleotide solutions
EP2267029B1 (en) 1999-09-03 2016-06-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and compositions for treatment of inflammatory disease using Cadherin-11 modulating agents
CA2386540A1 (en) * 1999-10-04 2001-04-12 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Novel carbamates and ureas
US6569685B1 (en) * 1999-10-05 2003-05-27 The Molecular Sciences Institute, Inc. Protein fingerprint system and related methods
KR100378252B1 (ko) * 1999-11-12 2003-03-29 학교법인 포항공과대학교 니트로술포닐에톡시카르보닐-아미노산을 이용한 합성테트라펩티드 라이브러리의 제조방법
US6458538B1 (en) 1999-12-14 2002-10-01 Ptc Therapeutics, Inc. Methods of assaying for compounds that inhibit premature translation termination and nonsense-mediated RNA decay
US8642284B1 (en) 1999-12-15 2014-02-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents that alter NAD-dependent deacetylation activity of a SIR2 protein
US7452664B2 (en) 1999-12-15 2008-11-18 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying agents which alter histone protein acetylation
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
EP1250463B1 (en) 2000-01-24 2006-04-05 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
CA2398961A1 (en) 2000-02-03 2001-08-09 The Regents Of The University Of California Assays for the detection of agents that affect cognition
US7416524B1 (en) 2000-02-18 2008-08-26 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. System, method and computer program product for fast and efficient searching of large chemical libraries
WO2001065462A2 (en) 2000-02-29 2001-09-07 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method and computer program product for designing combinatorial arrays
TW201006846A (en) 2000-03-07 2010-02-16 Senomyx Inc T1R taste receptor and genes encidung same
WO2001071624A1 (en) 2000-03-22 2001-09-27 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. System, method, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
US20050037430A1 (en) * 2000-03-29 2005-02-17 Biotempt B.V. Methods and uses for protein breakdown products
USRE43279E1 (en) 2000-03-29 2012-03-27 Biotemp B.V. Compositions capable of reducing elevated blood urea concentration
AU2001249805A1 (en) 2000-04-03 2001-10-15 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. Method, system, and computer program product for representing object relationships in a multidimensional space
EP1373561B1 (en) 2000-06-13 2009-02-18 The Trustees of Boston University Use of mass-matched nucleotides in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
ES2259666T3 (es) 2000-06-21 2006-10-16 Bioarray Solutions Ltd Analisis molecular de multiples analitos usando series de particulas aleatorias con especificidad de aplicacion.
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US6759510B1 (en) * 2000-06-30 2004-07-06 Becton, Dickinson And Company Peptides for use in culture media
US20020019010A1 (en) * 2000-07-07 2002-02-14 Stockwell Brent R. Methods for identifying combinations of entities as therapeutics
US20020051991A1 (en) * 2000-07-11 2002-05-02 Zhi Hong Rapid generation of diverse nucleoside and nucleotide libraries
AU8356201A (en) * 2000-08-11 2002-02-25 Agilix Corp Ultra-sensitive detection systems
US7452964B2 (en) 2001-09-07 2008-11-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions and methods of use of targeting peptides against placenta and adipose tissues
US20040170955A1 (en) 2000-09-08 2004-09-02 Wadih Arap Human and mouse targeting peptides identified by phage display
US6963807B2 (en) 2000-09-08 2005-11-08 Oxford Glycosciences (Uk) Ltd. Automated identification of peptides
US7420030B2 (en) 2000-09-08 2008-09-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Aminopeptidase A (APA) targeting peptides for the treatment of cancer
CA2421732A1 (en) * 2000-09-11 2002-03-14 Affymetrix, Inc. Photocleavable protecting groups
JP2004513332A (ja) * 2000-09-18 2004-04-30 ジェンザイム、コーポレーション 質量分析法（ｍａｌｄｉ−ｔｏｆ）に基づいて抗体標的を同定するための方法
AU2001294654A1 (en) 2000-09-25 2002-04-08 The Regents Of The University Of California Model for neurodegenerative diseases involving amyloid accumulation
US20030045005A1 (en) 2000-10-17 2003-03-06 Michael Seul Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
US7045283B2 (en) 2000-10-18 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Methods of high-throughput screening for internalizing antibodies
WO2002046400A2 (en) * 2000-12-08 2002-06-13 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Mutated class ii major histocompatibility proteins
US7572575B2 (en) 2000-12-13 2009-08-11 Massachusetts Institute Of Technology SIR2 activity
ATE387507T1 (de) 2000-12-23 2008-03-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Screeningverfahren für die oligonukleotidtransfektion
TW201022287A (en) 2001-01-03 2010-06-16 Senomyx Inc T1R taste receptors and genes encoding same
US7054757B2 (en) 2001-01-29 2006-05-30 Johnson & Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. Method, system, and computer program product for analyzing combinatorial libraries
DE10106339A1 (de) * 2001-02-09 2002-08-22 Hans-Joachim Mueller Verfahren zum Hochdurchsatz-Screening von Kandidaten-Verbindungen über die Hochdurchsatz-Direktsynthese von rekombinanten Polypeptiden
US7883856B2 (en) 2001-04-05 2011-02-08 Senomyx Inc. Identification of bitter ligands that specifically activate human T2R receptors and related assays for identifying human bitter taste modulators
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
WO2002083837A1 (en) * 2001-04-11 2002-10-24 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that bind specific rna structural motifs
US20060228730A1 (en) * 2001-04-11 2006-10-12 Rando Robert F Methods for identifying small molecules that bind specific RNA structural motifs
US6649573B2 (en) * 2001-04-13 2003-11-18 Michael J. Mitrovich Solid lubricant and composition
US6914123B2 (en) 2001-04-17 2005-07-05 Genentech, Inc. Hairpin peptides with a novel structural motif and methods relating thereto
US7803982B2 (en) 2001-04-20 2010-09-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of New York University T1R3 transgenic animals, cells and related methods
JP2005505749A (ja) 2001-05-21 2005-02-24 アクララ バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド タンパク質を分析するための方法および組成物
US20030113714A1 (en) * 2001-09-28 2003-06-19 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticles
US20050164515A9 (en) * 2001-06-05 2005-07-28 Belcher Angela M. Biological control of nanoparticle nucleation, shape and crystal phase
US20030148380A1 (en) * 2001-06-05 2003-08-07 Belcher Angela M. Molecular recognition of materials
EP1406493A4 (en) 2001-06-11 2006-06-14 Xenoport Inc ADMINISTRATION OF MEDIUM BY THE PEPT-2 TRANSPORTER
WO2002102820A1 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Nuevolution A/S Nucleoside derivatives for library preparation
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
EP1412750B1 (en) 2001-06-26 2012-05-23 Senomyx, Inc. T1r2-t1r3 hetero-oligomeric sweet taste receptors and cell lines that express said receptors and use thereof for identification of sweet taste compounds
AU2002312566A1 (en) 2001-07-09 2003-01-29 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods of inhibiting amyloid toxicity
US6800449B1 (en) * 2001-07-13 2004-10-05 Syngenta Participations Ag High throughput functional proteomics
US7413870B2 (en) 2001-08-01 2008-08-19 Rigel Pharmaceuticals, Incorporated SAK: modulation of cellular proliferation for treatment of cancer
US6767731B2 (en) * 2001-08-27 2004-07-27 Intel Corporation Electron induced fluorescent method for nucleic acid sequencing
TW573125B (en) * 2001-08-29 2004-01-21 Combinatorx Inc A screening system for identifying drug-drug interactions and methods of use thereof
US20030073104A1 (en) * 2001-10-02 2003-04-17 Belcher Angela M. Nanoscaling ordering of hybrid materials using genetically engineered mesoscale virus
EP2722395B1 (en) 2001-10-15 2018-12-19 Bioarray Solutions Ltd Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection
EP1440083B1 (en) 2001-10-25 2013-01-02 Medical Research Council Molecules
US6670142B2 (en) 2001-10-26 2003-12-30 The Regents Of The University Of California Method for screening combinatorial bead library, capturing cells from body fluids, and ligands for cancer cells
US7262269B2 (en) 2001-10-26 2007-08-28 The Regents Of University Of California Method for screening combinational bead library; ligands for cancer cells
US20030124595A1 (en) * 2001-11-06 2003-07-03 Lizardi Paul M. Sensitive coded detection systems
ES2327398T3 (es) * 2001-11-20 2009-10-29 Duke University Biomateriales interfaciales.
US7871619B2 (en) 2001-11-30 2011-01-18 Chemocentryx, Inc. Compositions and methods for detecting and treating diseases and conditions related to chemokine receptors
AU2002349905A1 (en) * 2001-12-17 2003-06-30 Ribapharm Inc. Nucleoside libraries and compounds by mcc combinatorial strategies on solid support
US7291456B2 (en) 2002-01-24 2007-11-06 The Regents Of The University Of California Method for determining differences in molecular interactions and for screening a combinatorial library
WO2003065358A2 (en) * 2002-01-28 2003-08-07 Burstein Technologies, Inc. Methods and apparatus for logical triggering of an optical bio-disc
AU2003209372B2 (en) 2002-01-31 2009-02-19 Burstein Technologies, Inc. Method for triggering through disc grooves and related optical analysis discs and system
US20030220249A1 (en) * 2002-02-07 2003-11-27 Hackett Perry B. Factors for angiogenesis, vasculogenesis, cartilage formation, bone formation, and methods of use thereof
EP1572906A4 (en) 2002-03-04 2008-05-28 Bristol Myers Squibb Co NEW PAVIAN TAFI-CODING NUCLEIC ACID MOLECULES AND POLYPEPTIDES
IL163822A0 (en) 2002-03-15 2005-12-18 Nuevolution As An improved method for synthesising templated molecules
US7544767B2 (en) 2002-04-05 2009-06-09 Burnham Institute For Medical Research HMGN2 peptides and related molecules that selectively home to tumor blood vessels and tumor cells
US20060275753A1 (en) * 2002-04-15 2006-12-07 Hammond David J Recovery of analytes using combinatorial libraries
CN100525829C (zh) 2002-04-15 2009-08-12 美国国家红十字会 检测混合物中配体和靶标的方法
EP1578781A4 (en) * 2002-05-17 2007-05-30 Alfred E Slanetz METHOD FOR DETERMINING TARGET FUNCTION AND IDENTIFICATION OF DRUG SERIES HEADS
US7893218B2 (en) 2003-06-16 2011-02-22 Stowers Institute For Medical Research Antibodies that specifically bind SOST peptides
WO2004001010A2 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Ptc Therapeutics, Inc. METHODS FOR IDENTIFYING SMALL MOLECULES THAT MODULATE PREMATURE TRANSLATION TERMINATION AND NONSENSE MEDIATED mRNA DECAY
US20100168037A1 (en) * 2002-07-03 2010-07-01 Bio Science International, Inc. Peptides comprising aromatic d-amino acids and methods of use
JP4486497B2 (ja) * 2002-07-11 2010-06-23 アメリカン ナショナル レッド クロス 複合混合物中の個々の活性成分を同定する方法
US7301006B2 (en) * 2002-07-16 2007-11-27 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and materials for the synthesis of modified peptides
CA2493808A1 (en) * 2002-07-24 2004-01-29 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for identifying small molecules that modulate premature translation termination and nonsense mediated mrna decay
US10730906B2 (en) 2002-08-01 2020-08-04 Nuevolutions A/S Multi-step synthesis of templated molecules
AU2003243151A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
CN102516417B (zh) 2002-09-06 2014-12-10 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的以环糊精为基础的聚合物
US7157228B2 (en) * 2002-09-09 2007-01-02 Bioarray Solutions Ltd. Genetic analysis and authentication
US20050064508A1 (en) * 2003-09-22 2005-03-24 Semzyme Peptide mediated synthesis of metallic and magnetic materials
AU2003304278B2 (en) * 2002-10-16 2009-03-12 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
WO2004038415A1 (en) * 2002-10-24 2004-05-06 Biacore Ab Assay with co-immobilized ligands
PT1558744E (pt) 2002-10-30 2011-09-22 Nuevolution As Codificação enzimática
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
DK2317317T3 (en) 2002-12-03 2015-03-02 Univ North Carolina State Prion protein ligands, as well as methods of use thereof
US20040185473A1 (en) * 2002-12-17 2004-09-23 Affymetrix, Inc. Releasable polymer arrays
ATE450609T1 (de) 2002-12-19 2009-12-15 Nuevolution As Durch quasizufallsstrukturen und funktionen geführte synthesemethode
US7736909B2 (en) * 2003-01-09 2010-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions comprising capture agents
AT413945B (de) * 2003-01-14 2006-07-15 Mattner Frank Dr Impfstoff für die alzheimer-krankheit
US20070026397A1 (en) 2003-02-21 2007-02-01 Nuevolution A/S Method for producing second-generation library
GB0305448D0 (en) * 2003-03-10 2003-04-16 Tcp Innovations Ltd Immunoassay
US20040185499A1 (en) * 2003-03-20 2004-09-23 Jolley Michael E. Method of epitope scanning using fluorescence polarization
US20040235054A1 (en) * 2003-03-28 2004-11-25 The Regents Of The University Of California Novel encoding method for "one-bead one-compound" combinatorial libraries
US20040235053A1 (en) * 2003-03-28 2004-11-25 The Regents Of The University Of California Preparation and application of encoded bead aggregates in combinatorial chemistry
GB0307428D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Compartmentalised combinatorial chemistry
GB0307403D0 (en) * 2003-03-31 2003-05-07 Medical Res Council Selection by compartmentalised screening
US20060078893A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-13 Medical Research Council Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control
US20040235027A1 (en) * 2003-03-31 2004-11-25 Regent Of The University Of California Preparation and application of ligand-biopolymer conjugates
PL1615992T3 (pl) 2003-04-04 2014-03-31 Pathogen Removal And Diagnostic Tech Inc Materiały wiążące białko prionowe i sposoby ich zastosowania
US7510848B2 (en) 2003-04-04 2009-03-31 North Carolina State University Prion protein binding materials and methods of use
US20040210036A1 (en) * 2003-04-15 2004-10-21 Nanogen, Inc. Peptide substrate libraries
WO2004098764A2 (en) 2003-04-30 2004-11-18 Aurora Discovery, Inc. Multi-well plate providing a high-density storage and assay platform
WO2005037053A2 (en) * 2003-05-23 2005-04-28 Board Of Regents - The University Of Texas System High throughput screening of aptamer libraries for specific binding to proteins on viruses and other pathogens
CA2526690C (en) * 2003-05-23 2014-01-14 Board Of Regents The University Of Texas System Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting ap-1 transcription factors
JP2007525196A (ja) 2003-05-30 2007-09-06 アジェンシス， インコーポレイテッド 前立腺幹細胞抗原（ｐｓｃａ）変異体及びその部分配列
US20040253642A1 (en) * 2003-06-06 2004-12-16 Grant Zimmermann System and method for multidimensional evaluation of combinations of compositions
US7672791B2 (en) * 2003-06-13 2010-03-02 International Business Machines Corporation Method of performing three-dimensional molecular superposition and similarity searches in databases of flexible molecules
WO2005010016A2 (en) * 2003-07-24 2005-02-03 Board Of Regents Thioaptamers enable discovery of physiological pathways and new therapeutic strategies
RU2006106920A (ru) 2003-08-06 2007-09-20 Синомикс Инк. (Us) Гетеро-олигомерные вкусовые рецепторы t1r, клеточные линии, которые экспрессируют указанные рецепторы и вкусовые соединения
ATE447626T1 (de) 2003-09-18 2009-11-15 Nuevolution As Methode zur gewinnung struktureller informationen kodierter moleküle und zur selektion von verbindungen
WO2005029705A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
WO2005031305A2 (en) 2003-09-22 2005-04-07 Bioarray Solutions, Ltd. Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
WO2005035552A2 (en) * 2003-10-07 2005-04-21 Genzyme Corporation Transducing combinatorial peptide library
JP2007521017A (ja) 2003-10-28 2007-08-02 バイオアレイ ソリューションズ リミテッド 固定化捕捉プローブを用いる遺伝子発現分析法の最適化
EP1694859B1 (en) 2003-10-29 2015-01-07 Bioarray Solutions Ltd Multiplexed nucleic acid analysis by fragmentation of double-stranded dna
EP1694816B1 (en) 2003-11-07 2013-08-28 Ciphergen Biosystems, Inc. Biomarkers for alzheimer's disease
EP1701611B1 (en) 2003-12-24 2011-05-18 G2 Inflammation Pty Ltd Transgenic non-human mammal comprising a polynucleotide encoding human or humanized c5ar
US20050164167A1 (en) * 2004-01-28 2005-07-28 Buscher Benjamin A. Method of discovery and development of broad-spectrum antiviral drugs
US20050221339A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-06 Medical Research Council Harvard University Compartmentalised screening by microfluidic control
AU2005229015C1 (en) 2004-04-02 2013-01-17 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with alphaVbeta5 integrin
US7794713B2 (en) 2004-04-07 2010-09-14 Lpath, Inc. Compositions and methods for the treatment and prevention of hyperproliferative diseases
NZ550119A (en) 2004-04-08 2009-10-30 Biomatrica Inc Method for storing biological material in a dissolvable matrix
US20050239134A1 (en) * 2004-04-21 2005-10-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate single-stranded DNA aptamers for TGF-beta-1 protein
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
ATE438102T1 (de) * 2004-05-25 2009-08-15 2Curex Aps Identifizierung von eine zelluläre antwort modifizierenden verbindungen
EP1753871B1 (en) 2004-05-28 2015-07-15 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to psca proteins
EP2453024B1 (en) 2004-06-21 2017-12-06 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Genes and pathways differentially expressed in bipolar disorder and/or major depressive disorder
JP4507080B2 (ja) * 2004-07-30 2010-07-21 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
AU2005277648B2 (en) 2004-08-20 2011-12-22 Buck Institute For Age Research Small molecules that replace or agonize p53 function
US7968287B2 (en) * 2004-10-08 2011-06-28 Medical Research Council Harvard University In vitro evolution in microfluidic systems
US7850960B2 (en) 2004-12-30 2010-12-14 University Of Washington Methods for regulation of stem cells
US7547775B2 (en) 2004-12-31 2009-06-16 Affymetrix, Inc. Parallel preparation of high fidelity probes in an array format
US8338093B2 (en) * 2004-12-31 2012-12-25 Affymetrix, Inc. Primer array synthesis and validation
US20070207555A1 (en) * 2005-02-03 2007-09-06 Cesar Guerra Ultra-sensitive detection systems using multidimension signals
US20100196509A1 (en) 2005-02-28 2010-08-05 Jonathan Braun Methods for Diagnosis and Treatment of Endometrial Cancer
US20100240770A1 (en) * 2005-03-11 2010-09-23 Jifa Qi Synthesis and use of colloidal III-V nanoparticles
CA2601400A1 (en) 2005-03-19 2006-09-28 Medical Research Council Improvements in or relating to treatment and prevention of viral infections
US7989590B2 (en) 2005-03-22 2011-08-02 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd Peptides that increase collagen or hyaluronic acid production
EP1869230B1 (en) 2005-03-23 2017-08-30 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for purifying proteins
KR20080003390A (ko) 2005-03-31 2008-01-07 어젠시스 인코포레이티드 161ｐ2ｆ10ｂ 단백질과 결합하는 항체 및 관련 분자
US8318906B2 (en) 2005-04-15 2012-11-27 The Regents Of The University Of California EMP2 antibodies and their therapeutic uses
US20070099830A1 (en) 2005-04-21 2007-05-03 Massachusetts Institute Of Technology Sirt4 activities
US20070003954A1 (en) * 2005-05-12 2007-01-04 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Protein and antibody profiling using small molecule microarrays
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20070021433A1 (en) 2005-06-03 2007-01-25 Jian-Qiang Fan Pharmacological chaperones for treating obesity
HUE040063T2 (hu) 2005-07-19 2019-02-28 Stemgen S P A Tumor õssejtek tumorképzõ potenciáljának gátlása BMP-4 segítségével
US20090136918A1 (en) * 2005-08-16 2009-05-28 Heather Newkirk Quantification of microsphere suspension hybridization and uses thereof
US7943134B2 (en) 2005-08-31 2011-05-17 Academia Sinica Compositions and methods for identifying response targets and treating flavivirus infection responses
US7781209B2 (en) 2005-09-25 2010-08-24 Multispan, Inc. GPCR-expressing cell lines
ES2658859T3 (es) 2005-10-20 2018-03-12 Senomyx, Inc. Receptores del sabor dulce-umami y umami-dulce humanos quiméricos
US8119572B2 (en) 2005-10-24 2012-02-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for determining protein binding specificity using peptide libraries
JP2009514535A (ja) 2005-11-03 2009-04-09 レッドポイント バイオ コーポレイション Ｔｒｐｍ５イオンチャネルのためのハイスループットスクリーニングアッセイ
EA014900B1 (ru) 2005-11-07 2011-02-28 Зе Скрипс Ресеч Инститьют Композиции и способы контроля специфичности передачи сигналов, опосредуемой тканевым фактором
EP1951908B1 (en) 2005-11-12 2013-08-07 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Fgf2-related methods for diagnosing and treating depression
US7576037B2 (en) 2005-11-18 2009-08-18 Mei Technologies, Inc. Process and apparatus for combinatorial synthesis
DK3305900T3 (da) 2005-12-01 2021-10-25 Nuevolution As Enzymatic encoding methods for efficient synthesis of large libraries
GB2433591A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Method for functionalising a hydrophobic substrate
GB2433505A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk Capture agents for binding a ligand
GB2433506A (en) * 2005-12-20 2007-06-27 Sharp Kk A method of producing a multimeric capture agent
WO2007087113A2 (en) 2005-12-28 2007-08-02 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
JP2009536313A (ja) * 2006-01-11 2009-10-08 レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド ナノリアクターの形成および制御において使用するマイクロ流体デバイスおよび方法
US8859209B2 (en) * 2006-01-12 2014-10-14 Carviar Aps Reimmunization and antibody design
WO2007092777A2 (en) * 2006-02-02 2007-08-16 Wyeth Cloning, characterization, and application of tnfrsf19 in neurological disorders
US20100278821A1 (en) 2006-03-21 2010-11-04 The Regents Of The University Of California N-cadherin: target for cancer diagnosis and therapy
WO2007109347A2 (en) 2006-03-21 2007-09-27 The Regents Of The University Of California N-cadherin and ly6 e: targets for cancer diagnosis and therapy
WO2007124143A2 (en) * 2006-04-21 2007-11-01 Wyeth Methods for high-throughput screening of cell lines
DK3235811T3 (en) 2006-04-21 2018-11-12 Senomyx Inc PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF OXALAMIDS
WO2007129598A1 (ja) 2006-05-02 2007-11-15 Teikyo University グルタチオン増加物質のスクリーニング方法
EP2027158B1 (en) 2006-05-02 2012-09-19 Carviar ApS Method for immunizing an avian species
US9562837B2 (en) 2006-05-11 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Systems for handling microfludic droplets
US20080014589A1 (en) 2006-05-11 2008-01-17 Link Darren R Microfluidic devices and methods of use thereof
US7862812B2 (en) 2006-05-31 2011-01-04 Lpath, Inc. Methods for decreasing immune response and treating immune conditions
DK1865316T3 (da) 2006-06-07 2010-05-25 Nutrinova Gmbh Fremgangsmåde til screening af forbindelser, der modulerer aktiviteten af G-protein-koblede receptorer
US7572618B2 (en) 2006-06-30 2009-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Polynucleotides encoding novel PCSK9 variants
WO2008013861A2 (en) 2006-07-27 2008-01-31 Redpoint Bio Corporation Screening assay for inhibitors of trpa1 activation by a lower alkyl phenol
US9012390B2 (en) 2006-08-07 2015-04-21 Raindance Technologies, Inc. Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants
WO2008023840A2 (en) 2006-08-25 2008-02-28 Oncotherapy Science, Inc. Prognostic markers and therapeutic targets for lung cancer
EP2589961A3 (en) 2006-09-06 2013-08-07 The Regents of the University of California Molecular diagnosis and classification of malignant melanoma
US20090252745A1 (en) * 2006-09-15 2009-10-08 Duke University Amino acids in the HCV core polypeptide domain 3 and correlation with steatosis
WO2008060448A2 (en) 2006-11-10 2008-05-22 Massachusetts Institute Of Technology Small molecule pak inhibitors
US9316633B2 (en) 2006-11-16 2016-04-19 The Regents Of The University Of California Methods for identifying inhibitors of solute transporters
EP2114396A4 (en) 2006-12-29 2010-03-10 Salk Inst For Biological Studi METHOD FOR IMPROVING TRAINING PERFORMANCE
US20080176958A1 (en) 2007-01-24 2008-07-24 Insert Therapeutics, Inc. Cyclodextrin-based polymers for therapeutics delivery
US8772046B2 (en) 2007-02-06 2014-07-08 Brandeis University Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems
US8592221B2 (en) * 2007-04-19 2013-11-26 Brandeis University Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems
US20080269065A1 (en) * 2007-04-30 2008-10-30 Syntrix Biosystems, Inc. Conformationally Constrained Analytical Probes
KR101440153B1 (ko) * 2007-05-09 2014-09-15 재단법인서울대학교산학협력재단 펩타이드 라이브러리를 이용한 단백질 인산화 효소의기질특이성 분석 방법
CN101820757A (zh) 2007-06-01 2010-09-01 普林斯顿大学托管委员会 通过调节宿主细胞代谢途径治疗病毒感染
KR101607244B1 (ko) * 2007-06-11 2016-03-30 알. 로치 맥도날드 뇌혈관 연축의 예방을 위한 약물 전달 시스템
US10092524B2 (en) 2008-06-11 2018-10-09 Edge Therapeutics, Inc. Compositions and their use to treat complications of aneurysmal subarachnoid hemorrhage
US8334239B2 (en) * 2007-07-10 2012-12-18 The Board Of Regents Of The University Of Texas System High affinity VEGF-receptor antagonists
WO2009021077A2 (en) * 2007-08-06 2009-02-12 THE GOVERMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA. as represented by THE SECRETARY OF THE NAVY Beta helical peptide structures stable in aqueous and non-aqueous media and methods for preparing same
ES2477294T3 (es) 2007-08-13 2014-07-16 Baxter International Inc Modulación por IVIG de quimioquinas para el tratamiento de la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson
US8703161B2 (en) * 2007-08-13 2014-04-22 Elc Management, Llc Skin repair compositions comprising circadian gene activators and a synergistic combination of Sirt1 gene activators
CN101828111B (zh) 2007-08-21 2014-07-23 塞诺米克斯公司 人t2r苦味受体及其用途
US7875452B2 (en) 2007-10-01 2011-01-25 Redpoint Bio Corporation Non-desensitizing mutant of the transient receptor potential TRPM5 ion channel
CA2971794C (en) 2007-10-04 2020-03-24 Zymogenetics, Inc. B7 family member zb7h6 and related compositions and methods
US8609347B2 (en) 2007-10-22 2013-12-17 The Regents Of The University Of California Biomarkers for prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus
WO2010008411A1 (en) 2007-11-09 2010-01-21 The Salk Institute For Biological Studies Use of tam receptor inhibitors as immunoenhancers and tam activators as immunosuppressors
US20110015239A1 (en) 2007-12-14 2011-01-20 The Regents Of The University Of California Inhibitors of calcium-activated chloride channels
EP2077272A1 (en) * 2007-12-21 2009-07-08 Affibody AB Polypeptide libraries with a predetermined scaffold
US9187535B2 (en) 2007-12-19 2015-11-17 Affibody Ab Polypeptide derived from protein A and able to bind PDGF
EP2072525A1 (en) 2007-12-21 2009-06-24 Affibody AB New polypeptides having affinity for HER2
ES2424329T3 (es) 2008-03-05 2013-10-01 The Regents Of The University Of California Diagnóstico molecular y clasificación de melanoma maligno
KR101679082B1 (ko) 2008-03-17 2016-11-23 더 스크립스 리서치 인스티튜트 유도 만능 줄기 세포 생성을 위한 화학적 및 유전적 조합 접근법
WO2009131957A2 (en) 2008-04-21 2009-10-29 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising oxadiazole derivatives
JP5623384B2 (ja) 2008-04-21 2014-11-12 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 選択的高親和性リガンドおよびこれらを作製する方法
SG176464A1 (en) 2008-05-09 2011-12-29 Agency Science Tech & Res Diagnosis and treatment of kawasaki disease
CA2987102A1 (en) 2008-07-01 2010-01-07 Genocea Biosciences, Inc. Screening system
US12038438B2 (en) 2008-07-18 2024-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enzyme quantification
WO2010009365A1 (en) 2008-07-18 2010-01-21 Raindance Technologies, Inc. Droplet libraries
JP2011529708A (ja) 2008-08-04 2011-12-15 ユニバーシティ オブ マイアミ 自然免疫応答の調節因子ｓｔｉｎｇ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）
EP2350031A2 (en) 2008-08-20 2011-08-03 Ensemble Therapeutics Corporation Macrocyclic compounds for inhibition of tumor necrosis factor alpha
CA2738019A1 (en) 2008-09-23 2010-04-08 President And Fellows Of Harvard College Sirt4 and uses thereof
BRPI0919817A2 (pt) 2008-09-25 2019-02-26 Syngenta Participations Ag célula vegetal transgênica e planta a compreendendo, semente da dita planta, bem como métodos relacionados a expressão de uma proteína de osenod93
JP5390621B2 (ja) 2008-10-20 2014-01-15 グワンジュ・インスティテュート・オブ・サイエンス・アンド・テクノロジー 二座ペプチドバインダー
CA2779958A1 (en) 2008-11-06 2010-05-14 University Of Miami Role of soluble upar in the pathogenesis of proteinuric kidney disease
WO2010054379A2 (en) 2008-11-10 2010-05-14 The United States Of America, As Represensted By The Secretary, Department Of Health And Human Services Gene signature for predicting prognosis of patients with solid tumors
WO2010060599A1 (en) 2008-11-27 2010-06-03 Roche Diagnostics Gmbh Directed synthesis of oligophosphoramidate stereoisomers
BRPI0922345B1 (pt) 2008-12-03 2022-03-22 The Scripps Research Institute Composto, métodos in vitro para estabilizar uma célula animal isolada e para manter a sobrevivência da célula, e, composição
MX2011005910A (es) 2008-12-04 2011-06-17 Opko Curna Llc Tratamiento de enfermedades relacionadas con eritropoyetina (epo) mediante inhibicion del transcrito antisentido natural a eritropoyetina.
JP5971948B2 (ja) 2008-12-04 2016-08-17 クルナ・インコーポレーテッド Ｖｅｇｆに対する天然アンチセンス転写物の抑制による血管内皮増殖因子（ｖｅｇｆ）関連疾患の治療
CN102361985B (zh) 2008-12-04 2017-06-20 库尔纳公司 通过抑制肿瘤抑制基因的天然反义转录物治疗肿瘤抑制基因相关性疾病
WO2010077894A2 (en) 2008-12-16 2010-07-08 Bristol-Myers Squibb Company Methods of inhibiting quiescent tumor proliferation
CN102317442B (zh) 2008-12-17 2014-08-13 斯克里普斯研究所 干细胞的产生和保持
US20120165650A1 (en) 2010-12-22 2012-06-28 General Electric Company Her2 binders
CN101768213B (zh) 2008-12-30 2012-05-30 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种与植物分蘖数目相关的蛋白及其编码基因与应用
PT2396038E (pt) 2009-02-12 2016-02-19 Curna Inc Tratamento das doenças associadas com o factor neurotrófico derivado do cérebro (bdnf) por inibição do produto antisenso natural da transcrição para bdnf
CN101817879A (zh) 2009-02-26 2010-09-01 中国科学院遗传与发育生物学研究所 金属硫蛋白及其编码基因与应用
JP6116242B2 (ja) 2009-03-16 2017-04-19 クルナ・インコーポレーテッド 核因子（赤血球由来２）様２（ｎｒｆ２）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｎｒｆ２関連疾患の治療
US9708604B2 (en) 2009-03-17 2017-07-18 Curna, Inc. Treatment of delta-like 1 homolog (DLK1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to DLK1
US8528589B2 (en) 2009-03-23 2013-09-10 Raindance Technologies, Inc. Manipulation of microfluidic droplets
BRPI1014121A2 (pt) 2009-03-27 2016-11-08 Gojo Ind Inc composições e métodos para investigação e uso de compostos que antagonizam as interações esporo-superfície
US8343976B2 (en) 2009-04-20 2013-01-01 Institute For Oneworld Health Compounds, compositions and methods comprising pyrazole derivatives
JP6250930B2 (ja) 2009-05-06 2017-12-20 クルナ・インコーポレーテッド トリステトラプロリン（ｔｔｐ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるｔｔｐ関連疾患の治療
KR101835889B1 (ko) 2009-05-06 2018-03-08 큐알엔에이, 인크. 지질 수송 및 대사 유전자에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의해 지질 수송 및 대사 유전자 관련된 질환의 치료
CA2761248C (en) 2009-05-08 2023-03-14 Joseph Collard Treatment of dystrophin family related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dmd family
NO2432881T3 (sk) 2009-05-18 2018-04-14
CN102549158B (zh) 2009-05-22 2017-09-26 库尔纳公司 通过抑制针对转录因子e3(tfe3)的天然反义转录物来治疗tfe3和胰岛素受体底物蛋白2(irs2)相关的疾病
US8791085B2 (en) 2009-05-28 2014-07-29 Curna, Inc. Treatment of antiviral gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an antiviral gene
CN102612560B (zh) 2009-06-16 2017-10-17 库尔纳公司 通过抑制针对对氧磷酶1(pon1)的天然反义转录物来治疗pon1相关的疾病
CN102695797B (zh) 2009-06-16 2018-05-25 库尔纳公司 通过抑制针对胶原基因的天然反义转录物来治疗胶原基因相关的疾病
ES2618894T3 (es) 2009-06-24 2017-06-22 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con el receptor del factor de necrosis tumoral 2 (tnfr2) por inhibición del transcrito natural antisentido para tnfr2
JP5907866B2 (ja) 2009-06-26 2016-04-26 クルナ・インコーポレーテッド ダウン症候群遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるダウン症候群遺伝子関連疾患の治療
US20120122711A1 (en) * 2009-07-15 2012-05-17 Heath James R Screening of biopolymers
CN102498123A (zh) * 2009-07-15 2012-06-13 新加坡科技研究局 改进的生物聚合物筛选
KR20120089637A (ko) 2009-07-22 2012-08-13 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 동질량의 아미노산 및 기타 종의 분별
AU2010275367B2 (en) 2009-07-24 2015-09-03 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating and preventing disease associated with avB5 integrin
KR101801407B1 (ko) 2009-07-24 2017-11-24 큐알엔에이, 인크. 시르투인 (ｓｉｒｔ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 시르투인 관련된 질환의 치료
ES2585360T3 (es) 2009-08-05 2016-10-05 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con un gen de la insulina (INS) por inhibición de la transcripción antisentido natural en un gen de la insulina (INS)
JP6189594B2 (ja) 2009-08-11 2017-08-30 クルナ・インコーポレーテッド アディポネクチン（ａｄｉｐｏｑ）に対する天然アンチセンス転写物の抑制によるアディポネクチン（ａｄｉｐｏｑ）関連疾患の治療
DK3444613T3 (da) 2009-08-14 2021-06-21 Univ California Fremgangsmåder til diagnosticering og behandling af autisme
US20120148604A1 (en) 2009-08-20 2012-06-14 Transposagen Biopharmaceuticals, Inc. Trp inhibitors and uses thereof
KR101805213B1 (ko) 2009-08-21 2017-12-06 큐알엔에이, 인크. Ｃｈｉｐ에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 “ｈｓｐ70-상호작용 단백질(ｃｈｉｐ)의 ｃ-말단” 관련된 질환의 치료
WO2011028390A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 St. Jude Children's Research Hospital Compositions and methods for potentiating interleukin-35
CN102482671B (zh) 2009-08-25 2017-12-01 库尔纳公司 通过抑制‘含有iq模体的gtp酶激活蛋白’(iqgap)的天然反义转录物而治疗iqgap相关疾病
DK2480669T3 (en) 2009-09-25 2018-02-12 Curna Inc TREATMENT OF FILAGGRIN- (FLG) RELATED DISEASES BY MODULATING FLG EXPRESSION AND ACTIVITY
WO2011042564A1 (en) 2009-10-09 2011-04-14 Universite De Strasbourg Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof
ES2365343B1 (es) 2009-11-19 2012-07-10 Fundación Centro Nacional De Investigaciones Cardiovasculares Carlos Iii Uso de cd98 como marcador de receptividad endometrial.
CA2781290A1 (en) 2009-11-20 2011-05-26 Lynn K. Gordon Epithelial membrane protein-2 (emp2) and proliferative vitreoretinopathy (pvr)
CN104208716A (zh) * 2009-11-23 2014-12-17 天蓝制药公司 用于传递治疗剂的基于环糊精的聚合物
ES2661813T3 (es) 2009-12-16 2018-04-04 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con la peptidasa del factor de transcripción de membrana, sitio 1 (mbtps1) mediante inhibición del transcrito antisentido natural al gen mbtps1
KR101891352B1 (ko) 2009-12-23 2018-08-24 큐알엔에이, 인크. 간세포 성장 인자(ｈｇｆ)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 ｈｇｆ 관련 질환의 치료
KR101793753B1 (ko) 2009-12-23 2017-11-03 큐알엔에이, 인크. 커플링방지 단백질 ２(ｕｃｐ２)에 대한 천연 안티센스 전사체의 저해에 의한 ｕｃｐ２ 관련 질환의 치료
US10837883B2 (en) 2009-12-23 2020-11-17 Bio-Rad Laboratories, Inc. Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets
KR101838305B1 (ko) 2009-12-29 2018-03-13 큐알엔에이, 인크. ＮＲＦ1(Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ 1)에 대한 천연 안티센스 전사체의 억제에 의한 핵 호흡 인자 1 관련된 질환의 치료
RU2611186C2 (ru) 2009-12-29 2017-02-21 Курна, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ БЕЛКОМ 63 (р63), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К р63
CN102791862B (zh) 2009-12-31 2017-04-05 库尔纳公司 通过抑制胰岛素受体底物2(irs2)和转录因子e3(tfe3)的天然反义转录物而治疗irs2相关疾病
NO2521784T3 (sk) 2010-01-04 2018-05-05
JP5963680B2 (ja) 2010-01-06 2016-08-03 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド 膵臓発生遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の阻害による膵臓発生遺伝子疾患の治療
US9200277B2 (en) 2010-01-11 2015-12-01 Curna, Inc. Treatment of sex hormone binding globulin (SHBG) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to SHBG
US9073033B2 (en) 2010-01-19 2015-07-07 Illumina, Inc. Methods and compositions for processing chemical reactions
DK2529015T3 (en) 2010-01-25 2018-02-26 Curna Inc TREATMENT OF RNASE H1-RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO RNASE H1
WO2011091435A2 (en) 2010-01-25 2011-07-28 Mount Sinai School Of Medicine Methods of treating liver disease
WO2011094759A2 (en) 2010-02-01 2011-08-04 The Regents Of The University Of California Novel diagnostic and therapeutic targets associated with or regulated by n-cadherin expression and/or epithelial to mesenchymal transition (emt) in prostate cancer and other malignancies
US10351905B2 (en) 2010-02-12 2019-07-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analyte analysis
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
US9399797B2 (en) 2010-02-12 2016-07-26 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
WO2011100604A2 (en) 2010-02-12 2011-08-18 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
CN102844435B (zh) 2010-02-22 2017-05-10 库尔纳公司 通过抑制吡咯啉‑5‑羧酸还原酶1(pycr1)的天然反义转录物而治疗pycr1相关疾病
RU2612884C2 (ru) 2010-04-02 2017-03-13 Курна, Инк. Лечение заболеваний, связанных с колониестимулирующим фактором 3 (csf3), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта k csf3
JP5978203B2 (ja) 2010-04-09 2016-08-24 カッパーアールエヌエー，インコーポレイテッド Ｆｇｆ２１に対する天然アンチセンス転写物の阻害による線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ２１）線維芽細胞増殖因子ｆｇｆ２１）関連疾患の治療
LT2558577T (lt) 2010-04-16 2019-03-12 Nuevolution A/S Bifunkciniai kompleksai ir tokių kompleksų gamybos ir naudojimo būdai
CN107988228B (zh) 2010-05-03 2022-01-25 库尔纳公司 通过抑制沉默调节蛋白(sirt)的天然反义转录物而治疗沉默调节蛋白(sirt)相关疾病
TWI531370B (zh) 2010-05-14 2016-05-01 可娜公司 藉由抑制ｐａｒ４天然反股轉錄本治療ｐａｒ４相關疾病
CN102971423B (zh) 2010-05-26 2018-01-26 库尔纳公司 通过抑制蛋氨酸硫氧化物还原酶a(msra)的天然反义转录物而治疗msra相关疾病
CN102947451B (zh) 2010-05-26 2017-09-22 库尔纳公司 通过抑制无调同源物1(atoh1)的天然反义转录物而治疗atoh1相关疾病
EP2400304A1 (en) 2010-06-22 2011-12-28 Centro de Investigación Cooperativa En Biomateriales ( CIC biomaGUNE) Method for the characterization of intermolecular interactions
US9771579B2 (en) 2010-06-23 2017-09-26 Curna, Inc. Treatment of sodium channel, voltage-gated, alpha subunit (SCNA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to SCNA
DK2593547T3 (en) 2010-07-14 2018-02-26 Curna Inc Treatment of Discs large homolog (DLG) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to DLG
WO2012018639A2 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012018638A2 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
WO2012026887A1 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Agency For Science, Technology And Research Peptide libraries for screening and other applications
US9562897B2 (en) 2010-09-30 2017-02-07 Raindance Technologies, Inc. Sandwich assays in droplets
CA2813901C (en) 2010-10-06 2019-11-12 Curna, Inc. Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4
WO2012052391A1 (en) 2010-10-19 2012-04-26 Glaxo Group Limited Polypeptide with jmjd3 catalytic activity
CA2815212A1 (en) 2010-10-22 2012-04-26 Curna, Inc. Treatment of alpha-l-iduronidase (idua) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to idua
WO2012068340A2 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Opko Curna Llc Antagonat compositions and methods of use
EP2643484A4 (en) 2010-11-22 2014-04-16 Univ California METHOD OF IDENTIFYING AN RNA TRANSCRIPTION OF CELLULAR ORIGIN
US8987225B2 (en) 2010-11-23 2015-03-24 Curna, Inc. Treatment of NANOG related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NANOG
JP6182456B2 (ja) 2010-12-22 2017-08-23 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 単細胞選別のための細胞培養プラットホームおよびｉＰＳＣの再プログラミングの増強
WO2012109495A1 (en) 2011-02-09 2012-08-16 Metabolic Solutions Development Company, Llc Cellular targets of thiazolidinediones
US9364803B2 (en) 2011-02-11 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Methods for forming mixed droplets
EP3736281A1 (en) 2011-02-18 2020-11-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
ES2716865T3 (es) 2011-02-18 2019-06-17 Scripps Research Inst Diferenciación dirigida de células precursoras de oligodendrocitos a un destino celular mielinizante
CA2828411A1 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Intrexon Corporation Vectors conditionally expressing protein
WO2012119989A2 (en) 2011-03-04 2012-09-13 Oryzon Genomics, S.A. Methods and antibodies for the diagnosis and treatment of cancer
CA2832501A1 (en) 2011-04-05 2012-10-11 R. Loch Macdonald Intraventricular drug delivery system for improving outcome after a brain injury affecting cerebral blood flow
US20120301904A1 (en) 2011-04-26 2012-11-29 Prosetta Antiviral, Inc Multiprotein assemblies
CA2835942C (en) 2011-05-19 2019-01-22 Sequenom, Inc. Products and processes for multiplex nucleic acid identification
EP2714970B1 (en) 2011-06-02 2017-04-19 Raindance Technologies, Inc. Enzyme quantification
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
US9561274B2 (en) 2011-06-07 2017-02-07 University Of Hawaii Treatment and prevention of cancer with HMGB1 antagonists
WO2012170740A2 (en) 2011-06-07 2012-12-13 University Of Hawaii Biomarker of asbestos exposure and mesothelioma
KR102043422B1 (ko) 2011-06-09 2019-11-11 큐알엔에이, 인크. 프라탁신 (fxn)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 프라탁신 (fxn) 관련된 질환의 치료
US8658430B2 (en) 2011-07-20 2014-02-25 Raindance Technologies, Inc. Manipulating droplet size
WO2013018690A1 (ja) 2011-07-29 2013-02-07 国立大学法人徳島大学 Erap1由来ペプチド及びその使用
MX370814B (es) 2011-09-02 2020-01-08 Univ California Pirazolo[3,4-d]pirimidinas sustituidas y usos de las mismas.
KR101991980B1 (ko) 2011-09-06 2019-06-21 큐알엔에이, 인크. 소형 분자로 전압-개폐된 나트륨 채널 (SCNxA)의 알파 아단위에 관련된 질환의 치료
SG10201508662SA (en) 2011-10-28 2015-11-27 Presage Biosciences Inc Methods for drug delivery
DK2790687T3 (en) 2011-12-16 2018-11-19 Poseida Therapeutics Inc TRPC4 MODULATORS FOR USE IN TREATMENT OR PREVENTION OF Pain
JP6012767B2 (ja) 2012-02-07 2016-10-25 ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー 基板、ペプチドアレイ、および方法
US9708411B2 (en) 2012-02-16 2017-07-18 The Penn Research Foundation Modulators of acyl-CoA lysocardiolipin acyltransferase 1 (ALCAT1) and uses thereof
EP2825209B1 (en) 2012-03-14 2018-08-29 University of Central Florida Research Foundation, Inc. Neurofibromatoses therapeutic agents and screening for same
CN110438125A (zh) 2012-03-15 2019-11-12 科纳公司 通过抑制脑源神经营养因子(bdnf)的天然反义转录物治疗bdnf相关疾病
EP2836482B1 (en) 2012-04-10 2019-12-25 The Regents of The University of California Compositions and methods for treating cancer
WO2013162772A2 (en) 2012-04-24 2013-10-31 University Of Miami Perforin 2 defense against invasive and multidrug resistant pathogens
US9399019B2 (en) 2012-05-09 2016-07-26 Evonik Corporation Polymorph compositions, methods of making, and uses thereof
US9347948B2 (en) 2012-06-04 2016-05-24 The Scripps Research Institute Phenyl glyoxal probes
WO2014018535A1 (en) 2012-07-25 2014-01-30 Salk Institute For Biological Studies Regulating the interaction between tam ligands and lipid membranes with exposed phosphatidylserine
US9750705B2 (en) 2012-08-31 2017-09-05 The Regents Of The University Of California Agents useful for treating obesity, diabetes and related disorders
CN104995192A (zh) 2012-09-26 2015-10-21 加利福尼亚大学董事会 Ire1的调节
US10006909B2 (en) 2012-09-28 2018-06-26 Vibrant Holdings, Llc Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis
WO2014055493A1 (en) 2012-10-02 2014-04-10 Cerulean Pharma Inc. Methods and systems for polymer precipitation and generation of particles
AU2013204200B2 (en) 2012-10-11 2016-10-20 Brandeis University Treatment of amyotrophic lateral sclerosis
US20140120116A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 The Chinese University Of Hong Kong Treatment of cancer using smad3 inhibitor
CA2889765C (en) 2012-10-26 2021-06-22 Minna D. BALBAS Androgen receptor variants and methods for making and using
US10286376B2 (en) 2012-11-14 2019-05-14 Vibrant Holdings, Llc Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis
AU2013359429A1 (en) * 2012-12-10 2015-07-09 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for screening
EP3249054A1 (en) 2012-12-20 2017-11-29 Biomatrica, INC. Formulations and methods for stabilizing pcr reagents
EP2954323B1 (en) 2013-02-07 2020-04-15 The Regents of The University of California Use of translational profiling to identify target molecules for therapeutic treatment
JP5981667B2 (ja) 2013-02-15 2016-08-31 ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー 増幅された電気化学発光検出のための方法および組成物
WO2014144844A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University tRNA DERIVED SMALL RNAs (tsRNAs) INVOLVED IN CELL VIABILITY
US9227978B2 (en) 2013-03-15 2016-01-05 Araxes Pharma Llc Covalent inhibitors of Kras G12C
WO2014172661A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 The Regent Of The University Of California Lone star virus
US10626178B2 (en) 2013-08-21 2020-04-21 Raz Yirmiya Treatment of mood and stress related disorders
WO2015025323A1 (en) 2013-08-21 2015-02-26 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Treatment of mood and stress related disorders
US11901041B2 (en) 2013-10-04 2024-02-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Digital analysis of nucleic acid modification
JO3805B1 (ar) 2013-10-10 2021-01-31 Araxes Pharma Llc مثبطات كراس جي12سي
US9644037B2 (en) 2013-10-18 2017-05-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibodies that specifically bind ataxia telangiectasia-mutated and RAD3-related kinase phosphorylated at position 1989 and their use
ES2713196T3 (es) 2013-12-11 2019-05-20 Biogen Ma Inc Compuestos de biarilo útiles para el tratamiento de enfermedades humanas en oncología, neurología e inmunología
CN105979780A (zh) 2013-12-11 2016-09-28 斯隆-凯特林癌症研究院 治疗前列腺癌的糖皮质激素抑制剂
US9944977B2 (en) 2013-12-12 2018-04-17 Raindance Technologies, Inc. Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample
US11193176B2 (en) 2013-12-31 2021-12-07 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species
KR20240091064A (ko) 2014-03-04 2024-06-21 페이트 세러퓨틱스, 인코포레이티드 개선된 재프로그래밍 방법 및 세포 배양 플랫폼
WO2015136509A2 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Genesis Theranostix Korlatolt Felelossegu Tarsasag Diagnostic and therapeutic targets for preeclampsia and closely related complications of pregnancy
ES2891555T3 (es) 2014-06-10 2022-01-28 Biomatrica Inc Estabilización de trombocitos a temperaturas ambiente
JO3556B1 (ar) 2014-09-18 2020-07-05 Araxes Pharma Llc علاجات مدمجة لمعالجة السرطان
US10011600B2 (en) 2014-09-25 2018-07-03 Araxes Pharma Llc Methods and compositions for inhibition of Ras
JP2017528498A (ja) 2014-09-25 2017-09-28 アラクセス ファーマ エルエルシー Ｋｒａｓ ｇ１２ｃ変異体タンパク質のインヒビター
CN107849022A (zh) 2015-04-10 2018-03-27 亚瑞克西斯制药公司 取代的喹唑啉化合物和其使用方法
EP3283462B1 (en) 2015-04-15 2020-12-02 Araxes Pharma LLC Fused-tricyclic inhibitors of kras and methods of use thereof
CN114540470A (zh) 2015-04-24 2022-05-27 基纳生物技术有限公司 用于次要等位基因和多态性的鉴定和定量的多重化方法
CN107787371B (zh) 2015-04-24 2022-02-01 基纳生物技术有限公司 检测和定量次要变体的并行式方法
US10196701B2 (en) 2015-06-01 2019-02-05 The Penn State Research Foundation Hepatitis B virus capsid assembly
US20160370380A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Pharmaseq, Inc. Combinatorial antibody diagnostic
US10851423B2 (en) 2015-06-22 2020-12-01 Proteovista Llc SNP arrays
EP3314260B1 (en) 2015-06-24 2021-04-21 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Methods for detecting protein-protein interactions
US10144724B2 (en) 2015-07-22 2018-12-04 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use thereof
US10647981B1 (en) 2015-09-08 2020-05-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Nucleic acid library generation methods and compositions
EP3356347A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10689356B2 (en) 2015-09-28 2020-06-23 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
EP3356354A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
US10975071B2 (en) 2015-09-28 2021-04-13 Araxes Pharma Llc Inhibitors of KRAS G12C mutant proteins
WO2017058792A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
WO2017058728A1 (en) 2015-09-28 2017-04-06 Araxes Pharma Llc Inhibitors of kras g12c mutant proteins
EP3356351A1 (en) 2015-09-28 2018-08-08 Araxes Pharma LLC Inhibitors of kras g12c mutant proteins
CN117737124A (zh) 2015-10-16 2024-03-22 菲特治疗公司 用于诱导和维护基态多能性的平台
WO2017070256A2 (en) 2015-10-19 2017-04-27 Araxes Pharma Llc Method for screening inhibitors of ras
US10414757B2 (en) 2015-11-16 2019-09-17 Araxes Pharma Llc 2-substituted quinazoline compounds comprising a substituted heterocyclic group and methods of use thereof
EP4242628A3 (en) 2015-12-08 2023-11-08 Biomatrica, INC. Reduction of erythrocyte sedimentation rate
US9988357B2 (en) 2015-12-09 2018-06-05 Araxes Pharma Llc Methods for preparation of quinazoline derivatives
JP2019518017A (ja) 2016-02-09 2019-06-27 アレクサンダー・クランツ トレースレス親和性標識を使用したタンパク質の部位選択的官能化
WO2017172979A1 (en) 2016-03-30 2017-10-05 Araxes Pharma Llc Substituted quinazoline compounds and methods of use
US10646488B2 (en) 2016-07-13 2020-05-12 Araxes Pharma Llc Conjugates of cereblon binding compounds and G12C mutant KRAS, HRAS or NRAS protein modulating compounds and methods of use thereof
WO2018036503A1 (en) 2016-08-25 2018-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Fecal bacterial markers for colorectal cancer
CN110036010A (zh) 2016-09-29 2019-07-19 亚瑞克西斯制药公司 Kras g12c突变蛋白的抑制剂
US10726944B2 (en) 2016-10-04 2020-07-28 International Business Machines Corporation Recommending novel reactants to synthesize chemical products
CN110312711A (zh) 2016-10-07 2019-10-08 亚瑞克西斯制药公司 作为ras抑制剂的杂环化合物及其使用方法
WO2018112420A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for treating cancer
WO2018140512A1 (en) 2017-01-26 2018-08-02 Araxes Pharma Llc Fused bicyclic benzoheteroaromatic compounds and methods of use thereof
US11279689B2 (en) 2017-01-26 2022-03-22 Araxes Pharma Llc 1-(3-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)benzofuran-2-yl)azetidin-1 yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as KRAS G12C modulators for treating cancer
CN110382482A (zh) 2017-01-26 2019-10-25 亚瑞克西斯制药公司 稠合的杂-杂二环化合物及其使用方法
EP3573970A1 (en) 2017-01-26 2019-12-04 Araxes Pharma LLC 1-(6-(3-hydroxynaphthalen-1-yl)quinazolin-2-yl)azetidin-1-yl)prop-2-en-1-one derivatives and similar compounds as kras g12c inhibitors for the treatment of cancer
US11358959B2 (en) 2017-01-26 2022-06-14 Araxes Pharma Llc Benzothiophene and benzothiazole compounds and methods of use thereof
WO2018170464A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 The Johns Hopkins University Targeted epigenetic therapy against distal regulatory element of tgfb2 expression
EP3601326A4 (en) 2017-03-20 2020-12-16 The Broad Institute, Inc. COMPOUNDS AND METHODS OF REGULATING INSULIN SECRETION
AU2018240199A1 (en) 2017-03-20 2019-10-17 Genocea Biosciences, Inc. Treatment methods
CN110869358A (zh) 2017-05-25 2020-03-06 亚瑞克西斯制药公司 Kras的共价抑制剂
EP3630747A1 (en) 2017-05-25 2020-04-08 Araxes Pharma LLC Quinazoline derivatives as modulators of mutant kras, hras or nras
TW201906832A (zh) 2017-05-25 2019-02-16 美商亞瑞克西斯製藥公司 用於癌症治療之化合物及其使用方法
US10538808B2 (en) 2017-05-26 2020-01-21 Vibrant Holdings, Llc Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing
ES2947336T3 (es) 2017-09-01 2023-08-07 Univ Johns Hopkins Terapia epigenética dirigida para el aneurisma aórtico hereditario
WO2019070908A1 (en) 2017-10-03 2019-04-11 Cedars-Sinai Medical Center METHODS OF TARGETING THE PD1 PATHWAY OF THE IMMUNE CONTROL POINT FOR THE TREATMENT OF PULMONARY FIBROSIS
JP2021502418A (ja) 2017-11-04 2021-01-28 アドバンスト・プロテオーム・セラピューティクス・インコーポレイテッド ポリペプチドを修飾するための組成物及び方法
JP2022512897A (ja) 2018-10-29 2022-02-07 ジェノセア バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド 治療方法
US20210395751A1 (en) 2018-10-31 2021-12-23 The University Of Sydney Compositions and methods for treating viral infections
US11325978B2 (en) 2018-11-06 2022-05-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Compositions and methods for treating beta-globinopathies
CN113365661A (zh) 2019-01-31 2021-09-07 新加坡科技研究局 用于治疗或预防癌症的cnx/erp57抑制剂
WO2020232029A1 (en) 2019-05-13 2020-11-19 Iovance Biotherapeutics, Inc. Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy
RU2699563C1 (ru) * 2019-05-29 2019-09-06 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт-ПИЯФ) Модифицированный синтетический аналог природного опиоидного пептида энкефалина
DE102020202529A1 (de) * 2020-02-27 2021-09-02 Robert Bosch Gesellschaft mit beschränkter Haftung Verfahren zur Identifikation einer Wirkstoffkombination
US11965162B2 (en) 2020-04-16 2024-04-23 The Johns Hopkins University MicroRNA and inhibitors thereof and methods of treatment
WO2023081167A2 (en) 2021-11-02 2023-05-11 The Regents Of The University Of California P-selectin mutants and modulation of integrin-mediated signaling
WO2023086969A2 (en) 2021-11-12 2023-05-19 Ichor Medical Systems Inc. Treatment methods
WO2023146807A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 The Regents Of The University Of California Vegf mutants and modulation of integrin-mediated signaling
WO2024197185A1 (en) 2023-03-21 2024-09-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for dissecting organelle physiology

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4392997A (en) * 1981-07-06 1983-07-12 Northwestern University Antigenic peptide compounds
US4618598A (en) * 1982-04-12 1986-10-21 Duke University Method of regulating hormone function or release
NZ207394A (en) * 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4703008A (en) * 1983-12-13 1987-10-27 Kiren-Amgen, Inc. DNA sequences encoding erythropoietin
US4555101A (en) * 1984-03-13 1985-11-26 Stobb, Inc. Method and apparatus for separating signatures from a stack
US4590003A (en) * 1984-03-23 1986-05-20 Oncogen Platelet related growth regulator
US4569792A (en) * 1984-06-14 1986-02-11 Eli Lilly And Company Anti-diabetic compounds
US4625014A (en) * 1984-07-10 1986-11-25 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Cell-delivery agent
WO1986000991A1 (en) * 1984-07-24 1986-02-13 Commonwealth Serum Laboratories Commission Method for determining mimotopes
US4798787A (en) * 1984-09-19 1989-01-17 Cetus Corporation Peptide antibodies and their use in detecting oncogene products
US4705777A (en) * 1985-02-25 1987-11-10 The Regents Of The University Of California Cationic oligopeptides having microbicidal activity
US4863857A (en) * 1985-03-01 1989-09-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Polypeptide complementary to peptides or proteins having an amino acid sequence or nucleotide coding sequence at least partially known
US4631211A (en) * 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
WO1986006487A1 (en) * 1985-04-22 1986-11-06 Commonwealth Serum Laboratories Commission Method for determining mimotopes
NZ215865A (en) * 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
US4710489A (en) * 1985-04-22 1987-12-01 Cornell Research Foundation, Inc. Glutathione delivery system
CS256960B1 (en) * 1985-11-16 1988-04-15 Viktor Krchnak Peptides with properties of antigenic determinants and method of their production
US4780421A (en) * 1986-04-03 1988-10-25 Sclavo Inc. Cleavable labels for use in binding assays
US4837304A (en) * 1987-05-22 1989-06-06 Merck & Co., Inc. Inhibitor of ribonucleotide reductase
ATE152244T1 (de) * 1987-10-13 1997-05-15 Terrapin Tech Inc Verfahren zur herstellung von imunodiagnose- mitteln
ATE167301T1 (de) * 1988-03-24 1998-06-15 Terrapin Tech Inc Gruppe von getrennten peptiden
US5010175A (en) * 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
JP3042626B2 (ja) * 1988-05-24 2000-05-15 ゲゼルシャフト フュア バイオテクノロギッシェ フォーシュング エムベーハー（ゲーベーエフ） オリゴヌクレオチドバンクを用いるｄｎａ塩基配列の決定法
US4988625A (en) * 1988-11-09 1991-01-29 Merck & Co., Inc. Method for determining the functionalization of a solid support
CA2009996A1 (en) * 1989-02-17 1990-08-17 Kathleen S. Cook Process for making genes encoding random polymers of amino acids
US5182366A (en) * 1990-05-15 1993-01-26 Huebner Verena D Controlled synthesis of peptide mixtures using mixed resins
US5650489A (en) * 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP0542770B1 (en) 1999-01-27
AU659091B2 (en) 1995-05-11
NO930011D0 (no) 1993-01-04
KR100245767B1 (ko) 2000-03-15
CZ407392A3 (en) 1993-10-13
NO315002B1 (no) 2003-06-23
EP0542770A4 (en) 1993-09-15
FI107995B (fi) 2001-11-15
NO930011L (no) 1993-02-22
IL98682A0 (en) 1992-07-15
FI925986A0 (fi) 1992-12-31
DE69130828T2 (de) 1999-06-17
DK0542770T3 (da) 1999-09-13
HUT63576A (en) 1993-09-28
ES2126572T3 (es) 1999-04-01
US5650489A (en) 1997-07-22
DE69130828D1 (de) 1999-03-11
IL98682A (en) 1997-02-18
SK407392A3 (en) 1994-08-10
NZ238805A (en) 1994-07-26
GR3029443T3 (en) 1999-05-28
AU2845495A (en) 1996-05-16
CA2086672A1 (en) 1992-01-03
US5510240A (en) 1996-04-23
CA2086672C (en) 2005-04-12
KR100222146B1 (en) 1999-10-01
US5858670A (en) 1999-01-12
EP0542770A1 (en) 1993-05-26
RO112336B1 (ro) 1997-08-29
PL169616B1 (pl) 1996-08-30
HU218007B (hu) 2000-05-28
HU9204179D0 (en) 1993-04-28
AU8238591A (en) 1992-01-23
WO1992000091A1 (en) 1992-01-09
AU683762B2 (en) 1997-11-20
CZ289365B6 (cs) 2002-01-16
IE912299A1 (en) 1992-01-15
AU2836995A (en) 1995-12-07
FI925986A (fi) 1992-12-31
MX9100052A (es) 1992-02-28
ATE176330T1 (de) 1999-02-15
PL168354B1 (pl) 1996-02-29
JPH06500308A (ja) 1994-01-13
JP3552718B2 (ja) 2004-08-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK281490B6 (sk) Banka oligomérov, spôsob jej vytvárania a spôsob určenia sekvencie bio-oligomérového ligandu
AU750244B2 (en) Modular protein libraries and methods of preparation
JP3523252B2 (ja) 等モル多種オリゴマー混合物、特にオリゴペプチド混合物の合成
EP0639584B1 (en) Preparation and screening of highly diverse peptide libraries for binding activity
JPH09501490A (ja) 位相学的に分離された、コードされた固相ライブラリー
US5948693A (en) Solid phase synthesis of immunosuppressive agents
CA2399032A1 (en) Ligands for fpr class receptors that induce a host immune response to a pathogen or inhibit hiv infection
US5639852A (en) Immunostimulatory agents
WO1994018345A1 (en) Receptor-binding antiproliferative peptides
EP0138616A2 (en) Nona- and dodecapeptides for augmenting natural killer cell activity, processes for making them and pharmaceutical compositions comprising them
RU2145233C1 (ru) Неупорядоченная библиотека пептидов, способ ее получения и способ идентификации пептида, синтезированного твердофазным синтезом
Hruby et al. Applications of synthetic peptides
Darlot Design of modulatory peptides against chemokines
Stokes New methods for the synthesis of biologically active cyclosporins

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Expiry date: 20110701