KR101440153B1 - 펩타이드 라이브러리를 이용한 단백질 인산화 효소의기질특이성 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 ⅰ) 하나의 지지체 수지 표면에 아미노산 서열이 서로 동일한 펩타이드들을 다수 개 생성시켜 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계; ⅱ) 아미노산 서열을 달리하면서 ⅰ)단계를 수차례 반복하여 각각의 지지체 수지별로는 아미노산 서열이 서로 상이한, 무작위 펩타이드 라이브러리들의 혼성체를 형성하는 단계; ⅲ) 상기 펩타이드 라이브러리들의 혼성체에 인산화 효소를 반응시켜 인산화된 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계; ⅳ) 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나가 결합되어 있고 인산화된 아미노산에만 선택적으로 결합하는 항체를 상기 인산화된 펩타이드 라이브러리에 반응시키고, 이 반응 혼합물에 선택적으로 작용하는 기질을 가하는 단계; ⅴ) 상기 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나와 상기 기질의 반응에 의하여 나타나는 물성의 변화를 감지하여 물성의 변화를 일으킨 펩타이드 라이브러리가 존재하는 고체상 지지체 수지만을 선별해 내는 단계; ⅵ) 상기 분리된 고체상 지지체 수지에서 펩타이드를 분리시키고, 이렇게 분리된 펩타이드의 아미노산 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법에 대한 것이다.
인산화 효소

Description

펩타이드 라이브러리를 이용한 단백질 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법 {Process for Identification of Kinase Substrate Specificity by Using Peptide Library}
도 1은 본 발명에 따른 라이브러리 비드의 개념도이다.
도 2는 본 발명에 따른 KIPP-MS 방법을 사용하여 인산화 효소의 기질특이성을 규명하는 과정의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 방법에 따른 질량분석 결과를 나타낸다.
도 4는 p60c - src 은 티로신 인산화 효소에 의해 인산화된 시퀀스를 MALDI-TOF로 분석한 결과이다.
도 5는 p60c - src 은 티로신 인산화 효소의 위치별 아미노산 출현 빈도수를 통계적으로 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 ZAP-70 은 티로신 인산화 효소에 의해 인산화된 시퀀스를 MALDI-TOF로 분석한 결과이다.
도 7은 ZAP-70 은 티로신 인산화 효소의 위치별 아미노산의 출현 빈도수를 통계적으로 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 NCBI human 단백질 데이터베이스 조사를 통해 KIPP-MS 를 통해 밝힌 티로신 인산화 효소 ZAP-70의 기질특이성 시퀀스와 일치하는 단백질들이다.
도 9의 (a)는 p60c - src 은 티로신 인산화 효소의 활성 부위에 KIPP-MS를 통해 얻어진 최적의 기질 펩타이드의 3차원 도킹 연구 결과이다. 제 9도의 (b)는 ZAP-70 은 티로신 인산화 효소의 활성 부위에 KIPP-MS를 통해 얻어진 최적의 기질 펩타이드의 3차원 도킹 연구 결과이다.
본 발명은 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 ⅰ) 하나의 지지체 수지 표면에 아미노산 서열이 서로 동일한 펩타이드들을 다수 개 생성시켜 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계; ⅱ) 아미노산 서열을 달리하면서 ⅰ)단계를 수차례 반복하여 각각의 지지체 수지별로는 아미노산 서열이 서로 상이한, 무작위 펩타이드 라이브러리들의 혼성체를 형성하는 단계; ⅲ) 상기 펩타이드 라이브러리들의 혼성체에 인산화 효소를 반응시켜 인산화된 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계; ⅳ) 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나가 결합되어 있고 인산화된 아미노산에만 선택적으로 결합하는 항체를 상기 인산화된 펩타이드 라이브러리에 반응시키고, 이 반응 혼합물에 선택적으로 작용하는 기질을 가하는 단계; ⅴ) 상기 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나와 상기 기질의 반응에 의하여 나타나는 물성의 변화를 감지하여 물성의 변화를 일으 킨 펩타이드 라이브러리가 존재하는 고체상 지지체 수지만을 선별해 내는 단계; ⅵ) 상기 분리된 고체상 지지체 수지에서 펩타이드를 분리시키고, 이렇게 분리된 펩타이드의 아미노산 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법에 대한 것이다.
본 명세서에서 인산화 효소란 단백질의 세린(serine), 트레오닌(threonine), 티로신(tyrosine) 잔기에 ATP에서 제공된 인산기를 붙여주는 효소이다. 그리고 티로신 인산화 효소란 단백질의 티로신 잔기를 특이적으로 인산화 시키는 효소이다.
항체란 항원과 결합하는 단백질로 혈액과 체액에 녹아있는 면역 글로블린으로서, 항체의 항원 특이성은 매우 다양하다. 그리고 기질 특이성이란 하나의 효소가 촉매 하는 기질에는 여러 가지 선택성이 있는데 이것을 기질특이성이라 한다. 기질 특이성은 효소의 단백질 부분에 의하여 규정된다.
인산화 반응이란 인산화 효소의 의해 티로신(Tyr), 세린(Ser), 트레오닌(Thr)에 인산기가 도입되는 반응이다. 그리고 KIPP-MS (Kinase Phosphorylation Profiling by Mass Spectrometry)란 질량분석법에 의한 인산화 효소의 인산화 반응 분석법이다. 또한 MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desoroption/ Ionization)란 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화법 비행시간형 질량분석기이다. 그리고 포스파타아제 (Phosphatase)란 단백질에 결합되어 있는 인산기를 가수분해 반응을 통해 제거하는 효소이다.
펩타이드 라이브러리란 펩타이드의 각 위치에 아미노산을 무작위로 합성한 다양한 서열의 조합이다. 그리고 래더 펩타이드 시퀀스(ladder peptide sequence) 란 사다리 형태로 합성된 펩타이드로서, 하나의 비드에 특정한 서열을 갖는 펩타이드가 아미노산 한개, 두개, 세개 등의 서열들이 하나씩 더 늘어난 형태로 합성된 시퀀스이다. 또한 나누고 섞기(Split and pool) 방법이란 나누기(splitting), 커플링(coupling) 및 혼합(mixing)의 세가지 방법을 반복적으로 수행하여 무작위로 펩타이드 라이브러리를 합성하는 방법이다.
OBOC(One-Bead One-Compound)란 한 개의 비드에 한 종류의 순서를 갖는 아미노산 라이브러리가 합성된 것이다. 그리고 광분해성 링커란 비드와 펩타이드를 결합시키는 화합물로서 특정 파장의 자외선(UV) 조사시 분해되는 성질을 같는 링커이다. 본 발명에서 폴리스티렌으로 이루어진 고체상 지지체 수지(solid support resin)를 비드로 사용한다.
도킹(Docking)이란 컴퓨터 프로그램을 이용하여 질병, 효소의 3차원 구조에 원하는 물질들을 결합자리에 결합하는 과정으로 이로 인해 단백질과 리간드 간의 반응특성과 반응 잔기들과 리간드 간의 상호작용을 이해하고자 하는 작업이다. 그리고 도킹 에너지(Docking energy)란 단백질과 기질간의 상호작용들, 즉 수소결합, 원자 전자간의 반발과 친화력 등을 양자화학적 프로그램을 이용하여 나타낸 값이다. 또한 플렉시블 도킹(Flexible Docking)이란 단백질에 기질을 도킹시 단백질의 구조를 고정한 반면 기질의 구조 즉 단백질과 기질 결합 간에 회전과 광학 이성질체 등을 고려하여 도킹을 수행하는 방법이다.
플렉스엑스(FlexX) 방법이란 단백질에 기질을 도킹시킬 때 단백질의 구조를 고정시키지 아니하고 단백질과 기질 간의 결합에 회전 및 광학 이성질체 등을 고려 하여 도킹을 수행하는 방법으로서, 단백질과 기질의 구조의 변화에 따른 물리, 화학적 특징들을 이용하여 다양한 결합자리들과 이에 따른 단백질과 기질간의 결합에너지를 계산하여 최적의 도킹모드를 연구할 수 있는 방법이다.
P-O 거리(P-O distance)란 아데노신삼인산(ATP)의 포스페이트(Phosphate)의 인(P)과 기질인 티로신의 -OH기의 산소 간의 거리이다.
RMS 그래디언트(RMS gradient)란 단백질과 화합물의 구조계산시 구조의 변화에 의해 에너지 변화가 수반될 때의 에너지 변화율이고, 에너지의 변화가 적은 곳에서 가장 안정한 구조를 찾을 수 있다.
본 발명은 OBOC 펩타이드 라이브러리와 질량분석기를 이용하여 인산화 효소의 기질특이성을 빠르게 분석하는 방법으로 기질특이성이 알려지지 않은 인산화 효소의 인산화 반응을 규명하므로서 인산화에 의해 일어나는 신호전달 과정을 규명하고, 단백질 인산화 효소의 연구뿐 아니라 세포 내에서 신호 전달에 관여하는 프로테아제(protease) 또는 포스파타아제(phosphatase)를 연구하는데 있어서 중요한 도구로 이용될 수 있다.
효소는 기질의 특정 구조를 인식하여 차별적으로 결합함으로써 특정 기질에만 선택적으로 반응하여 변화시키는 기질 특이성을 나타낸다. 따라서 어떠한 효소의 기질 특이성을 확인하는 것은 그 효소의 생체내의 역할을 밝히는데 있어서 매우 중요한 과정이다.
인산화 효소는, 뉴클레오티드삼인산, 주로 아데노신삼인산(ATP)의 인산기를 사용하여 인산화합물을 생성시키는 인산기 전이 효소의 일종으로서 기질을 활성화 하는 역할을 한다. 인산화 효소에는 아데닐산 인산화 효소, 피루빈산 인산화 효소, 포스포 인산화 효소 등과 같은 여러 종류의 인산화 효소가 있다. 이들 중 단백질을 인산화하는 효소는 효소의 활성화나 불활성화를 통하여 인체 내의 대사 제어에 중요한 역할을 한다.
인산화 효소 중에서도 단백질 중의 티로신을 인산화하는 효소인 티로신 인산화 효소는 세포 증식의 제어에 관련하고 있을 가능성이 있다. 상피 성장 인자 등의 세포성장 인자의 수용체가 티로신 인산화 효소 활성을 가지는 것이 많다. 암 관련 유전자로서 대표적인 서크(src)가 생산하는 단백질도 티로신 인산화 효소의 일종이다.
OBOC 펩타이드 라이브러리를 합성하는 방법은 1991년 Lam 등에 의하여 처음 발표되었으며 양치매성의 텐타젤(TentaGel) 비드 위에서의 합성이 시도되었고, 현재까지 생체활성물질 탐색에 활용하고 있다 (Lam; K. S., Salmon; S. E., Hersh; E. M., Hruby; V., Kazmierski; W. M., Knapp; R. J.. Nature 354, 82 (1991)).
그러나 Lam 등에 의해 개발된 OBOC라이브러리는 펩타이드의 서열 분석 시 ㅌ텐타젤(TentaGel)의 고유한 고른 기능기의 분포에 의하여 광분해성 링커를 사용하지 못하고 화학물질을 이용하여 펩타이드를 유리 시킴으로써 펩타이드를 정제하는 과정이 추가로 요구된다는 문제점이 있다(Franz; A. H., Liu; R., Song; A., Lam; K. S., Lebrilla; C. B., J. Comb. Chem. 5, 125 (2003)).
펩타이드 라이브러리에서 광화학적 방법으로 펩타이드를 유리시키는 방법이, 2002년에 힐레어 등에 의하여 프로테아제의 기질 특이성을 밝혀내는데 사용되었지 만, 힐레어 등에 의하여 개발된 방법은 300~800 mm의 매우 큰 크기의 PEGA 수지를 이용하기 때문에 수백만 종 이상의 펩타이드 라이브라리 합성에 제약이 있다(St. Hilaire; Alves; L. C., Herrera; F., Renil; M., Sanderson; S. J., Mottram; J. C.; Coombs; G. H., Juliano; M. A., Juliano; L., Arevalo; J., Meldal; M. J. Med. Chem. 45, 1971 (2002)).
인산화 효소는 질병의 전이 등의 메커니즘에 관련된 단백질로써 인산화에 의해서 일어나는 신호전달에 관한 명확한 이해를 바탕으로 그 기능을 정확히 이해하는 것이 매우 중요하다. 그 중 인산화 효소 단백질이 작용하는 기질의 서열을 분석하는 것은 새로운 인산화 효소의 특성을 분석하고 이를 휴먼 키놈 맵(Human Kinome Map)에서 분류하여 신약 개발의 마커로 사용하는데 있어서 매우 중요하다.
인산화 효소의 기질특이성을 확인하기 위한 여러가지 방법들이 현재까지 개발되었다. 그러나 기존 연구에서 개발된 방법은 각각의 인산화 효소의 기질 서열을 분석하는 데 있어 한정된 펩타이드 라이브러리를 사용하여 수행되었으며, 일반적으로 노동집약적이고 많은 시간이 소요되는 경우가 많다.
최근, 조합합성 펩타이드 라이브러리를 이용하여, 인산화된 서열을 검출하는 여러가지 방법이 개발되었다. 그 예로 인산화 효소의 기질 펩타이드로서 아미노산-스캐닝 돌연변이 검출법(amino acid-scanning mutagenesis), 아미노산 제거 방법(deletion) 그리고 위치별 검출법(positional scanning)을 위하여 각각 펩타이드 라이브러리를 합성하여 유리표면에 위치특이적 마이크로어레이(site-specific Microarray)를 제조하였다(Uttamchandani; M., Chan; E. W., Chen; G. Y.,Yao; S. Q., Bioorg. Med. Chem. Lett. 13, 2997 (2003)).
이를 이용하여 기질의 인산화 패턴을 분석하기 위하여 형광표지가 붙어있는 항인산화티로신 항체(antiphosphotyrosine Ab)를 이용하였고, 이것의 활성 프로파일(profile)을 분석함으로써 인산화 효소의 기질 특이성을 분석하는 연구가 진행되었다(Mahesh U (2003), 미국 특허6,806,056 Glickman; J. (2004)).
또한 항체를 대신하여 방사선 동위원소를 이용하여 인산화 정도를 검출하는데 이용한 방법도 개발되었으며(Jessica E. H (2004)), 펩타이드의 서열분석에 있어서 가장 고전적인 방법인 에드만 분해(Edman-Degradation) 방법이 이용되었다. 더 나아가 생물정보학에 기반한 방법들까지 이용하고 있다.
그러나 이러한 방법들이 시간이 많이 걸리고, 방사선을 다루는데 있어 제약이 따르는 등 여러가지 단점들이 있다. 위에서 기술한 위치 스캐닝(positional scanning) 접근 방법은 인산화 효소 기질의 정확한 시퀀스를 결정하는데 어려움이 있다. 왜냐하면 위치 스캐닝(positional scanning) 방법은 인산화된 아미노산 잔기에 가까이 있는 단일 위치(single site) 서열만을 최적화하는 것이기 때문이다.
프란쯔 등은 작은 크기의 화합물 라이브러리를 고체상 지지체 위에 제조하고 이를 화학물질을 이용하여 유리시키는 방법을 개시하였다(J. Comb. Chem./2003년 Vol. 5, 125). 프란쯔 등은 텐타젤(TentaGel)을 이용하여 생체 활성이 있는 화합물질 라이브러리를 만들었으며 메티오닌 링커를 이용하여 최종적으로 브롬화시아노겐 (cyanogen bromide, CNBr)을 이용하여 분석 물질을 유리시켰다.
그러나 프란쯔 등에 의해 발표된 선행 기술은 텐타젤 고유의 고른 기능기의 분포에 의하여 광분해성 링커를 이용하지 못하고 화학물질 선택성을 가진 브롬화시아노겐으로 분석물질을 유리시켰고, 이는 분석물질을 유리시킨 후, 추가로 정제작업이 필요하다는 단점이 있다.
본 발명자들은, 인산화 효소의 기질특이성을 규명하는데 있어 코어-쉘(core-shell) 비드에 펩타이드를 래더(ladder) 시퀀스로 합성하여, 합성된 펩타이드를 인산화 효소를 이용하여 반응시키고, 인산화된 펩타이드만을 인지하는 항체를 이용하여 결합시킨 후, 이 항체에는 포스파타아제 또는 퍼옥시다아제가 결합되어 있어 그 포스파타아제 또는 퍼옥시다아제의 기질 반응을 통한 색 변화를 관찰함으로써 인산화 효소에 의해 인산화된 펩타이드를 구분해 내는 방법, 및 펩타이드의 질량분석을 쉽게 하기 위하여 광분해성 링커를 코어-쉘(core-shell) 비드에 도입하는 것에 착안하여, 인산화된 펩타이드의 서열을 보다 신속, 정확하게 찾아낼 수 있음을 구체적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 기본적인 목적은 펩타이드 라이브러리를 이용한 고속 단백질 분석 및 스크리닝이 가능한 ⅰ) 고체상 지지체 수지의 표면에 일정한 순서의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드 라이브러리를 생성시킴에 있어서, 하나의 지지체 수지 표면에 아미노산 서열이 서로 동일한 펩타이드들을 다수 개 생성시켜 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계; ⅱ) 아미노산 서열을 달리하면서 ⅰ)단계를 수차례 반복하여 하나의 지지체 수지에는 아미노산 서열이 서로 동일한 펩타이드 라이브러리가 생성되어 있으나, 각각의 지지체 수지별로는 아미노산 서열이 서로 상이한, 무작위 펩타이드 라이브러리들의 혼성체를 형성하는 단계; ⅲ) 상기 펩타이드 라이브러리들의 혼성체에 인산화 효소를 반응시켜 일정한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 특정 아미노산을 선택적으로 인산화시켜 인산화된 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계; ⅳ) 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나가 결합되어 있고 인산화된 아미노산에만 선택적으로 결합하는 항체를 상기 인산화된 펩타이드 라이브러리에 반응시키고, 이 반응 혼합물에 선택적으로 작용하는 기질을 가하는 단계; ⅴ) 상기 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나와 상기 기질의 반응에 의하여 나타나는 물성의 변화를 감지하여 물성의 변화를 일으킨 펩타이드 라이브러리가 존재하는 고체상 지지체 수지만을 선별해 내는 단계; ⅵ) 상기 분리된 고체상 지지체 수지에서 펩타이드를 분리시키고, 이렇게 분리된 펩타이드의 아미노산 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법에 사용되는 다음 하기의 일반식으로 표시되는 펩타이드 라이브러리를 제공하는 것이다.
Z-X-X-Y-X-X-Z-스페이서-링커-고체상 지지체 수지
상기 일반식에서 Z는 시스테인을 제외한 필수아미노산 중 하나이고; X는 시스테인을 제외한 필수 아미노산 중 Y와 동일하지 아니한 아미노산이며; Y는 티로신, 트레오닌 및 세린 중 어느 하나이고; 스페이서는 알킬기 또는 에테르기를 복합 적으로 가지는 선형 또는 가지가 있는 1 내지 6 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이며; 링커는 2-니트로벤질 유도체, 2-(2-니트로페닐)프로필 유도체, 벤조인 유도체 및 펜아실(phenacyl) 유도체로 이루어진 광분해성 링커이다.
전술한 본 발명의 기본적인 목적은 ⅰ) 고체상 지지체 수지의 표면에 일정한 순서의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드 라이브러리를 생성시킴에 있어서, 하나의 지지체 수지 표면에 아미노산 서열이 서로 동일한 펩타이드들을 다수 개 생성시켜 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계; ⅱ) 아미노산 서열을 달리하면서 ⅰ)단계를 수차례 반복하여 하나의 지지체 수지에는 아미노산 서열이 서로 동일한 펩타이드 라이브러리가 생성되어 있으나, 각각의 지지체 수지별로는 아미노산 서열이 서로 상이한, 무작위 펩타이드 라이브러리들의 혼성체를 형성하는 단계; ⅲ) 상기 펩타이드 라이브러리들의 혼성체에 인산화 효소를 반응시켜 일정한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 특정 아미노산을 선택적으로 인산화시켜 인산화된 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계; ⅳ) 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나가 결합되어 있고 인산화된 아미노산에만 선택적으로 결합하는 항체를 상기 인산화된 펩타이드 라이브러리에 반응시키고, 이 반응 혼합물에 선택적으로 작용하는 기질을 가하는 단계; ⅴ) 상기 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나와 상기 기질의 반응에 의하여 나타나는 물성의 변화를 감지하여 물성의 변화를 일으킨 펩타이드 라이브러리가 존재하는 고체상 지지체 수지만을 선별해 내는 단계; ⅵ) 상기 분리된 고체상 지지체 수지에서 펩타이드를 분리시키고, 이렇게 분리된 펩타이드의 아 미노산 서열을 분석하는 단계를 포함하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.
본 발명은 인산화 효소의 기질특이성을 조사하는데 있어 질량분석기를 사용하였고, 래더 펩타이드가 포함된 OBOC 합성 기술을 사용하여 빠르고 효과적으로 인산화 효소의 인산화 반응을 조사할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 티로신 인산화 효소뿐 아니라 세린 및 트레오닌 인산화 효소에도 적용시킬 수 있다. 본 발명에 따른 방법을 이용하여 p60c - src 와 ZAP-70의 기질특이성을 조사하였다.
본 발명에 따른 KIPP-MS 방법은 다음과 같다.
제1단계로서, OBOC 래더 펩타이드를 합성한다. 펩타이드 라이브러리는 코어-쉘 형태의 수지에 나누고 섞기(split and pool) 방법을 사용하여 합성한다. 코어-쉘 수지는 표면에 아미노 그룹이 존재하기 때문에 상용화 되어 있는 텐타젤 수지(TentaGel resin)에 비해 광분해 효능이 두배 이상 높은 특징이 있다(Kim; H, Cho; J. K., Chung; W. J., Lee; Y. S. Org. Lett. 6, 3273 (2004), 이윤식, 김한영, 대한민국 특허출원10-2004-0078860 (2004)).
티로신을 중심으로 양쪽으로 두개의 자리 즉, 모두 4개의 자리를 시스테인과 티로신을 제외한 18개의 필수아미노산을 사용하여 무작위로 합성한다. 인산화 효소가 비드 상에 합성된 펩타이드에 접근하기 쉽게 하기 위하여 펩타이드의 N-말단(N-terminal) 과 C-말단(C-terminal)에 알라닌을 삽입한다. N-, C- 말단의 아미노산은 알라닌 외에 시스테인을 제외한 모든 아미노산으로 대체할 수 있다.
펩타이드를 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 분석할 때 비드에서 펩타이드를 분리하기 위하여 광분해성 링커를 도입하고, 분석시 필요한 보조제인 매트릭스와 질량이 겹치는 것을 피하기 위하여 (β-Ala)-(ε-ACA)-(β-Ala)-(ε-ACA) (BEBE)로 이루어진 스페이서(spacer)를 광분해성 링커 다음에 도입한다. 사용할 수 있는 광분해성 링커로는 2-니트로벤질 유도체, 2-(2-니트로페닐)프로필 유도체, 벤조인 유도체 또는 펜아실 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 사용할 수 있고, 스페이서는 알킬기 또는 에테르기를 복합적으로 가지는 선형 또는 가지가 있는 1 내지 6 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이를 사용할 수 있다. 결과적으로 펩타이드 라이브러리의 시퀀스는 Ala-X-X-Tyr-X-X-Ala-BEBE-NH2 구조이다(도 1 참조). 합성된 비드 약 30mg 은 무작위 서열 비드가 약 100,000 개 이상이므로 4개의 아미노산 서열 조합을 모두 포함하기에 충분하다.
제2단계는 펩타이드 라이브러리 비드 준비 단계로, 비드는 인산염완충액(phosphate-buffered solution,PBS)을 이용하여 세척하고, 단백질의 비특이적 흡착을 막기 위하여 블록킹(Blocking) 용액으로 처리한 후 세척하여 비드를 준비한다.
제3단계는 인산화 효소 반응이다. 인산화 효소 반응은 트리스-염산 완충액(Tris-HCl buffer), ATP 및 인산화 효소를 섞어 반응시킨다. 반응 후 반응용액을 모두 제거하고, 비드를 3차수를 이용하여 세척한다.
제4단계는 항체(Ab)를 인산화된 비드에 결합하는 반응이다. 사용한 항체는 알칼라인 포스파타아제가 결합되어있는 항인산화티로신 항체(anti-phosphotyrosine Ab)이다. 상기 포스파타아제를 대신하여 퍼옥시다아제(peroxidase)가 결합되어 있는 항인산화티로신 항체를 사용할 수 있다. 항체를 비드와 반응시키면 인산화가 된 비드에만 항체가 결합하게 된다. 반응이 끝난 후 마찬가지로 세척 후 다음단계 반응을 진행한다.
제5단계는 검출 단계이다. 제4단계에서 사용한 항체에 결합된 알칼라인 포스파타아제의 반응을 이용하여 인산화된 비드 만을 색변화를 통해 검출하는 단계이다. 알칼라인 포스파타아제는 BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt) 와 NBT(nitro-blue tetrazolium chloride)를 PBS 용액에 녹여 비드와 반응시킨다. 인산화되어 항체가 결합된 비드는 포스파타아제 반응이 진행되어 선명한 빨간색으로 색변화가 일어난다. 비드를 세척하여 반응을 멈춘다. 퍼옥시다아제의 경우 3,3'-디아미노벤지딘(3,3'-diaminobenzidine)과 반응시켜 색변화를 관찰할 수 있다.
제6단계에서는 이렇게 색깔이 변화된 비드를 겸자(forceps)와 현미경을 이용하여 한 개씩 각각 골라낸 후 365nm UV를 조사하여 비드에 합성된 펩타이드를 끊어내어 MALDI-TOF를 이용하여 분석한다. 이때 분석에 사용된 유기산 보조제는 DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid in 70% MeOH)을 사용한다.
티로신 인산화 효소와 최적의 기질들 사이의 반응성의 차이를 분석하기 위하여 분자 모델링 연구를 수행하였다. SYBYL 7.1 분자 모델링 소프트웨어 패키지를 사용하여 모델링을 수행하였다. p60c - src 와 ZAP-70 인산화 효소의 구조는 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank)에서 얻었다. 인산화 효소와 기질의 복합체의 X-레이 크리스탈 구조를 예측하기 위한 플렉시블 도킹(Flexible Docking)은 FlexX 방법을 이용하였다. 인산화 효소와 최적의 기질 복합체의 구조를 트리포스 포스 필드(Tripos force field)를 사용하여 활성 사이트(Active site)의 15 Å 내의 아미노산 잔기들이 RMS 그래디언트가 0.05kcal/mol/Å 미만이 될때까지 최소화한다.
전술한 본 발명의 또 다른 목적은 다음 하기의 일반식으로 표시되는 펩타이드 라이브러리를 제공함으로써 달성될 수 있다.
Z-X-X-Y-X-X-Z-스페이서-링커-고체상 지지체 수지
상기 일반식에서 Z는 시스테인을 제외한 필수아미노산 중 하나이고; X는 시스테인을 제외한 필수 아미노산 중 Y와 동일하지 아니한 아미노산이며; Y는 티로신, 트레오닌 및 세린 중 어느 하나이고; 스페이서는 알킬기 또는 에테르기를 복합적으로 가지는 선형 또는 가지가 있는 1 내지 6 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드이며; 링커는 2-니트로벤질 유도체, 2-(2-니트로페닐)프로필 유도체, 벤조인 유도체 및 펜아실 유도체로 이루어진 광분해성 링커이다.
이하, 다음 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들에 기재된 내용으로 한정하거나 제한 해석하고자 의도하는 것은 아니다.
실시 예 1) 광분해성 링커 및 스페이서가 도입된 지지체 수지의 제조
코어-쉘 수지에 광분해성 링커 및 스페이서를 도입하기 위하여 하이코어(HiCore) 지지체 수지 (0.3 mmol/g, 1g)을 30 mL의 N-메틸-2-파이롤리돈(NMP, N-methyl-2-pyrrolidone)에 팽윤시킨 뒤 에프목-광분해성 링커(Fmoc-photolabile linker, Fmoc-PLL, Fmoc-4-[4-(1-aminoethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy]butyric acid) 0.6 mmol, 벤조트리아졸-1-일옥시트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로-포스페이트 (BOP, benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)phosphonium hexafluoro-phosphate) 0.6 mmol, 1-하이드로벤조트리아졸 (HOBt, 1-hydroxybenzotriazole) 0.6 mmol, 디이소프로필에틸아민 (DIEA, diisopropylethylamine) 1.2 mmol을 10mL의 NMP에 녹여 넣어주었다.
상온에서 1 내지 2시간 동안 반응시킨 뒤, 여액을 걸러서 제거해 주고, NMP, DCM, MeOH로 세척하여 Fmoc-PLL이 결합된 지지체 수지을 얻었다. 반응의 종결은 카리저(Kaiser) 닌히드린 시험법을 이용하였다. Fmoc 보호기는 20 % 피페리딘(piperidine)/NMP 용액으로 각각 3분, 17분 반응시켜 제거한 후, 같은 방법으로 세척하였다. 스페이서를 도입시키기 위하여 PLL이 결합된 지지체 수지에 Fmoc-e-ACA (Fmoc-e-aminocaproic acid; 2당량) 및 Fmoc-b-Ala(2당량)을 BOP(2당량), HOBt(2당량) 및 DIEA(4당량)를 이용하여 번갈아 두 번씩 반복하여 결합 반응을 시켜 광분해성 링커 및 스페이서가 도입된 지지체 수지를 제조하였다.
실시 예 2) 펩타이드 라이브러리의 제조
펩타이드 라이브러리는 나누고 섞기 방법으로 합성하였다. 키나아제가 비드 상에 합성된 펩타이드에 접근하기 쉽게 하기 위하여 펩타이드의 N-말단과 C-말단에 알라닌을 삽입하였고 가운데 부분에 티로신을 넣어 Ala-X-X-Tyr-X-X-Ala-BEBE-PLL-HiCore 구조의 펩타이드 라이브러리를 합성하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이 하나의 비드에 하나의 서열을 가진 펩타이드 시퀀스를 사다리 형태로 합성하였다.
PLL은 광분해성 링커(photolabile linker)를 나타낸다. 이것은 365nm-UV 조사에 의해 분해되는 특성을 나타낸다. BEBE는 스페이서(spacer)로서 MALDI-TOF 질량 분석시 사용되는 matrix와 구분하기 위해 도입했다. X는 시스테인과 티로신을 제외한 18개의 아미노산을 나타낸다.
실시예 1에서 제조된 광분해성 링커 및 스페이서가 도입된 하이코어 지지체 수지를 50 mg 씩 18등분하여 각각 반응 튜브 (5 mL)에 넣었고, Fmoc-아미노산 (시스테인, 티로신 제외, 2당량), 아세트산 (0.2당량), BOP (2.2당량), HOBt (2.2당량), DIEA (4.4당량)을 3 mL NMP에 녹여 넣었다.
상온에서 1 내지 4 시간 동안 반응시킨 뒤, 여액을 걸러서 제거해 주고, NMP, DCM, MeOH로 세척하였다. Fmoc 보호기는 각각의 지지체 수지을 하나의 반응 용기에 담아 20 % 피페리딘/NMP 용액으로 각각 3분, 17분 반응하여 제거한 후, 같은 방법으로 세척하고 6 내지 12 시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다.
상기 과정을 반복한 뒤, 마지막에 K 시약 (Reagent K ; 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid, TFA) 85%, 페놀(phenol) 5%, 에탄디티올(ethanedithiol) 2.5%, 물 2.5%)를 넣어 상온에서 1 내지 2 시간 동안 반응시켜 펩타이드 라이브러리 지지체 수지를 제조하였다.
실시예 3) 인산화된 펩타이드 라이브러리의 제조
펩타이드 라이브러리 지지체 수지는 50 mM PBS를 사용하여 세척되었고, 단백질의 비특이적 흡착을 막기위하여 블록킹 (Blocking) 용액 (3% BSA, Tween20 in PBS)을 상온에서 2 내지 4 시간 동안 처리한 후 세척하여 비드를 준비하였다. 인산화 효소 반응은 25 mM Tris-HCl 버퍼 용액 (pH 7.4, 7mM MgCl2, 0.5mM EGTA), 100 M ATP 와 2 unit의 p60c - src 또는 ZAP70 인산화 효소를 섞어 20 내지 30℃ 에서 1 내지 2 시간 동안 반응시켰다. 반응 후 반응용액을 모두 제거하고, 비드를 3차수를 이용하여 세척하였다.
실시예 4) 인산화된 펩타이드 라이브러리에 항체의 결합
항체를 인산화된 비드에 결합시키기 위하여 알칼라인 포스파타아제가 결합되어 있는 항인산화 티로신 항체 (anti-phosphotyrosine Ab)를 반응시켰다. 100ng/ml 의 항체를 상온에서 1 내지 2 시간 동안 비드와 반응시킨 후 50mM PBS 및 3차수를 이용하여 세척하였다.
실시예 5) 포스파타아제와 반응한 인산화된 펩타이드 라이브러리의 선별 및 분리된 펩타이드의 아미노산 서열 분석
항체에 결합된 알칼라인 포스파타아제의 반응을 이용하여 인산화된 비드를, 색변화를 통해 검출하기 위하여 알칼라인 포스파타아제는 0.1mg/mL의 BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt) 와 0.1mg/mL의 NBT (nitro-blue tetrazolium chloride)를 50 mM PBS 용액에 녹여 비드와 37℃에서 30분 내지 1시간 동안 반응시킨 후 3차수로 세척하였다.
인산화되어 항체가 결합된 비드는 포스파타아제 반응이 진행되어 선명한 빨간색으로 변하였으며 색깔이 변화된 비드를 핀셋과 현미경을 이용하여 한 개씩 각각 골라낸 후 365 nm 자외선 (50 mW/cm2)을 30분 내지 1 시간 동안 조사하여 비드에 합성된 펩타이드를 끊어내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이 (가)에서는 One Bead One Compound (OBOC) 라이브러리 비드에 인산화 효소 반응을 시켜 인산화시켰다. 그 후 포스파타아제가 결합되어 있는 항인산화아미노산 항체(antiphosphoamino acid Ab)를 인산화 효소와 반응시킨 비드와 반응시켰다. 항체에 결합된 포스파타아제는 인산화된 비드의 검출에 사용하였다. 즉, 항체와 결합시킨 후 포스파타아제 기질을 라이브라리 비드에 넣어주면, 인산화 효소에 의해 인산화된 비드의 경우 붉은 색으로 변화하였다. 이렇게 색이 변화된 비드를 하나씩 분리해 내었다. (나)에서는 분리된 비드를 UV 조사를 통해 비드에서 펩타이드를 잘라낸 후 MALDI-TOF를 이용하여 분석하였다.
유리된 펩타이드(5 μL)는 유기산 보조제인 DHB (2,5-dihydroxybenzoic acid, 1 μL, 30 mg/mL, MeOH : 물=70:30)를 섞어 MALDI-TOF를 이용하여 펩타이드의 서열을 분석하였다. 도 3에 상기 분석결과를 나타내었고, 사다리 형태의 펩타이드를 분석하면 도식과 같은 여섯개의 피크가 나타나며 각 피크들의 질량 차이를 순서대로 계산하여 펩타이드의 각 위치의 아미노산을 결정할 수 있다.
실시예 6) p60 c - src 티로신 인산화 효소를 이용한 KIPP - MS 의 유효성 실험
본 발명에 따른 KIPP-MS가 인산화 효소의 기질특이성을 밝히는데 사용할 수 있는 일반적인 방법임을 확인하기 위해 이미 기질특이성이 잘 밝혀진 p60c - src 티로신 인산화 효소로 시험하였다. p60c - src 를 이용하였을 때, 붉은색으로 바뀐 100개의 비드를 골라내어 광분해한 후 MALDI-TOF로 분석하였다. 그 중 정확하게 분석된 81개의 스펙트럼을 얻었다. 인산화 효소에 반응한 펩타이드 시퀀스는 제 4도에 나타내었다.
이 서열들을 바탕으로 통계처리를 통해 p60c - src 인산화 효소의 인산화에 영향을 미치는 각 위치의 중요한 서열을 결정한다(도 5 참조). p60c - src 인산화 효소의 기질특이성은 +1과 +2 위치에 산성의 아미노산(Glu 과 Asp) 과 -1 위치에 Ile 이 위치할 때 가장 인산화가 효율적으로 일어난다는 것을 볼 수 있었다. 이는 이전의 연구결과와 동일한 것으로 본 발명에 따른 KIPP-MS 방법이 티로신 인산화 효소의 기질 특이성을 밝히는데 일반적으로 적용될 수 있는 방법임을 증명해 주었다.
실시예 7) KIPP - MS 에 의한 ZAP -70 인산화 효소의 기질특이성 조사
본 발명에 따른 KIPP-MS을 일반화하기 위하여, ZAP-70 인산화 효소의 기질 특이성을 상기 방법을 활용하여 조사하였다. 현재 ZAP-70 인산화 효소에 대한 기질 특이성은 잘 밝혀지지 않았지만, p60c - src 인산화 효소와 같은 종류로 분류 되고 있다. KIPP-MS를 이용한 ZAP-70 인산화 효소의 펩타이드 서열 분석 효율은 약 92%였다.
서열 분석된 펩타이드는 +1(21%)와 +2(49%) 위치에 Glu 가 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 또한 +2 위치에 Asp 가 약 29% 정도로 Glu 다음으로 빈도가 높음을 확인하였다. -1 위치는 Glu 과 Asp 가 가장 빈도가 높았으며, -2 위치의 경우는 특정 아미노산의 선택성이 없었다(도 7 참조). 이러한 통계적인 데이터 처리를 통해 ZAP-70 인산화 효소가 티로신을 기준으로 양쪽 위치에 산성의 아미노산을 잘 인지하여 인산화된다는 것을 알 수 있었다. 따라서 본 발명에 따른 KIPP-MS 분석을 통해서 ZAP-70 인산화 효소의 최적 기질은 -1, +1, +2 위치가 모두 Glu 임을 확인하였다.
실시예 8) 티로신 인산화 효소와 최적의 기질들 사이의 반응성의 차이를 분석하기 위하여 분자 모델링
티로신 인산화 효소와 최적의 기질들 사이의 반응성의 차이를 분석하기 위하 여 분자 모델링을 수행하였다. 본 발명에서는 SYBYL 7.1 분자 모델링 소프트웨어 패키지를 사용하여 모델링을 수행하였다. p60c - src 와 ZAP-70 인산화 효소의 구조는 단백질 데이터 뱅크에서 얻었다. 인산화 효소와 기질의 복합체의 X-레이 크리스탈 구조를 예측하기 위한 플렉시블 도킹은 FlexX 방법을 이용하였다.
인산화 효소와 최적의 기질 복합체의 구조를 트리포스 포스 필드를 사용하여 활성 영역의 15 Å 내의 아미노산 잔기들이 RMS 그래디언트가 0.05 kcal/mol/Å 미만이 될 때까지 최소화하였다.
실시예 9) p60 c - src 인산화 효소의 기질특이성 조사 실험 결과에 대한 3차원 도킹 연구
p60c - src 인산화 효소의 기질특이성 조사 실험 결과를 뒷받침하기 위하여 3차원 도킹 연구를 수행하였다. 실험을 통해 얻어진 최적의 기질로 Ile-Tyr-Glu-Glu 을 선택하였다. -1 위치의 Ile은 p60c - src 인산화 효소의 Gly406과 정전기적으로 상호작용하며, 기질의 Tyr의 수산기(Hydroxyl group)는 ATP의 인산기와의 P-O 거리가 약 4.16Å으로 매우 가깝게 위치함으로써 인산화 효소의 활성 부위에 있는 Arg388과 Asp286과 수소결합을 형성하였다.
최적 기질의 도킹 에너지(ΔG)는 -15.76 kcal/mol로 얻어졌다. 만약 -1 위치의 Ile 을 두번째 최적 시퀀스인 Glu 로 바꿨을 경우 도킹 에너지(ΔG)는 -11.22 kcal/mol이고 활성 부위와의 P-O 거리는 4.34Å로 얻어졌다(도 9(a) 참조). 또한 +1과 +2 위치의 Glu를 다른 아미노산으로 바꿨을 경우 p60c - src 인산화 효소의 활성 부위에 기질이 들어갈 수 없음을 확인하였다. 이 결과로 볼 때 본 발명에 따른 KIPP-MS가 인산화 효소의 기질특이성을 밝히는데 일반적으로 활용될 수 있다는 것이 증명되었다.
실시예 10) ZAP -70 인산화 효소의 기질특이성 조사 실험 결과에 대한 3차원 도킹 연구
ZAP-70 인산화 효소의 기질특이성 조사 실험 결과를 뒷받침하기 위하여 3차원 도킹 연구를 수행하였다. -1 위치의 Glu 는 인산화 효소의 결합 포켓 가장자리에 있는 Ser497과 인접하여 상호작용을 한다. +1 위치의 Glu는 Lys500과 수소결합을 형성하였다. Tyr의 수산기는 활성 부위의 Asp479과 Asp461의 극성 잔기와 동시에 수소결합을 형성하였다.
최적 기질의 도킹 에너지는 -28.17Kcal/mol 이며, 활성 부위와의 P-O 거리는 3.53Å 이었다(도 9(b) 참조). -1위치의 Glu를 Asp로 대체 하였을 경우 Tyr의 수산기가, 활성 부위의 Asp476 만이 수소결합을 하기 때문에 인산화 효소의 활성 부위와의 P-O 거리가 4.44Å으로 더 길어졌다.
실시예 11) KIPP - MS 를 통한 ZAP -70 인산화 효소의 기질특이성 확인
실시예 7에서 제시된 ZAP-70 인산화 효소의 활성 펩타이드 시퀀스들을 이용하여 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 조사를 한 결과, T-세포 수용체 제타 사슬(T-cell receptor zeta chain), 원형종양유전자(proto-oncogene) Cb1과 Vav 단백질들의 일부 부위에 속하는 것으로 나타났다(도 9 참조). 이것으로써 본 발명에 따른 KIPP-MS를 통하여 ZAP-70 인산화 효소의 기질특이성을 처음으로 밝혔다.
첫째, 본 발명에서 제안한 사다리(Ladder) 펩타이드가 포함된 OBOC 펩타이드 라이브러리 합성기술과 MALDI-TOF분석 기술을 결합하여 인산화 효소의 기질특이성을 빠르게 결정할 수 있었다.
둘째, 여기서 얻어진 기질 서열은 생체 내에서(in vivo) 실제 인산화 효소가 작용하는 모티프(motif)와 잘 맞는 것을 확인하였다. 이것은 단백질 인산화 효소의 역할을 정확히 이해하는데 중요할 뿐 아니라 그것의 저해제의 개발에 중요한 정보를 제공할 수 있다.
셋째, 인산화 효소의 저해제 개발은 의학 및 약학 분야에 있어서 핵심 연구 분야이므로, 펩타이드 라이브러리를 이용한 고속 단백질 분석 및 스크리닝은 장차 신약 개발과 관련되어 새로운 단백질 마커를 찾고 저해제를 찾는데 매우 중요하게 쓰일 수 있다.
넷째, 본 발명에 따른 방법은 티로신 인산화 효소뿐 아니라 세린 및 트레오닌 인산화 효소에도 적용시킬 수 있다.

Claims (12)

  1. ⅰ) 고체상 지지체 수지의 표면에 일정한 순서의 아미노산 배열을 갖는 펩타이드 라이브러리를 생성시킴에 있어서, 하나의 지지체 수지 표면에 아미노산 서열이 서로 동일한 펩타이드들을 다수 개 생성시켜 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
    ⅱ) 아미노산 서열을 달리하면서 ⅰ)단계를 수차례 반복하여 하나의 지지체 수지에는 아미노산 서열이 서로 동일한 펩타이드 라이브러리가 생성되어 있으나, 각각의 지지체 수지별로는 아미노산 서열이 서로 상이한, 무작위 펩타이드 라이브러리들의 혼성체를 형성하는 단계;
    ⅲ) 상기 펩타이드 라이브러리들의 혼성체에 인산화 효소를 반응시켜 일정한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 특정 아미노산을 선택적으로 인산화시켜 인산화된 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계;
    ⅳ) 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나가 결합되어 있고 인산화된 아미노산에만 선택적으로 결합하는 항체를 상기 인산화된 펩타이드 라이브러리에 반응시키고, 이 반응 혼합물에 선택적으로 작용하는 기질을 가하는 단계;
    ⅴ) 상기 포스파타아제 및 퍼옥시다아제 중의 어느 하나와 상기 기질의 반응에 의하여 나타나는 물성의 변화를 감지하여 물성의 변화를 일으킨 펩타이드 라이브러리가 존재하는 고체상 지지체 수지만을 선별해 내는 단계;
    ⅵ) 상기 선별된 고체상 지지체 수지에서 펩타이드를 분리시키고, 이렇게 분리된 펩타이드의 아미노산 서열을 분석하는 단계
    를 포함하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 고체상 지지체 수지가 코어-쉘(core-shell) 구조의 지지체 수지인 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 고체상 지지체 수지가 그 표면에 광분해성 링커가 결합된 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 고체상 지지체 수지의 표면에 결합된 광분해성 링커에 추가로 스페이서가 결합된 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 인산화 효소가 티로신 인산화 효소, 세린 인산화 효소 및 트레오닌 인산화 효소로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 인산화 효소가 티로신 인산화 효소인 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 티로신 인산화 효소가 p60c - src 또는 ZAP-70인 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 ⅴ)단계의 물성의 변화가 고체상 지지체 수지의 색 변화인 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 광분해성 링커는 에프목-4-[4-(1-아미노에틸)-2-메톡시-5-니트로페녹시]부탄 산을 포함한 2-니트로벤질 유도체, 2-(2-니트로페닐)프로필 유도체, 벤조인 유도체 및 펜아실 유도체로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  10. 제 4항에 있어서, 상기 스페이서는 알킬기 또는 에테르기를 복합적으로 가지는 선형 또는 가지가 있는 1 내지 6 개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드인 것임을 특징으로 하는, 인산화 효소의 기질특이성 분석 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
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