JP2005523232A - 光切断可能保護基 - Google Patents
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Abstract
化学合成、好ましくはオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの固相合成における連結基として有用な新規な化合物が提供される。この化合物は、一般的に、光不安定であり、かつ反応性基をマスクしないように光分解によって除去され得る保護基を有する。この保護基は、一般式（Ｙ）を有し、式中（Ｙ）は、図に示されるような化学構造である。上記の保護化合物を用いて、成分分子から支持体上に複数の化合物（各化合物は支持体の別個の予め規定された領域を占有する）を形成する方法がまた、提供される。
Description
【０００１】
関連出願
本出願は、２０００年９月１１日に出願された米国特許出願第09/659,599号の一部継続出願である。上記出願の全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
本発明は化学合成の分野に関する。より詳しくは、本発明は、光不安定な化合物、該化合物を調製するための試薬、ならびに、特に固体支持体上の高密度分子アレイの合成におけるその光切断性リンカーおよび保護基としての使用方法に関する。分子を固体支持体に結合させるため、およびその後の切断反応を促進するためのリンカーとしての光不安定分子の使用は、ここ２０年の間、かなり注目されている。光分解は、伝統的な酸性切断技術または塩基性切断技術を補足する穏やかな切断方法を提供する。例えば、Lloyd-Williamsら(1993)Tetrahedron 49:11065-11133を参照のこと。ペプチドおよび低分子のライブラリーが関与するコンビナトリアル有機合成分野の急速な成長（例えば、Gallopら(1994)J.Med.Chem.37:1233-1251;およびGordonら(1994)J.Med.Chem.37:1385-1401 を参照のこと）は、リガンドおよび標識性分子の両方を放出するための光不安定リンカーの使用に対する関心を顕著に再燃（renew ）させた。
【０００３】
光不安定保護基として種々のオルト−ベンジル化合物が、ペプチド（Fodor ら(1994)Science 251:767-773 を参照のこと）およびオリゴヌクレオチド（Pease ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5022-5026 を参照のこと）の両方のフォトリソグラフィー合成を最適化する過程において使用されている。国際公開公報WO 90/15070 、WO 92/10092 およびWO 94/10128 を参照のこと。また、１９９２年１１月２日に出願された米国特許出願第07/971,181号明細書、および１９９４年９月２２日に出願された米国特許出願第08/310,510号明細書；Peptides：Chemistry,Structure and Biology （第１３回米国ペプチドシンポジウムの講演集）のHolmesら（１９９４）；Hodgesら編、ESCOM:Leiden;pp.110-12（これらの参考文献のそれぞれは、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）を参照のこと。これらの化合物の例としては、ベンゼン環内にさらに２個のアルコキシ基を含有する６−ニトロベラトリル（veratryl）誘導型保護基が挙げられる。ベンジル炭素上へのα−メチルの導入は、＞350nm のＵＶ光での光分解性切断を促進し、ニトロソケトンの形成をもたらした。
【０００４】
光切断性の保護基およびリンカーは、種々の試薬（例えば、ピペリジン、ＴＦＡなど）に対して安定で、温和な条件下で速やかに切断され、かつ反応性の高い副産物を生じないものでなければならない。本発明は、かかる保護基およびその高密度分子アレイの合成における使用方法を提供する。
【０００５】
発明の概要
本発明の第１の局面によれば、化学合成、好ましくはオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの固相合成における保護基を提供するのに有用な新規化合物が提供される。これらの化合物は、一般に光不安定であり、反応基をマスクしないように光分解により除去されうる保護基を含有する。一態様において、該化合物は、図１および９に示すような一般式を有する。
【０００６】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉ：
Ｙ−Ｘ
Ｉ
で表すことができる。構造式Ｉにおいて、Ｘは、脱離基、またはマスクされた反応部位を有する化合物であり、Ｙは、光不安定保護基である。一態様において、光不安定保護基は、マスクされた反応部位に結合している。したがって、マスクされた反応部位は、該光不安定保護基が、例えば350nm より大きな波長の放射線への曝露によって切断されるまで、別の化合物と反応しない。好ましい態様において、Ｙは、
【０００７】
【化１８】
【０００８】
からなる群より選ばれる。上記の構造の基において、Ｒは、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアリールである。Ａは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、または−（ＣＨ2 ）k −である。ｋは、０または１〜約３の整数である。Ｂは、一価または二価の非プロトン性の弱塩基性基である。
【０００９】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉで表され、式中のＹが構造式ＩＩ：
【００１０】
【化１９】
【００１１】
で表されるものである。
【００１２】
構造式ＩＩにおいて、Ｒ1 およびＲ2 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または前記記載の基のビニル様（vinylogous）誘導体である。Ｑ1 は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−である。Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシ、または−ＮＯ2 であるが、Ｒ3 またはＲ4 の一方が−ＮＯ2 であるとき、Ｒ1 またはＲ2 の少なくとも一方は−Ｈであるとする。Ｒ5 およびＲ6 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。Ｑ3 は、−Ｈ、任意に置換されたアルコキシ、またはジアルキルアミノである。Ｚ1 およびＺ2 は、一体となって−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ7 Ｃ（Ｏ）−、または−ＣＲ8 ＝ＣＲ9 −である。Ｒ7 は、−Ｈまたはアルキルである。Ｒ8 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。Ｒ9 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 である。あるいはまた、Ｒ8 およびＲ9 は、これらが結合している炭素原子とともに、五員環または六員環の炭素環または複素環を形成する。しかしながら、Ｒ3 、Ｒ4 またはＲ9 のいずれも−ＮＯ2 でない場合、Ｑ1 は−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−でないとする。
【００１３】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉで表され、式中のＹが構造式ＩＩＩ：
【００１４】
【化２０】
【００１５】
で表されるものである。構造式ＩＩＩにおいて、ｍは０または１である。ｐは０、１または２である。Ｒ1 およびＲ2 は、各存在について、独立して−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または前述の基のビニル様誘導体である。Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｑ4 は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ13−である。Ｒ13は、−Ｈ、任意に置換されたアルキルまたは任意に置換されたアリールである。Ｒ10は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 である。あるいはまた、Ｒ10およびＲ13は、これらが結合している炭素原子および窒素原子とともに、五員環または六員環の複素環を形成する。Ｒ11およびＲ12は、それぞれ、独立して−Ｈ、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。あるいはまた、Ｒ11およびＲ12は、これらが結合している炭素とともに一体となって、五員環または六員環の炭素環または複素環を形成する。
【００１６】
本発明の別の局面は、
（ａ） 反応部位を有する支持体を提供する工程、
（ｂ） 該反応部位に、図１に示す式の光不安定保護基と結合したマスクされた反応部位を含有する分子を結合させる工程、
（ｃ） 光不安定保護基を除去し、マスクされていない反応部位を有する分子が上面に固定された誘導体化支持体を提供する工程
を含む、反応部位を有する分子を支持体に結合させる方法を提供する。
【００１７】
別の態様において、反応部位を有する分子を支持体に結合させる方法は、
（ａ） 反応部位を有する支持体を提供する工程、
（ｂ） さらなる反応部位を含有する構造式Ｉで表される第１の化合物の該反応部位を支持体と反応させて結合を形成する工程、ならびに
（ｃ） 光不安定保護基を除去し、上面に固定された、マスクされていない反応部位を含有する構造式Ｉの化合物を含む誘導体化支持体を提供する工程
を含む。
【００１８】
本発明の関連する局面は、成分分子から、支持体上に複数の化合物を形成する方法を提供する。各化合物は、該支持体の別々の領域を占め、該方法は、
（ａ） 支持体の領域を活性化する工程、
（ｂ） 図１に示す、または構造式IIもしくはIII に示す式の光不安定保護基と結合したマスクされた反応部位を含有する分子を該領域に結合させる工程、
（ｃ） 工程（ａ）および（ｂ）を、該支持体の他の領域において繰り返し、それにより該他の領域のそれぞれに、光不安定保護基と結合したマスクされた反応部位を含有する別の分子を結合させる工程、ここで、該別の分子は工程（ｂ）で使用したものと同じであっても異なっていてもよい、
（ｄ） 支持体の領域の１つに結合した分子の１つから光不安定保護基を除去し、マスクされていない反応部位を有する分子を含有する領域を提供する工程、
（ｅ） マスクされていない反応部位を有する分子にさらに分子を結合する工程、
（ｆ） 成分分子から所望の複数の化合物（各化合物は、該支持体の別々の領域を占める）が形成されるまで、工程（ｄ）および（ｅ）を該支持体の領域において繰り返する工程
を含む。
【００１９】
該方法は、３’から５’または５’から３’のいずれかの方向で、固体支持体上に核酸の高密度アレイを合成するのに特に有用であることが見出される。
【００２０】
発明の詳細な説明
以下の定義は、本明細書において本発明を記載するために使用される種々の用語の意味および範囲を例示および規定するために記載される。
【００２１】
「アルキル」という用語は、１〜２０個の炭素原子を有する、分枝鎖または直鎖の非環式単価飽和炭化水素ラジカルをいう。
【００２２】
「アルコキシ」という用語は、酸素を介して化合物に結合したアルキル基をいう。
【００２３】
「アルケニル」という用語は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有する不飽和炭化水素ラジカルをいい、直鎖、分枝鎖および環式のラジカルを包含する。
【００２４】
「アルキニル」という用語は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含有する不飽和炭化水素ラジカルをいい、直鎖、分枝鎖および環式のラジカルを包含する。
【００２５】
「アリール」という用語は、１個の環（例えばフェニル）または２個の縮合環（例えばナフチル）を有する芳香族単価炭素環式ラジカルをいうが、独立してアルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、ニトロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、アシル、ヒドロキシカルボニル、低級アルコキシカルボニル、ヒドロキシスルホニル、低級アルコキシスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、トリフルオロメチル、シアノ、テトラゾイル（tetrazoyl ）、カルバモイル、低級アルキルカルバモイルおよびジ低級アルキルカルバモイルにより任意に一置換、二置換または三置換されたものであり得る。あるいはまた、芳香環の２つの隣接する位置がメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ基で置換されていてもよい。典型的には、電子供与性置換基が好ましい。
【００２６】
「ヘテロ芳香族」または「ヘテロアリール」という用語は、環内に少なくとも１個のヘテロ原子、例えば窒素、酸素もしくは硫黄を有する芳香族単価の単環式または多環式ラジカルをいう。ここで、該芳香族環は、独立してアルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、ニトロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、アシル、ヒドロキシカルボニル、低級アルコキシカルボニル、ヒドロキシスルホニル、低級アルコキシスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、トリフルオロメチル、シアノ、テトラゾイル、カルバモイル、低級アルキルカルバモイルおよびジ低級アルキルカルバモイルにより任意に一置換、二置換または三置換されたものであり得る。例えば、１個以上の窒素原子を有する典型的なヘテロアリール基は、テトラゾイル、ピリジル（例えば、４−ピリジル、３−ピリジル、２−ピリジル、）、ピロリル（例えば、２−ピロリル、２−（Ｎ−アルキル）ピロリル）、ピリダジニル、キノリル（例えば、２−キノリル、３−キノリルなど）、イミダゾリル、イソキノリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリドニルまたはピリダジノニルであり、酸素原子を有する典型的な酸素へテロアリールラジカルは、２−フリル、３−フリルまたはベンゾフラニルであり、典型的な硫黄へテロアリールラジカルは、チエニルおよびベンゾチエニルであり、典型的な混合ヘテロ原子ヘテロアリールラジカルは、フラザニルおよびフェノチアジニルである。さらに、該用語は、環内のヘテロ原子が酸化されており、例えば、Ｎ−オキシドまたはスルホンが形成された場合も包含する。
【００２７】
本明細書で使用されるヘテロシクロアルキル基は、好ましくは５〜６個の原子を有し、窒素、酸素および硫黄から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含有する非芳香族環系である。ヘテロシクロアルキル基の例としては、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチエニル、アゼチジニル、テトラヒドロフリル、ジオキサニルおよびジオキセパニルが挙げられる。
【００２８】
「複素環」という用語は、ヘテロアリール基およびヘテロシクロアルキル基を包含する。
【００２９】
「炭素環」という用語は、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基、およびアリール基を包含する。
【００３０】
「ビニル様誘導体」という用語は、ビニル基によって化合物に結合した基をいう。ビニル基は、シスまたはトランスのいずれかの立体配置を有しうる。例えば、フェニル基のトランスビニル様誘導体およびシスビニル様誘導体は、以下の構造式：
【００３１】
【化２１】
【００３２】
を有しうる。
【００３３】
「任意に置換された」という用語は、規定された基上における置換基の存在またはその欠如をいう。置換が存在する場合、該基は、独立して、アルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、ニトロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、アシル、ヒドロキシカルボニル、低級アルコキシカルボニル、ヒドロキシスルホニル、低級アルコキシスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、トリフルオロメチル、シアノ、テトラゾイル、カルバモイル、低級アルキルカルバモイルおよびジ低級アルキルカルバモイルにより一置換、二置換または三置換されたものであり得る。典型的には、アルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノおよびジ低級アルキルアミノなどの電子供与性置換基が好ましい。
【００３４】
「電子供与性基」という用語は、分子内の同じ位置を占める場合、水素原子の場合よりも電子に対する親和性が低いラジカル基をいう。例えば、典型的な電子供与性基は、ヒドロキシ、アルコキシ（例えばメトキシ）、アミノ、アルキルアミノおよびジアルキルアミノである。
【００３５】
「脱離基」という用語は、化学反応において求核基によって置換されうる基、例えば、ハロ、ニトロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、アルキルスルホネート（例えば、メタンスルホネート）、アリールスルホネート、ホスフェート、スルホン酸、スルホン酸塩などを意味する。
【００３６】
「活性化基」は、特定の官能基または反応部位に結合すると、該部位を第２の官能基または反応部位との共有結合形態に対してより反応性にする基をいう。カルボン酸に有用な活性化基の群としては、単純エステル基および無水物が挙げられる。エステル基としては、アルキル、アリールおよびアルケニルエステル、および特に４−ニトロフェニル、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドおよびペンタフルオロフェノールなどの基が挙げられる。他の活性化基は当業者に公知である。
【００３７】
「化学物質ライブラリー」または「アレイ」は、合成的または生合成的のいずれかにより調製され得、かつ種々の異なる形式（例えば、可溶性分子のライブラリー、および樹脂ビーズ、シリカチップまたは他の固体支持体上に固定された化合物のライブラリー）で、生物学的活性についてスクリーニングされ得る、異なる分子の集合体を意図的に作製したものである。該用語はまた、意図的に作製した立体異性体の集合体をも指すことが意図される。
【００３８】
「予め規定された領域」は、選択された分子の形成に使用される、使用された、または使用することが意図される、固体支持体上の局所エリアをいい、この用語以外に、本明細書において代替的に「選択された」領域という。予め規定された領域は、任意の簡便な形状、例えば、円形、三角形、楕円形、くさび形などを有し得る。本明細書において簡潔にするため、「予め規定された領域」を単に「領域」という場合がある。いくつかの態様において、予め規定された領域、したがって、個々の化合物が合成されるエリアは、約1cm2より小さか、または1mm2より小さい。これらの領域内において、そこで合成される分子は、好ましくは実質的に純粋な形態で合成される。さらなる態様において、予め規定された領域は、該領域（すなわち、ビーズ、樹脂、ゲルなど）をウェル、トレイなどに物理的に分離することにより得られうる。
【００３９】
「固体支持体」、「支持体」および「基材」は、硬質または半硬質の１つまたは複数の表面を有する材料または材料群をいう。多くの態様において、固体支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるが、いくつかの態様においては、異なる化合物の合成領域を、例えば、ウェル、隆起領域、ピン、エッチング溝、などで物理的に分離することが望ましい場合もある。他の態様によれば、固体支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、マイクロスフェアの形態または他の幾何的形態をとり得る。
【００４０】
本明細書に記載の化合物および中間体の同定および精製は、所望により、例えば、濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、厚層（thick-layer ）（調製用）クロマトグラフィー、蒸留またはこれらの手順の組み合わせなどの任意の適切な分離または精製手順により行われうる。適切な分離および単離手順の具体的な例示は、以下に記載する実施例を参照することによりなされ得る。しかしながら、他の等価な分離または単離手順もまた、もちろん使用し得る。
【００４１】
「チャンネルブロック」は、表面上に複数の溝または凹部領域を有する材料である。該溝または凹部領域は、限定されないが、細形、円形、蛇行路などを含む種々の幾何的形態をとり得る。チャンネルブロックは、シリコンブロックのエッチング、ポリマーの成型または圧縮などを含む、種々の様式で調製されうる。
【００４２】
本発明は、化学合成、好ましくはオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの固相合成ならびにその高密度アレイにおける保護基を提供するのに有用な新規化合物を提供する。これらの化合物は、一般に光不安定であり、反応基をマスクしないように光分解により除去されうる保護基を含有する。具体的に、好ましい化合物を図１および９に示す。より具体的には、好ましい化合物は、Ｈ、任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロ芳香族基でありうるＲまたはＲ１基を有する。
【００４３】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉで表され、式中のＹが構造式ＩＩ：
【００４４】
【化２２】
【００４５】
で表されるものである。
【００４６】
構造式ＩＩにおいて、Ｒ1 およびＲ2 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または前記記載の基のビニル様誘導体である。Ｑ1 は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−である。Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシ、または−ＮＯ2 であるが、Ｒ3 またはＲ4 の一方が−ＮＯ2 であるとき、Ｒ1 またはＲ2 の少なくとも一方は−Ｈである。Ｒ5 およびＲ6 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。Ｑ3 は、−Ｈ、任意に置換されたアルコキシ、またはジアルキルアミノである。Ｚ1 およびＺ2 は、一体となって−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ7 Ｃ（Ｏ）−、または−ＣＲ8 ＝ＣＲ9 −である。Ｒ7 は、−Ｈまたはアルキルである。Ｒ8 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。Ｒ9 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 である。あるいはまた、Ｒ8 およびＲ9 は、これらが結合している炭素原子とともに、五員環または六員環の炭素環または複素環を形成する。しかしながら、Ｒ3 、Ｒ4 またはＲ9 のいずれも−ＮＯ2 でない場合、Ｑ1 は−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−でない。
【００４７】
好ましい態様において、Ｘは、マスクされた反応部位を有する化合物であり、反応部位をさらに有する。より好ましくは、Ｘは、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオシドホスホルアミダイト、ヌクレオシドＨ−ホスホネート、ヌクレオチド、固体支持体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ホルモン、抗体、多糖、単糖、二糖、固体支持体に結合したペプチド、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド、固体支持体に結合したタンパク質、固体支持体に結合したホルモン、固体支持体に結合した抗体、固体支持体に結合した多糖、固体支持体に結合した単糖、または固体支持体に結合した二糖からなる群より選ばれる。
【００４８】
別の好ましい態様において、Ｙは構造式IV：
【００４９】
【化２３】
【００５０】
で表される。構造式IVにおいて、Ｑ1 、Ｑ2 、Ｑ3 、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｚ1 およびＺ2 は、先に定義したとおりである。
【００５１】
より好ましくは、Ｙは構造式Ｖ：
【００５２】
【化２４】
【００５３】
で表される。構造式Ｖにおいて、Ｑ2 、Ｑ3 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、先に定義したとおりである。
【００５４】
構造式II、IVおよびＶにおいて、Ｒ3 またはＲ4 のうち一方は、好ましくは−ＮＯ2 である。
【００５５】
好ましくは、構造式Ｖにおいて、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は−Ｈであり、Ｑ3 はジアルキルアミノである。
【００５６】
別の好ましい態様において、Ｙは構造式VI：
【００５７】
【化２５】
【００５８】
で表される。
【００５９】
別の態様において、Ｙは、以下：
【００６０】
【化２６】
【００６１】
からなる群より選ばれる。
【００６２】
別の態様において、Ｙは構造式VII ：
【００６３】
【化２７】
【００６４】
で表される基である。構造式VII において、Ｑ1 、Ｑ2 、Ｑ3 、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｚ1 およびＺ2 は、先に定義したとおりである。
【００６５】
別の態様において、Ｙは構造式VIII：
【００６６】
【化２８】
【００６７】
で表される。構造式VIII中、Ｑ3 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ8 およびＲ9 は、上記のように規定される。
【００６８】
好ましくは、構造式VIIIにおいて、Ｒ3 またはＲ9 は、−ＮＯ2 である。
【００６９】
別の態様において、Ｙは構造式IX：
【００７０】
【化２９】
【００７１】
で表される。構造式IX中、Ｑ3 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は上記のように規定される。
【００７２】
構造式IX中、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、好ましくは−Ｈであり、Ｑ3 は好ましくはジアルキルアミノである。
【００７３】
別の態様において、Ｙは：
【００７４】
【化３０】
【００７５】
からなる群より選ばれる。
【００７６】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉで表され、式中Ｙは構造式III ：
【００７７】
【化３１】
【００７８】
で表される。構造式III において、ｍは０または１である。ｐは０、１または２である。Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれの存在について、独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールである。Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｑ4 は−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ13−である。Ｒ13は、−Ｈ、任意に置換されたアルキルまたは任意に置換されたアリールである。Ｒ10は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 である。あるいは、Ｒ10およびＲ13は炭素原子および窒素原子と共に５または６員環のヘテロ環を形成する。Ｒ11およびＲ12は、ぞれぞれ独立して、−Ｈ、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。あるいは、Ｒ11およびＲ12は、接続した炭素と共に５または６員環の炭素環またはヘテロ環を形成する。
【００７９】
一つの態様において、構造式III のｍおよびｐは共に０であり、Ｙは構造式Ｘ：
【００８０】
【化３２】
【００８１】
で表される。構造式Ｘ中、Ｑ2 、Ｑ4 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は上記のように規定される。
【００８２】
好ましい態様において、Ｙは：
【００８３】
【化３３】
【００８４】
からなる群より選ばれる。
【００８５】
別の態様において、構造式III 中、ｍは１、ｐは１およびＹは構造式XI：
【００８６】
【化３４】
【００８７】
で表される。構造式XI中、Ｑ2 、Ｑ4 、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は上記のように規定される。
【００８８】
好ましい態様において、Ｙは構造式XII ：
【００８９】
【化３５】
【００９０】
で表される。
【００９１】
別の態様において、構造式III 中、ｍは０、ｐは１または２、およびＹは構造式XIII：
【００９２】
【化３６】
【００９３】
で表される。構造式XIII中、Ｑ2 、Ｑ4 、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は上記のように規定される。
【００９４】
好ましい態様において、Ｙは：
【００９５】
【化３７】
【００９６】
からなる群より選択される。
【００９７】
したがって、前記の保護基を含む試薬は、反応性求核性基の保護が必要とされる多くの応用法に使用され得る。かかる応用法には、ポリペプチド合成、固相および液相の両方のオリゴ−および多糖合成、ポリヌクレオチド合成、潜在性薬物の有機合成における求核性基の保護などが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
好ましくは、Ｍは、巨大分子を作製するのに使用され得る単量体基礎単位(building block)であろう。かかる基礎単位には、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、単糖類などが含まれる。好ましいヌクレオシドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、チミジンおよびデオキシグアノシンならびにかかるヌクレオシドを組み込んだオリゴヌクレオチドである。好ましくは、前記基礎単位は、水酸基またはアミン基を介して光不安定な(photolabile) 保護基に結合される。本発明の保護基と共にヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物を用いる場合、該保護基は好ましくはヌクレオシドの３’−ＯＨまたは５’−ＯＨに組み込まれる。他の好ましい化合物は、保護されたペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドである。小有機分子、タンパク質、ホルモン、抗体および求核性反応基を有する他のこれらの種は、本明細書で開示される保護基を用いて保護され得る。
【００９９】
ヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログの使用については、本明細書で開示される保護基を有するオリゴヌクレオチドアナログまたはオリゴヌクレオシドアナログを提供することも本発明で図られている。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドという用語は、一般に、本明細書に記載されるようなアナログを含む。これらのアナログは、オリゴヌクオチド配列またはオリゴヌクレオシド配列に組み込まれた場合、それらが溶液中で天然に存在するオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるような、天然に存在するヌクレオシドまたはヌクレオチドと同じようないくつかの構造的特徴を有するそれらの分子である。典型的には、これらのアナログは天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドから、その塩基、リボースまたはホスホジエステル部分を置換および／または修飾することにより得られる。変化は、目的に併せて調整され、ハイブリッド形成を安定化または不安定化したり、あるいは所望の相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を増強したりすることができる。
【０１００】
アナログは、また、オリゴヌクレオチド合成に日常的に使用されるような保護されたおよび／または修飾されたモノマーを含む。当業者であれば、オリゴヌクレオチド合成では、プリンおよびピリミジン部分の１つ以上の窒素がジメトキシトリチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなどの基により保護されている、種々の塩基保護デオキシヌクレオシド誘導体が使用されることは周知である。本発明が包含する特異的な単量体基礎単位には、塩基保護されたデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートおよびデオキシヌクレオシドホスホルアミダイトが含まれる。
【０１０１】
たとえば、構造基は、リボース上の２’−０位でメチル、プロピルまたはアリル基、または２’−Ｏ基について置換するフルオロ基、またはリボヌクレオシド塩基上のブロモ基などの、オリゴヌクレオチドへ組み込むためのヌクレオシドのリボースまたは塩基に任意に付加される。２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−ＭｅＯＲＮｓ）は、相補的核酸（特にＲＮＡ）に対して、それらの未修飾対よりも高いアフィニィティーを有する。２’−Ｏ−ＭｅＯＲＮＡホスホルアミダイトモノマーは、たとえば、ケム・ジーンズ社（Chem Genes Corp.) またはグレン・リサーチ社(Glen Research, Inc.) から市販されている。あるいは、プリンまたはピリミジンヘテロ環の１以上のＮ原子がＣ原子で置換されたデアザプリンおよびデアザピリミジンも使用され得る。
【０１０２】
ホスホジエステル結合、またはオリゴヌクレオチドアナログの「糖−ホルフェート骨格」は、また、たとえば、メチルホスホネートまたはＯ−メチルホスフェートで置換または修飾され得る。この開示のためのオリゴヌクレオチドアナログの別の例には、ポリアミド骨格がオリゴヌクレオチド塩基、または修飾されたオリゴヌクレオチド塩基に付着された「ペプチド核酸」が含まれる。ポリアミド骨格および天然に存在するヌクレオシドに見られる塩基を含むペプチド核酸は、市販されている。
【０１０３】
修飾された塩基を有するヌクレオチドも本発明において使用され得る。塩基修飾のいくつかの例には、相補的核酸についての結合アフィニィティーを増大するためにオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る、２−アミノアデニン、５−メチルシトシン、５−（プロピン−１−イル）シトシン、５−（プロピン−１−イル）ウラシル、５−ブロモウラシル、および５−ブロモシトシンが含まれる。基は、負に帯電したホスフェート骨格との静電気的な相互作用により、またはメジャーなおよびマイナーなグローブにおける水素結合相互作用を介して二本鎖を安定化し得るヌクレオシド糖環またはプリンもしくはピリミジン環の種々の位置に連結し得る。たとえば、アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは、Ｎ2 位置でイミダゾリルプロピル基と置換されて、二本鎖安定性を増大し得る。３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基アナログも含まれ得る。本発明での使用に適当な種々の修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログは、「アンチセンスの研究および応用（Antisense Research and Applications)」, S.T. Crooke とB. LeBleu(編) （ＣＲＣプレス，１９９３）および「アンチセンス研究における炭水化物修飾(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)」ACS Symp. Ser. ＃580, Y.S. Sanghvi とP.D. Cook(編) ACS, Washington, D.C. 1994) に記載されている。
【０１０４】
本発明の化合物は、たとえば、ホスゲン（ＣＯＣｌ2 ）、カルボニルジイミダゾールまたはペンタフルオロフェノキシクロロホルメートなどのカルボニル化試薬で「Ｙ」のアルコールまたはアミン前駆体をカルボニル化することにより調製され、Ｙ1 −Ｃ（Ｏ）−Ｘ〔式中、Ｙ1 −Ｃ（Ｏ）−はＹ基であり、Ｘはカルボニル化試薬（ホスゲンが使用される場合はＣｌ、ペンタフルオロフェノキシクロロホルメートが使用される場合はペンタフルオロフェノキシなど）由来の脱離基である〕が提供され得る。この中間体である、Ｙ1 −Ｃ（Ｏ）−Ｘは、次いで、その保護により保護基礎単位Ｙ1 −Ｃ（Ｏ）−Ｍを生じることが望まれる、求核基を有する分子Ｍと反応させる。
【０１０５】
あるいは、まず、前記のような、カルボニル化試薬で保護されている分子上の基をカルボニル化し、つぎに脱離基Ｘを置換し、次いで芳香族カルビノールの水酸基とともに挿入し得る。いずれの方法においても、脱離基の置換を促進するためにしばしばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの塩基を使用する。
【０１０６】
当業者は、本明細書に開示される保護基が「分子」としては伝統的に考えられていない種類のものにも付着し得ることを認識するだろう。したがって、本明細書に開示される保護基が付着した固体表面（たとえば、紙、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、シリコーン、修飾シリコーン、ＧａＡｓ、シリカなど）、ゲル（たとえば、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミドなどのような組成物も本発明に包含され得る。
【０１０７】
本発明の保護基は、典型的に、光分解、すなわち照射により除去されるが、選択された場合においては、開裂状態に触媒作用を及ぼす酸または塩基を使用するのに有利であろう。この合成は、３’＞５’または５’＞３のいずれの方向でも生じ得る。一般的に照射は、約350nm を超える波長、好ましくは約３６５ｎｍである。光分解は、通常、水系、アルコール系または混合水−アルコール系もしくは混合水−有機溶媒混合物などのヒドロキシル溶媒の存在中で行われる。しばしば使用されるアルコール系溶媒は、メタノールおよびエタノールを含みうる。光分解媒体は、過酸化水素などの求核性スカベンジャーも含む。光分解は、中性または塩基性ｐＨでしばしば行われる。
【０１０８】
本発明は、以下の工程：
（ａ）反応部位を有する支持体を提供する工程、
（ｂ）反応部位に分子を結合する工程であり、該一次分子が式Ｙの光不安定保護基に付着されたマスクされた反応部位を含む工程、および
（ｃ）光不安定保護基を除去して、誘導体化支持体に固定された、曝露された反応部位を有する分子を含む誘導化支持体を提供する工程
を含む、反応部位を有する分子を支持体に付着させる方法も提供する。
【０１０９】
当業者であれば、前記プロセスを繰り返して、固体支持体に付着されたコンポーネント分子の鎖を含む化合物を生じ得ることを認識するだろう。「混合と適合」アプローチにおいて、光不安定保護基は、保護された前駆体分子の合成の容易さに依存してそのプロセスにおける異なる工程で改変され得る。あるいは、光不安定保護基は、合成のいくつかの工程で使用され得、化学的に不安定なもの（たとえば、酸または塩基感受性基）は、たとえば、コンポーネントモノマーの有効性、基質の感受性などに依存して、他の工程において使用され得る。この方法は、米国特許第5,143,854 号、5,384,261 号、5,424,186 号、5,445,934 号、6,022,963 号および１９９５年１月２３日出願の継続出願中の米国特許出願第０８／３７６，９６３号（その全体は全ての用途のための参照として組み込まれる）に開示されるような支持体上の相違するおよび同定可能な部位に付着している化合物のアレイを調製する際に使用されるように生じ得る。
【０１１０】
当業者であれば、前記工程を繰り返して、固体支持体に付着されたコンポーネント分子の鎖を含む化合物を生じ得ることを認識するだろう。「混合と適合」アプローチにおいて、光不安定保護基は、保護された前駆体分子の合成の容易さに依存してそのプロセスにおける異なる工程で改変され得る。あるいは、光不安定保護基は、合成のいくつかの工程に使用され得、化学的に不安定なもの（たとえば、酸または塩基感受性基）は、たとえば、コンポーネントモノマーの有効性、基質の感受性などに依存して、他の工程において使用され得る。この方法は、米国特許第5,143,854 号、5,384,261 号、5,424,186 号、5,445,934 号および１９９５年１月２３日出願の継続出願中の米国特許出願第０8/376,963 号（現在5,959,298 号として発行されている）（全ての用途のための参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるような支持体上の相違するおよび同定可能な部位に付着する化合物のアレイを調製する際に使用されるようにも生じ得る。
【０１１１】
大きなアレイ上でオリゴマーを合成する一般的な方法は、当該分野で公知である。たとえば、米国特許第5,384,261 号は、基質上でポリマーの大きなアレイを形成するための方法やデバイスを記載している。本発明の好ましい側面によれば、基質は、そこで、チャンネルを有するチャンネルブロックにより接触される。選択された試薬は、チャンネルを介して流動し、基質は回転ステージで回転され、そしてプロセスが繰り返されて、基質上でポリマーのアレイが形成される。該方法は、光指向化方法論と組み合わされ得る。
【０１１２】
米国特許第5,143,854 号および第5,424,186 号は、ポリペプチドアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイを合成するための方法を記載している。ポリペプチドアレイは、光除去可能な保護基を基質表面に付着し、基質の選択領域を、その領域を活性化するために光に曝露し、光除去可能な基を有するアミノ酸モノマーを活性化領域に付着させ、所望の長さと配列を有するポリペプチドが合成されるまで活性化工程と付着工程を繰り返すことにより、基質上で合成され得る。
【０１１３】
光除去可能な保護基の使用は、パターン化照射を介して、固相合成の脱保護サイクル中に、基質表面の選択された部分の除去を可能にする。これは合成の空間的なコントロールを選択的に可能にする−−次のアミノ酸は、照射領域にのみ連結される。得られるアレイは、アレイ上のペプチドがレセプターに結合し得ることを決定するのに使用され得る。
【０１１４】
固相支持体上でオリゴヌクレオチドの形成は、基質−結合生長オリゴマーへのヌクレオチドの段階をおった付着を必要とする。反応条件下でのモノマーヌクレオチドの不必要な重合を防ぐために、ヌクレオチドの５’−水酸基の保護は必要とされる。モノマーがオリゴマーの末端に連結された後、５’−水酸保護基を除去し、別のヌクレオチドをその鎖に連結させる。この連結と脱保護のサイクルは、オリゴマー配列における各ヌクレオチドについて継続される。光除去可能な保護基の使用は、パターン化照射を介して、固相合成の脱保護サイクル中に基質表面の選択された部分の除去を可能にする。これは、合成の空間的なコントロールを選択的に可能にする−次のヌクレオチドは照射された領域にのみ連結される。
【０１１５】
好ましくは、感光性保護基は、紫外線（ＵＶ）または電磁スペクトルの可視部分での放射により、除去可能であろう。より好ましくは、保護基は、ＵＶ付近またはスペクトルの可視部分での放射により除去可能であろう。いくつかの態様においては、しかしながら、活性化は局在化された加熱、電子ビームリソグラフィー、ｘ線リソグラフィー、レーザーポンピング、微小電極を用いた酸化または還元などの他の方法により行われ得る。スルホニル化合物は、電子ビームリソグラフィーについての適当な反応基である。酸化または還元除去は、保護基の電流源への曝露によって、好ましくは活性化を必要とする表面の予め定められた領域へ指向された微小電極を用いて、なし遂げられる。他の方法は、この開示を考慮して使用され得る。
【０１１６】
種々の基を活性化または不活性化するのに光を使用する場合、光は、伝統的な白熱源、レーザー、レーザーダイオードなどに由来するものであり得る。光の非視準源が使用される場合、基質上での光の分散を防ぐために、薄いまたは多層のマスクを提供することが望ましいだろう。いくつかの態様では、合成をコントロールするために異なる波長に対して感受性がある基を利用することがさらに望ましいだろう。たとえば、異なる波長に対して感受性がある基を使用することにより、ポリマーの合成における分岐位置を選択するまたはある種のマスキング工程を除去することができる。
【０１１７】
アミノ酸などの異なる光保護モノマーは、異なる光分解率を示し得ることに注意されたい。特定の応用法においては、実質的に類似の光分解率を有する光保護モノマーを利用することが望ましいだろう。かかる一連の光保護モノマーを得るためには、一連の各モノマーについて適切な光保護基を選択する必要があるにすぎない。類似の様式で、光保護基の適切な選択により、（モノマー間で）実質的に異なる光分解率を有する、一連の光保護モノマーを調製することができる。
【０１１８】
光除去可能な保護基の多く（全てではない）は、ＵＶ付近および可視放射線を吸収する芳香族化合物であろう。適当な光除去可能な保護基は、好ましくは、ｏ−ニトロベンジル誘導体またはベンジルスルホニルなどのニトロ芳香族化合物を含む広範囲のポジティブ光反応基から選択され得る。好ましい態様において、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、２−ニトロベンジルオキシカルボニル（ＮＢＯＣ）またはα，α−ジメチル−ジメトキシベンジルオキシカルボニル（ＤＤＺ）が用いられる。光除去可能な保護基のさらなる例には、ニトロ基に対してオルトのベンジル水素を含む多重置換ニトロ芳香族化合物が含まれ、ここで置換基は、アルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、アルケニル、ニトロ、ハロ、または水素を含み得る。使用され得る他の物質には、ｏ−ヒドロキシ−α−メチルシンナモイル誘導体が含まれ得る。光除去可能な保護基のさらなる例は、たとえば、Patchornik, J. Am. Chem. Soc. (1970) 92:6333およびAmitら, J. Org. Chem. (1974)39:192に見られ得る。
【０１１９】
米国特許第5,413,854 号は、ポジティブ反応基が、溶液中において試薬との反応について活性化され得ることを示している。たとえば、５−ブロモ−７−ニトロインドリン基は、カルボニルに結合された場合、420nm の光に曝露すると反応をうける。あるいは、リンカー分子上の反応基は、シナメート基を含む、広範囲のネガティブな光反応基から選択される。
【０１２０】
米国特許第5,384,261 号は、得られた基質が、たとえば、生物学的活性について多数のポリマーをスクリーニングすることを含む、種々の使用を有することを記載している。生物学的活性についてスクリーニングするため、基質を、抗体全細胞、小胞上のレセプター、脂質、または任意の他の種々のレセプターなどの１以上のレセプターに曝露する。該レセプターは、好ましくは、たとえば、フルオレセインなどの蛍光マーカー、放射マーカー、またはレセプターと反応する標識化抗体で標識される。いくつかの場合、ポリマーの合成アレイ上のレセプターを含む溶液を導入するために、用いることができる。たとえば、チャンネルブロックは基質の領域に関して異なるレセプター濃度を有するレセプター溶液を導入するためにチャンネルブロックを用いられる。
【０１２１】
基質上のマーカーの位置は、たとえば、光子検出または放射能写真技術で検出される。結合が検出される位置での物質の配列の知識を通じて、配列がレセプターと結合することをすばやく決定することができ、したがって、その技術が多数のペプチドをスクリーニングするのに使用され得る。フルオレセイン標識により提供されるシグナルの増幅は、所望の抗体に基質を曝露し、次いでその基質を所望の抗体に相補的であり、好ましくは所望の抗体の複数の位置で結合する標識化物質に曝露することにより提供される。たとえば、マウス抗体が研究される場合、標識された二次抗体は、たとえばヤギ抗マウスである基質に曝露され得る。
【０１２２】
本発明の他の可能な応用は、本明細書では、特定のレセプターに対する種々の抗体が基質上に配置し、たとえば、血清が免疫欠乏症についてスクリーニングされるような診断を含む。また、さらなる応用には、たとえば、半導体装置中の有機物質の選択的な「ドーピング」、すなわち、前記装置などの中への選択された不純物の導入を含む。
【０１２３】
本発明で使用され得るレセプターの例には、（ウイルス、細胞、他の物質などの上の）特異的な抗原決定因子、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、および細胞小器官と反応する抗体、細胞膜レセプター、モノクローナル抗体および抗血清が含まれるが、これらに限定されない。レセプターの他の例には、米国特許第5,215,899 号に記載された触媒ポリペプチドが含まれる。
【０１２４】
したがって、本発明の関連する側面は、コンポーネント分子から、支持体上で多数の化合物を形成する方法であり、各化合物は支持体の分離領域を占め、次の工程：
（ａ）支持体の領域を活性化する工程、
（ｂ）該領域に、式Ｙの光不安定保護基に連結された、マスクされた反応部位を含む分子を結合させる工程、および
（ｃ）支持体の他の領域上で工程（ａ）および工程（ｂ）を繰り返し、それにより該他の領域がそれぞれ、光不安定保護基に連結したマスクされた反応部位を含む、別の分子に結合する工程であり、該別の分子が工程（ｂ）で使用されるものと同じまたは異なり得る工程、
（ｄ）光不安定保護基を、支持体の領域の一つに結合した１つの分子から除去して、曝露された反応部位をもつ分子を有する領域を提供する工程、
（ｅ）曝露された反応部位をもつ分子に追加の分子を結合させる工程、
（ｆ）所望の多数の化合物が、コンポーネント分子から形成され、各化合物が支持体の分離領域を占めるまで、支持体の領域上で工程（ｄ）および工程（ｅ）を繰り返す工程を含む方法を提供する。
【０１２５】
支持体の予め規定された領域上で多数の化合物を形成する関連方法には、化学的に不安定な保護基で保護された反応部位を有する分子を支持体の活性化領域に結合させ、反応部位を示すために化学的に不安定な保護基を化学的に除去する工程を含む。反応部位は、ついで、本発明の光不安定保護基で保護される。このプロセスは、支持体の分離領域上で光不安定保護基により保護された反応部位を有する分子を有する支持体を提供することが所望される場合、他の分子を有する支持体の他の領域について繰り返される。反応部位は、選択された領域から光不安定基を除去することにより、曝露され得、かつ支持体上の化合物のアレイを作り上げるためによりはやく記載されるように、光不安定保護基を有する追加の分子に結合させ得る。再び、「混合と適合」アプローチにおいて、化学的に不安定な保護基を有するモノマーは、基質上（即ち、モノマーの第１層が会合された場合には支持体自体の上、またはついで、反応部位が曝露された、すでに付着したモノマー上）の反応部位に付着され得、これらの化学的に不安定な保護基は、本発明の光不安定保護基により置換され得る。置換は、支持体上にあり得る任意の光不安定基に影響を与えない条件下で、化学的に不安定な保護基を除去することにより、達成される。これは、ついで、化学的に不安定な保護基を有するモノマー上の曝露された反応部位を示し、この曝露された反応部位は、式Ｙ−Ｘ（式中、Ｘは脱離基である）の試薬と反応させる。それにより、支持体のこの領域は、米国特許第5,143,854 号、第5,384,261 号、第5,424,186 号および第5,445,934 号に記載の光指向システムならびにさらに以下に記載のもの（すべての用途のためにその全ては参照により取り込まれる）により、選択的に除去され得る光不安定保護基により保護される。この方法は、本明細書に記載の光安定性保護基より化学的に不安定な保護基を有するモノマーがより容易に利用しうる場合、特に有用である。少なくとも一つの工程において本発明の保護基／試薬または化合物を使用する、支持体上で化合物の鎖または化合物のアレイを形成する任意の方法は、本発明の方法の範疇に含まれることが認識される。
【０１２６】
一般に、これらの方法は、モノマーの逐次添加を伴ない、基質または固体支持体の予め規定された領域を活性化させ、次に基質と本発明の保護モノマー（例えば、保護ヌクレオシドまたはアミノ酸）とを接触させることにより、支持体上のポリマー種のアレイを築く。個々のモノマーが工程から工程へ変更しうることが、認識されるであろう。半導体デバイスで用いられる場合、一般的な支持体は、ガラスまたはシリカ基質である。
【０１２７】
予め規定された領域は、典型的には集積回路の組立において使用される技術に類似するフォトリソグラフィーマスクなどのスクリーンを通して示される光源を用いて活性化されうる。支持体の他の領域は、照明からマスクにより遮断され化学的に保護されたままであるので、不活性なままである。したがって、光パターンは、支持体の領域が所定のモノマーと反応することを規定する。保護モノマーは、活性化領域と反応し、そこに固定される。保護基は、光分解により除去され、未反応モノマーと共に洗浄される。予め規定された領域の異なるセットを活性化し、異なるモノマー溶液と基質とを接触させることを繰り返し行なうことにより、基質の規定された領域に公知の組成物のポリマーの多様なアレイが調製されうる。106 、107 、108 、109 、1010、1011、1012またはそれ以上の異なるポリマーのアレイを、基質上で組み立てうる。領域は、1mm2以上、典型的には10μm2であり得、 1μm2ほど小さくてもよい。
【０１２８】
これらのアレイを調製する好ましい方法において、形(features)間のコントラストは、基質の前面曝露を介して増強されうる。「前面曝露」により、活性化光が基質の合成側に入射され、基質を通過する前に基質の合成側に接触することが意味される。前面曝露は、マスクが合成表面により近く位置するのを可能にすることにより、回折または発散の影響を低減する。さらに、おそらくより重要なことに、合成表面の曝露前の基質表面を通過する光からの屈折の影響もまた、前面曝露により、低減または削除される。前面曝露は、1996年4 月17日に提出された米国特許出願第08/634,053号（現在放棄されている）に十分詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
以前記載したが、本発明の好ましい光不安定保護基の光分解効率は、かかる光分解が水またはメタノールなどの求核溶媒の存在下で行なわれる場合、改善される。前面光分解が用いられる場合、これには特有の問題が存在する。詳細には、基質の前面が活性化放射に曝露される場合、フローセルは、かかる光分解の間の所望の求核環境を維持するために使用され得ない。したがって、好ましい局面において、本発明の保護基に使用する光指向合成法は、基質の合成表面上に薄層水性フィルムを提供することによりまたは基質の合成表面上を被覆することにより行なわれる。この薄層フィルムまたは被覆の存在は、合成表面の局部環境の制御、すなわち合成に好ましい条件を提供することを可能にする。「反応に好ましい条件」により、その環境において行なわれない反応に関して、１つまたは複数の所定の化学反応物の反応効率（例えば、反応速度、収率またはその両方）の改善が生じる条件を意味する。例えば、本明細書に記載の保護基を使用する合成方法に対して、保護基の光分解に好ましく、それにより効率的な合成を促進する求核環境を提供する被覆が適用されうる。かかる被覆の使用はまた、基質表面の前面曝露を可能にする。この方法はまた、被覆前に表面に両方の反応物を適用することにより、または被覆後第２の反応物を添加することによりあるいは被覆のエレメントとして添加することにより、１つより多くの化学反応物を反応させて行なわれうる。
【０１３０】
一般に、薄層フィルムまたは水性溶液の被覆は、例えば、前の合成工程に供された本発明の保護基が保有される基質の合成表面に適用されうる。被覆の適用は、当該分野で周知の方法により行なわれうる。例えば、スピン被覆法が利用され得、そこでは、基質の表面に一様な被覆を生じさせる被覆物質の適用の間に基質がスピンされる。単純な浸漬法、スプレー被覆法などを含む代替的な適用法もまた、使用されうる。
【０１３１】
被覆物質として使用するための水性溶液としては、典型的には、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの低分子量多価アルコールが挙げられる。これらの溶液は、一般に親水性であり、求核水酸基を提供し、それは光分解反応も支持する。多価アルコールはまた、溶液の粘度を増加し、被覆の厚さを制御するのに使用されうる。より高い分子量の多価アルコール、すなわちポリビニルアルコールは、被覆物質の粘度を調節するために使用されうる。
【０１３２】
一般的に、好ましい基質は、相対的に疎水的な表面を有する。基質表面上のフィルムの展着(spreading) および接着を可能にするために、水性被覆溶液はまたそれ自体、適切な界面活性剤を例えば約0.01〜約10％v/v 含みうる。かかる界面活性剤としては、一般に当該分野で周知のものが挙げられ、例えば、Triton X-100、Tween-80などが挙げられる。基質に対する被覆の展着および接着を促進するのに加えて、被覆溶液内のこれらの非揮発性溶質の添加は、フィルムの蒸発の量を制限し、その寿命を促進しうる。
【０１３３】
本明細書に記載された方法は、構造Ｙを有する光不安定保護基に付着するマスクされた反応部位を含有する成分分子も使用しうる。かかる場合において、保護基は、カルボキシレートまたはホスフェートなどの酸性反応部位に付着され、光分解により除去される。
【０１３４】
固体基質または固体支持体は、任意の形態でありうるが、それらは好ましくは、平面で透過性である（および潜在的にいくつかの３次元構造）。支持体は、大きさ、形または組成において均一(homogenous)である必要はないが、支持体は、通常好ましくは一様(uniform) である。ある態様において、大きさがまさに一様である支持体は、特に好ましくありうる。他の態様において、固体支持体の２つ以上の明確に異なる集団は、一定の目的のために使用されうる。
【０１３５】
固体支持体は多くの物質からなり得、それは任意の多くの化学反応基の付着に対する誘導体化のための能力およびアレイを製造するために使用される合成化学およびある態様においてタグ付着および／または合成に使用される方法との適合性により主に限定される。適切な支持体物質は、典型的には、ペプチドおよびポリマー合成に一般に使用される物質型であり、ガラス、ラテックス、重架橋ポリスチレンまたは類似のポリマー、金または他のコロイド状金属粒子、および当業者に公知の他の物質が挙げられる。かかる固体支持体が誘導体化されうる化学反応基は、ポリマーの固相合成に一般に用いられるものであり、したがって、当業者に周知のもの、すなわちカルボキシル、アミンおよびヒドロキシルである。
【０１３６】
洗浄効率を改善するために、非多孔支持体または典型的なペプチド合成支持体より少ない多孔性の他の固体支持体を使用しうる；しかしながら、本発明のある適用のために、非常に多孔性のビーズ、樹脂、または他の支持体が良好に作用し、しばしば好ましい。１つのかかる支持体は、ビーズの形態の樹脂である。一般に、ビーズの大きさは、1nm 〜100 μm の範囲であるが、1mm の大きさまでのより充実した固体支持体が、ときどき使用されうる。特に好ましい樹脂としては、Sasrin樹脂（Bachem Bioscience, Switzerlandから入手されるポリスチレン樹脂）；ならびにTentaGel S AC 、TentaGel PHBまたはTentaGel S NH2樹脂（Rappe Polymere, Tubingen, Germany から入手されるポリスチレン−ポリエチレングリコールコポリマー樹脂）が挙げられる。他の好ましい支持体が市販されており、Novabiochem, La Jolla, California に記載されている。
【０１３７】
他の態様において、固体基質は平面であり、または代替的には代替的表面配置を取りうる。例えば、固体基質は、合成が生じるふくらんだまたはくぼんだ領域を含みうる。ある態様において、固体基質は、適切な光吸収特性を提供するために選択されるでろう。例えば、基質は、重合されたLangmuir Blodgett フィルム、官能基化されたガラス、Si、Ge、GaAs、GaP 、SiO2、SiN4、修飾シリコン、または種々のゲルまたは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネートなどのポリマーの任意の１つ、あるいはそれらの組み合わせでありうる。他の適切な固体基質物質は、当業者に容易に明らかである。好ましくは、固体基質の表面は、反応基を含み、それはカルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオールなどでありうる。さらに好ましくは、表面は光学透過性であり、シリカ表面に見られるような表面Si-OH 官能性を有する。
【０１３８】
本明細書に開示された光不安定保護基および保護モノマーは、固体支持体上の分子のアレイの固定方法に基づくビーズにおいて使用されうる。
【０１３９】
ビーズに基づく合成に対する一般的なアプローチは、同時係争中である出願第07/762,522号( 1991年 9月18日に提出);出願第07/946,239号( 1992年 9月16日に提出);出願第08/146,886号( 1993年11月 2日に提出);出願第07/876,792号( 1992年 4月29日に提出) およびPCT/US93/04145( 1993年 4月28日に提出) 、Lam ら、(1991) Nature 354:82-84;PCT 出願第92/00091号およびHoughtenら、(1991) Nature 354:84-86 に記載されており、それぞれは、全目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
単一の平面の固体支持体は、化合物のアレイを合成するために使用され得、化合物は、非常に大きなスケールの固定ポリマー合成(VLSIPS.TM.)技術を用いてスクリーニングする前に、支持体から切断されうる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,143,845号明細書を参照のこと。１つの例としては、オリゴヌクレオチドのアレイがVLSIPS.TM.チップ上で合成され、各オリゴヌクレオチドは、ジスルフィドなどの切断可能リンカーによりチップに連結される。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,412,087号明細書(1992 年 4月24日に提出された米国特許出願第874,849 号) を参照のこと。オリゴヌクレオチドタグは、タグ化される分子の付着のために、アミンなどの遊離の官能基を有し、それは典型的にはオリゴマーおよび好ましくはペプチドである。タグは、ピリミジンのみ、またはピリミジンおよびプリンアナログベースを任意に含みうる。タグはまた、増幅のための結合部位、すなわちPCR プライマー部位、任意に配列決定プライマー部位、およびタグ化されるオリゴマーのモノマー配列を唯一にコードする短いセクションを含みうる。次に、オリゴマーが、すなわちタグの遊離の末端アミノ基からまたはタグに連結されたリンカーから合成され、そして各オリゴマーがタグに連結される。タグ化オリゴマーの集団は、リンカーを切断することによりチップから放出され、可溶性タグ化オリゴマーライブラリーを作製しうる。
【０１４１】
ビーズに基づく合成に関して、当該分野で周知の通常の技術が使用される。例えば、ペプチドの合成に関しては、Athertonら、「固相ペプチド合成」IRL Press,(1989)に記載されているメリフィールド技術が、使用されるだろう。異なるモノマーが使用される場合、他の合成技術が適切である。成長ポリマー鎖に添加されるモノマーがヌクレオチドである場合、例えば、Gaitら、Oligonucleotide Synthesis に記載される技術が使用されるだろう。これらの技術は、例示であるにすぎず、他のより進歩した技術が、米国特許第 4,242,974号明細書に開示される逆(reversed)および環化ポリマー合成に対するものなどのいくつかの態様において使用されるだろう。
【０１４２】
モノマーは基質に直接結合される必要がなく、モノマーと基質の間にリンカー分子が提供されうることが認識されるだろう。かかるリンカー分子は、例えば、米国特許第 5,445,934号明細書の11欄および12欄に記載された。
【０１４３】
所望の適用および効果に依存して、広く多様なリンカーが組み込まれうる。例えば、架橋または結合効率などの特性における所望の効果を達成するために、疎水性、親水性または立体容積を与えるリンカーを選択しうる。本発明の１つの局面において、分枝リンカー、すなわちリンカーFmoc-Thr(tBu) などのかさ高い側鎖を有するリンカーは、ライブラリーの固体支持体上の分子またはライブラリーの分子とタグとの間に堅さを与えるためまたはそれらの間隔を制御するために使用される。
【０１４４】
好ましい光切断可能リンカーとしては、6-ニトロベラトリルオキシカルボニル(nitroveratryloxycarbonyl)(NVOC)および他のNVOC関連リンカー化合物が挙げられる。米国特許第 5,143,854号明細書の11〜13欄を参照。もう１つの態様において、リンカーは、１つ以上の制限部位を有する核酸であるので、ライブラリーメンバーの１つの部分（タグ、オリゴマーもしくは他の目的の化合物または両方か、あるいは固体支持体のいずれか）が、別の部分から、適切な制限酵素により選択的に切断されうる。この新規核酸リンカーは、本発明の目的に対する有用な効果のために使用されうる多様なリンカーを説明する。
【０１４５】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、特に好ましい情報保有同定タグである。オリゴヌクレオチドは、天然の高密度の情報記録媒体である。モノマー型の同定および添加の工程または化学合成手順に関連する任意の他の情報が、短いオリゴヌクレオチド配列に容易にコードされる。オリゴヌクレオチドは、順番に、広く多様な固体支持体、オリゴマー、リンカーおよび他の分子への付着を容易に行ないうる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ペプチド合成ビーズに容易に付着されうる。
【０１４６】
あるモノマーセット（例えば、アミノ酸）のカップリング工程は、ある態様において、相対的に長いインキュベーション時間を必要とし得、このためおよび他の理由のために、並行した多数のモノマー添加を行なうシステムが所望である。コードした合成分子ライブラリーの作製およびスクリーニングに使用するための自動装置化は、好ましくは、50〜100 またはより多くの並行反応を同時に行ないうるものが、米国特許第 5,503,805号明細書(1993 年11月 2日に提出された特許出願第08/149,675号) に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。かかる装置は、プール、混合および再分配の種々のチャンネルに対するプログラム可能な制御下で、反応混合物または合成固体支持体のスラリーを分配しうる。
【０１４７】
しかしながら、一般に、タグ化分子の合成ライブラリーを作製するための器械設置は、代表的なペプチド合成機を、モノマーの多様性および使用したタグの数および所望の同時カップリング反応の数に対する多数の貯蔵器とあわせて配管する必要がある。タグ分配(dispensing)能力は、単純な指令をタグの正しい混合物に翻訳し、その混合物を分配する。所望の場合、モノマー構築ブロックが、特定の混合物として分配される。反応の攪拌、温度、および時間制御が提供される。適切に設計された装置がまた、アッセイ目的のために100 までの特異的ペプチドの1 〜50mg（粗）を作製しうるマルチチャンネルペプチド合成機として役にたつ。
【０１４８】
本明細書に記載の本発明は、アミノ酸などのモノマーの配列を含む分子の調製ならびに他のポリマーの調製に使用される。かかるポリマーとしては、例えば、核酸、多糖、リン脂質、およびα−、β−またはω−アミノ酸のいずれかを有するペプチドの直鎖および環状ポリマー、公知の薬物が上記の任意のものに共有結合されたヘテロポリマー、ポリヌクレオチド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、またはこの開示の観点から明らかである他のポリマーが挙げられる。異なるモノマー配列を有するポリマーが、基質の予め規定された異なる領域で形成される場合、かかるポリマーは「多様」である。
【０１４９】
さらに、本発明は、当業者により認識されうるような、成分ごとの様式で合成されうる化合物の任意のセットの調製に容易に適用されうる。例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントインおよびペプチジルホスホネートなどの化合物は、本方法を用いて調製されうる。参照により組み込まれる米国特許第 5,420,328号明細書を参照のこと。ポリマーの環化およびポリマー逆(polymer reversal)方法が、本発明と共に使用され得、米国特許第 5,242,974号明細書に開示され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
本発明の光切断可能保護基が使用されうる分子のアレイの固定の他の方法としては、ピンに基づくアレイおよびフローチャンネルおよびスポッティング方法が挙げられる。
【０１５１】
光切断可能アレイはまた、コンビナトリアル固相ペプチド合成に対するGeysenらにより開発されたピンアプローチを用いて調製されうる。この方法の説明は、Geysenら、J.Immunol.Meth.(1987)102:259-274により提供され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
単一基質上のライブラリー合成に適切であるさらなる方法は、米国特許第 5,384,261号明細書、米国特許第 5,677,195号明細書、米国特許第 6,040,193号明細書に記載され、全目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。これらの適用において開示された方法では、(1) 予め規定された領域上の規定されたチャンネル内における流動(flowing) または(2) 予め規定された領域上の「スポッティング」のいずれかにより、試薬は基質に送達される。しかしながら、他のアプローチ、ならびにスポッティングおよび流動の組み合わせが、使用されうる。それぞれの例において、モノマー溶液が様々な反応部位に送達される場合、基質の一定の活性化領域が機械的に他の領域から区別される。光切断可能リンカーは、この技術に特に適切であり、他では、この送達法は、展着、試薬希釈、不正確な送達などによる乏しい合成忠実度を生じるであろう。通常の酸切断可能リンカーよりむしろ光切断可能リンカーを用いることにより、次のアッセイまたは他の手順に対する表面から非常に純粋な物質が選択的に切断されうる。より詳細には、マスクは、リンカーの切断時に使用され得、送達領域（すなわち、試薬送達が非常に一致し、再現性のある領域）の中心のリンカーのみが切断されることを確実にしうる。したがって、このように選択的に切断された物質は、物質が全表面から取られた場合よりも、高純度であるであろう。
【０１５３】
典型的には、本方法で使用された分子は、複合体高分子のモノマー成分であろう。これらのモノマー成分は、小さいリガンド分子、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、単糖などであり得、それにより固相支持体上のポリペプチド、核酸および合成レセプターなどの複合体高分子またはポリマー配列のアレイの合成を可能にする。
【０１５４】
実施例
Ｉ. 合成方法
チミジンホスホルアミダイトモノマー上の5'光不安定保護基として、図２に示した好ましい基の例を合成し、試験した。異なる溶媒中の表面光分解率（std. 365nm光源）を、他に記載のようにして決定した（McGallら、JACS 1997, 119:5081,全目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる）。標準カップリング効率の測定を、切断可能リンカーHPLC解析技術〔米国特許出願第09/545,207号および代理人事件番号3233.1（その両方が全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照〕を用いて行った。
【０１５５】
図１は、好ましい化合物およびその合成を示す。それは、好ましい構造の一般構造、好ましい構造、その合成、好ましい保護基を用いて形成された核酸配列の収率および光分解条件を示す。また、合成工程は、特定の合成に関する参考文献を用いて注釈をつける。これらの参考文献の全ては、全目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
5'-TEMPOC-T-ホスホルアミダイトを、図３に概略を述べた工程を用いて合成し、詳細を図の参考文献に示した。詳細には、以下の参考文献：Dyerら、JOC 64:7988(1999);Tetrahedron Lett.,38(52),8933-4(1997);Mcgallら、JACS 119:5081(1997) が、全目的ならびに引用される工程のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。図は、トリホスゲンが工程１に対して等しく良好に作用し得、クロロホルメートがおそらく精製無しで工程２に使用されうることを示す。NINOC-T-CEP を、図４に示される工程に従って合成し、以下の参考文献；Bromidgeら、(1998)J. Med. Chem. 41:1598;Brooker, LS ら、(1953)米国特許第 2,646,430号明細書;Boekelheideら、(1954)J.Org.Chem.19:504;Bennetら、(1941) J.Chem.Soc.74:244; およびMortensen ら、(1996)Org.Prep.Proc.Int.28:123が、全目的ならびに引用される工程のために全体として参照により組み込まれる。図５〜８は、以下の化合物；Me2NPOC-T-CEP;Me3NPOC-T-CEP;およびNA1BOC-T-CEPの合成を示す。図８は、Aust.J.Chem 48:1969-70に関し、それはまた全体として参照により組み込まれる。プロセスの最初の工程で使用される略語は、物質の供給源を示す。例えば、DAV はDavos であり、LAN はLancaster であり、ALH はAdrichである。CEP は、シアノエチルN,N ジイソプロピルホスホルアミダイトを表す。
【０１５７】
図９〜20は、本発明の他の化合物の合成方法を提供する。
【０１５８】
II. 光分解研究
表面光分解率および逐次合成効率（またはサイクル収率）を、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれるMcGallら、J.Am.Chem.Soc.(1997),119(22):5081 に記載の方法に従って行なった。様々な光分解条件に基づく本発明の保護基の切断の半減期およびサイクル収率を表１に挙げる。
【０１５９】
【表１】
【０１６０】
前記発明は、明瞭および理解の目的のために例示および実施例により、詳細に説明される。添付の請求の範囲の範囲内で変更および改変が行なわれることが、当業者に明らかであろう。それゆえに、上記説明が、例示であって限定を意図するものでないことが理解される。したがって、本発明の範囲は、上記説明に関して決定されないが、代わりに以下の添付の特許請求の範囲に関して、加えてかかる請求の範囲が権利を与える十分な範囲の同等物に関して決定されるであろう。
【０１６１】
本出願に引用される全ての特許、特許出願および出版物は、それぞれの個々の特許、特許出願または出版物が個々に示されている限り、同一の程度まで全目的に対して全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、選択的合成化学反応（alternative synthesis chemistries）の一般的な概要、および「Ｙ」の一般構造がどのようなものでありうるかの概要を示す。
【図２】
図２は、図１に示す一般構造のうち好ましい具体的な化合物を示し、ヌクレオチドを互いに結合させるためにこれらを使用した場合の段階収率および使用した具体的な光分解条件を示す。
【図３】
図３は、５’−ＴＥＭＰＯＣ−Ｔ−ホスホルアミダイトの合成を示す。
【図４】
図４は、ＮＩＮＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図５】
図５は、Ｍｅ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。ＣＥＰは、シアノエチルＮ，Ｎジイソプロピルホスホルアミダイトを表す。
【図６】
図６は、Ｍｅ３ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図７】
図７は、ＮＰ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図８】
図８は、ＮＡ１ＢＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図９】
図９は、１−（３−ニトロクマリン−４−イル）エチルアルコールの合成を示す。
【図１０】
図１０は、６，７−ジメトキシクマリンホスホルアミダイトの合成を示す。該方法は、７，８−ジメトキシクマリンホスホルアミダイトおよび５，７−ジメトキシクマリンホスホルアミダイトの合成にも適用されうる。
【図１１】
図１１は、７，８−ジメトキシ−５−ニトロクマリニル−４−エタノールの合成を示す。
【図１２】
図１２は、（１，２）ＮＮＥＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１３】
図１３は、（９，１０）ＮＰｈｅｎＥＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１４】
図１４は、５’−（７−ジエチルアミノクマリン−３−イル）メチルオキシカルボニル−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１５】
図１５は、Ｎ−アルキル−４，５−置換−２−ニトロアナリドの合成を示す。
【図１６】
図１６は、（８，１）ＮＮＥＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１７】
図１７は、５’−（７−メトキシ−３−ニトロクマリン−４−イルオキシカルボニル）チミジン−３’−ホスホルアミダイトの合成を示す。
【図１８】
図１８は、（３，２）ＮＮＥＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１９】
図１９は、５’−（７−ジエチルアミノクマリン−４−イル）メチルオキシカルボニル−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図２０】
図２０は、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルカルボニル−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図２１】
図２１は、好ましい「Ｙ」基を示す。
関連出願
本出願は、２０００年９月１１日に出願された米国特許出願第09/659,599号の一部継続出願である。上記出願の全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
発明の背景
本発明は化学合成の分野に関する。より詳しくは、本発明は、光不安定な化合物、該化合物を調製するための試薬、ならびに、特に固体支持体上の高密度分子アレイの合成におけるその光切断性リンカーおよび保護基としての使用方法に関する。分子を固体支持体に結合させるため、およびその後の切断反応を促進するためのリンカーとしての光不安定分子の使用は、ここ２０年の間、かなり注目されている。光分解は、伝統的な酸性切断技術または塩基性切断技術を補足する穏やかな切断方法を提供する。例えば、Lloyd-Williamsら(1993)Tetrahedron 49:11065-11133を参照のこと。ペプチドおよび低分子のライブラリーが関与するコンビナトリアル有機合成分野の急速な成長（例えば、Gallopら(1994)J.Med.Chem.37:1233-1251;およびGordonら(1994)J.Med.Chem.37:1385-1401 を参照のこと）は、リガンドおよび標識性分子の両方を放出するための光不安定リンカーの使用に対する関心を顕著に再燃（renew ）させた。
【０００３】
光不安定保護基として種々のオルト−ベンジル化合物が、ペプチド（Fodor ら(1994)Science 251:767-773 を参照のこと）およびオリゴヌクレオチド（Pease ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:5022-5026 を参照のこと）の両方のフォトリソグラフィー合成を最適化する過程において使用されている。国際公開公報WO 90/15070 、WO 92/10092 およびWO 94/10128 を参照のこと。また、１９９２年１１月２日に出願された米国特許出願第07/971,181号明細書、および１９９４年９月２２日に出願された米国特許出願第08/310,510号明細書；Peptides：Chemistry,Structure and Biology （第１３回米国ペプチドシンポジウムの講演集）のHolmesら（１９９４）；Hodgesら編、ESCOM:Leiden;pp.110-12（これらの参考文献のそれぞれは、あらゆる目的のために参照により本明細書に援用される）を参照のこと。これらの化合物の例としては、ベンゼン環内にさらに２個のアルコキシ基を含有する６−ニトロベラトリル（veratryl）誘導型保護基が挙げられる。ベンジル炭素上へのα−メチルの導入は、＞350nm のＵＶ光での光分解性切断を促進し、ニトロソケトンの形成をもたらした。
【０００４】
光切断性の保護基およびリンカーは、種々の試薬（例えば、ピペリジン、ＴＦＡなど）に対して安定で、温和な条件下で速やかに切断され、かつ反応性の高い副産物を生じないものでなければならない。本発明は、かかる保護基およびその高密度分子アレイの合成における使用方法を提供する。
【０００５】
発明の概要
本発明の第１の局面によれば、化学合成、好ましくはオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの固相合成における保護基を提供するのに有用な新規化合物が提供される。これらの化合物は、一般に光不安定であり、反応基をマスクしないように光分解により除去されうる保護基を含有する。一態様において、該化合物は、図１および９に示すような一般式を有する。
【０００６】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉ：
Ｙ−Ｘ
Ｉ
で表すことができる。構造式Ｉにおいて、Ｘは、脱離基、またはマスクされた反応部位を有する化合物であり、Ｙは、光不安定保護基である。一態様において、光不安定保護基は、マスクされた反応部位に結合している。したがって、マスクされた反応部位は、該光不安定保護基が、例えば350nm より大きな波長の放射線への曝露によって切断されるまで、別の化合物と反応しない。好ましい態様において、Ｙは、
【０００７】
【化１８】
からなる群より選ばれる。上記の構造の基において、Ｒは、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、または任意に置換されたアリールである。Ａは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、または−（ＣＨ2 ）k −である。ｋは、０または１〜約３の整数である。Ｂは、一価または二価の非プロトン性の弱塩基性基である。
【０００９】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉで表され、式中のＹが構造式ＩＩ：
【００１０】
【化１９】
で表されるものである。
【００１２】
構造式ＩＩにおいて、Ｒ1 およびＲ2 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または前記記載の基のビニル様（vinylogous）誘導体である。Ｑ1 は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−である。Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシ、または−ＮＯ2 であるが、Ｒ3 またはＲ4 の一方が−ＮＯ2 であるとき、Ｒ1 またはＲ2 の少なくとも一方は−Ｈであるとする。Ｒ5 およびＲ6 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。Ｑ3 は、−Ｈ、任意に置換されたアルコキシ、またはジアルキルアミノである。Ｚ1 およびＺ2 は、一体となって−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ7 Ｃ（Ｏ）−、または−ＣＲ8 ＝ＣＲ9 −である。Ｒ7 は、−Ｈまたはアルキルである。Ｒ8 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。Ｒ9 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 である。あるいはまた、Ｒ8 およびＲ9 は、これらが結合している炭素原子とともに、五員環または六員環の炭素環または複素環を形成する。しかしながら、Ｒ3 、Ｒ4 またはＲ9 のいずれも−ＮＯ2 でない場合、Ｑ1 は−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−でないとする。
【００１３】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉで表され、式中のＹが構造式ＩＩＩ：
【００１４】
【化２０】
で表されるものである。構造式ＩＩＩにおいて、ｍは０または１である。ｐは０、１または２である。Ｒ1 およびＲ2 は、各存在について、独立して−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または前述の基のビニル様誘導体である。Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｑ4 は、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ13−である。Ｒ13は、−Ｈ、任意に置換されたアルキルまたは任意に置換されたアリールである。Ｒ10は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 である。あるいはまた、Ｒ10およびＲ13は、これらが結合している炭素原子および窒素原子とともに、五員環または六員環の複素環を形成する。Ｒ11およびＲ12は、それぞれ、独立して−Ｈ、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。あるいはまた、Ｒ11およびＲ12は、これらが結合している炭素とともに一体となって、五員環または六員環の炭素環または複素環を形成する。
【００１６】
本発明の別の局面は、
（ａ） 反応部位を有する支持体を提供する工程、
（ｂ） 該反応部位に、図１に示す式の光不安定保護基と結合したマスクされた反応部位を含有する分子を結合させる工程、
（ｃ） 光不安定保護基を除去し、マスクされていない反応部位を有する分子が上面に固定された誘導体化支持体を提供する工程
を含む、反応部位を有する分子を支持体に結合させる方法を提供する。
【００１７】
別の態様において、反応部位を有する分子を支持体に結合させる方法は、
（ａ） 反応部位を有する支持体を提供する工程、
（ｂ） さらなる反応部位を含有する構造式Ｉで表される第１の化合物の該反応部位を支持体と反応させて結合を形成する工程、ならびに
（ｃ） 光不安定保護基を除去し、上面に固定された、マスクされていない反応部位を含有する構造式Ｉの化合物を含む誘導体化支持体を提供する工程
を含む。
【００１８】
本発明の関連する局面は、成分分子から、支持体上に複数の化合物を形成する方法を提供する。各化合物は、該支持体の別々の領域を占め、該方法は、
（ａ） 支持体の領域を活性化する工程、
（ｂ） 図１に示す、または構造式IIもしくはIII に示す式の光不安定保護基と結合したマスクされた反応部位を含有する分子を該領域に結合させる工程、
（ｃ） 工程（ａ）および（ｂ）を、該支持体の他の領域において繰り返し、それにより該他の領域のそれぞれに、光不安定保護基と結合したマスクされた反応部位を含有する別の分子を結合させる工程、ここで、該別の分子は工程（ｂ）で使用したものと同じであっても異なっていてもよい、
（ｄ） 支持体の領域の１つに結合した分子の１つから光不安定保護基を除去し、マスクされていない反応部位を有する分子を含有する領域を提供する工程、
（ｅ） マスクされていない反応部位を有する分子にさらに分子を結合する工程、
（ｆ） 成分分子から所望の複数の化合物（各化合物は、該支持体の別々の領域を占める）が形成されるまで、工程（ｄ）および（ｅ）を該支持体の領域において繰り返する工程
を含む。
【００１９】
該方法は、３’から５’または５’から３’のいずれかの方向で、固体支持体上に核酸の高密度アレイを合成するのに特に有用であることが見出される。
【００２０】
発明の詳細な説明
以下の定義は、本明細書において本発明を記載するために使用される種々の用語の意味および範囲を例示および規定するために記載される。
【００２１】
「アルキル」という用語は、１〜２０個の炭素原子を有する、分枝鎖または直鎖の非環式単価飽和炭化水素ラジカルをいう。
【００２２】
「アルコキシ」という用語は、酸素を介して化合物に結合したアルキル基をいう。
【００２３】
「アルケニル」という用語は、少なくとも１個の炭素−炭素二重結合を含有する不飽和炭化水素ラジカルをいい、直鎖、分枝鎖および環式のラジカルを包含する。
【００２４】
「アルキニル」という用語は、少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を含有する不飽和炭化水素ラジカルをいい、直鎖、分枝鎖および環式のラジカルを包含する。
【００２５】
「アリール」という用語は、１個の環（例えばフェニル）または２個の縮合環（例えばナフチル）を有する芳香族単価炭素環式ラジカルをいうが、独立してアルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、ニトロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、アシル、ヒドロキシカルボニル、低級アルコキシカルボニル、ヒドロキシスルホニル、低級アルコキシスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、トリフルオロメチル、シアノ、テトラゾイル（tetrazoyl ）、カルバモイル、低級アルキルカルバモイルおよびジ低級アルキルカルバモイルにより任意に一置換、二置換または三置換されたものであり得る。あるいはまた、芳香環の２つの隣接する位置がメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ基で置換されていてもよい。典型的には、電子供与性置換基が好ましい。
【００２６】
「ヘテロ芳香族」または「ヘテロアリール」という用語は、環内に少なくとも１個のヘテロ原子、例えば窒素、酸素もしくは硫黄を有する芳香族単価の単環式または多環式ラジカルをいう。ここで、該芳香族環は、独立してアルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、ニトロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、アシル、ヒドロキシカルボニル、低級アルコキシカルボニル、ヒドロキシスルホニル、低級アルコキシスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、トリフルオロメチル、シアノ、テトラゾイル、カルバモイル、低級アルキルカルバモイルおよびジ低級アルキルカルバモイルにより任意に一置換、二置換または三置換されたものであり得る。例えば、１個以上の窒素原子を有する典型的なヘテロアリール基は、テトラゾイル、ピリジル（例えば、４−ピリジル、３−ピリジル、２−ピリジル、）、ピロリル（例えば、２−ピロリル、２−（Ｎ−アルキル）ピロリル）、ピリダジニル、キノリル（例えば、２−キノリル、３−キノリルなど）、イミダゾリル、イソキノリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリドニルまたはピリダジノニルであり、酸素原子を有する典型的な酸素へテロアリールラジカルは、２−フリル、３−フリルまたはベンゾフラニルであり、典型的な硫黄へテロアリールラジカルは、チエニルおよびベンゾチエニルであり、典型的な混合ヘテロ原子ヘテロアリールラジカルは、フラザニルおよびフェノチアジニルである。さらに、該用語は、環内のヘテロ原子が酸化されており、例えば、Ｎ−オキシドまたはスルホンが形成された場合も包含する。
【００２７】
本明細書で使用されるヘテロシクロアルキル基は、好ましくは５〜６個の原子を有し、窒素、酸素および硫黄から選ばれる少なくとも１個のヘテロ原子を含有する非芳香族環系である。ヘテロシクロアルキル基の例としては、モルホリニル、ピペリジニル、ピペラジニル、チオモルホリニル、ピロリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチエニル、アゼチジニル、テトラヒドロフリル、ジオキサニルおよびジオキセパニルが挙げられる。
【００２８】
「複素環」という用語は、ヘテロアリール基およびヘテロシクロアルキル基を包含する。
【００２９】
「炭素環」という用語は、３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基、およびアリール基を包含する。
【００３０】
「ビニル様誘導体」という用語は、ビニル基によって化合物に結合した基をいう。ビニル基は、シスまたはトランスのいずれかの立体配置を有しうる。例えば、フェニル基のトランスビニル様誘導体およびシスビニル様誘導体は、以下の構造式：
【００３１】
【化２１】
を有しうる。
【００３３】
「任意に置換された」という用語は、規定された基上における置換基の存在またはその欠如をいう。置換が存在する場合、該基は、独立して、アルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、ニトロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノ、ジ低級アルキルアミノ、アシル、ヒドロキシカルボニル、低級アルコキシカルボニル、ヒドロキシスルホニル、低級アルコキシスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、トリフルオロメチル、シアノ、テトラゾイル、カルバモイル、低級アルキルカルバモイルおよびジ低級アルキルカルバモイルにより一置換、二置換または三置換されたものであり得る。典型的には、アルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ低級アルキルアミノおよびジ低級アルキルアミノなどの電子供与性置換基が好ましい。
【００３４】
「電子供与性基」という用語は、分子内の同じ位置を占める場合、水素原子の場合よりも電子に対する親和性が低いラジカル基をいう。例えば、典型的な電子供与性基は、ヒドロキシ、アルコキシ（例えばメトキシ）、アミノ、アルキルアミノおよびジアルキルアミノである。
【００３５】
「脱離基」という用語は、化学反応において求核基によって置換されうる基、例えば、ハロ、ニトロフェノキシ、ペンタフルオロフェノキシ、アルキルスルホネート（例えば、メタンスルホネート）、アリールスルホネート、ホスフェート、スルホン酸、スルホン酸塩などを意味する。
【００３６】
「活性化基」は、特定の官能基または反応部位に結合すると、該部位を第２の官能基または反応部位との共有結合形態に対してより反応性にする基をいう。カルボン酸に有用な活性化基の群としては、単純エステル基および無水物が挙げられる。エステル基としては、アルキル、アリールおよびアルケニルエステル、および特に４−ニトロフェニル、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミドおよびペンタフルオロフェノールなどの基が挙げられる。他の活性化基は当業者に公知である。
【００３７】
「化学物質ライブラリー」または「アレイ」は、合成的または生合成的のいずれかにより調製され得、かつ種々の異なる形式（例えば、可溶性分子のライブラリー、および樹脂ビーズ、シリカチップまたは他の固体支持体上に固定された化合物のライブラリー）で、生物学的活性についてスクリーニングされ得る、異なる分子の集合体を意図的に作製したものである。該用語はまた、意図的に作製した立体異性体の集合体をも指すことが意図される。
【００３８】
「予め規定された領域」は、選択された分子の形成に使用される、使用された、または使用することが意図される、固体支持体上の局所エリアをいい、この用語以外に、本明細書において代替的に「選択された」領域という。予め規定された領域は、任意の簡便な形状、例えば、円形、三角形、楕円形、くさび形などを有し得る。本明細書において簡潔にするため、「予め規定された領域」を単に「領域」という場合がある。いくつかの態様において、予め規定された領域、したがって、個々の化合物が合成されるエリアは、約1cm2より小さか、または1mm2より小さい。これらの領域内において、そこで合成される分子は、好ましくは実質的に純粋な形態で合成される。さらなる態様において、予め規定された領域は、該領域（すなわち、ビーズ、樹脂、ゲルなど）をウェル、トレイなどに物理的に分離することにより得られうる。
【００３９】
「固体支持体」、「支持体」および「基材」は、硬質または半硬質の１つまたは複数の表面を有する材料または材料群をいう。多くの態様において、固体支持体の少なくとも１つの表面は、実質的に平坦であるが、いくつかの態様においては、異なる化合物の合成領域を、例えば、ウェル、隆起領域、ピン、エッチング溝、などで物理的に分離することが望ましい場合もある。他の態様によれば、固体支持体は、ビーズ、樹脂、ゲル、マイクロスフェアの形態または他の幾何的形態をとり得る。
【００４０】
本明細書に記載の化合物および中間体の同定および精製は、所望により、例えば、濾過、抽出、結晶化、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、厚層（thick-layer ）（調製用）クロマトグラフィー、蒸留またはこれらの手順の組み合わせなどの任意の適切な分離または精製手順により行われうる。適切な分離および単離手順の具体的な例示は、以下に記載する実施例を参照することによりなされ得る。しかしながら、他の等価な分離または単離手順もまた、もちろん使用し得る。
【００４１】
「チャンネルブロック」は、表面上に複数の溝または凹部領域を有する材料である。該溝または凹部領域は、限定されないが、細形、円形、蛇行路などを含む種々の幾何的形態をとり得る。チャンネルブロックは、シリコンブロックのエッチング、ポリマーの成型または圧縮などを含む、種々の様式で調製されうる。
【００４２】
本発明は、化学合成、好ましくはオリゴヌクレオチドおよびポリペプチドの固相合成ならびにその高密度アレイにおける保護基を提供するのに有用な新規化合物を提供する。これらの化合物は、一般に光不安定であり、反応基をマスクしないように光分解により除去されうる保護基を含有する。具体的に、好ましい化合物を図１および９に示す。より具体的には、好ましい化合物は、Ｈ、任意に置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはヘテロ芳香族基でありうるＲまたはＲ１基を有する。
【００４３】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉで表され、式中のＹが構造式ＩＩ：
【００４４】
【化２２】
で表されるものである。
【００４６】
構造式ＩＩにおいて、Ｒ1 およびＲ2 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリール、または前記記載の基のビニル様誘導体である。Ｑ1 は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−である。Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｒ3 およびＲ4 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシ、または−ＮＯ2 であるが、Ｒ3 またはＲ4 の一方が−ＮＯ2 であるとき、Ｒ1 またはＲ2 の少なくとも一方は−Ｈである。Ｒ5 およびＲ6 は、それぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。Ｑ3 は、−Ｈ、任意に置換されたアルコキシ、またはジアルキルアミノである。Ｚ1 およびＺ2 は、一体となって−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ7 Ｃ（Ｏ）−、または−ＣＲ8 ＝ＣＲ9 −である。Ｒ7 は、−Ｈまたはアルキルである。Ｒ8 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。Ｒ9 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 である。あるいはまた、Ｒ8 およびＲ9 は、これらが結合している炭素原子とともに、五員環または六員環の炭素環または複素環を形成する。しかしながら、Ｒ3 、Ｒ4 またはＲ9 のいずれも−ＮＯ2 でない場合、Ｑ1 は−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−でない。
【００４７】
好ましい態様において、Ｘは、マスクされた反応部位を有する化合物であり、反応部位をさらに有する。より好ましくは、Ｘは、アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオシドホスホルアミダイト、ヌクレオシドＨ−ホスホネート、ヌクレオチド、固体支持体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ホルモン、抗体、多糖、単糖、二糖、固体支持体に結合したペプチド、固体支持体に結合したオリゴヌクレオチド、固体支持体に結合したタンパク質、固体支持体に結合したホルモン、固体支持体に結合した抗体、固体支持体に結合した多糖、固体支持体に結合した単糖、または固体支持体に結合した二糖からなる群より選ばれる。
【００４８】
別の好ましい態様において、Ｙは構造式IV：
【００４９】
【化２３】
で表される。構造式IVにおいて、Ｑ1 、Ｑ2 、Ｑ3 、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｚ1 およびＺ2 は、先に定義したとおりである。
【００５１】
より好ましくは、Ｙは構造式Ｖ：
【００５２】
【化２４】
で表される。構造式Ｖにおいて、Ｑ2 、Ｑ3 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、先に定義したとおりである。
【００５４】
構造式II、IVおよびＶにおいて、Ｒ3 またはＲ4 のうち一方は、好ましくは−ＮＯ2 である。
【００５５】
好ましくは、構造式Ｖにおいて、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は−Ｈであり、Ｑ3 はジアルキルアミノである。
【００５６】
別の好ましい態様において、Ｙは構造式VI：
【００５７】
【化２５】
で表される。
【００５９】
別の態様において、Ｙは、以下：
【００６０】
【化２６】
からなる群より選ばれる。
【００６２】
別の態様において、Ｙは構造式VII ：
【００６３】
【化２７】
で表される基である。構造式VII において、Ｑ1 、Ｑ2 、Ｑ3 、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｚ1 およびＺ2 は、先に定義したとおりである。
【００６５】
別の態様において、Ｙは構造式VIII：
【００６６】
【化２８】
で表される。構造式VIII中、Ｑ3 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 、Ｒ6 、Ｒ8 およびＲ9 は、上記のように規定される。
【００６８】
好ましくは、構造式VIIIにおいて、Ｒ3 またはＲ9 は、−ＮＯ2 である。
【００６９】
別の態様において、Ｙは構造式IX：
【００７０】
【化２９】
で表される。構造式IX中、Ｑ3 、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は上記のように規定される。
【００７２】
構造式IX中、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 は、好ましくは−Ｈであり、Ｑ3 は好ましくはジアルキルアミノである。
【００７３】
別の態様において、Ｙは：
【００７４】
【化３０】
からなる群より選ばれる。
【００７６】
別の態様において、本発明の化合物は、構造式Ｉで表され、式中Ｙは構造式III ：
【００７７】
【化３１】
で表される。構造式III において、ｍは０または１である。ｐは０、１または２である。Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれの存在について、独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールである。Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｑ4 は−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ13−である。Ｒ13は、−Ｈ、任意に置換されたアルキルまたは任意に置換されたアリールである。Ｒ10は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 である。あるいは、Ｒ10およびＲ13は炭素原子および窒素原子と共に５または６員環のヘテロ環を形成する。Ｒ11およびＲ12は、ぞれぞれ独立して、−Ｈ、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシである。あるいは、Ｒ11およびＲ12は、接続した炭素と共に５または６員環の炭素環またはヘテロ環を形成する。
【００７９】
一つの態様において、構造式III のｍおよびｐは共に０であり、Ｙは構造式Ｘ：
【００８０】
【化３２】
で表される。構造式Ｘ中、Ｑ2 、Ｑ4 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は上記のように規定される。
【００８２】
好ましい態様において、Ｙは：
【００８３】
【化３３】
からなる群より選ばれる。
【００８５】
別の態様において、構造式III 中、ｍは１、ｐは１およびＹは構造式XI：
【００８６】
【化３４】
で表される。構造式XI中、Ｑ2 、Ｑ4 、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は上記のように規定される。
【００８８】
好ましい態様において、Ｙは構造式XII ：
【００８９】
【化３５】
で表される。
【００９１】
別の態様において、構造式III 中、ｍは０、ｐは１または２、およびＹは構造式XIII：
【００９２】
【化３６】
で表される。構造式XIII中、Ｑ2 、Ｑ4 、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は上記のように規定される。
【００９４】
好ましい態様において、Ｙは：
【００９５】
【化３７】
からなる群より選択される。
【００９７】
したがって、前記の保護基を含む試薬は、反応性求核性基の保護が必要とされる多くの応用法に使用され得る。かかる応用法には、ポリペプチド合成、固相および液相の両方のオリゴ−および多糖合成、ポリヌクレオチド合成、潜在性薬物の有機合成における求核性基の保護などが含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
好ましくは、Ｍは、巨大分子を作製するのに使用され得る単量体基礎単位(building block)であろう。かかる基礎単位には、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、単糖類などが含まれる。好ましいヌクレオシドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、チミジンおよびデオキシグアノシンならびにかかるヌクレオシドを組み込んだオリゴヌクレオチドである。好ましくは、前記基礎単位は、水酸基またはアミン基を介して光不安定な(photolabile) 保護基に結合される。本発明の保護基と共にヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド組成物を用いる場合、該保護基は好ましくはヌクレオシドの３’−ＯＨまたは５’−ＯＨに組み込まれる。他の好ましい化合物は、保護されたペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびオリゴデオキシヌクレオチドである。小有機分子、タンパク質、ホルモン、抗体および求核性反応基を有する他のこれらの種は、本明細書で開示される保護基を用いて保護され得る。
【００９９】
ヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログの使用については、本明細書で開示される保護基を有するオリゴヌクレオチドアナログまたはオリゴヌクレオシドアナログを提供することも本発明で図られている。したがって、ヌクレオシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドおよびデオキシヌクレオチドという用語は、一般に、本明細書に記載されるようなアナログを含む。これらのアナログは、オリゴヌクオチド配列またはオリゴヌクレオシド配列に組み込まれた場合、それらが溶液中で天然に存在するオリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができるような、天然に存在するヌクレオシドまたはヌクレオチドと同じようないくつかの構造的特徴を有するそれらの分子である。典型的には、これらのアナログは天然に存在するヌクレオシドおよびヌクレオチドから、その塩基、リボースまたはホスホジエステル部分を置換および／または修飾することにより得られる。変化は、目的に併せて調整され、ハイブリッド形成を安定化または不安定化したり、あるいは所望の相補的核酸配列とのハイブリダイゼーションの特異性を増強したりすることができる。
【０１００】
アナログは、また、オリゴヌクレオチド合成に日常的に使用されるような保護されたおよび／または修飾されたモノマーを含む。当業者であれば、オリゴヌクレオチド合成では、プリンおよびピリミジン部分の１つ以上の窒素がジメトキシトリチル、ベンジル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチルなどの基により保護されている、種々の塩基保護デオキシヌクレオシド誘導体が使用されることは周知である。本発明が包含する特異的な単量体基礎単位には、塩基保護されたデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートおよびデオキシヌクレオシドホスホルアミダイトが含まれる。
【０１０１】
たとえば、構造基は、リボース上の２’−０位でメチル、プロピルまたはアリル基、または２’−Ｏ基について置換するフルオロ基、またはリボヌクレオシド塩基上のブロモ基などの、オリゴヌクレオチドへ組み込むためのヌクレオシドのリボースまたは塩基に任意に付加される。２’−Ｏ−メチルオリゴリボヌクレオチド（２’−Ｏ−ＭｅＯＲＮｓ）は、相補的核酸（特にＲＮＡ）に対して、それらの未修飾対よりも高いアフィニィティーを有する。２’−Ｏ−ＭｅＯＲＮＡホスホルアミダイトモノマーは、たとえば、ケム・ジーンズ社（Chem Genes Corp.) またはグレン・リサーチ社(Glen Research, Inc.) から市販されている。あるいは、プリンまたはピリミジンヘテロ環の１以上のＮ原子がＣ原子で置換されたデアザプリンおよびデアザピリミジンも使用され得る。
【０１０２】
ホスホジエステル結合、またはオリゴヌクレオチドアナログの「糖−ホルフェート骨格」は、また、たとえば、メチルホスホネートまたはＯ−メチルホスフェートで置換または修飾され得る。この開示のためのオリゴヌクレオチドアナログの別の例には、ポリアミド骨格がオリゴヌクレオチド塩基、または修飾されたオリゴヌクレオチド塩基に付着された「ペプチド核酸」が含まれる。ポリアミド骨格および天然に存在するヌクレオシドに見られる塩基を含むペプチド核酸は、市販されている。
【０１０３】
修飾された塩基を有するヌクレオチドも本発明において使用され得る。塩基修飾のいくつかの例には、相補的核酸についての結合アフィニィティーを増大するためにオリゴヌクレオチドに組み込まれ得る、２−アミノアデニン、５−メチルシトシン、５−（プロピン−１−イル）シトシン、５−（プロピン−１−イル）ウラシル、５−ブロモウラシル、および５−ブロモシトシンが含まれる。基は、負に帯電したホスフェート骨格との静電気的な相互作用により、またはメジャーなおよびマイナーなグローブにおける水素結合相互作用を介して二本鎖を安定化し得るヌクレオシド糖環またはプリンもしくはピリミジン環の種々の位置に連結し得る。たとえば、アデノシンヌクレオチドおよびグアノシンヌクレオチドは、Ｎ2 位置でイミダゾリルプロピル基と置換されて、二本鎖安定性を増大し得る。３−ニトロピロールおよび５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基アナログも含まれ得る。本発明での使用に適当な種々の修飾オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドアナログは、「アンチセンスの研究および応用（Antisense Research and Applications)」, S.T. Crooke とB. LeBleu(編) （ＣＲＣプレス，１９９３）および「アンチセンス研究における炭水化物修飾(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)」ACS Symp. Ser. ＃580, Y.S. Sanghvi とP.D. Cook(編) ACS, Washington, D.C. 1994) に記載されている。
【０１０４】
本発明の化合物は、たとえば、ホスゲン（ＣＯＣｌ2 ）、カルボニルジイミダゾールまたはペンタフルオロフェノキシクロロホルメートなどのカルボニル化試薬で「Ｙ」のアルコールまたはアミン前駆体をカルボニル化することにより調製され、Ｙ1 −Ｃ（Ｏ）−Ｘ〔式中、Ｙ1 −Ｃ（Ｏ）−はＹ基であり、Ｘはカルボニル化試薬（ホスゲンが使用される場合はＣｌ、ペンタフルオロフェノキシクロロホルメートが使用される場合はペンタフルオロフェノキシなど）由来の脱離基である〕が提供され得る。この中間体である、Ｙ1 −Ｃ（Ｏ）−Ｘは、次いで、その保護により保護基礎単位Ｙ1 −Ｃ（Ｏ）−Ｍを生じることが望まれる、求核基を有する分子Ｍと反応させる。
【０１０５】
あるいは、まず、前記のような、カルボニル化試薬で保護されている分子上の基をカルボニル化し、つぎに脱離基Ｘを置換し、次いで芳香族カルビノールの水酸基とともに挿入し得る。いずれの方法においても、脱離基の置換を促進するためにしばしばトリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンなどの塩基を使用する。
【０１０６】
当業者は、本明細書に開示される保護基が「分子」としては伝統的に考えられていない種類のものにも付着し得ることを認識するだろう。したがって、本明細書に開示される保護基が付着した固体表面（たとえば、紙、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、シリコーン、修飾シリコーン、ＧａＡｓ、シリカなど）、ゲル（たとえば、アガロース、セファロース、ポリアクリルアミドなどのような組成物も本発明に包含され得る。
【０１０７】
本発明の保護基は、典型的に、光分解、すなわち照射により除去されるが、選択された場合においては、開裂状態に触媒作用を及ぼす酸または塩基を使用するのに有利であろう。この合成は、３’＞５’または５’＞３のいずれの方向でも生じ得る。一般的に照射は、約350nm を超える波長、好ましくは約３６５ｎｍである。光分解は、通常、水系、アルコール系または混合水−アルコール系もしくは混合水−有機溶媒混合物などのヒドロキシル溶媒の存在中で行われる。しばしば使用されるアルコール系溶媒は、メタノールおよびエタノールを含みうる。光分解媒体は、過酸化水素などの求核性スカベンジャーも含む。光分解は、中性または塩基性ｐＨでしばしば行われる。
【０１０８】
本発明は、以下の工程：
（ａ）反応部位を有する支持体を提供する工程、
（ｂ）反応部位に分子を結合する工程であり、該一次分子が式Ｙの光不安定保護基に付着されたマスクされた反応部位を含む工程、および
（ｃ）光不安定保護基を除去して、誘導体化支持体に固定された、曝露された反応部位を有する分子を含む誘導化支持体を提供する工程
を含む、反応部位を有する分子を支持体に付着させる方法も提供する。
【０１０９】
当業者であれば、前記プロセスを繰り返して、固体支持体に付着されたコンポーネント分子の鎖を含む化合物を生じ得ることを認識するだろう。「混合と適合」アプローチにおいて、光不安定保護基は、保護された前駆体分子の合成の容易さに依存してそのプロセスにおける異なる工程で改変され得る。あるいは、光不安定保護基は、合成のいくつかの工程で使用され得、化学的に不安定なもの（たとえば、酸または塩基感受性基）は、たとえば、コンポーネントモノマーの有効性、基質の感受性などに依存して、他の工程において使用され得る。この方法は、米国特許第5,143,854 号、5,384,261 号、5,424,186 号、5,445,934 号、6,022,963 号および１９９５年１月２３日出願の継続出願中の米国特許出願第０８／３７６，９６３号（その全体は全ての用途のための参照として組み込まれる）に開示されるような支持体上の相違するおよび同定可能な部位に付着している化合物のアレイを調製する際に使用されるように生じ得る。
【０１１０】
当業者であれば、前記工程を繰り返して、固体支持体に付着されたコンポーネント分子の鎖を含む化合物を生じ得ることを認識するだろう。「混合と適合」アプローチにおいて、光不安定保護基は、保護された前駆体分子の合成の容易さに依存してそのプロセスにおける異なる工程で改変され得る。あるいは、光不安定保護基は、合成のいくつかの工程に使用され得、化学的に不安定なもの（たとえば、酸または塩基感受性基）は、たとえば、コンポーネントモノマーの有効性、基質の感受性などに依存して、他の工程において使用され得る。この方法は、米国特許第5,143,854 号、5,384,261 号、5,424,186 号、5,445,934 号および１９９５年１月２３日出願の継続出願中の米国特許出願第０8/376,963 号（現在5,959,298 号として発行されている）（全ての用途のための参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるような支持体上の相違するおよび同定可能な部位に付着する化合物のアレイを調製する際に使用されるようにも生じ得る。
【０１１１】
大きなアレイ上でオリゴマーを合成する一般的な方法は、当該分野で公知である。たとえば、米国特許第5,384,261 号は、基質上でポリマーの大きなアレイを形成するための方法やデバイスを記載している。本発明の好ましい側面によれば、基質は、そこで、チャンネルを有するチャンネルブロックにより接触される。選択された試薬は、チャンネルを介して流動し、基質は回転ステージで回転され、そしてプロセスが繰り返されて、基質上でポリマーのアレイが形成される。該方法は、光指向化方法論と組み合わされ得る。
【０１１２】
米国特許第5,143,854 号および第5,424,186 号は、ポリペプチドアレイおよびオリゴヌクレオチドアレイを合成するための方法を記載している。ポリペプチドアレイは、光除去可能な保護基を基質表面に付着し、基質の選択領域を、その領域を活性化するために光に曝露し、光除去可能な基を有するアミノ酸モノマーを活性化領域に付着させ、所望の長さと配列を有するポリペプチドが合成されるまで活性化工程と付着工程を繰り返すことにより、基質上で合成され得る。
【０１１３】
光除去可能な保護基の使用は、パターン化照射を介して、固相合成の脱保護サイクル中に、基質表面の選択された部分の除去を可能にする。これは合成の空間的なコントロールを選択的に可能にする−−次のアミノ酸は、照射領域にのみ連結される。得られるアレイは、アレイ上のペプチドがレセプターに結合し得ることを決定するのに使用され得る。
【０１１４】
固相支持体上でオリゴヌクレオチドの形成は、基質−結合生長オリゴマーへのヌクレオチドの段階をおった付着を必要とする。反応条件下でのモノマーヌクレオチドの不必要な重合を防ぐために、ヌクレオチドの５’−水酸基の保護は必要とされる。モノマーがオリゴマーの末端に連結された後、５’−水酸保護基を除去し、別のヌクレオチドをその鎖に連結させる。この連結と脱保護のサイクルは、オリゴマー配列における各ヌクレオチドについて継続される。光除去可能な保護基の使用は、パターン化照射を介して、固相合成の脱保護サイクル中に基質表面の選択された部分の除去を可能にする。これは、合成の空間的なコントロールを選択的に可能にする−次のヌクレオチドは照射された領域にのみ連結される。
【０１１５】
好ましくは、感光性保護基は、紫外線（ＵＶ）または電磁スペクトルの可視部分での放射により、除去可能であろう。より好ましくは、保護基は、ＵＶ付近またはスペクトルの可視部分での放射により除去可能であろう。いくつかの態様においては、しかしながら、活性化は局在化された加熱、電子ビームリソグラフィー、ｘ線リソグラフィー、レーザーポンピング、微小電極を用いた酸化または還元などの他の方法により行われ得る。スルホニル化合物は、電子ビームリソグラフィーについての適当な反応基である。酸化または還元除去は、保護基の電流源への曝露によって、好ましくは活性化を必要とする表面の予め定められた領域へ指向された微小電極を用いて、なし遂げられる。他の方法は、この開示を考慮して使用され得る。
【０１１６】
種々の基を活性化または不活性化するのに光を使用する場合、光は、伝統的な白熱源、レーザー、レーザーダイオードなどに由来するものであり得る。光の非視準源が使用される場合、基質上での光の分散を防ぐために、薄いまたは多層のマスクを提供することが望ましいだろう。いくつかの態様では、合成をコントロールするために異なる波長に対して感受性がある基を利用することがさらに望ましいだろう。たとえば、異なる波長に対して感受性がある基を使用することにより、ポリマーの合成における分岐位置を選択するまたはある種のマスキング工程を除去することができる。
【０１１７】
アミノ酸などの異なる光保護モノマーは、異なる光分解率を示し得ることに注意されたい。特定の応用法においては、実質的に類似の光分解率を有する光保護モノマーを利用することが望ましいだろう。かかる一連の光保護モノマーを得るためには、一連の各モノマーについて適切な光保護基を選択する必要があるにすぎない。類似の様式で、光保護基の適切な選択により、（モノマー間で）実質的に異なる光分解率を有する、一連の光保護モノマーを調製することができる。
【０１１８】
光除去可能な保護基の多く（全てではない）は、ＵＶ付近および可視放射線を吸収する芳香族化合物であろう。適当な光除去可能な保護基は、好ましくは、ｏ−ニトロベンジル誘導体またはベンジルスルホニルなどのニトロ芳香族化合物を含む広範囲のポジティブ光反応基から選択され得る。好ましい態様において、６−ニトロベラトリルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）、２−ニトロベンジルオキシカルボニル（ＮＢＯＣ）またはα，α−ジメチル−ジメトキシベンジルオキシカルボニル（ＤＤＺ）が用いられる。光除去可能な保護基のさらなる例には、ニトロ基に対してオルトのベンジル水素を含む多重置換ニトロ芳香族化合物が含まれ、ここで置換基は、アルコキシ、アルキル、ハロ、アリール、アルケニル、ニトロ、ハロ、または水素を含み得る。使用され得る他の物質には、ｏ−ヒドロキシ−α−メチルシンナモイル誘導体が含まれ得る。光除去可能な保護基のさらなる例は、たとえば、Patchornik, J. Am. Chem. Soc. (1970) 92:6333およびAmitら, J. Org. Chem. (1974)39:192に見られ得る。
【０１１９】
米国特許第5,413,854 号は、ポジティブ反応基が、溶液中において試薬との反応について活性化され得ることを示している。たとえば、５−ブロモ−７−ニトロインドリン基は、カルボニルに結合された場合、420nm の光に曝露すると反応をうける。あるいは、リンカー分子上の反応基は、シナメート基を含む、広範囲のネガティブな光反応基から選択される。
【０１２０】
米国特許第5,384,261 号は、得られた基質が、たとえば、生物学的活性について多数のポリマーをスクリーニングすることを含む、種々の使用を有することを記載している。生物学的活性についてスクリーニングするため、基質を、抗体全細胞、小胞上のレセプター、脂質、または任意の他の種々のレセプターなどの１以上のレセプターに曝露する。該レセプターは、好ましくは、たとえば、フルオレセインなどの蛍光マーカー、放射マーカー、またはレセプターと反応する標識化抗体で標識される。いくつかの場合、ポリマーの合成アレイ上のレセプターを含む溶液を導入するために、用いることができる。たとえば、チャンネルブロックは基質の領域に関して異なるレセプター濃度を有するレセプター溶液を導入するためにチャンネルブロックを用いられる。
【０１２１】
基質上のマーカーの位置は、たとえば、光子検出または放射能写真技術で検出される。結合が検出される位置での物質の配列の知識を通じて、配列がレセプターと結合することをすばやく決定することができ、したがって、その技術が多数のペプチドをスクリーニングするのに使用され得る。フルオレセイン標識により提供されるシグナルの増幅は、所望の抗体に基質を曝露し、次いでその基質を所望の抗体に相補的であり、好ましくは所望の抗体の複数の位置で結合する標識化物質に曝露することにより提供される。たとえば、マウス抗体が研究される場合、標識された二次抗体は、たとえばヤギ抗マウスである基質に曝露され得る。
【０１２２】
本発明の他の可能な応用は、本明細書では、特定のレセプターに対する種々の抗体が基質上に配置し、たとえば、血清が免疫欠乏症についてスクリーニングされるような診断を含む。また、さらなる応用には、たとえば、半導体装置中の有機物質の選択的な「ドーピング」、すなわち、前記装置などの中への選択された不純物の導入を含む。
【０１２３】
本発明で使用され得るレセプターの例には、（ウイルス、細胞、他の物質などの上の）特異的な抗原決定因子、薬物、ポリヌクレオチド、核酸、ペプチド、補因子、レクチン、糖類、多糖類、細胞、細胞膜、および細胞小器官と反応する抗体、細胞膜レセプター、モノクローナル抗体および抗血清が含まれるが、これらに限定されない。レセプターの他の例には、米国特許第5,215,899 号に記載された触媒ポリペプチドが含まれる。
【０１２４】
したがって、本発明の関連する側面は、コンポーネント分子から、支持体上で多数の化合物を形成する方法であり、各化合物は支持体の分離領域を占め、次の工程：
（ａ）支持体の領域を活性化する工程、
（ｂ）該領域に、式Ｙの光不安定保護基に連結された、マスクされた反応部位を含む分子を結合させる工程、および
（ｃ）支持体の他の領域上で工程（ａ）および工程（ｂ）を繰り返し、それにより該他の領域がそれぞれ、光不安定保護基に連結したマスクされた反応部位を含む、別の分子に結合する工程であり、該別の分子が工程（ｂ）で使用されるものと同じまたは異なり得る工程、
（ｄ）光不安定保護基を、支持体の領域の一つに結合した１つの分子から除去して、曝露された反応部位をもつ分子を有する領域を提供する工程、
（ｅ）曝露された反応部位をもつ分子に追加の分子を結合させる工程、
（ｆ）所望の多数の化合物が、コンポーネント分子から形成され、各化合物が支持体の分離領域を占めるまで、支持体の領域上で工程（ｄ）および工程（ｅ）を繰り返す工程を含む方法を提供する。
【０１２５】
支持体の予め規定された領域上で多数の化合物を形成する関連方法には、化学的に不安定な保護基で保護された反応部位を有する分子を支持体の活性化領域に結合させ、反応部位を示すために化学的に不安定な保護基を化学的に除去する工程を含む。反応部位は、ついで、本発明の光不安定保護基で保護される。このプロセスは、支持体の分離領域上で光不安定保護基により保護された反応部位を有する分子を有する支持体を提供することが所望される場合、他の分子を有する支持体の他の領域について繰り返される。反応部位は、選択された領域から光不安定基を除去することにより、曝露され得、かつ支持体上の化合物のアレイを作り上げるためによりはやく記載されるように、光不安定保護基を有する追加の分子に結合させ得る。再び、「混合と適合」アプローチにおいて、化学的に不安定な保護基を有するモノマーは、基質上（即ち、モノマーの第１層が会合された場合には支持体自体の上、またはついで、反応部位が曝露された、すでに付着したモノマー上）の反応部位に付着され得、これらの化学的に不安定な保護基は、本発明の光不安定保護基により置換され得る。置換は、支持体上にあり得る任意の光不安定基に影響を与えない条件下で、化学的に不安定な保護基を除去することにより、達成される。これは、ついで、化学的に不安定な保護基を有するモノマー上の曝露された反応部位を示し、この曝露された反応部位は、式Ｙ−Ｘ（式中、Ｘは脱離基である）の試薬と反応させる。それにより、支持体のこの領域は、米国特許第5,143,854 号、第5,384,261 号、第5,424,186 号および第5,445,934 号に記載の光指向システムならびにさらに以下に記載のもの（すべての用途のためにその全ては参照により取り込まれる）により、選択的に除去され得る光不安定保護基により保護される。この方法は、本明細書に記載の光安定性保護基より化学的に不安定な保護基を有するモノマーがより容易に利用しうる場合、特に有用である。少なくとも一つの工程において本発明の保護基／試薬または化合物を使用する、支持体上で化合物の鎖または化合物のアレイを形成する任意の方法は、本発明の方法の範疇に含まれることが認識される。
【０１２６】
一般に、これらの方法は、モノマーの逐次添加を伴ない、基質または固体支持体の予め規定された領域を活性化させ、次に基質と本発明の保護モノマー（例えば、保護ヌクレオシドまたはアミノ酸）とを接触させることにより、支持体上のポリマー種のアレイを築く。個々のモノマーが工程から工程へ変更しうることが、認識されるであろう。半導体デバイスで用いられる場合、一般的な支持体は、ガラスまたはシリカ基質である。
【０１２７】
予め規定された領域は、典型的には集積回路の組立において使用される技術に類似するフォトリソグラフィーマスクなどのスクリーンを通して示される光源を用いて活性化されうる。支持体の他の領域は、照明からマスクにより遮断され化学的に保護されたままであるので、不活性なままである。したがって、光パターンは、支持体の領域が所定のモノマーと反応することを規定する。保護モノマーは、活性化領域と反応し、そこに固定される。保護基は、光分解により除去され、未反応モノマーと共に洗浄される。予め規定された領域の異なるセットを活性化し、異なるモノマー溶液と基質とを接触させることを繰り返し行なうことにより、基質の規定された領域に公知の組成物のポリマーの多様なアレイが調製されうる。106 、107 、108 、109 、1010、1011、1012またはそれ以上の異なるポリマーのアレイを、基質上で組み立てうる。領域は、1mm2以上、典型的には10μm2であり得、 1μm2ほど小さくてもよい。
【０１２８】
これらのアレイを調製する好ましい方法において、形(features)間のコントラストは、基質の前面曝露を介して増強されうる。「前面曝露」により、活性化光が基質の合成側に入射され、基質を通過する前に基質の合成側に接触することが意味される。前面曝露は、マスクが合成表面により近く位置するのを可能にすることにより、回折または発散の影響を低減する。さらに、おそらくより重要なことに、合成表面の曝露前の基質表面を通過する光からの屈折の影響もまた、前面曝露により、低減または削除される。前面曝露は、1996年4 月17日に提出された米国特許出願第08/634,053号（現在放棄されている）に十分詳細に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２９】
以前記載したが、本発明の好ましい光不安定保護基の光分解効率は、かかる光分解が水またはメタノールなどの求核溶媒の存在下で行なわれる場合、改善される。前面光分解が用いられる場合、これには特有の問題が存在する。詳細には、基質の前面が活性化放射に曝露される場合、フローセルは、かかる光分解の間の所望の求核環境を維持するために使用され得ない。したがって、好ましい局面において、本発明の保護基に使用する光指向合成法は、基質の合成表面上に薄層水性フィルムを提供することによりまたは基質の合成表面上を被覆することにより行なわれる。この薄層フィルムまたは被覆の存在は、合成表面の局部環境の制御、すなわち合成に好ましい条件を提供することを可能にする。「反応に好ましい条件」により、その環境において行なわれない反応に関して、１つまたは複数の所定の化学反応物の反応効率（例えば、反応速度、収率またはその両方）の改善が生じる条件を意味する。例えば、本明細書に記載の保護基を使用する合成方法に対して、保護基の光分解に好ましく、それにより効率的な合成を促進する求核環境を提供する被覆が適用されうる。かかる被覆の使用はまた、基質表面の前面曝露を可能にする。この方法はまた、被覆前に表面に両方の反応物を適用することにより、または被覆後第２の反応物を添加することによりあるいは被覆のエレメントとして添加することにより、１つより多くの化学反応物を反応させて行なわれうる。
【０１３０】
一般に、薄層フィルムまたは水性溶液の被覆は、例えば、前の合成工程に供された本発明の保護基が保有される基質の合成表面に適用されうる。被覆の適用は、当該分野で周知の方法により行なわれうる。例えば、スピン被覆法が利用され得、そこでは、基質の表面に一様な被覆を生じさせる被覆物質の適用の間に基質がスピンされる。単純な浸漬法、スプレー被覆法などを含む代替的な適用法もまた、使用されうる。
【０１３１】
被覆物質として使用するための水性溶液としては、典型的には、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの低分子量多価アルコールが挙げられる。これらの溶液は、一般に親水性であり、求核水酸基を提供し、それは光分解反応も支持する。多価アルコールはまた、溶液の粘度を増加し、被覆の厚さを制御するのに使用されうる。より高い分子量の多価アルコール、すなわちポリビニルアルコールは、被覆物質の粘度を調節するために使用されうる。
【０１３２】
一般的に、好ましい基質は、相対的に疎水的な表面を有する。基質表面上のフィルムの展着(spreading) および接着を可能にするために、水性被覆溶液はまたそれ自体、適切な界面活性剤を例えば約0.01〜約10％v/v 含みうる。かかる界面活性剤としては、一般に当該分野で周知のものが挙げられ、例えば、Triton X-100、Tween-80などが挙げられる。基質に対する被覆の展着および接着を促進するのに加えて、被覆溶液内のこれらの非揮発性溶質の添加は、フィルムの蒸発の量を制限し、その寿命を促進しうる。
【０１３３】
本明細書に記載された方法は、構造Ｙを有する光不安定保護基に付着するマスクされた反応部位を含有する成分分子も使用しうる。かかる場合において、保護基は、カルボキシレートまたはホスフェートなどの酸性反応部位に付着され、光分解により除去される。
【０１３４】
固体基質または固体支持体は、任意の形態でありうるが、それらは好ましくは、平面で透過性である（および潜在的にいくつかの３次元構造）。支持体は、大きさ、形または組成において均一(homogenous)である必要はないが、支持体は、通常好ましくは一様(uniform) である。ある態様において、大きさがまさに一様である支持体は、特に好ましくありうる。他の態様において、固体支持体の２つ以上の明確に異なる集団は、一定の目的のために使用されうる。
【０１３５】
固体支持体は多くの物質からなり得、それは任意の多くの化学反応基の付着に対する誘導体化のための能力およびアレイを製造するために使用される合成化学およびある態様においてタグ付着および／または合成に使用される方法との適合性により主に限定される。適切な支持体物質は、典型的には、ペプチドおよびポリマー合成に一般に使用される物質型であり、ガラス、ラテックス、重架橋ポリスチレンまたは類似のポリマー、金または他のコロイド状金属粒子、および当業者に公知の他の物質が挙げられる。かかる固体支持体が誘導体化されうる化学反応基は、ポリマーの固相合成に一般に用いられるものであり、したがって、当業者に周知のもの、すなわちカルボキシル、アミンおよびヒドロキシルである。
【０１３６】
洗浄効率を改善するために、非多孔支持体または典型的なペプチド合成支持体より少ない多孔性の他の固体支持体を使用しうる；しかしながら、本発明のある適用のために、非常に多孔性のビーズ、樹脂、または他の支持体が良好に作用し、しばしば好ましい。１つのかかる支持体は、ビーズの形態の樹脂である。一般に、ビーズの大きさは、1nm 〜100 μm の範囲であるが、1mm の大きさまでのより充実した固体支持体が、ときどき使用されうる。特に好ましい樹脂としては、Sasrin樹脂（Bachem Bioscience, Switzerlandから入手されるポリスチレン樹脂）；ならびにTentaGel S AC 、TentaGel PHBまたはTentaGel S NH2樹脂（Rappe Polymere, Tubingen, Germany から入手されるポリスチレン−ポリエチレングリコールコポリマー樹脂）が挙げられる。他の好ましい支持体が市販されており、Novabiochem, La Jolla, California に記載されている。
【０１３７】
他の態様において、固体基質は平面であり、または代替的には代替的表面配置を取りうる。例えば、固体基質は、合成が生じるふくらんだまたはくぼんだ領域を含みうる。ある態様において、固体基質は、適切な光吸収特性を提供するために選択されるでろう。例えば、基質は、重合されたLangmuir Blodgett フィルム、官能基化されたガラス、Si、Ge、GaAs、GaP 、SiO2、SiN4、修飾シリコン、または種々のゲルまたは（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネートなどのポリマーの任意の１つ、あるいはそれらの組み合わせでありうる。他の適切な固体基質物質は、当業者に容易に明らかである。好ましくは、固体基質の表面は、反応基を含み、それはカルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、チオールなどでありうる。さらに好ましくは、表面は光学透過性であり、シリカ表面に見られるような表面Si-OH 官能性を有する。
【０１３８】
本明細書に開示された光不安定保護基および保護モノマーは、固体支持体上の分子のアレイの固定方法に基づくビーズにおいて使用されうる。
【０１３９】
ビーズに基づく合成に対する一般的なアプローチは、同時係争中である出願第07/762,522号( 1991年 9月18日に提出);出願第07/946,239号( 1992年 9月16日に提出);出願第08/146,886号( 1993年11月 2日に提出);出願第07/876,792号( 1992年 4月29日に提出) およびPCT/US93/04145( 1993年 4月28日に提出) 、Lam ら、(1991) Nature 354:82-84;PCT 出願第92/00091号およびHoughtenら、(1991) Nature 354:84-86 に記載されており、それぞれは、全目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
単一の平面の固体支持体は、化合物のアレイを合成するために使用され得、化合物は、非常に大きなスケールの固定ポリマー合成(VLSIPS.TM.)技術を用いてスクリーニングする前に、支持体から切断されうる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,143,845号明細書を参照のこと。１つの例としては、オリゴヌクレオチドのアレイがVLSIPS.TM.チップ上で合成され、各オリゴヌクレオチドは、ジスルフィドなどの切断可能リンカーによりチップに連結される。参照により本明細書に組み込まれる米国特許第 5,412,087号明細書(1992 年 4月24日に提出された米国特許出願第874,849 号) を参照のこと。オリゴヌクレオチドタグは、タグ化される分子の付着のために、アミンなどの遊離の官能基を有し、それは典型的にはオリゴマーおよび好ましくはペプチドである。タグは、ピリミジンのみ、またはピリミジンおよびプリンアナログベースを任意に含みうる。タグはまた、増幅のための結合部位、すなわちPCR プライマー部位、任意に配列決定プライマー部位、およびタグ化されるオリゴマーのモノマー配列を唯一にコードする短いセクションを含みうる。次に、オリゴマーが、すなわちタグの遊離の末端アミノ基からまたはタグに連結されたリンカーから合成され、そして各オリゴマーがタグに連結される。タグ化オリゴマーの集団は、リンカーを切断することによりチップから放出され、可溶性タグ化オリゴマーライブラリーを作製しうる。
【０１４１】
ビーズに基づく合成に関して、当該分野で周知の通常の技術が使用される。例えば、ペプチドの合成に関しては、Athertonら、「固相ペプチド合成」IRL Press,(1989)に記載されているメリフィールド技術が、使用されるだろう。異なるモノマーが使用される場合、他の合成技術が適切である。成長ポリマー鎖に添加されるモノマーがヌクレオチドである場合、例えば、Gaitら、Oligonucleotide Synthesis に記載される技術が使用されるだろう。これらの技術は、例示であるにすぎず、他のより進歩した技術が、米国特許第 4,242,974号明細書に開示される逆(reversed)および環化ポリマー合成に対するものなどのいくつかの態様において使用されるだろう。
【０１４２】
モノマーは基質に直接結合される必要がなく、モノマーと基質の間にリンカー分子が提供されうることが認識されるだろう。かかるリンカー分子は、例えば、米国特許第 5,445,934号明細書の11欄および12欄に記載された。
【０１４３】
所望の適用および効果に依存して、広く多様なリンカーが組み込まれうる。例えば、架橋または結合効率などの特性における所望の効果を達成するために、疎水性、親水性または立体容積を与えるリンカーを選択しうる。本発明の１つの局面において、分枝リンカー、すなわちリンカーFmoc-Thr(tBu) などのかさ高い側鎖を有するリンカーは、ライブラリーの固体支持体上の分子またはライブラリーの分子とタグとの間に堅さを与えるためまたはそれらの間隔を制御するために使用される。
【０１４４】
好ましい光切断可能リンカーとしては、6-ニトロベラトリルオキシカルボニル(nitroveratryloxycarbonyl)(NVOC)および他のNVOC関連リンカー化合物が挙げられる。米国特許第 5,143,854号明細書の11〜13欄を参照。もう１つの態様において、リンカーは、１つ以上の制限部位を有する核酸であるので、ライブラリーメンバーの１つの部分（タグ、オリゴマーもしくは他の目的の化合物または両方か、あるいは固体支持体のいずれか）が、別の部分から、適切な制限酵素により選択的に切断されうる。この新規核酸リンカーは、本発明の目的に対する有用な効果のために使用されうる多様なリンカーを説明する。
【０１４５】
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドは、特に好ましい情報保有同定タグである。オリゴヌクレオチドは、天然の高密度の情報記録媒体である。モノマー型の同定および添加の工程または化学合成手順に関連する任意の他の情報が、短いオリゴヌクレオチド配列に容易にコードされる。オリゴヌクレオチドは、順番に、広く多様な固体支持体、オリゴマー、リンカーおよび他の分子への付着を容易に行ないうる。例えば、オリゴヌクレオチドは、ペプチド合成ビーズに容易に付着されうる。
【０１４６】
あるモノマーセット（例えば、アミノ酸）のカップリング工程は、ある態様において、相対的に長いインキュベーション時間を必要とし得、このためおよび他の理由のために、並行した多数のモノマー添加を行なうシステムが所望である。コードした合成分子ライブラリーの作製およびスクリーニングに使用するための自動装置化は、好ましくは、50〜100 またはより多くの並行反応を同時に行ないうるものが、米国特許第 5,503,805号明細書(1993 年11月 2日に提出された特許出願第08/149,675号) に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。かかる装置は、プール、混合および再分配の種々のチャンネルに対するプログラム可能な制御下で、反応混合物または合成固体支持体のスラリーを分配しうる。
【０１４７】
しかしながら、一般に、タグ化分子の合成ライブラリーを作製するための器械設置は、代表的なペプチド合成機を、モノマーの多様性および使用したタグの数および所望の同時カップリング反応の数に対する多数の貯蔵器とあわせて配管する必要がある。タグ分配(dispensing)能力は、単純な指令をタグの正しい混合物に翻訳し、その混合物を分配する。所望の場合、モノマー構築ブロックが、特定の混合物として分配される。反応の攪拌、温度、および時間制御が提供される。適切に設計された装置がまた、アッセイ目的のために100 までの特異的ペプチドの1 〜50mg（粗）を作製しうるマルチチャンネルペプチド合成機として役にたつ。
【０１４８】
本明細書に記載の本発明は、アミノ酸などのモノマーの配列を含む分子の調製ならびに他のポリマーの調製に使用される。かかるポリマーとしては、例えば、核酸、多糖、リン脂質、およびα−、β−またはω−アミノ酸のいずれかを有するペプチドの直鎖および環状ポリマー、公知の薬物が上記の任意のものに共有結合されたヘテロポリマー、ポリヌクレオチド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリアリーレンスルフィド、ポリシロキサン、ポリイミド、ポリアセテート、またはこの開示の観点から明らかである他のポリマーが挙げられる。異なるモノマー配列を有するポリマーが、基質の予め規定された異なる領域で形成される場合、かかるポリマーは「多様」である。
【０１４９】
さらに、本発明は、当業者により認識されうるような、成分ごとの様式で合成されうる化合物の任意のセットの調製に容易に適用されうる。例えば、ベンゾジアゼピン、ヒダントインおよびペプチジルホスホネートなどの化合物は、本方法を用いて調製されうる。参照により組み込まれる米国特許第 5,420,328号明細書を参照のこと。ポリマーの環化およびポリマー逆(polymer reversal)方法が、本発明と共に使用され得、米国特許第 5,242,974号明細書に開示され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
本発明の光切断可能保護基が使用されうる分子のアレイの固定の他の方法としては、ピンに基づくアレイおよびフローチャンネルおよびスポッティング方法が挙げられる。
【０１５１】
光切断可能アレイはまた、コンビナトリアル固相ペプチド合成に対するGeysenらにより開発されたピンアプローチを用いて調製されうる。この方法の説明は、Geysenら、J.Immunol.Meth.(1987)102:259-274により提供され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５２】
単一基質上のライブラリー合成に適切であるさらなる方法は、米国特許第 5,384,261号明細書、米国特許第 5,677,195号明細書、米国特許第 6,040,193号明細書に記載され、全目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。これらの適用において開示された方法では、(1) 予め規定された領域上の規定されたチャンネル内における流動(flowing) または(2) 予め規定された領域上の「スポッティング」のいずれかにより、試薬は基質に送達される。しかしながら、他のアプローチ、ならびにスポッティングおよび流動の組み合わせが、使用されうる。それぞれの例において、モノマー溶液が様々な反応部位に送達される場合、基質の一定の活性化領域が機械的に他の領域から区別される。光切断可能リンカーは、この技術に特に適切であり、他では、この送達法は、展着、試薬希釈、不正確な送達などによる乏しい合成忠実度を生じるであろう。通常の酸切断可能リンカーよりむしろ光切断可能リンカーを用いることにより、次のアッセイまたは他の手順に対する表面から非常に純粋な物質が選択的に切断されうる。より詳細には、マスクは、リンカーの切断時に使用され得、送達領域（すなわち、試薬送達が非常に一致し、再現性のある領域）の中心のリンカーのみが切断されることを確実にしうる。したがって、このように選択的に切断された物質は、物質が全表面から取られた場合よりも、高純度であるであろう。
【０１５３】
典型的には、本方法で使用された分子は、複合体高分子のモノマー成分であろう。これらのモノマー成分は、小さいリガンド分子、アミノ酸、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、単糖などであり得、それにより固相支持体上のポリペプチド、核酸および合成レセプターなどの複合体高分子またはポリマー配列のアレイの合成を可能にする。
【０１５４】
実施例
Ｉ. 合成方法
チミジンホスホルアミダイトモノマー上の5'光不安定保護基として、図２に示した好ましい基の例を合成し、試験した。異なる溶媒中の表面光分解率（std. 365nm光源）を、他に記載のようにして決定した（McGallら、JACS 1997, 119:5081,全目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる）。標準カップリング効率の測定を、切断可能リンカーHPLC解析技術〔米国特許出願第09/545,207号および代理人事件番号3233.1（その両方が全体として参照により本明細書に組み込まれる）を参照〕を用いて行った。
【０１５５】
図１は、好ましい化合物およびその合成を示す。それは、好ましい構造の一般構造、好ましい構造、その合成、好ましい保護基を用いて形成された核酸配列の収率および光分解条件を示す。また、合成工程は、特定の合成に関する参考文献を用いて注釈をつける。これらの参考文献の全ては、全目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
5'-TEMPOC-T-ホスホルアミダイトを、図３に概略を述べた工程を用いて合成し、詳細を図の参考文献に示した。詳細には、以下の参考文献：Dyerら、JOC 64:7988(1999);Tetrahedron Lett.,38(52),8933-4(1997);Mcgallら、JACS 119:5081(1997) が、全目的ならびに引用される工程のために全体として参照により本明細書に組み込まれる。図は、トリホスゲンが工程１に対して等しく良好に作用し得、クロロホルメートがおそらく精製無しで工程２に使用されうることを示す。NINOC-T-CEP を、図４に示される工程に従って合成し、以下の参考文献；Bromidgeら、(1998)J. Med. Chem. 41:1598;Brooker, LS ら、(1953)米国特許第 2,646,430号明細書;Boekelheideら、(1954)J.Org.Chem.19:504;Bennetら、(1941) J.Chem.Soc.74:244; およびMortensen ら、(1996)Org.Prep.Proc.Int.28:123が、全目的ならびに引用される工程のために全体として参照により組み込まれる。図５〜８は、以下の化合物；Me2NPOC-T-CEP;Me3NPOC-T-CEP;およびNA1BOC-T-CEPの合成を示す。図８は、Aust.J.Chem 48:1969-70に関し、それはまた全体として参照により組み込まれる。プロセスの最初の工程で使用される略語は、物質の供給源を示す。例えば、DAV はDavos であり、LAN はLancaster であり、ALH はAdrichである。CEP は、シアノエチルN,N ジイソプロピルホスホルアミダイトを表す。
【０１５７】
図９〜20は、本発明の他の化合物の合成方法を提供する。
【０１５８】
II. 光分解研究
表面光分解率および逐次合成効率（またはサイクル収率）を、その全体の教示が参照により本明細書に組み込まれるMcGallら、J.Am.Chem.Soc.(1997),119(22):5081 に記載の方法に従って行なった。様々な光分解条件に基づく本発明の保護基の切断の半減期およびサイクル収率を表１に挙げる。
【０１５９】
【表１】
前記発明は、明瞭および理解の目的のために例示および実施例により、詳細に説明される。添付の請求の範囲の範囲内で変更および改変が行なわれることが、当業者に明らかであろう。それゆえに、上記説明が、例示であって限定を意図するものでないことが理解される。したがって、本発明の範囲は、上記説明に関して決定されないが、代わりに以下の添付の特許請求の範囲に関して、加えてかかる請求の範囲が権利を与える十分な範囲の同等物に関して決定されるであろう。
【０１６１】
本出願に引用される全ての特許、特許出願および出版物は、それぞれの個々の特許、特許出願または出版物が個々に示されている限り、同一の程度まで全目的に対して全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、選択的合成化学反応（alternative synthesis chemistries）の一般的な概要、および「Ｙ」の一般構造がどのようなものでありうるかの概要を示す。
【図２】
図２は、図１に示す一般構造のうち好ましい具体的な化合物を示し、ヌクレオチドを互いに結合させるためにこれらを使用した場合の段階収率および使用した具体的な光分解条件を示す。
【図３】
図３は、５’−ＴＥＭＰＯＣ−Ｔ−ホスホルアミダイトの合成を示す。
【図４】
図４は、ＮＩＮＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図５】
図５は、Ｍｅ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。ＣＥＰは、シアノエチルＮ，Ｎジイソプロピルホスホルアミダイトを表す。
【図６】
図６は、Ｍｅ３ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図７】
図７は、ＮＰ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図８】
図８は、ＮＡ１ＢＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図９】
図９は、１−（３−ニトロクマリン−４−イル）エチルアルコールの合成を示す。
【図１０】
図１０は、６，７−ジメトキシクマリンホスホルアミダイトの合成を示す。該方法は、７，８−ジメトキシクマリンホスホルアミダイトおよび５，７−ジメトキシクマリンホスホルアミダイトの合成にも適用されうる。
【図１１】
図１１は、７，８−ジメトキシ−５−ニトロクマリニル−４−エタノールの合成を示す。
【図１２】
図１２は、（１，２）ＮＮＥＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１３】
図１３は、（９，１０）ＮＰｈｅｎＥＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１４】
図１４は、５’−（７−ジエチルアミノクマリン−３−イル）メチルオキシカルボニル−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１５】
図１５は、Ｎ−アルキル−４，５−置換−２−ニトロアナリドの合成を示す。
【図１６】
図１６は、（８，１）ＮＮＥＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１７】
図１７は、５’−（７−メトキシ−３−ニトロクマリン−４−イルオキシカルボニル）チミジン−３’−ホスホルアミダイトの合成を示す。
【図１８】
図１８は、（３，２）ＮＮＥＯＣ−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図１９】
図１９は、５’−（７−ジエチルアミノクマリン−４−イル）メチルオキシカルボニル−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図２０】
図２０は、５−ブロモ−７−ニトロインドリニルカルボニル−Ｔ−ＣＥＰの合成を示す。
【図２１】
図２１は、好ましい「Ｙ」基を示す。
Claims (90)
- 以下の構造式：
Ｙ−Ｘ
式中、Ｘは、脱離基またはマスクされた反応部位を有する化合物であり；
Ｙは、
Ａは、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＲ−、または−（ＣＨ2 ）k −であり；
ｋは、０または１〜約３の整数であり、
Ｂは、一価または二価の非プロトン性の弱塩基性基である、
からなる群より選択されてなる光不安定保護基である、
によって表されてなる化合物。 - Ｘがマスクされた反応部位を有する化合物であり、さらにＸが反応部位を含んでなる請求項１記載の化合物。
- Ｘがアミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはそれらのアナログ、単糖およびタンパク質からなる群より選択されてなる請求項２記載の化合物。
- Ｘが塩基保護デオキシヌクレオシドであり、該デオキシヌクレオシドがデオキシアデノシン、デオキシシチジン、チミジンまたはデオキシグアノシンである請求項２記載の化合物。
- Ｘが塩基保護デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネートおよび塩基保護デオキシヌクレオシドホスホルアミダイトからなる群より選択されてなる請求項４記載の化合物。
- （ａ）反応部位を有する支持体を提供する工程；
（ｂ）請求項２記載の第一化合物の反応部位を支持体と反応させて、結合を形成する工程；および
（ｃ）光不安定保護基を除去して、誘導支持体上に固定された、マスクされていない反応部位を有する請求項２記載の化合物を含む誘導支持体を提供する工程
を含む、反応部位を有する分子を支持体に連結する方法。 - 共有結合が工程（ｂ）で形成される請求項６記載の方法。
- （ｄ）請求項２記載の第二化合物の反応部位を第一化合物のマスクされていない反応部位と反応させて、結合を形成する工程；および
（ｅ）第二化合物の光不安定保護基を除去して、誘導支持体上に固定された、マスクされていない反応部位を有するダイマー鎖を有する誘導支持体を提供する工程
をさらに含む請求項６記載の方法。 - 分子の系列を用いて工程（ｄ）および（ｅ）を繰り返して、支持体に固定された分子の鎖を提供する工程をさらに含む請求項８記載の方法。
- 該分子がデオキシヌクレオシドである請求項９記載の方法。
- 支持体がガラスまたはシリカ基材である請求項６記載の方法。
- デオキシヌクレオシドが５’−ＯＨを介して光不安定基と連結されてなる請求項９記載の方法。
- 光不安定基が３５０ｎｍより大きな波長での放射によって除去されてなる請求項８記載の方法。
- 波長が約３６５ｎｍである請求項１３記載の方法。
- （ａ）支持体の第一の予め規定された領域を活性化する工程；
（ｂ）請求項２記載の化合物である分子を第一領域に結合する工程；
（ｃ）支持体の他の予め規定された領域上で工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し、それにより該他の領域のそれぞれに請求項２記載の化合物である別の分子を結合し、該別の分子は工程（ｂ）において使用されたものと同じであっても異なっていてもよい工程；
（ｄ）支持体の領域の１つに結合された分子から光不安定保護基を除去して、マスクされていない反応部位を有する分子を保有する領域を提供する工程；
（ｅ）請求項２記載の化合物であるさらなる分子をマスクされていない反応部位を有する分子に結合する工程；
（ｆ）複数の支持体結合化合物が成分分子から形成されるまで支持体の領域上で工程（ｄ）および（ｅ）を繰り返し、各化合物が支持体の別個の領域を占有する工程
を含む、成分分子から複数の支持体結合化合物（各化合物が支持体の別個の予め規定された領域を占有してなる）を形成する方法。 - 共有結合が工程（ｂ）および（ｅ）で形成されてなる請求項１５記載の方法。
- 分子がデオキシヌクレオシドである請求項１５記載の方法。
- 支持体がガラスまたはシリカ基材である請求項１５記載の方法。
- デオキシヌクレオシドが５’−ＯＨまたは３’−ＯＨを介して光不安定基と連結されてなる請求項１７記載の方法。
- 光不安定基が３５０ｎｍより大きな波長での放射によって除去される請求項１５記載の方法。
- 波長が約３６５ｎｍである請求項２０記載の方法。
- 少なくとも１０6 個の鎖が支持体に固定される請求項１５記載の方法。
- 各領域が約１μｍ2 〜１０，０００μｍ2 の面積である請求項１５記載の方法。
- （ｇ）化学的に不安定な保護基に連結されたマスクされた反応部位を含む第二分子を反応部位に共有結合し、反応部位が工程（ａ）において形成された支持体の活性化領域上にあるか、または工程（ｄ）において形成された支持体上の分子のマスクされていない反応部位であるかのいずれかである工程；
（ｈ）化学的に不安定な保護基を切断して、マスクされていない反応部位を形成する工程；
（ｉ）請求項１または２の分子をマスクされていない反応部位と反応させ、それにより化学的に不安定な保護基を光不安定保護基で置換して、光不安定保護基を有する分子を有する支持体の領域を提供する工程；および
（ｊ）任意に工程（ｄ）〜（ｆ）を繰り返す工程
をさらに含む請求項１５記載の方法。 - 化合物ＹがＭｅ２ＮＰＯＣ；Ｍｅ３ＮＰＯＣ；ＮＰ２ＮＰＯＣ；ＮＡ１ＢＯＣ；５’−ＴＥＭＰＯＣおよびＮＩＮＯＣである請求項１記載の化合物。
- 化合物ＹがＭｅ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；Ｍｅ３ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；ＮＰ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；ＮＡ１ＢＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；５’−ＴＥＭＰＯＣ−Ｔ−ホスホロアミダイト、およびＮＩＮＯＣ−Ｔ−ＣＥＰである請求項５記載の化合物。
- 化合物ＹがＭｅ２ＮＰＯＣ；Ｍｅ３ＮＰＯＣ；ＮＰ２ＮＰＯＣ；ＮＡ１ＢＯＣ；５’−ＴＥＭＰＯＣ、およびＮＩＮＯＣである請求項１０記載の方法。
- 化合物ＹがＭＥ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；Ｍｅ３ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；ＮＰ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；ＮＡ１ＢＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；５’−ＴＥＭＰＯＣ−Ｔ−ホスホロアミダイトである請求項９記載の方法。
- 化合物ＹがＭｅ２ＮＰＯＣ；Ｍｅ３ＮＰＯＣ；ＮＰ２ＮＰＯＣ；ＮＡ１ＢＯＣ；５’−ＴＥＭＰＯＣ、およびＮＩＮＯＣである請求項１４記載の方法。
- 化合物ＹがＭｅ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；Ｍｅ３ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；ＮＰ２ＮＰＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；ＮＡ１ＢＯＣ−Ｔ−ＣＥＰ；５’−ＴＥＭＰＯＣ−Ｔ−ホスホロアミダイト、およびＮＩＮＯＣ−Ｔ−ＣＥＰである請求項１６記載の方法。
- 以下の構造式：
Ｙ−Ｘ
式中、Ｘは、脱離基またはマスクされた反応部位を有する化合物であり；
Ｙは、脱離基に結合するかまたはマスクされた反応部位をマスクする光不安定保護基であり、Ｙは、以下の構造式：
Ｑ1 は、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−であり；
Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓであり、
Ｒ3 およびＲ4 はそれぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシ、または−ＮＯ2 であり、Ｒ3 またはＲ4 のうちの１つが−ＮＯ2 である場合、Ｒ1 またはＲ2 のうちの少なくとも１つは−Ｈであり；
Ｒ5 およびＲ6 はそれぞれ独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシであり；
Ｑ3 は、−Ｈ、任意に置換されたアルコキシ、またはジアルキルアミノであり；
Ｚ1 およびＺ2 は一体となって、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＮＲ7 Ｃ（Ｏ）−、または−ＣＲ8 ＝ＣＲ9 −であり；
Ｒ7 は、−Ｈまたはアルキル；
Ｒ8 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシであり；
Ｒ9 は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシまたは−ＮＯ2 であり；あるいは
Ｒ8 およびＲ9 はそれらが結合した炭素原子とともに、５または６員環の炭素環式または複素環式環を形成してなり、Ｒ3 、Ｒ4 またはＲ9 がいずれも−ＮＯ2 でない場合は、Ｑ1 は、−ＣＨ2 Ｏ−または−ＣＨ2 Ｓ−ではない、
によって表される、
によって表されてなる化合物。 - Ｘがマスクされた反応部位を有する化合物であり、さらにＸが反応部位を含んでなる請求項３１記載の化合物。
- Ｘがアミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオシドホスホルアミダイト、ヌクレオシドＨ−ホスホネート、ヌクレオチド、固体支持体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ホルモン、抗体、多糖、単糖、二糖、固体支持体結合ペプチド、固体支持体結合オリゴヌクレオチド、固体支持体結合タンパク質、固体支持体結合ホルモン、固体支持体結合抗体、固体支持体結合多糖、固体支持体結合単糖、または固体支持体結合二糖からなる群より選択されてなるマスクされた反応部位を有する化合物である、請求項３２記載の化合物。
- Ｙが以下の構造式：
- Ｙが以下の構造式：
- Ｒ3 またはＲ4 のうちの１つが−ＮＯ2 である請求項３５記載の化合物。
- Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 が−Ｈであり、Ｑ3 がジアルキルアミノである請求項３５記載の化合物。
- Ｙが以下の構造式：
- Ｙが
- Ｙが以下の構造式：
- Ｙが以下の構造式：
- Ｒ3 またはＲ9 のうちの１つが−ＮＯ2 である請求項４１記載の化合物。
- Ｙが以下の構造式：
- Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 およびＲ6 が−Ｈであり、Ｑ3 がジアルキルアミノである請求項４３記載の化合物。
- Ｙが
- 以下の構造式：
Ｙ−Ｘ
式中、Ｘは、脱離基またはマスクされた反応部位を有する化合物であり；
Ｙは、脱離基に結合するかまたはマスクされた反応部位をマスクする光不安定保護基であり、Ｙは、以下の構造式：
ｐは、０、１または２であり；
Ｒ1 およびＲ2 はそれぞれの存在について独立して、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、トリアルキルシリル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたヘテロアリールまたはこれらのビニローグ誘導体であり；
Ｑ2 は、＝Ｏまたは＝Ｓであり；
Ｑ4 は、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ13−であり；
Ｒ13は、−Ｈ、任意に置換されたアルキルまたは任意に置換されたアリール；
Ｒ10は、−Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、任意に置換されたアルコキシ、または−ＮＯ2 であり；あるいは
Ｒ10およびＲ13はそれらが結合した炭素原子および窒素原子と共に、５または６員環の複素環式の形態であり；
Ｒ11およびＲ12はそれぞれ独立して、−Ｈ、ハロゲン、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたアルコキシであり；あるいは
Ｒ11およびＲ12はそれらが結合した炭素原子と共に、５または６員環の炭素環式または複素環式環を形成してなる、
によって表される、
によって表される化合物。 - Ｘがマスクされた反応部位を有する化合物であり、Ｘがさらに反応部位を含んでなる請求項４６記載の化合物。
- Ｘがアミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオシドホスホルアミダイト、ヌクレオシドＨ−ホスホネート、ヌクレオチド、固体支持体、ペプチド、オリゴヌクレオチド、タンパク質、ホルモン、抗体、多糖、単糖、二糖、固体支持体結合ペプチド、固体支持体結合オリゴヌクレオチド、固体支持体結合タンパク質、固体支持体結合ホルモン、固体支持体結合抗体、固体支持体結合多糖、固体支持体結合単糖、または固体支持体結合二糖からなる群より選択されてなるマスクされた反応部位を有する化合物である、請求項４７記載の化合物。
- ｍおよびｐが両方とも０であり、Ｙが以下の構造式：
- Ｙが
- ｍが１であり、ｐが１であり、Ｙが以下の構造式：
- Ｙが以下の構造式：
- ｍが０であり、ｐが１または２であり、Ｙが以下の構造式：
- Ｙが
- （ａ）反応部位を有する支持体を提供する工程；
（ｂ）請求項３２記載の第一化合物の反応部位を支持体と反応させて、結合を形成する工程；および
（ｃ）光不安定保護基を除去して、誘導支持体上に固定された、マスクされていない反応部位を有する請求項３２記載の化合物を含む誘導支持体を提供する工程を含む、反応部位を有する分子を支持体に連結する方法。 - 工程（ｂ）で形成された結合が共有結合である請求項５５記載の方法。
- （ｄ）請求項３２記載の第二化合物の反応部位を第一化合物のマスクされていない反応部位と反応させて、結合を形成する工程；および
（ｅ）第二化合物の光不安定保護基を除去して、誘導支持体上に固定された、マスクされていない反応部位を有するダイマー鎖を有する誘導支持体を提供する工程；ならびに
（ｆ）分子の系列を用いて工程（ｄ）および（ｅ）を任意に繰り返して、支持体に固定されたオリゴマーを提供する工程
をさらに含む請求項５５記載の方法。 - 分子がデオキシヌクレオシドである請求項５７記載の方法。
- 支持体がガラスまたはシリカ基材である請求項５７記載の方法。
- デオキシヌクレオシドが５’−ＯＨを介して光不安定基に連結されてなる請求項５８記載の方法。
- 光不安定基が３５０ｎｍより大きな波長での放射によって除去されてなる請求項５７記載の方法。
- 波長が約３６５ｎｍである請求項６１記載の方法。
- （ａ）支持体の領域を活性化する工程；
（ｂ）請求項３２記載の化合物である分子を第一領域に結合する工程；
（ｃ）支持体の他の領域上で工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し、それにより該他の領域のそれぞれに請求項３２記載の化合物である別の分子を結合し、該別の分子は工程（ｂ）において使用されたものと同じであっても異なっていてもよい工程；
（ｄ）支持体の領域の１つに結合された分子から光不安定保護基を除去して、マスクされていない反応部位を有する分子を保有する領域を提供する工程；
（ｅ）請求項３２記載の化合物であるさらなる分子をマスクされていない反応部位を有する分子に結合する工程；
（ｆ）複数の支持体結合化合物が成分分子から形成されるまで支持体の領域上で工程（ｄ）および（ｅ）を繰り返し、各化合物が支持体の別個の領域を占有する工程
を含む、成分分子から複数の支持体結合化合物（各化合物が支持体の別個の予め規定された領域を占有してなる）を形成する方法。 - 共有結合が工程（ｂ）および（ｅ）において形成されてなる請求項６３記載の方法。
- 分子がデオキシヌクレオシドである請求項６３記載の方法。
- 支持体がガラスまたはシリカ基材である請求項６３記載の方法。
- デオキシヌクレオシドが５’−ＯＨまたは３’−ＯＨを介して光不安定基に連結されてなる請求項６５記載の方法。
- 光不安定基が３５０ｎｍより大きな波長での放射によって除去されてなる請求項６３記載の方法。
- 波長が約３６５ｎｍである請求項６８記載の方法。
- 少なくとも１０6 個の化合物が支持体に固定されてなる請求項６３記載の方法。
- 各領域が約１μｍ2 〜１０，０００μｍ2 の面積である請求項６３記載の方法。
- （ｇ）化学的に不安定な保護基に連結されたマスクされた反応部位を含む第二分子を反応部位に共有結合し、反応部位が工程（ａ）において形成された支持体の活性化領域上にあるか、または工程（ｄ）において形成された支持体上の分子のマスクされていない反応部位であるかのいずれかである工程；
（ｈ）化学的に不安定な保護基を切断して、マスクされていない反応部位を形成する工程；
（ｉ）請求項３２の分子をマスクされていない反応部位と反応させ、それにより化学的に不安定な保護基を光不安定保護基で置換して、光不安定保護基を有する分子を有する支持体の領域を提供する工程；および
（ｊ）任意に工程（ｄ）〜（ｆ）を繰り返す工程
をさらに含む請求項６３記載の方法。 - （ａ）反応部位を有する支持体を提供する工程；
（ｂ）請求項４７記載の第一化合物の反応部位を支持体と反応させて、結合を形成する工程；および
（ｃ）光不安定保護基を除去して、誘導支持体上に固定された、マスクされていない反応部位を有する請求項４７記載の化合物を含む誘導支持体を提供する工程を含む、反応部位を有する分子を支持体に連結する方法。 - 工程（ｂ）で形成された結合が共有結合である請求項７３記載の方法。
- （ｄ）請求項４７記載の第二化合物の反応部位を第一化合物のマスクされていない反応部位と反応させて、結合を形成する工程；および
（ｅ）第二化合物の光不安定保護基を除去して、誘導支持体上に固定された、マスクされていない反応部位を有するダイマー鎖を有する誘導支持体を提供する工程；ならびに
（ｆ）分子の系列を用いて工程（ｄ）および（ｅ）を任意に繰り返して、支持体に固定されたオリゴマーを提供する工程
をさらに含む請求項７３記載の方法。 - 分子がデオキシヌクレオシドである請求項７５記載の方法。
- 支持体がガラスまたはシリカ基材である請求項７５記載の方法。
- デオキシヌクレオシドが５’−ＯＨを介して光不安定基に連結されてなる請求項７６記載の方法。
- 光不安定基が３５０ｎｍより大きな波長での放射によって除去されてなる請求項７５記載の方法。
- 波長が約３６５ｎｍである請求項７９記載の方法。
- （ａ）支持体の領域を活性化する工程；
（ｂ）請求項４７記載の化合物である分子を第一領域に結合する工程；
（ｃ）支持体の他の領域上で工程（ａ）および（ｂ）を繰り返し、それにより該他の領域のそれぞれに請求項４７記載の化合物である別の分子を結合し、該別の分子は工程（ｂ）において使用されたものと同じであっても異なっていてもよい工程；
（ｄ）支持体の領域の１つに結合された分子から光不安定保護基を除去して、マスクされていない反応部位を有する分子を保有する領域を提供する工程；
（ｅ）請求項４７記載の化合物であるさらなる分子をマスクされていない反応部位を有する分子に結合する工程；
（ｆ）複数の支持体結合化合物が成分分子から形成されるまで支持体の領域上で工程（ｄ）および（ｅ）を繰り返し、各化合物が支持体の別個の領域を占有する工程
を含む、成分分子から複数の支持体結合化合物（各化合物が支持体の別個の予め規定された領域を占有してなる）を形成する方法。 - 共有結合が工程（ｂ）および（ｅ）において形成されてなる請求項８１記載の方法。
- 分子がデオキシヌクレオシドである請求項８１記載の方法。
- 支持体がガラスまたはシリカ基材である請求項８１記載の方法。
- デオキシヌクレオシドが５’−ＯＨまたは３’−ＯＨを介して光不安定基に連結されてなる請求項８３記載の方法。
- 光不安定基が３５０ｎｍより大きな波長での放射によって除去されてなる請求項８１記載の方法。
- 波長が約３６５ｎｍである請求項８６記載の方法。
- 少なくとも１０6 個の化合物が支持体に固定されてなる請求項８１記載の方法。
- 各領域が約１μｍ2 〜１０，０００μｍ2 の面積である請求項８１記載の方法。
- （ｇ）化学的に不安定な保護基に連結されたマスクされた反応部位を含む第二分子を反応部位に共有結合し、反応部位が工程（ａ）において形成された支持体の活性化領域上にあるか、または工程（ｄ）において形成された支持体上の分子のマスクされていない反応部位であるかのいずれかである工程；
（ｈ）化学的に不安定な保護基を切断して、マスクされていない反応部位を形成する工程；
（ｉ）請求項４７の分子をマスクされていない反応部位と反応させ、それにより化学的に不安定な保護基を光不安定保護基で置換して、光不安定保護基を有する分子を有する支持体の領域を提供する工程；および
（ｊ）任意に工程（ｄ）〜（ｆ）を繰り返す工程
をさらに含む請求項８１記載の方法。
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